Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-02-06T20:30:27Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Felipe Souto Araújo - 2014..pdf: 3055145 bytes, checksum: 201375acf3007e213c1265f0cae0ff5e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-02-19T14:44:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Felipe Souto Araújo - 2014..pdf: 3055145 bytes, checksum: 201375acf3007e213c1265f0cae0ff5e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-19T14:44:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Felipe Souto Araújo - 2014..pdf: 3055145 bytes, checksum: 201375acf3007e213c1265f0cae0ff5e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-06-02 / Paracoccidioides spp, dimorphic pathogenic fungi, is the etiologic agent of paracoccidioidomycosis (PCM). PCM is an endemic disease that affects at least 10 million people in Latin America, causing severe public health problem. The drugs used against pathogenic fungi have various side effects and have limited efficacy, therefore there is an inevitable and urgent medical needing for the development of new antifungal drugs. In the present study, we evaluated the transcriptional profile of Paracoccidioides spp exposed to argentilactone, a constituent of the essential oil of Hyptis ovalifolia. A total of 1,058 genes were identified, of which 208 were up-regulated and 850 down-regulated. The cell rescue, defense and virulence, with a total of 26 genes, was a functional category with a large number of genes induced, among them, heat shock protein 90 (hsp 90), cytochrome c peroxidase (ccp), hemoglobin ligant RBT5 (rbt5) and superoxide dismutase (sod). Quantitative real-time PCR revealed an increase in the expression level of all those genes. Enzymatic assay showed a significant increase in SOD activity. The reduced growth of Pbhsp90-aRNA, Pbccp-aRNA, Pbsod-aRNA, Pbrbt5-aRNA isolates in the presence of argentilactone indicates the importance of these genes in Paracoccidioides spp responding to argentilacone. Paracoccidioides spp cell wall was also evaluated. The results showed that argentilactone causes a decrease in the levels of polymers of the cell wall. These results suggest that argentilactone is a potential candidate for antifungal therapy. / Paracoccidioides spp, fungo patogênico dimórfico, é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM). PCM é uma doença endêmica que afeta pelo menos 10 milhões de pessoas na América Latina, causando grave problema de saúde pública. Os medicamentos usados contra fungos patogênicos têm vários efeitos secundários e têm eficácia limitada, por conseguinte, existe uma inevitável e urgente necessidade médica para o desenvolvimento de novas drogas anti-fúngicas. No presente estudo, foi avaliado o perfil transcricional de Paracoccidioides spp expostos a argentilactona, um componente do óleo essencial de Hyptis ovalifolia. Um total de 1.058 genes foram identificados, dos quais 208 foram induzidos e 850 reprimidos. Resgate celular, defesa e virulência, com um total de 26 genes, foi uma categoria funcional com um grande número de genes induzidos, entre eles, proteína de choque térmico 90 (HSP 90), citocromo c peroxidase (CCP), hemoglobina ligante RBT5 (rbt5) e superóxido dismutase (SOD). Quantitative real-time PCR revelou um aumento do nível de expressão de todos esses genes. Ensaio enzimático mostrou um aumento significativo na atividade de SOD. O crescimento reduzido de Pbhsp90-aRNA, Pbccp-aRNA, Pbsod-aRNA, Pbrbt5-aRNA na presença de argentilactona indica a importância desses genes em Paracoccidioides spp respondendo a argentilacona. Parede celular de Paracoccidioides spp também foi avaliada. Os resultados mostraram que argentilactona provoca uma diminuição nos níveis de polímeros da parede celular. Estes resultados sugerem que argentilactona é um candidato potencial para a terapia antifúngica.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-12-18T13:15:58Z No. of bitstreams: 2 Tese - Lívia do Carmo Silva - 2017.pdf: 33507637 bytes, checksum: 4e4e645677db485bad788889218760cd (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-12-18T13:17:23Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Lívia do Carmo Silva - 2017.pdf: 33507637 bytes, checksum: 4e4e645677db485bad788889218760cd (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-18T13:17:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Lívia do Carmo Silva - 2017.pdf: 33507637 bytes, checksum: 4e4e645677db485bad788889218760cd (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-12-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioidomycosis (PCM) is the cause of several deaths from systemic mycoses. The etiological agents of PCM belong to the genus Paracoccidioides spp., restricted to the regions of Latin America. The infection is acquired by inhaling conidia that primarily settle in the lungs, and can spread to other organs. The treatment of PCM is commonly performed with administration of antifungals such as amphotericin B, itraconazole and co-trimoxazole. The toxicity and side effects of antifungals, added over the long treatment time, has stimulated research for new bioactive compounds. Thus, with the objective of to identify the anti- Paracoccidioides spp. of compounds derived from chalcones and nitrogen heterocycles and to identify the molecular targets and mode of action of argentilactone and RRF-128 in P. brasiliensis were used methodologies such as shape-based virtual screening, minimum inhibitory and fungicidal concentration, cytotoxicity in fibroblast cells, interactions between antifungal, proteomic and chemoproteomics. After the virtual screening, 33 chalcones were proposed as anti-Paracoccidioides molecules, being this activity confirmed by biological assays. Among the compounds, eight aryl and heteroaryl chalcones had selectivity index considered attractive, highlighting Labmol-75 with selectivity index of 64.4 in P. lutzii and 32.2 in P. brasiliensis. In addition, Labmol-75 showed additive interaction with amphotericin B and co-trimoxazole. In relation to nitrogen heterocycles, of the 22 tested compounds, RRF-128 was the most important. RRF-128 showed to inhibit the growth of P. brasiliensis in low concentrations, selectivity index of 64.10, interacting synergistically with itraconazole. In addition, the proteomic analyzes of P. brasiliensis in the presence of the compound provided evidence that the energy metabolism of the fungus is induced to produce acetyl-CoA and that the synthesis of membrane sterols is impaired. In relation to argentilactone, 331 proteins were identified as ligands to this compound in the chemoproteomics assay and after being functionally classified, it was observed that the most representative functional classes are related to amino acid metabolism, energetic and detoxification. The inhibition of the enzymatic activity of malate dehydrogenase, citrate synthase and pyruvate dehydrogenase by argentilactone was confirmed. In addition, argentilactone induced the production of reactive oxygen species, and inhibited chitin and glucan synthesis and arrest of the cell cycle in the G0/G1 phase. From these results, it can be concluded that the compounds Labmol-75, RRF- 128 and argentilactone showed to be promising antifungal agents. / Paracoccidioidomicose (PCM) é a causa de várias mortes por micoses sistêmicas. Os agentes etiológicos da PCM pertencem ao gênero Paracoccidioides spp., restritos às regiões da América Latina. A infecção é adquirida por inalação de conídios que primariamente se instalam nos pulmões, podendo disseminar para outros órgãos. O tratamento da PCM é comumente realizado com a administração de antifúngicos como anfotericina B, itraconazol e co-trimoxazol. A toxidade e efeitos colaterais dos antifúngicos, adicionado ao longo tempo de tratamento, têm impulsionado pesquisas por novos compostos bioativos. Assim, com objetivo de identificar a atividade anti-Paracoccidioides spp. de compostos derivados de chalconas e heterociclos nitrogenados e identificar os alvos moleculares e modo de ação de argentilactona e RRF-128 em P. brasiliensis foram empregadas metodologias como rastreio virtual shape-based, concentração inibitória e fungicida mínima, citotoxicidade em células de fibroblastos, interações entre antifúngicos, proteômica e quimioproteômica. Após o rastreio virtual, 33 chalconas foram propostas como moléculas anti-Paracoccidioides, sendo esta atividade confirmada pelos ensaios biológicos. Dentre os compostos, oito aril e heteroaril chalconas tiveram índices de seletividades considerados promissores, destacando-se Labmol-75 com índice de seletividade de 64,4 em P. lutzii e 32,2 em P. brasiliensis. Além disso, Labmol-75 apresentou interação aditiva com anfotericina B e co-trimoxazol. Dos 22 compostos heterociclos nitrogenados, o RRF-128 apresentou resultados promissor. RRF-128 foi capaz de inibir o crescimento de P. brasiliensis em baixas concentrações e apresentou índice de seletividade de 64,10. Além disso, RRF-128 interagiu de forma sinérgica com itraconazol. As análises proteômicas de P. brasiliensis na presença de RRF-128 forneceram evidências de que o metabolismo energético do fungo é direcionado para produção de acetil-CoA e que a síntese de esteróis de membrana está comprometida. Quanto à argentilactona, 331 proteínas foram identificadas como ligantes a este composto utilizando abordagem quimioproteômica e após serem classificadas funcionalmente, observou-se que as classes funcionais mais representativas são relacionadas ao metabolismo de aminoácidos, energético e detoxificação. A inibição da atividade enzimática de malato desidrogenase, citrato sintase e piruvato desidrogenase por argentilactona foi confirmada. Além disso, argentilactona induziu a produção de espécies reativas de oxigênio, inibiu síntese de quitina e glicana, bem como o aprisionamento do ciclo celular na fase G0/G1. A partir destes resultados, conclui-se que os compostos Labmol-75, RRF-128 e argentilactona são promissores antifúngicos.

Orientador: Eduardo Bagagli / Resumo: Paracoccidioides spp. são fungos que vivem no ambiente (solo) e em associação com tecidos de hospedeiros mamíferos. Apresentam como característica de patogenicidade o termo-dimorfismo, em que, a 25º C apresenta a fase micelial e produz suas partículas infectantes (conídios) e a 35-37º C está sob forma de leveduras (forma parasitária). As características morfológicas e micromorfológicas são importantes, mas insuficientes para a diferenciação entre os genótipos. Contudo, o avanço no conhecimento da Biologia Molecular nos últimos anos permitiu uma grande compreensão da biologia e das relações filogenéticas de Paracoccidioides spp. A região de ITS1-5.8S-ITS2 (rDNA) tem sido largamente usada na identificação de diversos fungos, sendo muito útil para discriminar entre P. brasiliensis e P. lutzii, no entanto, ela não separa entre as genótipos do complexo P. brasiliensis (S1, PS2, PS3 e PS4), no qual, recentemente foi proposto um rearranjo taxonômico, em que foram descritas como novas espécies de Paracoccidioides: P. brasiliensis para S1, P. americana para PS2, P. restrepiensis para PS3 e P. venezuelensis para PS4. Além do seqüenciamento do ITS, é necessário incluir outras regiões gênicas mais ou menos polimórficas para estudos filogenéticos que visam identificar Paracoccidioides spp. como nesse estudo. Este trabalho teve como objetivo mapear áreas de ocorrência e isolar Paracoccidioides a partir de tatus (Dasypus novemcinctus), bem com detectar molecularmente por Nested-PCR o DNA do... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Submitted by MARLUCE FRANCISCA HRYCYK null (marluce@unemat.br) on 2018-03-23T15:42:38Z No. of bitstreams: 1 Texto final 23 03 18.pdf: 2572888 bytes, checksum: 00a5717448a63a2138d8dbcd62ca9c06 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Pizzani null (luciana@btu.unesp.br) on 2018-03-26T17:45:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 hrycyk_mf_dr_bot.pdf: 2473289 bytes, checksum: 4273a8f7803f0e2dda1dadd73582c9a2 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-26T17:45:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 hrycyk_mf_dr_bot.pdf: 2473289 bytes, checksum: 4273a8f7803f0e2dda1dadd73582c9a2 (MD5) Previous issue date: 2018-03-01 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso (FAPEMAT) / Paracoccidioides spp. são fungos que vivem no ambiente (solo) e em associação com tecidos de hospedeiros mamíferos. Apresentam como característica de patogenicidade o termo-dimorfismo, em que, a 25º C apresenta a fase micelial e produz suas partículas infectantes (conídios) e a 35-37º C está sob forma de leveduras (forma parasitária). As características morfológicas e micromorfológicas são importantes, mas insuficientes para a diferenciação entre os genótipos. Contudo, o avanço no conhecimento da Biologia Molecular nos últimos anos permitiu uma grande compreensão da biologia e das relações filogenéticas de Paracoccidioides spp. A região de ITS1-5.8S-ITS2 (rDNA) tem sido largamente usada na identificação de diversos fungos, sendo muito útil para discriminar entre P. brasiliensis e P. lutzii, no entanto, ela não separa entre as genótipos do complexo P. brasiliensis (S1, PS2, PS3 e PS4), no qual, recentemente foi proposto um rearranjo taxonômico, em que foram descritas como novas espécies de Paracoccidioides: P. brasiliensis para S1, P. americana para PS2, P. restrepiensis para PS3 e P. venezuelensis para PS4. Além do seqüenciamento do ITS, é necessário incluir outras regiões gênicas mais ou menos polimórficas para estudos filogenéticos que visam identificar Paracoccidioides spp. como nesse estudo. Este trabalho teve como objetivo mapear áreas de ocorrência e isolar Paracoccidioides a partir de tatus (Dasypus novemcinctus), bem com detectar molecularmente por Nested-PCR o DNA do fungo em amostras de solo e nos órgãos (baço, fígado e linfonodos mesentéricos) de tatus. Nós isolamos o fungo de tatus do Sudeste (Botucatu/SP) e Centro-Oeste (Alta Floresta/MT). Todos os isolados foram caracterizados molecularmente pelo seqüenciamento ITS-rDNA e gp43 exon 2 e por PCR-RFLP de alfa tubulina (tub1) como P. brasiliensis e P. americana. A reação de Nested-PCR foi sensível e permitiu detectar o DNA de Paracoccidioides nas amostras de tecido (baço, fígado e linfonodos mesentéricos) de D. novemcinctus e também no solo dos Estados de São Paulo e Mato Grosso. A construção filogenética com os amplicons ambientais de solo mostrou que P. lutzii está amplamente presente nessas regiões (Sudeste e Centro-Oeste), além do que, amplicons de P. lutzii de Alta Floresta/MT clusterizaram em um clado separadamente, sugerindo que espécies crípticas podem existir, dentro de P. lutzii. / Paracoccidioides spp. are fungi that live in the environment (soil) and in association with tissues of mammalian hosts. They present as a characteristic of pathogenicity the thermo - dimorphism, in which, at 25º C it presents the m ycelial phase and produces its infective particles (conidia) and at 35 - 37º C it is in the form of yeasts (parasitic form). The morphological and micromorphological characteristics are important, but insufficient for the differentiation between the genotype s. However, the advance in the knowledge of Molecular Biology in recent years has allowed a great understanding of the biology and phylogenetic relationships of Paracoccidioides spp. The region of ITS1 - 5.8S - ITS2 (rDNA) has been widely used in the identific ation of several fungi, in which it is very useful in the discrimination between P. brasiliensis and P. lutzii , however, it does not separate between genotypes of the complex P. brasiliensis (S1, PS2, PS3 and PS4), in which recently a taxonomic rearrangeme nt was proposed, described as new species of Paracoccidioides : P. brasiliensis for S1, P. americana for PS2, P. restrepiensis for PS3 and P. venezuelensis for PS4 . In addition to the sequencing of ITS, it is necessary to include other more or less polymorp hic gene regions for phylogenetic studies aimed at identifying Paracoccidioides spp. as in this study . The objective of this work was to map out occurrence areas and isolate Paracoccidioides from armadillos ( Dasypus novemcinctus ), as well as molecularly de tect the DNA of the fungus in soil samples and organs (spleen, liver and mesenteric lymph nodes) by Nested - PCR . We isolated the armadillo fungus from the Southeast (Botucatu / SP) and Central West (Alta Floresta / MT). All isolates were molecularly charac terized by ITS - rDNA and gp43 exon 2 sequencing and by alpha tubulin (tub1) PCR - RFLP as P. brasiliensis and P. americana . The Nested - PCR reaction was sensitive and allowed to detect the DNA of Paracoccidioides in tissue samples (spleen, liver and mesenteric lymph nodes) of D. novemcinctus and also in the soil of the States of São Paulo and Mato Grosso. Phylogenetic construction with environmental soil amplicons showed that P. lutzii is widely present in these regions (Southeast and Center - West), in addition, P. lutzii amplicons from Alta Floresta / MT cluster in a clade separately, suggesting that species may exist within P. lutzii .

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-18T11:21:28Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lívia do Carmo Silva - 2014.pdf: 15880202 bytes, checksum: d2325694a6f7dbb08cd06f6d414870ea (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-18T11:24:59Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lívia do Carmo Silva - 2014.pdf: 15880202 bytes, checksum: d2325694a6f7dbb08cd06f6d414870ea (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-18T11:24:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lívia do Carmo Silva - 2014.pdf: 15880202 bytes, checksum: d2325694a6f7dbb08cd06f6d414870ea (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-03-12 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous human mycosis caused by fungi of the genus Paracoccidioides, geographically restricted to Latin America. Inhalation of spores and fragments of mycelia, infective forms of the fungus, is a common route of infection. The PCM treatment is performed with the prolonged administration of antifungal amphotericin B, the class of sulfonamides and azoles, which are toxic. In this sense, there is a need for the identification and characterization of novel targets for antifungal drugs in Paracoccidioides well as the search for new antifungal compounds from natural or obtained by chemical synthesis sources. In order to elucidate the response of Paracoccidiodies the thiosemicarbazide derivative of camphene, analysis of the transcriptional profile of the fungus was performed after 8 hs of contact with thiosemicarbazide. The results demonstrate that Paracoccidioides induced genes related to metabolism, cell cycle and DNA processing, Biogenesis of cellular components, cell transduction / signal, defense communication and virulence, energy, protein synthesis, protein fate (folding, modification, destination mechanism), translation, and proteins not classified. In addition intensely inhibited genes related to protein synthesis. In order to evaluate the biological activity of six compounds synthesized by the reaction of Morita- Baylis- Hillman was realized to minimal inhibitory concentration assays, cytotoxicity and hemolytic potential, interaction with antifungal agents already used in the treatment of PCM. The Morita-Baylis-Hillman adducts interfered on fungal growth in a dose-dependent manner, promoted the decreased activity of mitochondrial dehydrogenases and showed synergistic interaction with bactrim. No hemolytic activity was observed despite the high toxicity found and no inhibition of Malate sintase. The results demonstrate the potential of these compounds as candidates antifungal. / Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose humana granulomatosa sistêmica causada por fungos do gênero Paracoccidioides, geograficamente restrita aos países da América Latina. A inalação de conídios e fragmentos de micélios, formas infectantes do fungo, é a frequente via de infecção. O tratamento da PCM é realizado com a administração por tempo prolongado de antifúngicos anfotericina B, sulfonamidas e da classe dos azólicos, os quais são tóxicos. Nesse sentido, surge a necessidade de identificação e caracterização de novos alvos para drogas antifúngicas em Paracoccidioides bem como a busca de novos compostos antifúngicos obtidos de fontes naturais ou através de síntese química. Com o objetivo de elucidar a resposta de Paracoccidiodies à tiossemicarbazida derivada do canfeno, foi realizada a análise do perfil transcricional do fungo após 8 horas de contato com tiossemicarbazida. Os resultados demonstram que Paracoccidioides induziu genes relacionados ao Metabolismo, ciclo celular e processamento de DNA, Biogêneses de componentes celulares, mecanismo de transdução de comunicação celular / sinal, defesa e virulência, energia, síntese de proteínas, destino de proteínas (Enovelamento, modificação pós-traducional), transcrição e proteínas não classificadas. Em adição inibiu intensamente genes relacionados à síntese proteica. Com o objetivo de conhecer a atividade biológica de seis compostos sintetizados através da reação de Morita-Baylis-Hillman, foi realizado ensaios de concentração inibitória mínima, citotoxidade e potencial hemolítico, interação com antifúngicos já utilizados no tratamento da PCM. Os adutos Morita-Baylis-Hillman interferiram no crescimento do fungo de forma dose-dependente, promoveu a diminuiu a atividade de desidrogenases mitocondriais e apresentou interação sinérgica com Bactrim. Nenhuma atividade hemolítica foi observada apesar da alta toxicidade encontrada e nenhuma inibição da malato sintase. Os resultados demostram a potencialidade destes compostos como candidatos a antifúngicos.

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2016-11-22T16:54:28Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Raisa Melo Lima - 2016.pdf: 5394977 bytes, checksum: 7066675bd31ee0e72d9ecd420ea0d1e7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-11-30T15:46:54Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Raisa Melo Lima - 2016.pdf: 5394977 bytes, checksum: 7066675bd31ee0e72d9ecd420ea0d1e7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-30T15:46:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Raisa Melo Lima - 2016.pdf: 5394977 bytes, checksum: 7066675bd31ee0e72d9ecd420ea0d1e7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-10-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis endemic in Brazil, where are recorded about 80% of cases worldwide, and has Paracoccidioides sp. as the etiologic agent. Malate synthase (MLS) is an important enzyme related to the fungal metabolism, once it is essential in the glyoxylate cycle, a secondary metabolic pathway of the citric acid cycle exclusive to microorganisms and plants. Its absence in humans makes this enzyme an interesting subject to study, mainly in rational drug design. From recent in vitro studies, several interacting proteins of MLS (receiver) were classified, but the modes of interaction and key regions involved in protein-protein interfaces (PPIs) have not yet been described. In this work, six (6) binding proteins (BPs) were selected to describe the IP's of MLS. Their tridimensonal structures, as well as MLS, were predicted by homology modeling using I-TASSER server, and subsequent molecular dynamics simulations (MD). The most common conformational modes of each protein were obtained by cluster analysis of the trajectories generated by MD. Molecular docking simulations using Gramm-X were then performed for the conformational modes of MLS against the BP's, resulting in a total of 36 complexes. Based on the higher frequency of some small fragments of proteins observed in the IPP's, 57 peptides with sizes between 5 and 20 residues, were initially selected from 5 regions of MLS which are considered more frequent in protein-protein interaction. FlexPepDock simulations were performed to optimize the atomic coordinates of the peptide complexed with MLS, and concomitantly, PepFOLD simulations were performed to evaluate the stability of each peptide in solution. Based on the lower energy score of peptides linked to MLS, and the stability of their structures in solution (MLS-free), 6 peptides were selected as promising ligands to MLS mode 1. The stability and patterns of interactions of these peptides were evaluated in detail. / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica no Brasil, onde são registrados cerca de 80% dos casos mundiais, e possui como agente etiológico o fungo Paracoccidioides spp. A Malato sintase (MLS) é uma importante enzima relacionada ao metabolismo fúngico, uma vez que é essencial no ciclo do glioxilato, uma via metabólica importante de produção de glicose para parede celular, sendo exclusiva de micro-organismos e plantas. Sua ausência em humanos a torna um alvo interessante de estudo, principalmente, no desenho racional de fármacos. A partir de recentes estudos in vitro, várias proteínas que interagem com a PbMLS (receptor) foram classificadas, porém os modos de interação e as regiões chaves envolvidas nas interfaces proteína-proteína (IPP’s), não foram ainda descritas. Neste trabalho, 6 (seis) proteínas ligantes (PL) foram selecionadas para verificar suas interações com PbMLS. As estruturas tridimensionais dessas proteínas, bem como de PbMLS, foram preditas por homologia, usando o servidor I-TASSER. Simulações de dinâmica molecular (DM) foram realizadas pelo programa GROMACS, e os modos das conformações mais representativas de cada proteína foram determinados baseando-se nas análises de agrupamentos a partir das trajetórias geradas por DM. Simulações de ancoragem molecular com GRAMM-X foram então realizadas entre os modos conformacionais de PbMLS contra os obtidos de PL’s, resultando num total de 36 complexos. Baseado na frequência maior de alguns pequenos fragmentos de proteínas, observados nas IPP’s, 57 peptídeos de tamanhos entre 5 e 20 resíduos de aminoácidos, foram inicialmente selecionados a partir de 5 regiões da PbMLS consideradas mais frequentes na interação proteína-proteína. Simulações com FlexPepDock foram realizadas para otimizar as coordenadas atômicas dos peptídeos complexados com MLS e, concomitantemente, simulações com PepFOLD foram realizadas para avaliar a estabilidade de cada peptídeo em solução. Com base nos mais baixos scores de energia dos peptídeos ligados a MLS bem como na estabilidade de suas estruturas não ligadas em solução , 5 peptídeos foram selecionados como promissores ligantes ao modo 1 de MLS. A estabilidade e os padrões de interações destes peptídeos são avaliados em detalhes.

Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-09-04T20:22:35Z No. of bitstreams: 1 LucasLuizVieiraDissertacao2016.pdf: 2717272 bytes, checksum: b547db9dacaad5a2da23826b5d215ccb (MD5) / Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-09-04T20:23:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 LucasLuizVieiraDissertacao2016.pdf: 2717272 bytes, checksum: b547db9dacaad5a2da23826b5d215ccb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-04T20:23:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LucasLuizVieiraDissertacao2016.pdf: 2717272 bytes, checksum: b547db9dacaad5a2da23826b5d215ccb (MD5) Previous issue date: 2016-04-14 / Invasive fungal infections are a major public health problem in the world, since they increase morbidity and patients??? hospitalization time. In Brazil, the highest mortality rate among the systemic mycoses is caused by an endemic disease named paracoccidioimycosis, which the etiologic agent is the dimorphic fungus Paracoccidioides spp. The worldwide increased resistance to the commercially available antifungal agents, their limited spectrum of activity against some fungal pathogens and concerns with their toxic side effects are reasonable evidence of the necessity of novel therapeutic strategies, especially the development of new antifungal agents. Thus, the essential gene rim8 was identified by comparative genomics as an orthologous sequence in the genome of human pathogenic fungi absent in the human genome. In filamentous fungi and yeasts, gene expression regulation by the ambient pH involves components of a signaling pathway that mediate proteolytic activation of the transcription factor PacC/Rim101 in response to alkaline environmental pH. The rim8 gene in yeasts, also called palF in filamentous fungi, performs an essential step in this signaling pathway. It is important for host-pathogen interaction, leading to increased virulence and pathogen survival. Thus, Rim8 is a very interesting and promising drug target. The aim of this work is to optimize heterologous expression and purification of Rim8 protein from P. luzii to further perform its structural and functional characterization and also, to use it as a molecular target for drugs development. The rim8 gene was chemically synthesized with a histidine tag and cloned into a pET-21a vector. Heterologous expression of the gene was made using two strains of E. coli, obtaining the best conditions using LB medium with 0.5% glucose at 30 ??C for 2 hours and 0.25 mM IPTG and adding protease inhibitor cocktail. The Rim8 heterologous protein was purified using a nickel affinity chromatography column. Expression and purification results were analyzed by SDS-PAGE and in some cases, confirmed by western blot. Immunization of BALB/c mice was performed with the purified protein to obtain anti- Rim8 antibodies. The antibody production was confirmed by ELISA test. The protein immunocitolocalization in P. lutzii cells showed a difuse protein-plasma membrane association at acidic pH. At neutral pH the fluorescence pattern is showed as localized foci in plasma membrane and later, with extracellular alcalinization, it migrates into the cytosol. Thus, it can be inferred that this work gives some contribution to the development of new antifungal drugs, but still must undergo further production steps, proteolysis reduction and protein purification to allow structural and functional characterization of Rim8. / Infec????es f??ngicas invasivas s??o um problema de sa??de p??blica no mundo, j?? que aumentam a morbidade e o tempo de interna????o de pacientes. A micose sist??mica com o maior ??ndice de mortalidade no Brasil, onde ?? considerada end??mica, ?? a paracoccidioidomicose, causada pelo fungo dim??rfico Paracoccidioides spp. A tend??ncia global de aumento da resist??ncia aos agentes antif??ngicos dispon??veis comercialmente, o espectro limitado de atividade contra alguns fungos patog??nicos e a preocupa????o com a toxicidade s??o evid??ncias da necessidade de novas estrat??gias terap??uticas, sobretudo do desenvolvimento de novas drogas antif??ngicas. Nesse sentido, o gene essencial rim8 foi identificado por gen??mica comparativa como uma sequ??ncia ort??loga no genoma de fungos patog??nicos humanos e ausente em humanos. Em fungos filamentosos e leveduras, a regula????o da express??o g??nica pelo pH envolve componentes de uma via de sinaliza????o que levam ?? ativa????o proteol??tica do fator de transcri????o PacC/Rim101 em resposta ?? alcaliniza????o do pH externo. O gene rim8 em leveduras ou palF em fungos filamentosos possui um papel essencial nessa cascata de sinaliza????o, sendo importante para a intera????o pat??geno-hospedeiro, aumento de virul??ncia e sobreviv??ncia do pat??geno. Por isso, Rim8 ?? um alvo molecular promissor e bastante interessante para o desenvolvimento de drogas. O objetivo deste trabalho ?? otimizar a express??o heter??loga e purifica????o da prote??na Rim8 de P. lutzii, visando realizar a caracteriza????o estrutural e funcional da prote??na para futuramente utiliz??-la como alvo molecular para o desenvolvimento de drogas. O gene rim8 foi sintetizado quimicamente com cauda de histidinas e foi clonado em vetor pET-21a. A express??o heter??loga do gene foi padronizada usando duas estirpes de E. coli, obtendo as melhores condi????es para purifica????o com o uso de meio LB contendo 0,5% de glicose a 30??C por 2 h e 0,25 mM de IPTG e coquetel de inibidores de proteases. Os resultados da express??o e purifica????o foram analisados por SDS-PAGE e/ou confirmados por western blot. Realizou-se a imuniza????o de camundongos BALB/c com a prote??na purificada para obten????o de anticorpos anti-Rim8. A produ????o dos anticorpos foi confirmada por ELISA. A imunocitolocaliza????o em c??lulas de P. lutzii mostrou que a prote??na se encontra associada ?? membrana plasm??tica de forma difusa em pH ??cido, em seguida apresenta focos localizados em resposta a um pH pr??ximo da neutralidade e, por fim, migra para o interior da c??lula em pH alcalino. Sendo assim, pode-se inferir que o trabalho apresenta contribui????es para o desenvolvimento de novas drogas antif??ngicas, al??m de auxiliar o entendimento do processo biol??gico no qual a prote??na RIM8 est?? envolvida.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2017-09-21T20:27:37Z No. of bitstreams: 2 Tese - Fabiana Ribeiro da Mata - 2017.pdf: 5224228 bytes, checksum: 062f7a43994431350fa0acd55b4f076c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-09-22T11:44:01Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Fabiana Ribeiro da Mata - 2017.pdf: 5224228 bytes, checksum: 062f7a43994431350fa0acd55b4f076c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-22T11:44:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Fabiana Ribeiro da Mata - 2017.pdf: 5224228 bytes, checksum: 062f7a43994431350fa0acd55b4f076c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-04-13 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Members of the genus Paracoccidioides are known pathogens of humans that can be isolated from different infection sites. To investigate the expression rates of proteins expressed by different isolates, of the genus Paracoccidioides, including one isolate of P. lutzii (Pb01), and three isolates of P. brasiliensis (Pb03, Pb339 and PbEPM83) using sodium acetate, as carbon source, proteins quantities were determined using label-free and data independent LC-MSE. Statistical analysis provided the comparison of proteins profiles in the isolates. A total of 1160, 1211, 1280 and 1462 proteins were reproducibly identified, and relatively quantified in P. lutzii e P. brasiliensis isolates Pb03, Pb339 e PbEPM83, respectively. Notably, a total of 526, 435, 744 and 747 proteins were differentially expressed among P. lutzii and the P. brasiliensis isolates Pb03, Pb339 and PbEPM83, respectively with a fold change equal or higher than 1.5. The analysis revealed the reorganization of metabolism through the induction of proteins related to gluconeogenesis, stress response and amino acid degradation in the four isolates evaluated. The differences between the isolates were observed as follows: greater increases in the expression levels of proteins belonging to the cycle of glyoxalate, TCA and respiratory chain, ethanol production and β-oxidation were observed in the isolatesPPEPM83 and Pb01; Cyclic and cyclocyclic proteins of the methylcitrate were induced in Pb339. Proteomic profiles indicate that the four isolates reorganize the metabolism for the use of acetate as a carbon source. / Membros do gênero Paracoccidioides são patógenos conhecidos de seres humanos que podem ser isolados de diferentes locais de infecção. Para investigar as taxas de expressão das proteínas expressas por diferentes isolados, do gênero Paracoccidioides, incluindo um isolado de P. lutzii (Pb01) e três isolados de P. brasiliensis (Pb03, Pb339 e PbEPM83) usando acetato de sódio, como fonte de carbono, As quantidades de proteínas foram determinadas usando o uso de LC-MSE independente de etiquetas e de dados. A análise estatística proporcionou a comparação de perfis de proteínas nos isolados. Um total de 1160, 1211, 1280 e 1462 proteínas foram identificadas de forma reprodutiva, e relativamente quantificadas em isolados de P. lutzii e P. brasiliensis Pb03, Pb339 e PbEPM83, respectivamente. Nomeadamente, um total de 526, 435, 744 e 747 proteínas foram diferencialmente expressas entre P. lutzii e os isolados de P. brasiliensis Pb03, Pb339 e PbEPM83, respectivamente, com uma mudança de dobra igual ou superior a 1,5. A análise revelou a reorganização do metabolismo através da indução de proteínas relacionadas à gliconeogênese, resposta ao estresse e degradação de aminoácidos nos quatro isolados avaliados. As diferenças entre os isolados foram observadas como segue: maiores aumentos nos níveis de expressão de proteínas pertencentes ao ciclo do glioxalato, TCA e cadeia respiratória, produção de etanol e β-oxidação foram observadas nos isoladosnPbEPM83 e Pb01; As proteínas do ciclo da e do ciclo do metilcitrato apresentaram induzidas no Pb339. Os perfis proteômicos indicam que os quatro isolados reorganizam o metabolismo para o uso do acetato como fonte de carbono.