O splicing alternativo é um processo pelo qual os exons de um transcrito primário são ligados de diferentes maneiras durante o processamento do RNA, levando à síntese de proteínas distintas. Compreende um importante mecanismo na expressão gênica de eucariotos, responsável pelo aumento da diversidade proteômica e, portanto da capacidade codificante do genoma. Diferentes mecanismos parecem afetar a regulação do splicing alternativo, incluindo estresse metabólico. No presente estudo, foi realizada uma análise detalhada de sequências ORESTES de tecidos de cabeça e pescoço. Essa análise revelou que o ganho de sequências exônicas é mais freqüente que sua perda, e que a regra GT/AG é predominante em sítios de splicing. Nós observamos que o splicing alternativo geralmente não altera a matriz de leitura, mas pode afetar um domínio protéico e remover ou adicionar novos sítios de fosforilação e glicosilação. Elementos reguladores potenciais e elementos repetitivos foram freqüentes nas sequências alternativas e nas suas vizinhas. A expressão de isoformas de splicing potenciais foi investigada em diferentes tecidos, incluindo sob condições de estresse. Foram validados cerca de 50 eventos de splicing novos em células normais e tumorais. Diversas variantes, tais como aquelas dos genes HNRNPK, ACTN1, BAT3, CEP192, MPV17, PDK1, PRKAR1A, RAG1AP1 e TRIP6 mostraram padrões de expressão distintos em diferentes tipos celulares, em amostras normais e tumorais de pacientes com carcinoma de cabeça e pescoço e, em alguns casos, em diferentes estágios do tumor. Também foi validado um transcrito novo do gene RIPK2, responsável por codificar uma quinase de serine/treonine que ativa a via de sinalização NF-kB, e foi observada uma mudança na expressão dessa variante em resposta ao estresse térmico in vitro. Ainda não está claramente definido se o splicing alternativo é causa ou conseqüência do processo neoplásico. Nossos dados adicionam informações novas a esse tópico e fornecem alguns exemplos que evidenciam a importância do processamento do RNA na regulação da expressão gênica, tanto em condições normais como de doença. / Alternative splicing is a process by which the exons of the primary gene transcript are linked in different ways during RNA processing resulting in distinctive proteins. It is an important mechanism in eukaryotic gene expression that enhances proteome diversity and, therefore, the coding capacity of the genome. Different mechanisms seem affect alternative splicing regulation, including metabolic stresses. In the present study, a detailed informatics analysis of ORESTES sequences from head and neck tissues was performed. This in silico analysis revealed that gain of exon sequences is more frequent than exon skipping and GT/AG rule is predominant in splice sites. We observed that alternative splicing usually does not alter the reading frame but may disrupt a protein domain and remove or add new phosphorylation and glycosylation sites. Repetitive and potential regulator elements were frequent in the alternative sequences or in their neighbors. The expression of putative splicing isoforms was investigated in different tissues, including upon stress conditions. We validated approximately 50 new splicing events in normal and tumor cells. Several variants, such as those from HNRNPK, ACTN1, BAT3, CEP192, MPV17, PDK1, PRKAR1A, RAG1AP1 and TRIP6 genes showed distinctive expression pattern in different cell types, in normal and cancer samples from head and neck carcinoma patients and, in some cases, in different tumor stages. We also validated a new transcript of RIPK2 gene, which codes a serine/threonine kinase that activates the NF-kB pathway, and observed a shift in the expression of this variant as a response to temperature stress in vitro. It is currently not clear whether alternative splicing is the cause or the consequence of the neoplastic process. Our data add new information to this topic and provide some examples on the importance of RNA processing in gene expression regulation, both in normal and disease conditions.

O splicing alternativo é um processo pelo qual os exons de um transcrito primário são ligados de diferentes maneiras durante o processamento do RNA, levando à síntese de proteínas distintas. Compreende um importante mecanismo na expressão gênica de eucariotos, responsável pelo aumento da diversidade proteômica e, portanto da capacidade codificante do genoma. Diferentes mecanismos parecem afetar a regulação do splicing alternativo, incluindo estresse metabólico. No presente estudo, foi realizada uma análise detalhada de sequências ORESTES de tecidos de cabeça e pescoço. Essa análise revelou que o ganho de sequências exônicas é mais freqüente que sua perda, e que a regra GT/AG é predominante em sítios de splicing. Nós observamos que o splicing alternativo geralmente não altera a matriz de leitura, mas pode afetar um domínio protéico e remover ou adicionar novos sítios de fosforilação e glicosilação. Elementos reguladores potenciais e elementos repetitivos foram freqüentes nas sequências alternativas e nas suas vizinhas. A expressão de isoformas de splicing potenciais foi investigada em diferentes tecidos, incluindo sob condições de estresse. Foram validados cerca de 50 eventos de splicing novos em células normais e tumorais. Diversas variantes, tais como aquelas dos genes HNRNPK, ACTN1, BAT3, CEP192, MPV17, PDK1, PRKAR1A, RAG1AP1 e TRIP6 mostraram padrões de expressão distintos em diferentes tipos celulares, em amostras normais e tumorais de pacientes com carcinoma de cabeça e pescoço e, em alguns casos, em diferentes estágios do tumor. Também foi validado um transcrito novo do gene RIPK2, responsável por codificar uma quinase de serine/treonine que ativa a via de sinalização NF-kB, e foi observada uma mudança na expressão dessa variante em resposta ao estresse térmico in vitro. Ainda não está claramente definido se o splicing alternativo é causa ou conseqüência do processo neoplásico. Nossos dados adicionam informações novas a esse tópico e fornecem alguns exemplos que evidenciam a importância do processamento do RNA na regulação da expressão gênica, tanto em condições normais como de doença. / Alternative splicing is a process by which the exons of the primary gene transcript are linked in different ways during RNA processing resulting in distinctive proteins. It is an important mechanism in eukaryotic gene expression that enhances proteome diversity and, therefore, the coding capacity of the genome. Different mechanisms seem affect alternative splicing regulation, including metabolic stresses. In the present study, a detailed informatics analysis of ORESTES sequences from head and neck tissues was performed. This in silico analysis revealed that gain of exon sequences is more frequent than exon skipping and GT/AG rule is predominant in splice sites. We observed that alternative splicing usually does not alter the reading frame but may disrupt a protein domain and remove or add new phosphorylation and glycosylation sites. Repetitive and potential regulator elements were frequent in the alternative sequences or in their neighbors. The expression of putative splicing isoforms was investigated in different tissues, including upon stress conditions. We validated approximately 50 new splicing events in normal and tumor cells. Several variants, such as those from HNRNPK, ACTN1, BAT3, CEP192, MPV17, PDK1, PRKAR1A, RAG1AP1 and TRIP6 genes showed distinctive expression pattern in different cell types, in normal and cancer samples from head and neck carcinoma patients and, in some cases, in different tumor stages. We also validated a new transcript of RIPK2 gene, which codes a serine/threonine kinase that activates the NF-kB pathway, and observed a shift in the expression of this variant as a response to temperature stress in vitro. It is currently not clear whether alternative splicing is the cause or the consequence of the neoplastic process. Our data add new information to this topic and provide some examples on the importance of RNA processing in gene expression regulation, both in normal and disease conditions.

Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2017-01-06T11:37:49Z No. of bitstreams: 1 2016 - Gabriel Alves Landulfo.pdf: 2085230 bytes, checksum: a7f7c364b23211ad81d1168cb1f6db85 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-06T11:37:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016 - Gabriel Alves Landulfo.pdf: 2085230 bytes, checksum: a7f7c364b23211ad81d1168cb1f6db85 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Ornithodoros mimon is an argasid tick that parasitizes bats, birds and opossums and is also aggressive towards humans. It inhabits some countries in the Neotropical region. Knowledge of the transcripts present in the tick gut helps in understanding the role of vital molecules in the digestion process and parasite-host relationship, while also providing information about the evolution of arthropod hematophagy. Thus, the present study aimed to ascertain the main molecules expressed in the gut of argasid ticks after their blood meal, through analysis on the gut transcriptome of engorged females of O. mimon. Sixty females were fed and dissected to extract the gut tissue. The transcriptome was obtained through pyrosequencing and the de novo assembly method on mRNA of the gut tissue. We identified 2,235 contigs, of which 1,729 matched database sequences, while 506 did not present any hits. The transcripts were annotated and grouped according to their biological function. Catalytic, binding and transporter activity were the most representative functions, accounting for 780, 709 and 106 contigs, respectively. The transcripts were classified into 31 categories, using both bioinformatics and data curation practices. The most representative categories were, respectively, unknown, catalytic activity and transporter channels. One hundred and three (103) digestives transcritps associated to digestion of proteins (67), carbohydrates (19) and lipid (17) were identified in the transcriptome analysis. Peptidases associated with hemoglobin digestion, such as serine, cysteine, aspartic protease and metalloenzymes, were identified in the gut of the engorged females. Genes associated with transport (hemelipoglycoprotein) and storage (ferritin) of nutrients resulting from hemoglobin digestion, such as heme, were also found in the digestive tract. The presence of a cathepsin O-like cysteine peptidase was recorded in ticks, for the first time. Two thousand and two hundred thirteen (2213) transcripts were deposited to the Transcriptome Shotgun Assembly (TSA) portal of the NCBI.The phylogenetic analysis on the peptidases confirmed that most of them are clustered with other tick genes. Genes for cathepsin L in O. mimon appear to have diverged from other more common recent ancestors. The topology of the phylogenetic inferences, based on transcripts of inferred families of homologues, was similar to that of previous reports based on different datasets, such as mitochondrial genome and nuclear rRNA sequences. Our findings may help towards better understanding of important argasid metabolic processes, such as digestion, nutrition and immunity / Ornithodoros mimon ? um carrapato argas?deo parasita de quir?pteras, aves e marsupiais, al?m de ser bastante agressivo aos humanos. O conhecimento dos transcritos presentes no intestino dos carrapatos auxilia no entendimento do papel de mol?culas vitais no processo digest?o e na rela??o parasito-hospedeiro, al?m de fornecer tamb?m informa??es sobre a evolu??o dos artr?podes hemat?fagos. Desta maneira, o presente estudo teve como objetivo conhecer e identificar as principais mol?culas expressas no intestino de uma esp?cie de carrapato argas?deo ap?s o repasto sangu?neo, atrav?s de uma an?lise transcrit?mica do intestino de f?meas ingurgitadas de O. mimon. Sessenta f?meas foram alimentadas e dissecadas para coleta o tecido intestinal. O RNAm da amostra do intestino foi extra?do, purificado e quantificado. Esse serviu de molde para s?ntese do cDNA, que foi utilizado no pirosequenciamento. O transcritoma foi obtido atrav?s do m?todo de montagem de novo do cDNA do tecido intestinal. Identificou-se 2235 sequ?ncias consensos (contigs) ou transcritos, dos quais 1729 apresentaram similaridade (hit) com sequ?ncias dos bancos de dados, enquanto que 506 n?o tiveram nenhuma similaridade. Os transcritos foram anotados e agrupados conforme as fun??es biol?gicas atribu?das as eles no processo de anota??o g?nica. Atividade catal?tica, ades?o e transporte foram as fun??es mais representativas com 780, 709 e 106 transcritos, respectivamente. Em uma an?lise n?o automatizada, os transcritos foram subcategorizados em 31 categorias. As categorias mais representativas foram desconhecido, atividade catal?tica e transportadores-canais. Identificamos 103 transcritos digestivos associados ? digest??o de prote?nas (67), carboidratos (19) e lip?dios (17). Proteinases das classes serino, ciste?ne, asp?rtica e metalo representaram as enzimas atuantes na digest?o intracelular do constituinte prote?co do repasto sangu?neo. Genes associados com o transporte (hemelipoglicoprote?na) e estocagem (ferritina) dos nutrientes resultantes da digest?o foram encontrados bem expressos no trato digestivo. Registrou-se pela primeira vez a presen?a de uma ciste?na peptidase do tipo catepsina O em carrapatos. Foram depositados no banco de dados g?nico p?blico 2213 transcritos de O. mimon. A an?lise filogen?tica das peptidases revelou que a maioria das proteinases de O. mimon ? pr?xima aos genes codificadores de proteinases de carrapatos. Transcritos de catepsinas L de O. mimon parecem ter divergido de ancestrais recentes diferentes. A infer?ncia filogen?tica baseada em conjunto de dados transcritos hom?logos tem uma resolu??o topol?gica similar a de outros conjuntos de dados, como genoma mitocondrial e sequ?ncias nuclear de RNA riboss?mico (rRNA). Os achados obtidos no presente estudo podem contribuir para compreens?o dos importantes processos dos carrapatos argas?deos, como digest?o, nutri??o e imunidade, al?m de fornecer informa??es sobre a filogenia dos carrapatos.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-05-04T17:52:11Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lanusse Andrade Fernandes - 2015.pdf: 1698917 bytes, checksum: b237e0d0c80dfe44acee928225ef0aa4 (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-05-05T12:45:38Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lanusse Andrade Fernandes - 2015.pdf: 1698917 bytes, checksum: b237e0d0c80dfe44acee928225ef0aa4 (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-05T12:45:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lanusse Andrade Fernandes - 2015.pdf: 1698917 bytes, checksum: b237e0d0c80dfe44acee928225ef0aa4 (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) Previous issue date: 2015-06-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Handroanthus impetiginosus, known as ipê roxo, is a species present in several Brazilian biomes, with ecological and economic importance. The species has suffered strong exploration thanks to the quality of its wood. Despite of its ecological importance, economic value and medicinal potential, there is virtually no genomic study published with this species. This work aimed to take advantage of the large sequencing capacity of next generation platforms to generate, assemble and functional annotate the sequences of the entire transcriptome of H. impetiginosus. Seeds were collected from two trees on the Campus II of the Universidade Federal de Goiás. The seeds were germinated, their aerial tissues collected and the RNA extracted and sent to the University of Illinois to be sequenced on the HiSeq 2500 platform (Illumina). A total of 148,359,530 sequencing reads were generated. The adapters and low-quality sequences were removed. Contaminating sequences were detected and eliminated, and the remaining sequences were normalized. Sequences were then assembled, annotated and polymorphisms were detected. A total of 190,885 scaffolds were assembled from 23,002 genes. Mimulus guttatus was the species with the most Blast best hit against the sequences of H. impetiginosus. Of all the Gene Ontology (GO) annotated sequences, the majority had categories for Biological Process (50.94%), followed by Cellular Component (28.34%) and Molecular Function (20.72%). The most frequent GO categories related to Biological Process were metabolic and cellular processes, while in Cell Components the most frequent were cell and organelles. Catalytic activity and binding of ions and molecules were the most frequent annotated categories of Molecular Function. As the sequences were generated from a pool of RNA from four plants, 25,169 InDels and 278,121 SNPs were identified. As expected, InDels are depleted in coding regions (CDS) when compared to SNPs. These results will be important for future studies with an interest in gene expression of the species. Furthermore, the possible SNPs identified can facilitate genetic studies and genomic H. impetiginosus populations. / Handroanthus impetiginosus, conhecida como ipê-roxo, é uma espécie presente em vários biomas brasileiros, tendo importância ecológica e econômica. O ipê-roxo vem sofrendo forte exploração graças à qualidade de sua madeira. Apesar de sua importância ecológica, seu valor econômico e de seu potencial medicinal, inexistem estudos genômicos publicados com esta espécie. Assim, este trabalho teve como objetivo principal aproveitar a grande capacidade de sequenciamento das plataformas de nova geração para gerar, montar e fazer anotação funcional da sequência do transcritoma de Handroanthus impetiginosus. Foram coletadas sementes de duas árvores matrizes de H. impetiginosus dispersas pelo Campus II da Universidade Federal de Goiás. As sementes foram germinadas, seus tecidos aéreos coletados e o RNA foi extraído e enviado à Universidade de Illinois para ser sequenciado na plataforma HiSeq 2500 da Illumina. Foi gerado um total de 148.359.530 sequências. Os adaptadores e as sequências de baixa qualidade foram removidos. Em seguida, possíveis sequências contaminantes foram detectadas e eliminadas, e as sequências restantes foram normalizadas. Ao final da normalização, as sequências foram montadas, anotadas e os polimorfismos detectados. Foram montados 190.885 transcritos (scaffolds), totalizando 23.002 genes. Mimulus guttatus, popularmente conhecida como flor de macaco, foi a espécie com maior número de sequências mais similares às de Handroanthus impetiginosus. De todas as sequências anotadas com categorias GO (Gene Ontology) a maioria teve anotações para Processo Biológico (50.94%), seguido de Componente Celular (28.34%) e Função Molecular (20.72%). As sequências mais frequentes relacionadas à Processo biológico estão ligadas a processos metabólicos e celulares, em Componentes Celulares as sequências mais frequentes estão ligadas a célula e a organelas. Já em Função Molecular as sequências mais frequentes estão relacionadas a atividade catalítica e ligação de íons e moléculas. Como as sequências foram geradas a partir de amostras de RNA de quatro plantas, 25.169 InDels e 278.121 SNPs foram identificados. Como esperado, os InDels são significativamente mais deplecionados em regiões codantes (CDS) que os SNPs.Estes resultados serão importantes para futuros estudos com interesse na expressão gênica da espécie. Além disso, os possíveis SNPs identificados poderão facilitar estudos de genética e genômica de populações para H. impetiginosus.

Plasmodium vivax é o parasita causador de malária humana com maior distribuição global, responsável pela redução da qualidade de vida de milhões de pessoas ao redor do mundo. O objetivo geral do trabalho foi contribuir, através de metodologias estatísticas e de bioinformática, para o entendimento do mecanismo de escape da eliminação pelo baço do hospedeiro utilizado por P. vivax. Para isso, primeiramente realizou-se a análise estatística de um experimento de transcritômica, através de microarrays. Esse experimento foi conduzido previamente pelo grupo de colaboradores do presente estudo, utilizando um modelo animal, Aotus lemurinus griseimembra, com o objetivo de identificar genes de P. vivax expressos somente em parasitas retirados de macacos que possuíam o baço intacto. Em uma segunda fase, foi projetado um tiling array contendo todos os éxons e as regiões 5UTR e 3UTR disponíveis do genoma de P. vivax, que será utilizado para a realização de mais investigações a respeito da influência da presença do baço na expressão gênica de P. vivax. Na última etapa, foi conduzida uma melhoria na anotação funcional do genoma de P. vivax, através de uma metodologia automática, com o objetivo de adicionar informações para auxiliar na interpretação biológica dos resultados obtidos anteriormente e em estudos futuros. / Plasmodium vivax is the parasite that causes the human malaria type with the largest global distribution and it is responsible for quality of life impairment of millions of people around the world. The general purpose of this study was contribute to understand the mechanism used by P. vivax to scape from the host spleen elimination, through statistical methodologies and bioinformatics. First of all, we carried out statistical analysis of a microarray experiment conducted earlier by the collaborators of this study, using Aotus lemurinus griseimembra as model organism, in order to identify genes of P. vivax expressed only in parasites extracted from monkeys with intact spleen. In the second step, we designed a tiling array containing 5\'UTR, 3\'UTR and all the exons of the P. vivax genome, which will be used to perform more experiments to investigate the role of the spleen on the parasite gene expression. In the last step, we add information to the functional annotation of P. vivax genome, through an automated methodology, to improve the biological interpretation of the results previously obtained and in future studies.

Submitted by Maria Cristina (library@lncc.br) on 2017-05-04T13:17:54Z No. of bitstreams: 1 Tese - LNCC - Pablo Ivan Pereira Ramos.pdf: 25881844 bytes, checksum: 3737e5c6b0b1a08ca20ed86f209a96d7 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Cristina (library@lncc.br) on 2017-05-04T13:18:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - LNCC - Pablo Ivan Pereira Ramos.pdf: 25881844 bytes, checksum: 3737e5c6b0b1a08ca20ed86f209a96d7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-04T13:18:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - LNCC - Pablo Ivan Pereira Ramos.pdf: 25881844 bytes, checksum: 3737e5c6b0b1a08ca20ed86f209a96d7 (MD5) Previous issue date: 2016-06-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) / The emergence of clinically important bacteria presenting a wide spectrum of antibiotic resistance represents a global concern. Although bacterial resistance was reported in the literature from the beggining of antibiotic use, early in the 20th century, we currently face the threat of pan-resistance, pathogens that can escape the action of all currently available antibiotic classes. A better understanding of virulence and resistance mechanisms, as well as new therapeutic options, are of paramount importance. This thesis proposal is based on the study of Klebsiella pneumoniae Kp13, a clinical isolate obtained in 2009 during a clonal outbreak in South Brazil which had its complete genome determined by our group. This strain is multidrug resistant and presents high-level resistance against polymyxin B (MIC 32 mg L􀀀1), a \last resort" drug for the treatment of Gram-negative multidrug-resistant bacteria. Using techniques from bioinformatics, transcriptomics (RNA-seq), systems biology and molecular modeling, we sought to better understand the gene expression response in K. pneumoniae in face of changes in abiotic characteristics and polymyxin B exposure. How these factors influence the metabolic repertoire of K. pneumoniae was also object of research. We also aimed to delineate a computational strategy for priorization of metabolic pathways that could serve as new targets for therapeuticals, by integrating expression, metabolic and structural reconstruction data. In parallel, this strategy was also applied to the study of Mycobacterium tubercluosis H37Rv (Mtb), the best characterized strain of this bacteria. E orts were made to study the metabolic complement of this pathogen, identifying important pathways related to its growth and correlating to molecular targets from a structural standview. The transcriptomic analyses allowed the identi cation of novel intracellular targets (such as ArcA-ArcB) that go beyond the \classic" e ect of polymyxin B mode of action, based in membrane interaction, besides drug-induced metabolic modulation which may lead to fermentative pathways of growth. The computational strategy for whole-genome target priorization led to the nding of pathways already known as druggable, such as S-methyl 5'-adenosin, as well as pathways not previously classi ed as druggable, but which could serve as candidates for future development of therapeutical compounds. / A emergência de isolados clínicos bacterianos apresentando resistência a uma ampla gama de medicamentos antibióticos representa uma preocupação global. Embora bactérias resistentes a alguns antibióticos já tenham sido relatadas na literatura médica desde o princípio do uso destas substâncias, no início do século XX, atualmente enfrentamos bactérias ditas panresistentes com capacidade de evadir à ação de todas as classes de drogas hoje disponíveis. O melhor entendimento dos mecanismos de resistência e virulência, bem como o delineamento de novas estratégias para o desenvolvimento de opções terapêuticas alternativas torna-se, portanto, imperativo. A presente proposta de tese de doutoramento tem como objeto de estudo central a bactéria Klebsiella pneumoniae Kp13, isolada no Sul do Brasil em 2009 na ocasião de um surto clonal e cujo genoma foi completamente determinado por nosso grupo. Esta cepa possui resistência multi-droga incluindo polimixina B (MIC > 32 mg L􀀀1), antibiótico considerado de último recurso no tratamento de patógenos Gram-negativos multi-resistentes. Utilizando técnicas de bioinformática, transcritômica (RNA-seq), biologia de sistemas e modelagem molecular, busca-se maior entendimento da resposta da ativação/desativação gênica de K. pneumonia frente a variações do meio e a exposição à polimixina B e como estes infuenciam no repertório metabólico exibido por esta bactéria. Ademais, objetiva-se delinear uma estratégia computacional para priorização de vias metabólicas servir como novos alvos terapêuticos para o controle deste importante patógeno, utilizando uma estratégia que integra os dados de expressão, metabólicos e da reconstrução estrutural. Em paralelo, esta estratégia foi também aplicada ao estudo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Mtb), a cepa mais bem caracterizada desta bactéria. Foi dado um foco no complemento metabólico de Mtb, realizando a reconstrução de vias metabólicas importantes ao seu crescimento, correlacionando-as com alvos proteicos do ponto de vista estrutural. A análise transcritômica permitiu identificar possíveis alvos intracelulares que vão além do efeito “clássico" de ação da polimixina, baseado em interação com a membrana externa, tais como o sistema ArcA-ArcB, al_em de modulação metabólica induzida pelo fármaco, levando ao crescimento fermentativo da bactéria. A priorização de alvos moleculares permitiu identificar vias reconhecidamente drogáveis, tais como o metabolismo de S-metil 5'-adenosina, além de vias anteriormente não identificadas como drogáveis, mas que poderiam servir como candidatos para o desenvolvimento de novos fármacos.

O Brasil é o maior produtor mundial de feijão com produção média anual de 3,5 milhões de toneladas, entretanto, um dos maiores problemas enfrentados por essa cultura é o déficit hídrico, que leva a uma redução considerável em seu rendimento. Dessa forma, a identificação de genes que controlam os mecanismos de defesa e adaptação do feijoeiro à falta de água durante o seu desenvolvimento é de grande utilidade. E, como a tolerância à seca é um caráter multigênico, genótipos com diferentes graus de tolerância apresentam expressão gênica diferencial, com ativação e/ou repressão de determinados genes. Diante disso, esse trabalho teve como objetivos: (i) identificar genes diferencialmente expressos em dois genótipos de feijoeiro comum, sendo um tolerante (BAT 477) e o outro suscetível (IACCarioca 80SH) à seca; (ii) verificar a expressão gênica espacial (em raízes, caules e folhas) e temporal (cinco níveis crescentes de déficit hídrico - 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 120 h de exposição ao estresse) por meio de RT-qPCR; (iii) predizer a função dos genes identificados, com base nos genes ortólogos de Arabidopsis thaliana, usando dados públicos de microarranjo disponíveis na plataforma Genevestigator. Para atingir esses objetivos, foi conduzido um experimento em casa-de-vegetação, sendo induzido o déficit hídrico, por meio da suspensão da irrigação, quando as plantas atingiram o estádio fenológico R5, mantendo sob suprimento hídrico adequado as plantas-controle. Foi então utilizada a técnica de cDNA-AFLP para isolar os transcritos diferencialmente expressos entre os dois genótipos, sob seca, a qual aliada ao sequenciamento possibilitou a identificação e anotação de 45 transcritos, sendo 21 exclusivamente expressos no genótipo tolerante e 24 no genótipo suscetível. Dentre os transcritos identificados no genótipo tolerante, podem ser listados pelo menos 11, com potencial de serem usados para transformação genética (chlorophyll A-B binding protein, HSP40, HSP70, glycosyl hydrolase, serine/threonine protein kinase, trehalose-6-phosphate synthase, E3 ubiquitin ligase, fructose biphosphate aldolase, mediator complex subunit 13, aquaporin nodulin MTN-3-related e TCP transcription factor), e no genótipo suscetível, podem ser listados nove (coatomer protein complex, monoamine-oxidase A repressor R1, synaptobrevin, haloacid dehalogenase-like hydrolase, ADP-ribosylation factor, mTERF, serine protease S1C HtrA-related, legume lectin e SWI/SNF-related chromatin binding). Na análise de expressão gênica espacial e temporal, os transcritos mais promissores para uso em trabalhos futuros de transformação genética foram: aquaporin nodulin MTN3, E3 ubiquitin ligase, serine/threonine protein kinase, glycosyl hydrolase e HSP 70 protein, uma vez que tiveram uma expressão bastante pronunciada no genótipo tolerante. Através das análises in silico, baseadas nos genes ortólogos de A. thaliana, foram descobertos processos e vias metabólicas que podem estar envolvidos na resposta do feijoeiro comum ao déficit hídrico. Além disso, foram identificados genes associados com a tolerância à seca, corroborando os dados experimentais. Sendo assim, os resultados obtidos nesse trabalho fornecem o entendimento necessário ao desenvolvimento de ferramentas moleculares (marcadores para genes diferencialmente regulados) para serem utilizados em programas de melhoramento, bem como para informação genética básica na anotação funcional do genoma do feijoeiro e também para utilização desses genes candidatos em trabalhos de transformação genética para obtenção de plantas mais tolerantes à seca. / Brazil is the largest producer of common beans, with average annual production of 3.5 million tonnes; however, one of the biggest problems faced by this crop is drought, which leads to a considerable reduction in their yield. Thus, the identification of genes that control the defense mechanisms and adaptation of common bean to drought during its development is very useful. Drought tolerance is a multigenic character, so genotypes with different degrees of water deficit tolerance exhibit differential gene expression, with activation and/or repression of certain genes. Therefore, this study aimed to: (i) identify differentially expressed genes in two common bean genotypes, one tolerant (BAT 477) and other susceptible (IAC-Carioca 80SH) to drought, (ii) verify the spatial (root, stem and leaves) and temporal (five increasing levels of water deficit - 24 h, 48 h, 72 h, 96 h and 120 h of stress exposition) gene expression by RTqPCR (iii) predict the genes function, based on Arabidopsis thaliana orthologous genes, using available data in the public microarray platform Genevestigator. To achieve these objectives, an experiment was conducted in a green house, being induced water deficit, by withholding water when the plants reached growth stage R5, maintaining adequate water supply under the control plants. To isolate transcripts differentially expressed between the two genotypes under drought was used the cDNA-AFLP technique, which coupled with sequencing enabled the identification and annotation of 45 transcripts, 21 exclusively expressed in the tolerant genotype and 24 in the susceptible one. Among the transcripts identified in the tolerant genotype, may be listed at least 11, with potential to be used in genetic transformation (chlorophyll A-B binding protein, HSP40, HSP70, glycosyl hydrolase, serine/threonine protein kinase, trehalose-6-phosphate synthase, E3 ubiquitin ligase, fructose biphosphate aldolase, mediator complex subunit 13, aquaporin nodulin MTN-3-related and TCP transcription factor), and in the susceptible genotype, can be listed nine (coatomer protein complex, monoamine-oxidase A repressor R1, synaptobrevin, haloacid dehalogenase-like hydrolase, ADP-ribosylation factor, mTERF, serine protease S1C HtrA-related, legume lectin and SWI/SNF-related chromatin binding). In the spatial and temporal gene expression analysis, the transcripts that stood out for use in genetic transformation future studies were: aquaporin nodulin MTN3, E3 ubiquitin ligase, serine/threonine protein kinase, glycosyl hydrolase and HSP 70 protein, since it had an expression quite pronounced in the tolerant genotype. Through the in silico analysis, based on orthologous genes of A. thaliana, was discovered processes and metabolic pathways that may be involved in the common bean response to drought. In addition, we identified genes associated with drought tolerance, corroborating the experimental data. Thus, the present results provide the necessary understanding to develop molecular tools (markers for differentially regulated genes) to be used in breeding programs, as well as basic genetic information in the common bean functional genome annotation and also to use these candidate genes for genetic transformation to obtain drought-tolerant plants.

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma importante cultura na produção de alimentos e energia. Várias espécies de insetos podem causar sérios prejuízos econômicos à cultura da cana-de-açúcar. A broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis) é a praga de maior relevância por estar amplamente distribuída nas regiões canavieiras. O silenciamento gênico por RNA de interferência (RNAi) se tornou uma técnica amplamente estudada e utilizada nos mais diversos aspectos da biologia. Uma de suas aplicações é no controle de insetos-praga como uma alternativa de alta eficiência, especificidade e reduzido impacto ambiental. A ingestão de moléculas de RNA dupla fita (dsRNA) com identidade a regiões de genes essenciais de insetos-praga pode resultar no silenciamento destes genes, levando a fenótipos deficientes. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo buscar genes alvos para o silenciamento com potencial para impedir o desenvolvimento normal da D. saccharalis e estabelecer uma forma de entrega do dsRNA eficiente para o teste de genes, visando assim validar o uso da técnica para a espécie. Por meio da clonagem de regiões de genes ortólogos já utilizados como alvo de silencimento em outras espécies de insetos (V-ATPase A, Receptor de Ecdisona e Arginina Kinase), e de genes com função específica identificadas após a caracterização do transcritoma de D. saccharalis (Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase, Neverland e Quitina Sintase) foram conduzidos ensaios de RNAi. Foram realizados ensaios de dose resposta para o gene V-ATPaseem lagartas neonatas, onde a concentração selecionada por causar melhor redução na expressão do gene alvo foi de 2,5 µg µL-1. Esta concentração foi então utilizada em ensaios de alimentação para os outros genes. Os genes V-ATPase A, receptor de Ecdisona, Arginina Kinase, Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase e Quitina Sintase apresentaram redução significativa no número de transcritos em larvas, demonstrando a viabilidade do uso de RNAi em D. saccharalisneonatas. O gene Neverland não demonstrou redução no acúmulo de transcritos nas condições trabalhadas. O gene GFP inicialmente utilizado como controle negativo apresentou variação na expressão de genes alvo, sendo desconsiderado como bom controle para D. saccharalis. O silenciamento dos genes alvo requer quantidades elevadas de dsRNA, superiores aos obtidos por transcrição in vitro, o que limita a viabilidade de ensaios com maiores replicatas e para determinar efeitos biológico. Alternativas de produção de dsRNA devem ser avaliadas para viabilizar a seleção de genes alvo efetivos / Sugarcane (Saccharum spp.) is an important crop for the production of food and bioenergy. Many insect species can cause economic losses in sugarcane. The sugarcane borer (Diatraea saccharalis) is the most important sugarcane pest, because it occurs in all production regions. Gene silencing by RNA interference (RNAi) rapidly became a widely investigated approach, adopted in various aspects of biology. One of the potential applications of RNAi is agricultural pest control, as an alternative with high efficiency, specificity and reduced environmental impact. The ingestion of double-stranded RNA (dsRNA) molecules with identity to regions of essential genes of the insect-pest can result in the target gene knock-down and, consequently, to deficient phenotypes. In the present work, target genes with the potential to affect the normal development of D. saccharaliswere searched, together with an efficient dsRNA delivery approach to test the target-genes to validate the use of the RNAi in D. saccharalis. Based on degenerated primers, expressed orthologous genes previously tested in other insect species (V-ATPase A, Ecdisone Receptor, and Arginine Kinase) were cloned,whilegenes with specific function (Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase, Neverland, and Chitin Synthase) were identified from an in-house assembled transcriptome of D. saccharalis and cloned. A dose-response assay was conducted using the V-ATPase gene region delivered by droplets to neonate larvae, and the 2.5 µg µL-1dsRNA concentration was selected for further tests. This concentration was then used to deliver the other genes. The dsRNA version from the genes V-ATPase A, Ecdisone Receptor, Arginine Kinase, Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase and Chitin Synthaseexhibited a significant reduction in the accumulation of transcripts, indicating the viability of RNAi to D. saccharalis in 1st instar larvae. The Neverland gene was not silenced by RNAi in the used conditions. The dsRNA of the Green Fluorescent Protein gene, used as negative control appeared to affectother gene targets. Target gene silencing require large amounts of dsRNA, more than what is achievable by in vitro transcription, which limits the viability to conduct large assays with more replicates and to determine biological effects. Alternatives to produce dsRNA need to be evaluated to enable the selection of effective target genes

A seca é um dos principais problemas que afetam a produção do feijoeiro. A despeito da importância de caracteres fenotípicos radiculares, muitos dos esforços de melhoramento genético da cultura tem focado na seleção de cultivares com maior produção de grãos. A simbiose estabelecida entre plantas e FMA aumentam o potencial de captação de água no solo através das extensas redes formadas pelas hifas e alteram vias metabólicas vitais para a manutenção das relações hídricas da planta. O modelo de interação feijoeiro (BAT 477) colonizado por uma mistura de FMA (Glomus clarum, Acaulospora scrobiculata e Gigaspora rosea) foi submetido a um déficit hídrico de 96 h durante o pré-florescimento. O transcritoma global de raízes inoculadas e não-inoculadas, sujeitas ou não à seca, foi comparado por RNA-Seq. Um conjunto de 71 transcritos foram induzidos por FMA durante a seca. Comparando-se os tratamentos estresse e controle, 12.086 unigenes foram regulados em plantas inoculadas e 11.938 em não-inoculadas, refletindo o alto potencial de tolerância da linhagem BAT 477 e indicando que a presença de FMA produz uma regulação fina no perfil de expressão de genes regularmente envolvidos na resposta da planta ao estresse. Foram selecionados 15 fatores de transcrição e seus perfis de expressão foram caracterizados por RT-qPCR tomando-se três períodos, 48, 72 e 96 h de déficit hídrico. Plantas inoculadas ativaram a expressão destes genes mais tardiamente (após 72 h), refletindo melhorias nas condições hídricas da planta que adiam a percepção do estresse. Adicionalmente, a expressão de 23 transcritos foi avaliada em três amostras teciduais diferentes obtidas por microscopia de microdissecção a laser. Glucan 1,3 ?-Glucosidase e PIP2,3, foram detectados somente em células do córtex radicular contendo arbúsculos indicando uma possível indução tecido específica dependente da presença dos fungos. Análises complementares apontaram a regulação de 171 unigenes envolvidos na resposta das FMA ao estresse. Estes resultados validam a hipótese inicial de que a inoculação com FMA altera os perfis de expressão de genes vitais para a resposta da planta ao déficit hídrico / Drought is one of the main problems that affect common bean\'s production. Despite the importance of root fenological characters, breeding efforts for the culture have focused on the selection of cultivars for grain yield. The symbiosis stablished between AMF and plants enhances the potential of water absorption from the soil through an extensive net formed by hyphae and alters vital metabolic pathways involved in the maintenance of the water relations in plants. The interaction model common bean (BAT 477) colonized by a mixture of AMF (Glomus clarum, Acaulospora scrobiculata and Gigaspora rosea) was exposed to a water deficit regime of 96 h during pre-flowering. Global transcriptome from inoculated and non-inoculated roots, exposed or not to drought, were compared through RNA-Seq. A set of 71 transcripts was induced by AMF during drought. Comparing both stress and control treatments, 12,086 unigenes were regulated in inoculated plants, and 11,938 in non-inoculated, reflecting the great tolerance potencial of the lineage BAT 477 and indicating that the presence of AMF produces a fine tune regulation on the expression of genes regularly involved on the drought response of the plant. It was selected 15 transcription factors and their expression profiles were characterized through RT-qPCR taking 3 periods, 48, 72 and 96 h of water deficit. AM plants activated earlier (after 72 h) the expression of these genes, reflecting improvements on the water conditions of the plant that delay the stress perception. Additionally, the expression of 23 transcripts was evaluated on three different tissue samples obtained through laser microdissection microscopy. Glucan 1,3 ?-Glucosidase and PIP2,3, were detected only in cortical cells containing arbuscules, pointing to a possible tissue specific induction dependent of the presence of the fungus. Additional analysis point to the regulation of 171 unigenes involved on the response of the AMF to drought. These results corroborate the initial hypothesis that the inoculation with AMF alters the gene expression profiles of genes that are vital for water deficit response in plants

Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-02-06T20:30:27Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Felipe Souto Araújo - 2014..pdf: 3055145 bytes, checksum: 201375acf3007e213c1265f0cae0ff5e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-02-19T14:44:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Felipe Souto Araújo - 2014..pdf: 3055145 bytes, checksum: 201375acf3007e213c1265f0cae0ff5e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-19T14:44:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Felipe Souto Araújo - 2014..pdf: 3055145 bytes, checksum: 201375acf3007e213c1265f0cae0ff5e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-06-02 / Paracoccidioides spp, dimorphic pathogenic fungi, is the etiologic agent of paracoccidioidomycosis (PCM). PCM is an endemic disease that affects at least 10 million people in Latin America, causing severe public health problem. The drugs used against pathogenic fungi have various side effects and have limited efficacy, therefore there is an inevitable and urgent medical needing for the development of new antifungal drugs. In the present study, we evaluated the transcriptional profile of Paracoccidioides spp exposed to argentilactone, a constituent of the essential oil of Hyptis ovalifolia. A total of 1,058 genes were identified, of which 208 were up-regulated and 850 down-regulated. The cell rescue, defense and virulence, with a total of 26 genes, was a functional category with a large number of genes induced, among them, heat shock protein 90 (hsp 90), cytochrome c peroxidase (ccp), hemoglobin ligant RBT5 (rbt5) and superoxide dismutase (sod). Quantitative real-time PCR revealed an increase in the expression level of all those genes. Enzymatic assay showed a significant increase in SOD activity. The reduced growth of Pbhsp90-aRNA, Pbccp-aRNA, Pbsod-aRNA, Pbrbt5-aRNA isolates in the presence of argentilactone indicates the importance of these genes in Paracoccidioides spp responding to argentilacone. Paracoccidioides spp cell wall was also evaluated. The results showed that argentilactone causes a decrease in the levels of polymers of the cell wall. These results suggest that argentilactone is a potential candidate for antifungal therapy. / Paracoccidioides spp, fungo patogênico dimórfico, é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM). PCM é uma doença endêmica que afeta pelo menos 10 milhões de pessoas na América Latina, causando grave problema de saúde pública. Os medicamentos usados contra fungos patogênicos têm vários efeitos secundários e têm eficácia limitada, por conseguinte, existe uma inevitável e urgente necessidade médica para o desenvolvimento de novas drogas anti-fúngicas. No presente estudo, foi avaliado o perfil transcricional de Paracoccidioides spp expostos a argentilactona, um componente do óleo essencial de Hyptis ovalifolia. Um total de 1.058 genes foram identificados, dos quais 208 foram induzidos e 850 reprimidos. Resgate celular, defesa e virulência, com um total de 26 genes, foi uma categoria funcional com um grande número de genes induzidos, entre eles, proteína de choque térmico 90 (HSP 90), citocromo c peroxidase (CCP), hemoglobina ligante RBT5 (rbt5) e superóxido dismutase (SOD). Quantitative real-time PCR revelou um aumento do nível de expressão de todos esses genes. Ensaio enzimático mostrou um aumento significativo na atividade de SOD. O crescimento reduzido de Pbhsp90-aRNA, Pbccp-aRNA, Pbsod-aRNA, Pbrbt5-aRNA na presença de argentilactona indica a importância desses genes em Paracoccidioides spp respondendo a argentilacona. Parede celular de Paracoccidioides spp também foi avaliada. Os resultados mostraram que argentilactona provoca uma diminuição nos níveis de polímeros da parede celular. Estes resultados sugerem que argentilactona é um candidato potencial para a terapia antifúngica.