Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-18T11:21:28Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lívia do Carmo Silva - 2014.pdf: 15880202 bytes, checksum: d2325694a6f7dbb08cd06f6d414870ea (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-18T11:24:59Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lívia do Carmo Silva - 2014.pdf: 15880202 bytes, checksum: d2325694a6f7dbb08cd06f6d414870ea (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-18T11:24:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lívia do Carmo Silva - 2014.pdf: 15880202 bytes, checksum: d2325694a6f7dbb08cd06f6d414870ea (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-03-12 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous human mycosis caused by fungi of the genus Paracoccidioides, geographically restricted to Latin America. Inhalation of spores and fragments of mycelia, infective forms of the fungus, is a common route of infection. The PCM treatment is performed with the prolonged administration of antifungal amphotericin B, the class of sulfonamides and azoles, which are toxic. In this sense, there is a need for the identification and characterization of novel targets for antifungal drugs in Paracoccidioides well as the search for new antifungal compounds from natural or obtained by chemical synthesis sources. In order to elucidate the response of Paracoccidiodies the thiosemicarbazide derivative of camphene, analysis of the transcriptional profile of the fungus was performed after 8 hs of contact with thiosemicarbazide. The results demonstrate that Paracoccidioides induced genes related to metabolism, cell cycle and DNA processing, Biogenesis of cellular components, cell transduction / signal, defense communication and virulence, energy, protein synthesis, protein fate (folding, modification, destination mechanism), translation, and proteins not classified. In addition intensely inhibited genes related to protein synthesis. In order to evaluate the biological activity of six compounds synthesized by the reaction of Morita- Baylis- Hillman was realized to minimal inhibitory concentration assays, cytotoxicity and hemolytic potential, interaction with antifungal agents already used in the treatment of PCM. The Morita-Baylis-Hillman adducts interfered on fungal growth in a dose-dependent manner, promoted the decreased activity of mitochondrial dehydrogenases and showed synergistic interaction with bactrim. No hemolytic activity was observed despite the high toxicity found and no inhibition of Malate sintase. The results demonstrate the potential of these compounds as candidates antifungal. / Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose humana granulomatosa sistêmica causada por fungos do gênero Paracoccidioides, geograficamente restrita aos países da América Latina. A inalação de conídios e fragmentos de micélios, formas infectantes do fungo, é a frequente via de infecção. O tratamento da PCM é realizado com a administração por tempo prolongado de antifúngicos anfotericina B, sulfonamidas e da classe dos azólicos, os quais são tóxicos. Nesse sentido, surge a necessidade de identificação e caracterização de novos alvos para drogas antifúngicas em Paracoccidioides bem como a busca de novos compostos antifúngicos obtidos de fontes naturais ou através de síntese química. Com o objetivo de elucidar a resposta de Paracoccidiodies à tiossemicarbazida derivada do canfeno, foi realizada a análise do perfil transcricional do fungo após 8 horas de contato com tiossemicarbazida. Os resultados demonstram que Paracoccidioides induziu genes relacionados ao Metabolismo, ciclo celular e processamento de DNA, Biogêneses de componentes celulares, mecanismo de transdução de comunicação celular / sinal, defesa e virulência, energia, síntese de proteínas, destino de proteínas (Enovelamento, modificação pós-traducional), transcrição e proteínas não classificadas. Em adição inibiu intensamente genes relacionados à síntese proteica. Com o objetivo de conhecer a atividade biológica de seis compostos sintetizados através da reação de Morita-Baylis-Hillman, foi realizado ensaios de concentração inibitória mínima, citotoxidade e potencial hemolítico, interação com antifúngicos já utilizados no tratamento da PCM. Os adutos Morita-Baylis-Hillman interferiram no crescimento do fungo de forma dose-dependente, promoveu a diminuiu a atividade de desidrogenases mitocondriais e apresentou interação sinérgica com Bactrim. Nenhuma atividade hemolítica foi observada apesar da alta toxicidade encontrada e nenhuma inibição da malato sintase. Os resultados demostram a potencialidade destes compostos como candidatos a antifúngicos.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2017-09-21T19:58:03Z No. of bitstreams: 2 Tese - Fernanda Craveiro Franco - 2017.pdf: 4803005 bytes, checksum: 35b5c5c99f5a0689a4c30ebe8ea513cd (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-09-22T11:38:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Fernanda Craveiro Franco - 2017.pdf: 4803005 bytes, checksum: 35b5c5c99f5a0689a4c30ebe8ea513cd (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-22T11:38:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Fernanda Craveiro Franco - 2017.pdf: 4803005 bytes, checksum: 35b5c5c99f5a0689a4c30ebe8ea513cd (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-09-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The interaction of some compounds and DNA molecule can cause genotoxic changes. The tests used to evaluate genotoxicity have evolved over the years, and they have great efficiency. Currently, several traditional methodologies are used, such as the comet assay, and some more modern, based on molecular biology. Considering the importance of detecting the effects caused by exposure to potentially genotoxic agents, this thesis presents three chapters with different approaches to this topic. The first chapter aimed at evaluating published studies on the mutagenic, genotoxic and oxidative effects caused by occupational exposure to pesticides. For this, a systematic review of articles published between the years of 2011 and 2015 was carried out, focusing on these exposure conditions. The results showed that 44% of the studies addressed only men and 44% approached men and women, and 78% used rural workers as an exposed population. The most evaluated class of pesticide was organophosphorus. The studies were separated by methodologies of analysis used and all showed some type of alteration in the populations occupationally exposed to pesticides. The second chapter, published in the journal Environmental Science and Pollution Research, considered the dengue scene in the state of Goias and techniques of mosquitoes control, and sought to understand the genotoxic effects caused by exposure of endemic agents to pesticides used against Aedes aegypti, being the first study published with this group of workers. The main pesticides used were insecticides and larvicides and an increase in DNA damage was observed in the exposed population, without influence of the lifestyle factors. In the whole transcriptome assay the differential expression of genes related to various chronic diseases was observed. Finally, the third chapter was carried out in collaboration with the Institute of Experimental Medicine of the Czech Academy of Sciences, aiming the determination of cytotoxic and genotoxic effects caused by in vitro exposure to different types of metallic nanomaterials. In nanomaterials that showed cell viability reduction (cytotoxic), an increase in genotoxicity was also identified. In addition, three of the four non-cytotoxic nanomaterials evaluated showed genotoxic effects. Studies aimed at detecting the compounds genotoxic potential are extremely important for the regulatory definition and identification of risks caused by exposure. In this study, the toxicological and genotoxic effects of different compounds and mixtures were evaluated using traditional and modern techniques, in vitro or by human biomonitoring, seeking to understand and determine the risks involved in exposure to these substances. / Compostos que interagem com a molécula de DNA podem provocar alterações genotóxicas. Os testes utilizados para avaliação de genotoxicidade evoluíram ao longo dos anos, apresentando grande eficiência. Atualmente, utilizam-se várias metodologias tradicionais, como o ensaio cometa, e também algumas mais modernas, baseadas na biologia molecular. Considerando a importância de detectar os efeitos causados pela exposição a agentes potencialmente genotóxicos, essa tese apresenta três capítulos com formas de abordagem distintas, referente a essa temática. O primeiro capítulo visou a avaliação de estudos publicados acerca dos efeitos mutagênicos, genotóxicos e oxidativos causados pela exposição ocupacional a pesticidas pela realização uma revisão sistemática de artigos publicados entre os anos de 2011 a 2015. Observou-se que 44% dos estudos abordaram exclusivamente indivíduos do sexo masculino e 44% abordaram ambos os sexos, e 78% utilizaram trabalhadores rurais como população exposta. A classe de pesticida mais avaliada foi a de organofosforado. Os estudos foram separados por metodologias de análise utilizada e todos apresentaram algum tipo de alteração nas populações expostas a pesticidas no ambiente de trabalho. O segundo capítulo, publicado na revista Environmental Science and Pollution Research, considerou o cenário da dengue no estado de Goiás e as formas de combate ao mosquito, e buscou compreender os efeitos genotóxicos causados pela exposição de Agentes de combate a endemias aos pesticidas utilizados contra o mosquito, sendo o primeiro estudo publicado com esse grupo de trabalhadores na região centro-oeste. Os principais pesticidas utilizados foram inseticidas e larvicidas e foi observado um aumento no dano ao DNA na população exposta, sem influência dos fatores relacionados ao estilo de vida. No ensaio de transcritoma foi observada a expressão diferencial de genes relacionados a diversas doenças crônicas. Finalmente, o terceiro capítulo foi realizado em colaboração com o Instituto de Medicina Experimental, da Academia Tcheca de Ciências, visando a determinação de efeitos citotóxicos e genotóxicos, causados pela exposição in vitro a diferentes tipos de nanomateriais metálicos. Nos nanomateriais que apresentaram redução na viabilidade celular (citotóxicos) também foi identificado aumento na genotoxicidade. Além disso, três dos quatro nanomateriais não citotóxicos avaliados apresentaram efeitos genotóxicos. Estudos que visam detectar o potencial gentoxicológico de compostos são de extrema importância para definição de normas e regulamentações de aplicação e identificação dos riscos causados pela exposição. Nesse estudo, foram avaliados os efeitos toxicológicos e genotóxicos de diferentes compostos e misturas, com a utilização de técnicas tradicionais e modernas, in vitro ou por biomonitoramento humano, buscando compreender e determinar os riscos envolvidos na exposição a essas substâncias.

As bases genéticas e moleculares da resistência de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) a lufenuron foram exploradas no presente estudo. Inicialmente, uma linhagem de S. frugiperda resistente a lufenuron foi selecionada a partir de uma população coletada na cultura do milho na região de Montevidiu-GO com intenso uso desse inseticida. As curvas de concentração-resposta a lufenuron para as linhagens de S. frugiperda suscetível (SUS) e resistente (LUF-R) a lufenuron foram caracterizadas pelo método de bioensaio com tratamento superficial da dieta artificial. As CL50 (I.C. 95%) estimadas para as linhagens SUS e LUF-R foram de 0,23 (0,18 - 0,28) e 210,6 (175,90 - 258,10) ?g de lufenuron.mL-1 respectivamente, com razão de resistência de ? 915 vezes. A partir dos resultados de cruzamentos recíprocos entre as linhagens SUS e LUF-R, concluiu-se que a herança da resistência de S. frugiperda a lufenuron é autossômica e incompletamente recessiva. Os testes de retrocruzamentos da progênie F1 de cruzamentos recíprocos com o parental LUF-R demonstraram um efeito poligênico para a resistência, com a estimativa do número mínimo de segregações independentes entre 1,54 e 1,71, indicando que o número de loci associado à resistência é baixo. Para conhecer o perfil de transcritos de lagartas de S. frugiperda e avaliar o padrão de expressão gênica diferencial entre lagartas da linhagem LUF-R em comparação ao de lagartas da linhagem SUS, buscando identificar o(s) mecanismo(s) de resistência a lufenuron, foram utilizadas novas tecnologias de sequenciamento em larga escala. Para isso, foram utilizados sequenciamentos de quatro bibliotecas de cDNA (plataforma HiScan 1000, Illumina©) obtidas de lagartas de 4º ínstar de S. frugiperda das linhagens LUF-R e SUS, induzidas ou não com lufenuron. O transcritoma foi construído utilizando aproximadamente 19,6 milhões de leituras single-end, o que gerou 18.506 transcritos, com N50 de 996 pb. A pesquisa contra o banco de dados nr (NCBI) proporcionou anotação funcional de 51,1% (9.457) dos transcritos obtidos, grande parte dos alinhamentos apresentaram homologia a insetos, com o maior número deles (45%) se assemelhando aos de Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae), enquanto 10% se assemelharam a sequências de diversas espécies do gênero Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae), sendo 3% dos alinhamentos obtidos contra sequências de Spodoptera frugiperda. A análise comparativa da expressão gênica entre lagartas de S. frugiperda resistente e suscetível a lufenuron identificou 1.224 transcritos expressos diferencialmente (p <= 0,05, teste t; expressão relativa > 2). Sete destes transcritos foram associados ao metabolismo da cutícula, sendo cinco deles superexpressos na linhagem LUFR. O metabolismo de detoxificação apresentou 48 transcritos expressos diferencialmente, dos quais foram identificados 40 transcritos associados às monooxigenases P450, cinco a glutationa-S-transferase, dois às carboxilesterases e um a esterase. Foi observado que 39 dos 48 transcritos associados ao metabolismo de detoxificação foram superexpressos na linhagem resistente. Este padrão foi confirmado a partir da expressão relativa utilizando \"PCR quantitativa em Tempo Real - qPCR\". Estes resultados representam um importante passo para o entendimento dos mecanismos moleculares da resistência de S. frugiperda a lufenuron, proporcionando, ainda, uma visão mais ampla do perfil de expressão gênica de insetos a inseticidas. / The genetic and molecular basis of resistance to lufenuron in Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) were exploited in this study. The resistant population of S. frugiperda was selected from a population collected in Montevidiu, Goiás. Initially, a luferunon-resistant strain of S. frugiperda was selected from a population collected in cornfields located in Montevidiu, Goiás State, Brazil, with intense use of this insecticide. The diet surface treatment bioassay was used to characterize the concentration-response to lufenuron in the susceptible (SUS) and resistant (LUF-R) strains of S. frugiperda. The estimated LC50s (95% C.I.) for the SUS and LUF-R strains were 0.23 (0.18 - 0.28) and 210.6 (175.90 - 258.10) ?g of lufenuron.mL-1 respectively, with resistance ratio of ? 915-fold. Based on reciprocal crosses between SUS and LUF-R strains, the inheritance of S. frugiperda resistance to lufenuron was incomplete autosomal recessive. Backcrosses between F1 of the reciprocal crosses and the parental LUF-R revealed a polygenic resistance, with an estimation of the minimum number of resistance genes from 1.54 to 1.71, indicating that the number of loci associated to resistance is low. Then, a new high-throughput cDNA sequencing technologies was explored to characterize the transcriptional profile of larvae of Spodoptera frugiperda, and to compare the differential gene expression between resistant and susceptible strains of S. frugiperda to lufenuron in order to identify the resistance mechanism(s) involved. Four cDNA libraries obtained from fourth instars of the resistant (LUF-R) and the susceptible (SUS) S. frugiperda strains, exposed or not to lufenuron, were sequenced in a HiScan1000® platform (Illumina©). The transcriptome was de novo assembled using nearly 19.6 million single-end reads, leading to 18,506 transcripts with a N50 of 996 bp in length. A Blast search against the non-redundant database available in NCBI allowed the functional annotation of 51.1% (9,457) of the obtained transcripts. Most of these transcripts aligned with insect sequences, and a majority of them (45%) with Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae). Nearly 10% of the transcripts aligned with species belonging to Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae), with 3% of the alignments matching sequences from Spodoptera frugiperda. Differential gene expression analysis between the resistant and the susceptible strains identified 1,224 differentially expressed transcripts (p <= 0.05, t-test; fold change > 2). Seven of them were associated with the cuticle metabolism, and five out seven were up-regulated in the resistant strain (LUF-R). A large set of transcripts (48) associated with the detoxification metabolism was differentially expressed; 40 P450 monooxygenases, five glutathione-Stransferases, two carboxylesterase and one esterase were identified. Thirty-nine out of these 48 transcripts were up-regulated in the resistant strain. Gene expression data obtained by RNA-Seq analysis was validated by quantitative real time PCR (qPCR) of several selected target transcripts. These results represent an important step toward the understanding of the molecular mechanisms of resistance of S. frugiperda to lufenuron, and provide a broader view on the gene expression profile of insects to insecticides.

O fitopatógeno Xylella fastidiosa coloniza o lúmen dos vasos do xilema de seus hospedeiros e o aparelho bucal do inseto-vetor. É responsável por doenças de extrema gravidade em videira, laranjeira, e oliveira, entre outras plantas de relevância econômica. Há evidência de especificidade entre cepas de X. fastidiosa e as diferentes espécies de plantas que colonizam, mas as bases moleculares desta interação são desconhecidas. O objetivo central deste trabalho foi elucidar o repertório completo de genes expressos e/ou diferencialmente expressos por diferentes cepas X. fastidiosa em meios e tempos de cultivo distintos e relacionar as respostas transcricionais a mecanismos de virulência, patogenicidade e especificidade ao hospedeiro. Foram sequenciados, analisados e comparados os transcritomas de cepas de laranjeiras (9a5c, J1a12, U24d e Fb7), de cafeeiro (3124), de hibisco (Hib4), ameixeira (Pr8x) e de videira (Temecula1), no início e fim da fase a exponencial de crescimento populacional em meio rico PWG e em meio mínimo PIM6, que mimetiza a seiva do xilema. Foi observado que a maioria dos genes de X. fastidiosa é expressa, ainda que, dependendo da cepa e da condição experimental, 40-80% dos transcritos sejam pouco abundantes. Por outro lado, foi verificado um conjunto de transcritos muito abundantes, uma parte deles comuns a todas as cepas, e que incluem os ncRNAs 6S e RNAse P, além de transcritos de microcinas, proteases, lipases, proteínas de resposta a estresse e proteínas de função desconhecida. Além da definição de perfis transcricionais, foram descritas as regiões 5\' e 3\' não-traduzidas dos transcritos. As estruturas de 545 e 386 operons expressos, respectivamente pelas cepas 9a5c e Temecula1, também foram mapeadas, e pela primeira vez foi obtido o perfil de sRNAs expressos por X. fastidiosa. As análises de expressão diferencial entre transcritomas das duas fases de crescimento no mesmo meio indicam que o estresse gerado pela limitação nutricional do meio PIM6 exigiu mudanças mais drásticas na expressão gênica do que no meio PWG. Foi também observado que diferentes cepas respondem de maneiras distintas a uma mesma condição, indicando que genes ortólogos são regulados de formas diferentes. Além disso, a transcritômica comparativa revelou diferenças relevantes na regulação gênica de cepas de hospedeiros vegetais distintos que podem estar relacionadas à especificidade ao hospedeiro. Por fim, as análises dos transcritomas evidenciaram vários genes candidatos que poderão ser futuramente investigados quanto ao seu papel na biologia e na virulência de X. fastidiosa. / The phytopathogenXylella fastidiosa colonizes the lumen of xylem vessels from its hosts and the mouth apparatus of the insect-vector. It is responsible for severe diseases in grapevine, orange and olive trees, among other plants of economic relevance. There is evidence for specificity between X. fastidiosa strains and the different plant species they colonize, but the molecular bases of this interaction are unknown. The main objective of this work was elucidate the complete repertoire of expressed and/or differentially expressed genes by different X. fastidiosa strains in distinct media and growth times and associate transcriptional responses to virulence mechanisms, pathogenicity and host specificity. Transcriptomes of orange strains (9a5c, J1a12, U24d and Fb7), coffee (3124), hibiscus (Hib4), plum (Pr8x) and grapevine (Temecula1), were sequenced, analyzed and compared from cells at the beginning and end stages of exponential growth phase in rich medium PWG and in minimum medium PIM6, which mimics xylem sap. It was observed that the majority of X. fastidiosa genes is expressed, although, depending of the strain and experimental condition, 40-80% of transcripts are less abundant. On the other hand, it was verified a set of more abundant transcripts, some of them shared by all strains, including 6S and RNAse P ncRNAs as well as transcripts for microcins, proteases, lipases, stress response proteins and proteins of unknown function. Besides the definition of transcriptional profiles, 5\' and 3\' untranslated regions of transcripts were described. The structure of 545 and 386 expressed operons, respectively for 9a5c and Temecula1 strains, were also mapped, and for the first time the expressed profile of sRNAs in X. fastidiosa was obtained. The differential expression analyzes between transcriptomes of two growth phases in the same medium indicate that the stress generated by nutritional limitation of PIM6 medium required more drastic changes in gene expression than PWG medium. It was also observed that different strains respond in distinct manners to a same condition, indicating that orthologous genes are regulated in different ways. Moreover, comparative transcriptomics revealed relevant differences in gene regulation of strain of distinct plant hosts that can be related to host specificity. Lastly, transcriptomic analyzes pointed to several gene candidates that could be further investigated for their roles in X. fastidiosa biology and virulence.

A dengue é uma infecção viral sistêmica que pode se manifestar clinicamente de diversas formas, desde febres leves a hemorragia e síndrome do choque, condições potencialmente fatais. Diversos estudos já foram publicados investigando as mudanças globais de expressão que ocorrem durante a evolução da doença nesses diferentes quadros clínicos. Porém, nenhum desses estudos analisou o papel dos RNAs não codificadores longos (lncRNAs) na progressão da doença. Neste projeto, foi realizada uma metanálise dos dados de expressão provenientes desses estudos de dengue focando na expressão de lncRNAs e seus possíveis mecanismos de regulação gênica. Foram identificados dezenas de lncRNAs cuja expressão aumenta ou diminui em pacientes infectados com dengue comparado com pessoas saudáveis. Através de análise de \"guilty-by-association\", procurou-se identificar genes codificadores de proteína possivelmente regulados por esses lncRNAs ou genes que os regulem. Nossos resultados fornecem evidência de novos mecanismos de regulação entre lncRNAs e mRNAs. / Dengue fever is a systemic viral infection that can manifest clinically in a variety of ways, from mild fever to potentially fatal conditions such as hemorrhage and shock syndrome. Several studies have already been published investigating the global changes in expression that occur during the evolution of the disease in these different clinical settings. However, none of these studies analyzed the role of long non-coding RNAs (lncRNAs) in disease progression. In this project, we performed a meta-analysis of transcriptome data obtained from these dengue studies and focused on the expression of lncRNAs and their possible mechanisms of gene regulation. Dozens of lncRNAs have been identified whose expression increases or decreases in patients infected with dengue compared to healthy individuals. Through guilty-by-association analysis, we identified several lncRNAs that possibly regulate protein coding genes. Our results provide evidence of novel regulatory mechanisms between lncRNAs and mRNAs.

A caracterização em larga escala do transcritoma de diferentes organismos revelou um cenário complexo da expressão gênica, levando a identificação de inúmeros transcritos produzidos ao longo dos genomas de eucariotos e procariotos. Esse fenômeno recebeu o nome de transcrição pervasiva e tem sido fonte de estudos na busca de novos RNAs com importâncias regulatórias e também transcritos envolvidos na tradução de proteínas ainda não caracterizadas. A abundância de dados de transcritômica e proteômica, além de informações completas a respeito do genoma, fazem do extremófilo halofílico Halobacterium salinarum, um organismo modelo ideal para os estudos da transcrição pervasiva. Esse micro-organismo pertence ao grupo Archaea, o último dos três domínios da vida a ser descrito e com características compartilhadas entre bactérias e eucariotos. Através do uso da técnica de differential RNA-seq (dRNA-seq), a qual permite a distinção entre transcritos primários e processados, identificamos 179 TSSaRNAs em H. salinarum, esses pequenos RNAs estão associados ao início de transcrição e ainda não haviam sido descritos em archaea. A aplicação do dRNA-seq em amostras de RNA extraídas ao longo da curva de crescimento permitiu a identificação de 4540 TSS no genoma de H. salinarum NRC-1. Parte desses inícios de transcrição está localizada upstream a genes conhecidos, permitindo a identificação de inícios de transcrição em 1545 genes. 59,2% desses inícios de transcrição estão localizados até 10 pb. de distância do códon de início de tradução, confirmando a ausência de regiões UTRs em grande parte dos genes. A análise de expressão, em diferentes condições, das regiões relacionadas a inícios de transcrição antisense a genes revelou que a maioria dessas regiões apresenta um perfil de expressão correlacionado com os genes na fita oposta, indicando um possível papel regulatório desses transcritos. De forma similar, a análise da expressão de inícios de transcrição intergênicos permitiu a identificação de 132 regiões diferencialmente expressas e que não estão relacionadas a nenhum outro elemento no genoma de H. salinarum NRC-1. A análise comparativa com dados de proteômica revela que algumas dessas regiões podem estar envolvidas com a produção de pequenas proteínas. Além disso, a identificação de 1365 inícios de transcrição internos a genes sugere que a produção de transcritos intragênicos (intraRNAs) seja um fenômeno amplamente distribuído no genoma desse halófilo. Experimentos de Northern blot confirmaram a produção de um transcrito correspondente a porção final do gene VNG_RS05220, e experimentos de Western blot revelaram que a tradução desses intraRNAs é responsável pela produção de pequenas proteínas correspondentes a domínios proteicos individuais, com importante papel funcional em condições específicas de crescimento. A análise de inícios de transcrição upstream a regiões codificantes de domínios similares em bactérias e outras archaea sugere que a produção de intraRNAs codificantes é um fenômeno amplamente distribuído em procariotos e pode ser responsável pelo aumento da diversidade do proteoma através da geração de isoformas de proteínas a partir de um único gene. Por fim, a análise de dados de RNA-seq, em conjunto com a busca por assinaturas conhecidas de término de transcrição em archaea, permitiu a identificação da posição final de 58 genes. Os dados obtidos a partir dos experimentos e análises realizados ajudam a traçar um panorama mais completo do transcritoma de H. salinarum NRC-1 e revelam a presença de novos transcritos que podem ser amplamente distribuídos em procariotos e apresentar importantes papéis funcionais. / The large-scale transcriptome characterization of different organisms revealed a highly complex scenario of gene expression, leading to the identification of numerous transcripts in the genomes of eukaryotes and prokaryotes. This phenomenon has been named pervasive transcription and has been an important source for the search of new RNAs with regulatory functions or involved in the translation of unknown proteins. The abundance of transcriptomic and proteomic data, as well as complete information regarding the genome, allowed the halophilic extremophile Halobacterium salinarum to be an ideal model organism for studies of pervasive transcription. This microorganism belongs to the Archaea group, the last one of the three domains of life to be described, which presents shared characteristics with bacteria and eukaryotes. The use of differential RNA-seq (dRNA-seq) approach, which allows the distinction between primary and processed transcripts, allowed the identification of 179 TSSaRNAs, small RNAs associated with the transcription initiation in H. salinarum. The application of dRNA-seq in RNA samples collected along the growth curve allowed the identification of 4540 transcription start sites (TSS) in H. salinarum NRC-1. Some of these transcription initiation are located upstream to known genes, enabling the identification of TSSs for 1545 genes. 59.2% of these positions are located up to 10 bp away from the translation initiation codon, confirming that most of genes are leaderless. The expression analysis of regions related to antisense TSS under different conditions revealed that most of these regions have a correlated expression profile with genes in the opposite strand, indicating a possible regulatory role. Similarly, analysis of the expression of intergenic TSS allowed the identification of 132 differentially expressed regions that are not related to any other element in H. salinarum NRC-1 genome. Integration with proteomic data reveals that some of these regions may be involved in the production of small proteins. The identification of 1365 TSS located within genes suggests that the production of intragenic RNAs (intraRNAs) is a widely distributed phenomenon in H. salinarum NRC-1 genome. Northern blot experiments confirmed the production of a transcript corresponding to the final portion of VNG_RS05220 gene and Western blot experiments also revealed that the translation of intraRNAs is responsible for producing small proteins corresponding to individual protein domains with important functional role in specific growth conditions. Analysis of TSS upstream to the coding regions of similar protein domains in bacteria and other archaea suggests that the production of coding intraRNAs is a widely distributed phenomenon in prokaryotes and may be responsible for the increased proteome diversity through the generation of protein isoforms from a unique gene. Finally, the RNA-seq data analysis, combined with a search for known signatures for transcription termination in archaea, allowed the identification of the final position of 58 genes. The present work help to give a more complete picture of H. salinarum transcriptional landscape and reveals the presence of new transcripts that can be widely distributed in prokaryotes, with important functional roles.

O inseticida spinosad tem sido um dos mais utilizados para o controle de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) no Brasil, devido à sua eficácia e ao seu mecanismo de ação único (modulador alostérico de receptores nicotínicos da acetilcolina). Para fornecer subsídios a um programa de manejo da resistência, foram realizados estudos para compreender as bases genéticas e moleculares da resistência de S. frugiperda a este inseticida. Inicialmente, foi selecionada uma linhagem de S. frugiperda resistente a spinosad (Spin-res) em laboratório por meio da técnica \"F2 screen\". A razão de resistência, baseada na CL50, foi de aproximadamente 890 vezes. A partir de cruzamentos recíprocos entre a linhagem suscetível (Sus) e Spin-res, constatou-se que o padrão de herança da resistência de S. frugiperda a spinosad é autossômica e incompletamente recessiva. Retrocruzamentos da progênie F1 de cruzamentos recíprocos com a linhagem Spin-res confirmaram a hipótese de herança poligênica da resistência, com número mínimo de segregações independentes variando de 1,86 a 2,45. Além disso, observou-se um elevado custo adaptativo associado à resistência de S. frugiperda a spinosad, baseado nos parâmetros da tabela de vida e fertilidade. A partir dos dados de seqüenciamento de quatro bibliotecas de cDNA de lagartas de quarto ínstar das linhagens Sus e Spin-res (expostas ou não a spinosad), utilizando a plataforma HiScan1000&reg; (Illumina&copy;), foi realizada a comparação do perfil de transcrição e expressão diferencial de genes entre as linhagens Sus e Spin-R. O transcritoma foi montado utilizando a estratégia de novo contendo cerca de 19 milhões de leituras single-end com qualidades de score acima de 30, gerando 42406 transcritos com o N50 de 598 pb. A busca por similaridade no banco de dados não-redundante (nr) do NCBI, possibilitou a anotação funcional de 24980 (59%) transcritos, alinhando-se a Bombyx mori L., Helicoverpa armigera (Hübner) e Spodoptera spp. com 22,5; 3,81 e 3,6% das sequências respectivamente. Foram identificados 2903 transcritos apresentando expressão diferencial (P <= 0,05, t-test; fold-change > 2) entre as linhagens Spin-res e Sus. Dentre os transcritos relacionados a enzimas do complexo metabólico, 23 P450 monooxigenases, 13 glutathiona S-transferases, uma carboxilesterase e uma esterase foram superexpressas na linhagem Spin-res. Além disso, foi observada a superexpressão de 15 genes relacionados à produção energética na linhagem Spin-res, o que pode estar relacionada ao elevado custo adaptativo associado à resistência. Análises de PCR quantitativo em tempo real confirmaram que os padrões de expressão foram consistentes com os resultados de RNA-seq. Bioensaios com os sinergistas PBO e DEM mostraram pouco envolvimento de enzimas P450 e nenhum envolvimento de glutationa S-transferases na resistência de S. frugiperda a spinosad. O sequenciamento da subunidade &alpha;6 do receptor nicotínico de acetilcolina de ambas linhagens demonstrou a existência de uma mutação sinônima entre as duas linhagens (G567A), indicando que a subunidade &alpha;6 não é a única relacionada à resistência de S. frugiperda a spinosad. / Spinosad has been one of the most used insecticides to manage Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) in Brazil, due to its efficacy and unique mode of action (nicotinic acetylcholine receptor allosteric modulator). To support an insect resistance management program (IRM), we selected and characterized in laboratory a spinosad-resistant strain (Spin-res) of S. frugiperda using the F2 screen method. The resistance ratio, based on LC50, was &asymp; 890-fold. Based on reciprocal crosses between susceptible (Sus) and Spin-res, the inheritance of spinosad resistance in S. frugiperda was autosomal incompletely recessive. Backcrosses between the F1 from reciprocal crosses and the parental Spin-res revealed a polygenic resistance, with an estimation of at least 1.86 to 2.45 genes related to spinosad resistance. Furthermore, it was observed a strong fitness cost associated to spinosad-resistance in Spin-res strain, based on the life table and fertility parameters. The characterization of the transcriptional profile and the differential gene expression comparison between susceptible and spinosad-resistant strains of Spodoptera frugiperda were obtained from the sequencing of cDNA libraries from fourth instar larvae of Sus and Spin-res strains (exposed or not to spinosad) using a HiScan1000&reg; platform (Illumina&copy;). The transcriptome was de novo assembled using nearly 19 million single-end reads with quality score over 30, yielding 42,406 transcripts with a N50 of 598 bp. Based on similarity search in the non-redundant (nr) nucleotide database, 24,980 (59%) transcripts were annotated. Most of the transcripts aligned to Bombyx mori L., Helicoverpa armigera (Hübner) and Spodoptera spp., with 22.5%, 3.81, and 3.6, respectively. We identified 2,032 differentially expressed transcripts (P <= 0.05, t-test; fold-change > 2) between the susceptible and spinosad-resistant strains. Among metabolic enzyme transcripts, 23 P450 monooxigenases, 13 glutathione S-transferases, one carboxylesterase and one esterase were up-regulated in the spinosad-resistant strain. In addition, it was observed 15 genes superexpressed in spinosad-resistant strain related to energy production, which can be related to the high fitness cost associated with resistance. Quantitative real-time PCR analysis showed that patterns of gene expression were consistent with RNA-seq results. Synergistic bioassays using PBO and DEM showed little involvement of P450s in spinosad-resistance and lack of involvement regarding the glutathione Stransferases. Furthermore, we sequenced and compared the subunit &alpha;6 from the nicotinic acetylcholine receptor of S. frugiperda Spin-res and Sus strains. Only one synonymous mutation within the two strains (G567A) was found, showing that the &alpha;6 is not the only subunit involved in S. frugiperda resistance to spinosad.

A dengue é uma infecção viral sistêmica que pode se manifestar clinicamente de diversas formas, desde febres leves a hemorragia e síndrome do choque, condições potencialmente fatais. Diversos estudos já foram publicados investigando as mudanças globais de expressão que ocorrem durante a evolução da doença nesses diferentes quadros clínicos. Porém, nenhum desses estudos analisou o papel dos RNAs não codificadores longos (lncRNAs) na progressão da doença. Neste projeto, foi realizada uma metanálise dos dados de expressão provenientes desses estudos de dengue focando na expressão de lncRNAs e seus possíveis mecanismos de regulação gênica. Foram identificados dezenas de lncRNAs cuja expressão aumenta ou diminui em pacientes infectados com dengue comparado com pessoas saudáveis. Através de análise de \"guilty-by-association\", procurou-se identificar genes codificadores de proteína possivelmente regulados por esses lncRNAs ou genes que os regulem. Nossos resultados fornecem evidência de novos mecanismos de regulação entre lncRNAs e mRNAs. / Dengue fever is a systemic viral infection that can manifest clinically in a variety of ways, from mild fever to potentially fatal conditions such as hemorrhage and shock syndrome. Several studies have already been published investigating the global changes in expression that occur during the evolution of the disease in these different clinical settings. However, none of these studies analyzed the role of long non-coding RNAs (lncRNAs) in disease progression. In this project, we performed a meta-analysis of transcriptome data obtained from these dengue studies and focused on the expression of lncRNAs and their possible mechanisms of gene regulation. Dozens of lncRNAs have been identified whose expression increases or decreases in patients infected with dengue compared to healthy individuals. Through guilty-by-association analysis, we identified several lncRNAs that possibly regulate protein coding genes. Our results provide evidence of novel regulatory mechanisms between lncRNAs and mRNAs.

O inseticida spinosad tem sido um dos mais utilizados para o controle de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) no Brasil, devido à sua eficácia e ao seu mecanismo de ação único (modulador alostérico de receptores nicotínicos da acetilcolina). Para fornecer subsídios a um programa de manejo da resistência, foram realizados estudos para compreender as bases genéticas e moleculares da resistência de S. frugiperda a este inseticida. Inicialmente, foi selecionada uma linhagem de S. frugiperda resistente a spinosad (Spin-res) em laboratório por meio da técnica \"F2 screen\". A razão de resistência, baseada na CL50, foi de aproximadamente 890 vezes. A partir de cruzamentos recíprocos entre a linhagem suscetível (Sus) e Spin-res, constatou-se que o padrão de herança da resistência de S. frugiperda a spinosad é autossômica e incompletamente recessiva. Retrocruzamentos da progênie F1 de cruzamentos recíprocos com a linhagem Spin-res confirmaram a hipótese de herança poligênica da resistência, com número mínimo de segregações independentes variando de 1,86 a 2,45. Além disso, observou-se um elevado custo adaptativo associado à resistência de S. frugiperda a spinosad, baseado nos parâmetros da tabela de vida e fertilidade. A partir dos dados de seqüenciamento de quatro bibliotecas de cDNA de lagartas de quarto ínstar das linhagens Sus e Spin-res (expostas ou não a spinosad), utilizando a plataforma HiScan1000&reg; (Illumina&copy;), foi realizada a comparação do perfil de transcrição e expressão diferencial de genes entre as linhagens Sus e Spin-R. O transcritoma foi montado utilizando a estratégia de novo contendo cerca de 19 milhões de leituras single-end com qualidades de score acima de 30, gerando 42406 transcritos com o N50 de 598 pb. A busca por similaridade no banco de dados não-redundante (nr) do NCBI, possibilitou a anotação funcional de 24980 (59%) transcritos, alinhando-se a Bombyx mori L., Helicoverpa armigera (Hübner) e Spodoptera spp. com 22,5; 3,81 e 3,6% das sequências respectivamente. Foram identificados 2903 transcritos apresentando expressão diferencial (P <= 0,05, t-test; fold-change > 2) entre as linhagens Spin-res e Sus. Dentre os transcritos relacionados a enzimas do complexo metabólico, 23 P450 monooxigenases, 13 glutathiona S-transferases, uma carboxilesterase e uma esterase foram superexpressas na linhagem Spin-res. Além disso, foi observada a superexpressão de 15 genes relacionados à produção energética na linhagem Spin-res, o que pode estar relacionada ao elevado custo adaptativo associado à resistência. Análises de PCR quantitativo em tempo real confirmaram que os padrões de expressão foram consistentes com os resultados de RNA-seq. Bioensaios com os sinergistas PBO e DEM mostraram pouco envolvimento de enzimas P450 e nenhum envolvimento de glutationa S-transferases na resistência de S. frugiperda a spinosad. O sequenciamento da subunidade &alpha;6 do receptor nicotínico de acetilcolina de ambas linhagens demonstrou a existência de uma mutação sinônima entre as duas linhagens (G567A), indicando que a subunidade &alpha;6 não é a única relacionada à resistência de S. frugiperda a spinosad. / Spinosad has been one of the most used insecticides to manage Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) in Brazil, due to its efficacy and unique mode of action (nicotinic acetylcholine receptor allosteric modulator). To support an insect resistance management program (IRM), we selected and characterized in laboratory a spinosad-resistant strain (Spin-res) of S. frugiperda using the F2 screen method. The resistance ratio, based on LC50, was &asymp; 890-fold. Based on reciprocal crosses between susceptible (Sus) and Spin-res, the inheritance of spinosad resistance in S. frugiperda was autosomal incompletely recessive. Backcrosses between the F1 from reciprocal crosses and the parental Spin-res revealed a polygenic resistance, with an estimation of at least 1.86 to 2.45 genes related to spinosad resistance. Furthermore, it was observed a strong fitness cost associated to spinosad-resistance in Spin-res strain, based on the life table and fertility parameters. The characterization of the transcriptional profile and the differential gene expression comparison between susceptible and spinosad-resistant strains of Spodoptera frugiperda were obtained from the sequencing of cDNA libraries from fourth instar larvae of Sus and Spin-res strains (exposed or not to spinosad) using a HiScan1000&reg; platform (Illumina&copy;). The transcriptome was de novo assembled using nearly 19 million single-end reads with quality score over 30, yielding 42,406 transcripts with a N50 of 598 bp. Based on similarity search in the non-redundant (nr) nucleotide database, 24,980 (59%) transcripts were annotated. Most of the transcripts aligned to Bombyx mori L., Helicoverpa armigera (Hübner) and Spodoptera spp., with 22.5%, 3.81, and 3.6, respectively. We identified 2,032 differentially expressed transcripts (P <= 0.05, t-test; fold-change > 2) between the susceptible and spinosad-resistant strains. Among metabolic enzyme transcripts, 23 P450 monooxigenases, 13 glutathione S-transferases, one carboxylesterase and one esterase were up-regulated in the spinosad-resistant strain. In addition, it was observed 15 genes superexpressed in spinosad-resistant strain related to energy production, which can be related to the high fitness cost associated with resistance. Quantitative real-time PCR analysis showed that patterns of gene expression were consistent with RNA-seq results. Synergistic bioassays using PBO and DEM showed little involvement of P450s in spinosad-resistance and lack of involvement regarding the glutathione Stransferases. Furthermore, we sequenced and compared the subunit &alpha;6 from the nicotinic acetylcholine receptor of S. frugiperda Spin-res and Sus strains. Only one synonymous mutation within the two strains (G567A) was found, showing that the &alpha;6 is not the only subunit involved in S. frugiperda resistance to spinosad.

Angiogênese é o processo de formação de novos vasos sanguíneos a partir dos vasos existentes. É um processo vital, mas muitas doenças também dependem deste mecanismo para obter nutrientes e progredir. Estas \"doenças dependentes de angiogênese\" incluem cânceres, retinopatias e degeneração macular. Alguns inibidores da angiogênese foram desenvolvidos na última década, com o objetivo de auxiliar no manejo dessas doenças e melhorar a qualidade de vida dos pacientes. A maioria destes compostos funciona inibindo a ligação de VEGFA/VEGFR2, que também é um elemento importante para a sobrevivência de células endoteliais quiescentes; e isso pode explicar parcialmente eventos adversos observados em alguns ensaios clínicos. Nossa hipótese é que a melhoria das terapias anti-angiogênicas depende de uma compreensão melhor e mais ampla desse processo, especialmente quando relacionada à progressão das doenças. Utilizando RNA-Seq e um modelo animal bem aceito de angiogênese, o modelo murino de Retinopatia Induzida por Oxigênio, exploramos o transcritoma e identificamos 153 genes diferencialmente expressos durante a angiogênese. Uma extensiva validação de vários genes realizada por qRT-PCR e hibridização in-situ confirmou a superexpressão de Esm1 em células endoteliais de tecidos com angiogênese ativa. A análise de enriquecimento desta lista de genes confirmou a ligação da angiogênese com genes frequentemente mutados em tumores, consistente com a conhecida ligação entre câncer e angiogênese, e forneceu sugestões de fármacos já aprovados que podem ser reutilizados para controlar a angiogênese em circunstâncias patológicas. Finalmente, com base neste panorama amplo da angiogênese, fomos capazes de criar um biomarcador molecular com poder prognóstico para a predição da recidiva de câncer de mama, com aplicações clínicas promissoras. Em resumo, este trabalho revelou com sucesso genes relacionados à angiogênese e forneceu novas alternativas terapêuticas, incluindo potenciais fármacos para reposicionamento. Esse conjunto de genes diferencialmente expressos é também um recurso valioso para investigações futuras. / Angiogenesis is the process of formation of new blood vessels based on existing vessels. It is a vital process but many diseases also rely on this mechanism to get nourishment and progress. These so called angiogenesis-dependent diseases include cancers, retinopathies and macular degeneration. Some angiogenesis inhibitors were developed in the past decade, aiming to help the management of such diseases and improve patients quality of life. Most of these compounds work by inhibiting VEGFA/VEGFR2 binding, which is also a key element to the survival of quiescent endothelial cells; this may partly explain unanticipated adverse events observed in some clinical trials. We hypothesize that the improvement of anti-angiogenesis therapies hinges on a better and broader understanding of the process, especially when related to diseases\' progression. Using RNA-seq and a well accepted animal model of angiogenesis, the murine model of Oxygen Induced Retinopathy, we have explored the transcriptome landscape and identified 153 genes differentially expressed in angiogenesis. An extensive validation of several genes carried out by qRT-PCR and in-situ hybridization confirmed Esm1 overexpression in endothelial cells of tissues with active angiogenesis, providing confidence on the results obtained. Enrichment analysis of this gene list endorsed a narrow link of angiogenesis and frequently mutated genes in tumours, consistent with the known connection between cancer and angiogenesis, and provided suggestions of already approved drugs that may be repurposed to control angiogenesis under pathological circumstances. Finally, based on this comprehensive landscape of angiogenesis, we were able to create a prognostic molecular biomarker for prediction of breast cancer relapse, with promising clinical applications. In summary, this work successfully unveiled angiogenesis-related genes, providing novel therapeutic alternatives, including potential drugs for repositioning. The set of differentially expressed genes is also a valuable resource for further investigations.