Adoptiver Transfer EBV-spezifischer, polyklonaler T-Zelllinien findet Anwendung bei Prophylaxe und Therapie EBV-assoziierter Erkrankungen. Der Ansatz hat den Nachteil der aufwändigen Herstellung der T-Zelllinien, welche aufgrund der Stimulation mit EBV transformierten B-Zelllinien oft nicht die gewünschten EBV Antigene, sondern immundominante EBV Antigene erkennen. Eine Alternative zum polyklonalen T Zelltransfer stellt die Übertragung EBV-spezifischer T-Zellrezeptoren (TCRs) dar. Dadurch können subdominante EBV Antigene angegangen werden, die von Tumorzellen tatsächlich exprimiert werden. In den hier beschriebenen Arbeiten, verwendeten wir peptidbeladene dendritische Zellen (DCs), um selektiv CD4+ T-Zellen gegen ein Epitop aus dem EBV Protein EBNA2 anzureichern. Es gibt Hinweise darauf, dass DCs sich besonders zur Stimulation von T-Zellen eignen, die subdominante EBV Antigene erkennen. Die TCR Gene eines solchen CD4+ T-Zellklons, sowie zweier CD8+ Klone, wurden in Vektoren kloniert, mit denen die EBV Spezifität der Klone auf andere T-Zellen übertragen werden sollte. Wie bereits zuvor in anderen Laboren beobachtet, waren auch unsere TCR modifizierten T-Zellen zunächst nicht in der Lage, EBV infizierte Zielzellen effektiv zu attackieren. Erst durch Modifikation der Vektorstrategie (2A Peptidlinker als Ersatz für das IRES Element (internal ribosomal entry site)) sowie der TCR Gene (Codon-Optimierung) konnte eine deutlich verbesserte Expression und Funktion der modifizierten T-Zellen erreicht werden. Außerdem hing die Effektivität der modifizierten T-Zellen essentiell von der als Zielzelle verwendeten LCL ab. Die hier beschriebenen Arbeiten zeigen die erfolgreiche Übertragung von TCRs gegen EBV Antigene auf T-Zellen. Die so modifizierten T-Zellen erlangten anti-EBV Aktivität und sprechen daher für die prinzipielle Anwendbarkeit TCR-modifizierter T-Zellen zur Behandlung EBV-assoziierter Erkrankungen. / Adoptive transfer of polyclonal Epstein-Barr-virus (EBV)-specific T cell lines has been used as prophylaxis and therapy in patients with EBV-associated malignancies. This approach, however, is limited by the difficult expansion of polyclonal T cells directed mainly against dominant EBV antigens presented on EBV-transformed B cell lines (LCLs). Isolating EBV-specific T cell receptors (TCRs) for transduction of T cells is an alternative strategy to confer T cell immunity against EBV antigens including subdominant EBV antigens. In this study, we have used peptide-pulsed DCs to selectively expand EBV-specific CD4+ T cell clones against an EBNA2-derived epitope. Data suggested that peptide-pulsed DCs are particularly effective in stimulating T cells specific for subdominant EBV antigens. TCR genes from one of these clones as well as from two CD8+ T cell clones were identified by RACE PCR. TCR alpha and beta chains where then cloned into retroviral vectors for transduction of T cells to equip them with anti-EBV specificity. The TCR-modified T cells where then tested for their function towards LCLs to assess the chances for the use of EBV-redirected T cells in adoptive immunotherapy of EBV-associated disease. Like in previous reports, our EBV-specific TCRs at first did not confer effective activity against LCLs. Instead, we had to apply modifications to the TCR vectors to improve expression and function of the introduced TCRs. Codon optimization as well as replacement of the IRES site by a 2A peptide linker was required to significantly increase expression and function of transduced TCRs. Also, we found that the effectiveness of TCR transduced T cells is dependent on the target cell chosen. Our data show successful transfer of functionally active EBV-specific TCRs into T cells to render them effective against LCLs, representing the basis for the development of TCR-transgenic T cells for adoptive T cell transfer in EBV-associated disease.

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Humane corneale Endothelzellen (HCEC) bilden einen Monolayer aus differenzierten Zellen an der posterioren Oberfläche der Cornea und sind essenziell für den Erhalt der cornealen Transparenz. HCEC zeigen nahezu keine proliferative Aktivität in vivo und nur eine begrenzte Proliferationsfähigkeit in vitro. Bei übermäßigem Zellverlust aufgrund von Traumata, Erkrankungen oder des Alters kann die Transparenz der Cornea irreversibel beeinträchtigt werden und die Transplantation einer Spenderhornhaut erforderlich sein, um die Hornhauttransparenz und damit die Sehfähigkeit wiederherzustellen. Dabei ist die weltweite Begrenzung der medizinischen Versorgung mit hochwertigen Spenderhornhäuten das derzeit größte Problem für die Therapie von Cornea-assoziierten Erkrankungen. Zellersatzstrategien mit in vitro kultivierten, quantitativ und qualitativ ausreichenden Spenderzellen sollen die weitestgehend ausgereizten logistischen Ansätze zur Verringerung des Spendermangels ergänzen. Die Entwicklung einer abschaltbaren bzw. transienten Methode zur in vitro- und in situ-Vervielfältigung primärer HCEC ohne Verlust ihrer typischen morphologischen Merkmale würde die Herstellung sowie eine detaillierte und umfassende Charakterisierung von Transplantaten aus primären HCEC ermöglichen. In dieser Arbeit sollten daher zunächst verschiedene proliferationsfördernde Faktoren (PF) identifiziert werden, die nach stabilem retroviralen Gentransfer mit Integrations-kompetenten lentiviralen Vektoren (ICLV) in primären HCEC ein starkes proliferationsförderndes Signal provozieren, das eine Immortalisierung der Zellen zur Folge hat. Dabei sollte die Pseudotypisierung der ICLV-Partikel mit alternativen viralen Glykoproteinen zytopathische Effekte verringern und die Transduktionseffizienz steigern. Nachfolgend sollten die identifizierten PF auf ihre Fähigkeit, die Proliferation primärer HCEC transient zu stimulieren, ohne die Zellen dabei zu transformieren, getestet werden. Mit Hilfe verschiedener retroviraler Expressionssysteme sollte ein klinisch anwendbares System entwickelt werden, das eine kontrollierte, zeitlich begrenzte Stimulierung der Proliferation bei gleichzeitiger Unterdrückung eines tumorartigen Zellwachstums ermöglichte. Hierzu dienten 1) Integrase-defiziente lentivirale Vektoren (IDLV), die eine transiente Transgenexpression durch direkte Transkription des episomalen DNA-Vektorgenoms erlauben, und 2) das transiente Foamyvirus-Vektorsystem (TraFo-VS), dass auf der Enkapsidierung und dem Transfer nicht-viraler mRNA in permissiven Zielzellen basiert. Es konnte gezeigt werden, dass ICLV-Pseudotypen, die entweder eine SFVmcy-Glykoproteinvariante (ICLVSFV) oder das VSV-G-Protein enthielten (ICLVVSV), eine signifikante Transduktionseffizienz aufwiesen und dabei keine zytopathischen Effekte in den Zielzellen auslösten, weshalb beide Glykoproteine für weiterführende Experiment genutzt wurden. Unter Verwendung des optimierten ICLV-Systems konnten drei PF identifiziert werden, die eine reproduzierbare Immortalisierung primärer HCEC infolge stabiler Expression durch Transduktion mit den ICLV-Pseudotypen ermöglichten. Dazu zählten der Cyclin D1/CDK4-Proteinkomplex (4D), die SV40 T-Antigene (SV40T) sowie die transformierenden Proteine E6 und E7 (E6/E7) des HPV-16. Es konnte auch gezeigt werden, dass die Proliferation transduzierter primärer HCEC nach stabiler Transduktion mit PF-codierenden ICLV-Partikeln in einer dosisabhängigen Weise signifikant erhöht werden konnte. Untersuchungen mit IDLV-Varianten haben jedoch gezeigt, dass transduzierte HCEC ein vergleichbares proliferatives Verhalten wie ihre stabil transduzierten Äquivalente aufwiesen. Dies demonstrierte die restliche, geringgradige, nicht-kanonische Integrationskapazität von IDLV-Partikeln besonders im Zusammenhang mit der Expression von potenten PF. Nach erfolgter Transduktion mit TraFo-VP konnten die transferierten PF-codierenden mRNA in den Primärzellen nachgewiesen werden. Die Anwendung dieses Systems resultierte jedoch weder in einer nachweisbaren PF-Expression noch konnte eine proliferationsfördernde Wirkung in transduzierten Zellen festgestellt werden. Auch durch sequenzielle Transduktion der Zielzellen konnte keine Steigerung der Proliferationsrate induziert werden. Durch Verwendung von 50 fach konzentrierten SV40T-codierenden TraFo-VP konnte der mRNA-Transfer erhöht werden, wodurch dann auch die SV40T-Proteinexpression in den transduzierten Zellen nachweisbar wurde. Zudem konnte erstmalig gezeigt werden, dass sich im zeitlichen Verlauf sowohl die zellassoziierte SV40T-mRNA als auch die SV40T-Proteinkonzentration verringerte, bis sie nicht mehr nachweisbar war. Dabei konnte jedoch auch mit den konzentrierten TraFo VP keine nachweisbare transiente Immortalisierung primärer HCEC erreicht werden. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass eine permanente genetische Manipulation mit den viralen PF und dem 4D-Komplex eine Verlängerung der replikativen Lebensdauer ermöglichte und damit einhergehend die Immortalisierung primärer HCEC. Obgleich eine transiente Immortalisierung primärer HCEC mit den getesteten Systemen in dieser Arbeit nicht möglich war, ist eine klinische Anwendung des TraFo-VS, nicht aber des IDLV-Systems, in der angewandten Form, vielversprechend, um die Verfügbarkeit von qualitativ geeignetem Spendergewebe für die Transplantation bzw. Zellen für das Bioengineering des Hornhautendothels zu erhöhen. Daneben könnte das TraFo-VS ebenfalls genutzt werden, um andere zelluläre Funktionen in HCEC oder auch anderen Zielzellen transient zu modifizieren, z. B. Ionenfluss, replikative Seneszenz, Phagozytose oder Apoptose. / Human corneal endothelial cells (HCEC) form a monolayer of differentiated cells on the posterior surface of the cornea and are essential for maintaining corneal transparency. HCECs show almost no proliferative activity in vivo and only limited proliferative capacity in vitro. With excessive cell loss due to trauma, disease, or age-related degeneration, corneal transparency may be irreversibly compromised, and donor cornea transplantation may be required to restore vision. In this context, the global limitations in the medical supply of high-quality donor corneas are currently the most significant obstacle to the treatment of cornea-associated diseases. Cell replacement strategies using in vitro cultured donor cells of sufficient quantity and quality could complement the largely exhausted logistic approaches to alleviate donor shortage. The development of a method for strictly transient in vitro and in situ replication of primary HCECs without loss of their natural morphological characteristics would allow the production of well-characterized grafts derived from primary HCECs. To this end, I first aimed to identify different proliferation factors (PF) that provoke a robust proliferation-promoting signal in primary HCECs through stable retroviral gene transfer of candidate PF genes with integration-competent lentiviral vectors (ICLVs). Additionally, the pseudotyping of ICLV particles with alternative viral glycoproteins should reduce cytopathic effects and increase transduction efficiency. Subsequently, it should be clarified to what extent the identified PFs are capable of stimulating the proliferation of primary HCEC for a limited duration in a non-transformed context. Using different retroviral expression systems, I attempted to develop a clinically applicable system that allowed controlled, time-limited stimulation of proliferation while circumventing tumor-like cell growth. For this purpose, 1) integrase-deficient lentiviral vectors (IDLV), which allow transient transgene expression by direct transcription of the episomal DNA vector genome, and 2) the transient foamy virus vector system (TraFo-VS), which is based on encapsidation and transfer of non-viral mRNA in permissive target cells, were used. It was shown that ICLV pseudotypes containing either an SFVmcy glycoprotein variant (ICLVSFV) or the VSV-G protein (ICLVVSV) exhibited significant transduction efficiency without eliciting cytotoxic effects in target cells, highlighting both as viable candidates. Employing the optimized ICLV system, three PFs were identified that enabled reproducible immortalization of primary HCECs through stable expression after transduction with the ICLV pseudotypes. These included the cyclin D1/CDK4 protein complex (4D), the SV40 T antigens (SV40T), and the transforming proteins E6 and E7 (E6/E7) of HPV16. It was also shown that proliferation of transduced primary HCEC could be significantly increased in a dose-dependent manner following stable transduction with PF encoding ICLV particles. However, studies conducted using IDLV variants showed that PF-transduced HCEC exhibited a comparable proliferative behavior to their stably transduced equivalents. This demonstrated the residual, non-canonical integration capacity of IDLV particles especially in the context of potent PF expression. After successful transduction with TraFo-VP, the transferred PF-encoding mRNA could be detected in primary cells. However, application of this system did not result in detectable PF protein expression, nor could a proliferation-promoting phenotype be detected in transduced cells. Sequential transduction of target cells also failed to induce an increased proliferation rate. By using 50-fold concentrated SV40T-encoding TraFo-VPs, mRNA transfer could be increased, enabling detectable SV40T protein expression in transduced cells. In addition, it was shown for the first time that both cell-associated SV40T mRNA and SV40T protein levels decreased over time until they were no longer detectable. No observable transient immortalization of primary HCEC could be achieved even with the concentrated SV40T-encoding TraFo-VP. In conclusion, permanent genetic manipulation with the viral PFs and 4D protein complex allowed the prolonging of the cellular replicative lifespan in vitro and concomitant immortalization of primary HCEC. Although transient immortalization of primary HCECs was not possible with the systems tested in this investigation, clinical application of the TraFo-VS, but not the IDLV system as applied, remains a promising approach to increase the availability of suitable donor tissue for transplantation or cells for corneal endothelial bioengineering. Additionally, the TraFo-VS could also be used to transiently modify other cellular functions in HCEC or other target cells, e.g., ion flux, replicative senescence, phagocytosis, or apoptosis, for further cell biological research approaches.

The following text constitutes an attempt to present the French philosopher Gilbert Simondon's genetic ontology through an account of his reconfiguration of the problem of individuation in his doctoral thesis from 1958, L'individuation à la lumière des notions de forme, information, potentiel, métastabilité. The intention is to show how Simondon through this reconfiguration of a classical philosophical problem – in which concepts and schemas from contemporary physics and technology is utilised in a critique of the bi-polar hylomorphic schema as its traditional, substantialistic solution – becomes able to articulate an anti-substantialistic and anti-reductionistic ontogenesis as first philosophy. A systematic philosophical conception that according to Simondon precedes every critical investigation of the subject as well as every scientific ontology – not by establishing a pre-critical position, but by exceeding Kant's critical position: that is, through a displacement toward a conception of the transcendental conditions for the genesis of being and thought as real conditions, rather than conditions of mere possibility. A displacement that in turn appears to respond to the question that frames this basic account of important concepts and schemas in Simondon, namely: in what sense and to what extent is it necessary for philosophical thought to be thought and developed in relation to other forms of thought?

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