FIGUEIREDO, Webertty Mayk Eufrásio de. Efeito da quimiocina CXCL10 na infecção por Leishmania infantum chagasi em camundongos BALB/c. 2012. 65 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-05-10T14:16:18Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_wmefigueiredo.pdf: 442833 bytes, checksum: 07c3a09e8e63fe5a99d0e9bcbcbb337f (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-05-16T13:41:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_wmefigueiredo.pdf: 442833 bytes, checksum: 07c3a09e8e63fe5a99d0e9bcbcbb337f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-16T13:41:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_wmefigueiredo.pdf: 442833 bytes, checksum: 07c3a09e8e63fe5a99d0e9bcbcbb337f (MD5) Previous issue date: 2012 / Visceral leishmaniasis caused by Leishmania infantum chagasi is characterized by the loss of the ability of host to generate an effective immune response. In this study it was investigated the role of CXCL10 chemokine in controlling L. infantum chagasi infection in vivo. Groups of BALB/c mice were treated or not with recombinant CXCL10 chemokine (5 μg/kg) with 1, 3 and 7 days of infection and after 1, 7 and 23 days of treatment, some parameters were evaluated: parasite load, levels of IFN-g, IL-4, TGF-β and IL-10, and the histopathological alterations in the liver. After 23 days of treatment, CXCL10 induced in the spleen a significant reduction on the number of parasites as compared to control group. In the liver, parasite load decreased in treated group between the 7th and 23th day post treatment. However, the antileishmanial effect of CXCL10, in this work, does not seem to be mediated by NO, since there was no difference in the NO production among the groups. IFN-γ was induced most significantly in treated group than in controls, and reached its maximum production (100 pg/mL) on day 23 after treatment, correlating with the reduction in parasite burden in target organs. IL-4 was produced in low doses, in both groups, although treated animals had shown higher levels than control group. Regarding to anti-inflammatory cytokines, after the 23th day of treatment, IL-10 levels in treated animals were smaller than in control group. Production of TGF-β after 7 days of treatment was 2 times lower in treated group when compared to control, and after the 23th day of treatment, this cytokine remained with lower levels than those observed in control. In the histopathological analysis of the liver after the 1st day of treatment, were found in both groups more immature granulomas (GI) than non-granulomatous infiltrate (NG), and some few mature granulomas (GM) were only observed in treated group. After 7 days of treatment, the amount of NG infiltrates was lower, and GI were still the most frequent in both groups, besides a slight increase of GM was observed in treated group. In summary, at the light of the found results, it is possible to suggest an important leishmanicidal role to CXCL10 in BALB/c mice infected by L. infantum chagasi, which seems to be mediated by a significant IFN-g production, and suppression of immunoregulatory cytokines, IL-10 and TGF-β, opening the hypothesis that this would be associated to a decrease in the frequency of regulatory T cells induced by CXCL10 in these animals. / A leishmaniose visceral causada por Leishmania infantum chagasi é caracterizada pela perda da habilidade do hospedeiro gerar uma resposta imunológica eficaz. Neste estudo, foi investigado o papel da quimiocina CXCL10 no controle da infecção por L. infantum chagasi in vivo. Grupos de camundongos BALB/c foram tratados ou não com CXCL10 (5 μg/kg) com 1, 3 e 7 dias de infecção e após 1, 7 e 23 dias do tratamento, alguns parâmetros foram avaliados: a carga parasitária, os níveis de IFN-, IL-4, TGF-β e IL-10, e as alterações histopatológicas no fígado. Após 23 dias de tratamento, CXCL10 induziu, no baço, uma redução expressiva no número de parasitos, quando comparado ao grupo controle. No fígado, a carga parasitária mostrou uma queda no grupo tratado, entre o 7º e 23º dia após o tratamento. Entretanto, o efeito leishmanicida de CXCL10, neste trabalho, não parece ser mediado por NO, uma vez que não houve diferença na produção de NO entre os grupos. IFN-γ foi induzida de maneira mais significativa no grupo tratado do que nos controles, e atingiu sua produção máxima (100 pg/mL) no 23º dia após o tratamento, correlacionando-se com a queda da carga parasitária nos órgãos-alvo. IL-4 foi produzida em baixas concentrações, em ambos os grupos, embora os animais tratados com CXCL10 tenham mostrado níveis mais elevados do que os controles. Em relação às citocinas antiinflamatórias, após 23 dias do tratamento, os níveis de IL-10 nos animais tratados foram menores do que os do controle. A produção de TGF-β após 7 dias do tratamento foi 2 vezes menor no grupo tratado quando comparado ao controle, e após 23 dias do tratamento, essa citocina continuou com níveis mais baixos do que aqueles observados no controle. Na análise histopatológica do fígado após o 1º dia do tratamento, foram encontrados, em ambos os grupos, mais granulomas imaturos (GI), do que infiltrados não granulomatosos (NG) e alguns poucos granulomas maduros (GM) apenas no grupo tratado. Após 7 dias do tratamento, a quantidade de infiltrados NG estava menor e os GI ainda foram os mais encontrados, em ambos os grupos, além disso, foi observado um pequeno aumento de GM no grupo tratado. Em resumo, diante dos resultados encontrados, é possível sugerir um importante papel leishmanicida de CXCL10 em camundongos BALB/c infectados por L. infantum chagasi, que parece ser mediado por uma expressiva produção de IFN-g e supressão das citocinas imunorreguladoras, IL-10 e TGF-β, abrindo a hipótese se isto não estaria associado a uma diminuição na frequência de células T regulatórias, induzida por CXCL10, nesses animais.

A fibrose hepática é caracterizada pelo acúmulo de matriz extracelular em resposta à lesão hepática crônica. Importantes causas de lesões hepáticas crônicas são: hepatites virais, doenças metabólicas, doenças auto-imunes e exposição a substâncias químicas, como álcool ou drogas. As células estreladas hepáticas e o TGF-ß1, uma das citocinas responsáveis pela sua ativação, têm sido descritos como os principais envolvidos neste processo. Neste trabalho buscamos avaliar, in vivo, o comportamento do TGF-ß1 no desenvolvimento da fibrose hepática e verificar, in vitro, o efeito da sua diminuição em células estreladas hepáticas ativadas. Inicialmente analisamos a relação dos níveis séricos de TGF-ß1 com a densidade de colágeno no tecido hepático em modelo murino de cirrose por Tetracloreto de Carbono. Observou-se que há uma correlação negativa entre os níveis séricos de TGF-ß1 e a densidade de colágeno no tecido hepático neste modelo. A seguir, buscou-se avaliar os níveis séricos e a expressão tecidual de TGF-ß1 em pacientes com Atresia Biliar no momento do diagnóstico e ao transplante, correlacionando com a densidade de colágeno no tecido hepático e com marcadores séricos da doença (APRI e contagem de plaquetas). Neste estudo verificou-se que os níveis séricos de TGF-ß1 não se relacionam com a densidade de colágeno e tampouco com sua expressão no tecido. Os pacientes no momento do transplante possuíam valores baixos de TGF-ß1, tanto em relação ao grupo diagnóstico como em relação aos controles. Contudo, ao diagnóstico observou-se uma correlação negativa do TGF-ß1 com a contagem de plaquetas. Nos estudos in vitro usou-se a linhagem celular GRX para avaliar o efeito do tratamento de células estreladas hepáticas com Anfotericina B sobre os níveis de TGF-ß1 e sua reversão ao fenótipo quiescente. Verificou-se que a droga foi eficiente, diminuindo a proliferação celular e reduzindo os níveis de expressão de TGF-ß1, com reversão ao fenótipo de lipócito. Na mesma linhagem celular foi avaliado o efeito do silenciamento da expressão de TGF-ß1 com o uso de RNA de interferência. Após transfecção com lipofectamina foi detectada uma redução de 20% da expressão de TGF-ß1 por PCR em tempo real. Através do uso de um gene marcador observou-se que a eficiência de transfecção foi de menos de 10%. Em conjunto, eses achados corroboram a importância do TGF-ß1 no processo de fibrogênese, inclusive na doença hepática infantil. Além disso, a redução dos níveis dessa citocina nos estágios finais da doença indicam que o uso do TGF-ß1 como alvo terapêutico possui uma janela de tempo bem definida para que possa ser efetivo. Neste sentido, a Amfotericina B poderá ser uma alternativa terapêutica para o tratamento da fibrose hepática. Por outro lado, aferramenta de RNAi necessita de métodos de transferência mais eficientes e seguros para futuramente tratar pacientes com doença hepática crônica. / Liver fibrosis is characterized by the accumulation of extracellular matrix in response to chronic liver injury. Important causes of chronic liver injury are viral hepatitis, metabolic diseases, autoimmune diseases, and exposure to chemicals such as alcohol or drugs. Hepatic stellate cells and TGF-ß1, one of the cytokines responsible for their activation, have been described as major players involved in this process. In this study we sought to evaluate, in vivo, the behavior of TGF-ß1 in the development of hepatic fibrosis and verify, in vitro, the effect of its decrease in activated hepatic stellate cells. First we analyzed the relationship between serum TGF-ß1 and collagen density in liver tissue in a rat model of cirrhosis by Carbon Tetrachloride. A negative correlation between serum levels of TGF-ß1 and collagen density in liver tissue was observed. Next, we tried to evaluate the serum levels and tissue expression of TGF-ß1 in patients with biliary atresia at the time of diagnosis and at liver transplantation, correlating with collagen density in liver tissue and serum markers of the disease (APRI and platelet count). It was shown that serum levels of TGF-ß1 do not correlate with collagen density or with TGF-ß1 expression in the tissue. Patients at the time of liver transplantation presented low levels of TGF-ß1 compared both to patients at diagnosis and to controls. However, a negative correlation between TGF-ß1 and platelet count was observed at the time of diagnosis. For in vitro studies, the GRX cell line was used to assess the effect of Amphotericin B on TGF-ß1 levels and their reversion to a quiescent phenotype. The drug was effective, reducing the cell proliferation rate, TGF-ß1 expression and reversion to the lipocyte phenotype. In the same cell line RNA interference for silencing the expression of TGF-ß1 was evaluated. After transfection with lipofectamine a reduction of 20% in TGF-ß1 was detected by real time PCR. Using a marker gene it was observed that the transfection efficiency was less than 10%. Taken together, these findings corroborate the importance of TGF-β1 in the process of fibrogeneses, including in liver disease in children. Moreover, the decrease of this cytokine in end stage liver disease shows that the use of TGF-ß1 as a therapeutic target for fibrosis is time dependent. In this sense, Amphotericin B may be a good option for treating for liver fibrosis. On the other hand, RNAi needs more efficient and safe delivery methods should it be used to treat patients with chronic liver disease in the future.

Resumo não disponível

Introdução: Técnicas que possibilitem o diagnóstico não-invasivo das condições que afetam a sobrevida dos transplantes e os mecanismos associados ao seu desenvolvimento encontram-se em intensa investigação. Este estudo objetiva delinear perfis de expressão de RNA mensageiro de alo-imunidade, tolerância, fibrose e injúria tubular aguda associados aos diferentes imunossupressores utilizados na prática clínica dos transplantes renais. Métodos: Amostras de sangue e urina foram coletadas de 53 pacientes transplantados renais com pelo menos um ano de seguimento pós-transplante e com níveis séricos de creatinina estáveis. Os pacientes foram divididos em 6 grupos, de acordo com seu regime de imunossupressão, todos contendo corticosteróides em baixas doses de manutenção: (1) inibidor da calcineurina (IC) + azatioprina (AZA) (7 pacientes); (2) ácido micofenólico (AMF) (6 pacientes); 3) rapamicina (RAPA) (7 pacientes); 4) IC + AMF (15 pacientes); 5) IC (6 pacientes); 6) belatacept (BLT) + AMF (11 pacientes). A quantificação do RNA mensageiro dos genes FOXP3, TIM-3, KIM-1, TGF-β e CTGF foi realizada através da técnica de reação em cadeia da polimerase em tempo real utilizando o método de quantificação relativa 2-ΔΔCT. Resultados: A expressão de FOXP3 foi maior nos grupos RAPA (P = 0,049) e IC (P = 0,039) em comparação ao grupo IC+AZA; a expressão na urina foi maior no grupo AMF em relação aos grupos IC+AZA(P = 0,004) e IC+AMF (P = 0,003), e no grupo RAPA em comparação ao grupo IC+AMF (P = 0,003). O grupo RAPA apresentou maior expressão de TIM-3 no sangue do que o grupo IC+AZA (P = 0,049); na urina, a expressão foi maior no grupo AMF quando comparada aos grupos IC+AZA (P = 0,005), RAPA (P = 0,003), IC+AMF (P = 0,001) e BLT+AMF (P = 0,021). TGF-β no sangue foi menos expresso no grupo IC+AZA em comparação aos grupos IC+AMF (P = 0,005), IC (P = 0,014) e BLT+AMF (P = 0,013); a expressão urinária foi menor no grupo IC+AMF em relação aos grupos IC+AZA(P = 0,008), AMF (P = 0,002), RAPA (P = 0,01), IC (P = 0,015) e BLT+AMF (P < 0,001); os grupos IC+AZA e RAPA também apresentaram menor expressão de TGF-β na urina em comparação aos grupos AMF (P = 0,028 e 0,032, respectivamente) e BLT+AMF (P = 0,001 e 0,006, respectivamente). A expressão de CTGF no sangue não foi diferente entre os grupos; sua expressão urinária foi menor no grupo IC+AMF quando comparada aos grupos IC+AZA (P = 0,004), AMF (P = 0,001), RAPA (P = 0,01) e BLT+AMF (P = 0,001). KIM-1 não foi expresso em células sanguíneas; na urina, o grupo IC+AZA apresentou maior expressão de KIM-1 do que o grupo IC+AMF (P = 0,019). Conclusões: A análise dos perfis de expressão gênica nos vários regimes de imunossupressão permite identificar associação de diferentes processos a cada tipo de combinação terapêutica. Os resultados evidenciam a associação dos inibidores de calcineurina aos marcadores de fibrose tecidual, enquanto que rapamicina e micofenolato parecem mediar processos de tolerância imune e modulação da alo-imunidade. Estudos com maior poder estatístico poderão estreitar essas associações, determinando o real papel da expressão de biomarcadores como ferramentas para o diagnóstico das condições que afetam os enxertos renais.

Introdução: Técnicas que possibilitem o diagnóstico não-invasivo das condições que afetam a sobrevida dos transplantes e os mecanismos associados ao seu desenvolvimento encontram-se em intensa investigação. Este estudo objetiva delinear perfis de expressão de RNA mensageiro de alo-imunidade, tolerância, fibrose e injúria tubular aguda associados aos diferentes imunossupressores utilizados na prática clínica dos transplantes renais. Métodos: Amostras de sangue e urina foram coletadas de 53 pacientes transplantados renais com pelo menos um ano de seguimento pós-transplante e com níveis séricos de creatinina estáveis. Os pacientes foram divididos em 6 grupos, de acordo com seu regime de imunossupressão, todos contendo corticosteróides em baixas doses de manutenção: (1) inibidor da calcineurina (IC) + azatioprina (AZA) (7 pacientes); (2) ácido micofenólico (AMF) (6 pacientes); 3) rapamicina (RAPA) (7 pacientes); 4) IC + AMF (15 pacientes); 5) IC (6 pacientes); 6) belatacept (BLT) + AMF (11 pacientes). A quantificação do RNA mensageiro dos genes FOXP3, TIM-3, KIM-1, TGF-β e CTGF foi realizada através da técnica de reação em cadeia da polimerase em tempo real utilizando o método de quantificação relativa 2-ΔΔCT. Resultados: A expressão de FOXP3 foi maior nos grupos RAPA (P = 0,049) e IC (P = 0,039) em comparação ao grupo IC+AZA; a expressão na urina foi maior no grupo AMF em relação aos grupos IC+AZA(P = 0,004) e IC+AMF (P = 0,003), e no grupo RAPA em comparação ao grupo IC+AMF (P = 0,003). O grupo RAPA apresentou maior expressão de TIM-3 no sangue do que o grupo IC+AZA (P = 0,049); na urina, a expressão foi maior no grupo AMF quando comparada aos grupos IC+AZA (P = 0,005), RAPA (P = 0,003), IC+AMF (P = 0,001) e BLT+AMF (P = 0,021). TGF-β no sangue foi menos expresso no grupo IC+AZA em comparação aos grupos IC+AMF (P = 0,005), IC (P = 0,014) e BLT+AMF (P = 0,013); a expressão urinária foi menor no grupo IC+AMF em relação aos grupos IC+AZA(P = 0,008), AMF (P = 0,002), RAPA (P = 0,01), IC (P = 0,015) e BLT+AMF (P < 0,001); os grupos IC+AZA e RAPA também apresentaram menor expressão de TGF-β na urina em comparação aos grupos AMF (P = 0,028 e 0,032, respectivamente) e BLT+AMF (P = 0,001 e 0,006, respectivamente). A expressão de CTGF no sangue não foi diferente entre os grupos; sua expressão urinária foi menor no grupo IC+AMF quando comparada aos grupos IC+AZA (P = 0,004), AMF (P = 0,001), RAPA (P = 0,01) e BLT+AMF (P = 0,001). KIM-1 não foi expresso em células sanguíneas; na urina, o grupo IC+AZA apresentou maior expressão de KIM-1 do que o grupo IC+AMF (P = 0,019). Conclusões: A análise dos perfis de expressão gênica nos vários regimes de imunossupressão permite identificar associação de diferentes processos a cada tipo de combinação terapêutica. Os resultados evidenciam a associação dos inibidores de calcineurina aos marcadores de fibrose tecidual, enquanto que rapamicina e micofenolato parecem mediar processos de tolerância imune e modulação da alo-imunidade. Estudos com maior poder estatístico poderão estreitar essas associações, determinando o real papel da expressão de biomarcadores como ferramentas para o diagnóstico das condições que afetam os enxertos renais.

Resumo não disponível

A fibrose hepática é caracterizada pelo acúmulo de matriz extracelular em resposta à lesão hepática crônica. Importantes causas de lesões hepáticas crônicas são: hepatites virais, doenças metabólicas, doenças auto-imunes e exposição a substâncias químicas, como álcool ou drogas. As células estreladas hepáticas e o TGF-ß1, uma das citocinas responsáveis pela sua ativação, têm sido descritos como os principais envolvidos neste processo. Neste trabalho buscamos avaliar, in vivo, o comportamento do TGF-ß1 no desenvolvimento da fibrose hepática e verificar, in vitro, o efeito da sua diminuição em células estreladas hepáticas ativadas. Inicialmente analisamos a relação dos níveis séricos de TGF-ß1 com a densidade de colágeno no tecido hepático em modelo murino de cirrose por Tetracloreto de Carbono. Observou-se que há uma correlação negativa entre os níveis séricos de TGF-ß1 e a densidade de colágeno no tecido hepático neste modelo. A seguir, buscou-se avaliar os níveis séricos e a expressão tecidual de TGF-ß1 em pacientes com Atresia Biliar no momento do diagnóstico e ao transplante, correlacionando com a densidade de colágeno no tecido hepático e com marcadores séricos da doença (APRI e contagem de plaquetas). Neste estudo verificou-se que os níveis séricos de TGF-ß1 não se relacionam com a densidade de colágeno e tampouco com sua expressão no tecido. Os pacientes no momento do transplante possuíam valores baixos de TGF-ß1, tanto em relação ao grupo diagnóstico como em relação aos controles. Contudo, ao diagnóstico observou-se uma correlação negativa do TGF-ß1 com a contagem de plaquetas. Nos estudos in vitro usou-se a linhagem celular GRX para avaliar o efeito do tratamento de células estreladas hepáticas com Anfotericina B sobre os níveis de TGF-ß1 e sua reversão ao fenótipo quiescente. Verificou-se que a droga foi eficiente, diminuindo a proliferação celular e reduzindo os níveis de expressão de TGF-ß1, com reversão ao fenótipo de lipócito. Na mesma linhagem celular foi avaliado o efeito do silenciamento da expressão de TGF-ß1 com o uso de RNA de interferência. Após transfecção com lipofectamina foi detectada uma redução de 20% da expressão de TGF-ß1 por PCR em tempo real. Através do uso de um gene marcador observou-se que a eficiência de transfecção foi de menos de 10%. Em conjunto, eses achados corroboram a importância do TGF-ß1 no processo de fibrogênese, inclusive na doença hepática infantil. Além disso, a redução dos níveis dessa citocina nos estágios finais da doença indicam que o uso do TGF-ß1 como alvo terapêutico possui uma janela de tempo bem definida para que possa ser efetivo. Neste sentido, a Amfotericina B poderá ser uma alternativa terapêutica para o tratamento da fibrose hepática. Por outro lado, aferramenta de RNAi necessita de métodos de transferência mais eficientes e seguros para futuramente tratar pacientes com doença hepática crônica. / Liver fibrosis is characterized by the accumulation of extracellular matrix in response to chronic liver injury. Important causes of chronic liver injury are viral hepatitis, metabolic diseases, autoimmune diseases, and exposure to chemicals such as alcohol or drugs. Hepatic stellate cells and TGF-ß1, one of the cytokines responsible for their activation, have been described as major players involved in this process. In this study we sought to evaluate, in vivo, the behavior of TGF-ß1 in the development of hepatic fibrosis and verify, in vitro, the effect of its decrease in activated hepatic stellate cells. First we analyzed the relationship between serum TGF-ß1 and collagen density in liver tissue in a rat model of cirrhosis by Carbon Tetrachloride. A negative correlation between serum levels of TGF-ß1 and collagen density in liver tissue was observed. Next, we tried to evaluate the serum levels and tissue expression of TGF-ß1 in patients with biliary atresia at the time of diagnosis and at liver transplantation, correlating with collagen density in liver tissue and serum markers of the disease (APRI and platelet count). It was shown that serum levels of TGF-ß1 do not correlate with collagen density or with TGF-ß1 expression in the tissue. Patients at the time of liver transplantation presented low levels of TGF-ß1 compared both to patients at diagnosis and to controls. However, a negative correlation between TGF-ß1 and platelet count was observed at the time of diagnosis. For in vitro studies, the GRX cell line was used to assess the effect of Amphotericin B on TGF-ß1 levels and their reversion to a quiescent phenotype. The drug was effective, reducing the cell proliferation rate, TGF-ß1 expression and reversion to the lipocyte phenotype. In the same cell line RNA interference for silencing the expression of TGF-ß1 was evaluated. After transfection with lipofectamine a reduction of 20% in TGF-ß1 was detected by real time PCR. Using a marker gene it was observed that the transfection efficiency was less than 10%. Taken together, these findings corroborate the importance of TGF-β1 in the process of fibrogeneses, including in liver disease in children. Moreover, the decrease of this cytokine in end stage liver disease shows that the use of TGF-ß1 as a therapeutic target for fibrosis is time dependent. In this sense, Amphotericin B may be a good option for treating for liver fibrosis. On the other hand, RNAi needs more efficient and safe delivery methods should it be used to treat patients with chronic liver disease in the future.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / En el corazón, los fibroblastos, las células más abundantes, tienen funciones estructurales, actúan como sensores de los cambios del entorno, reaccionan frente a estímulos externos secretando factores de crecimiento, tienen una alta capacidad proliferativa y de secreción de proteínas de matriz extracelular. El retículo endoplasmático (RE) es el responsable de la síntesis y correcto plegamiento de las proteínas, pero cuando por diferentes estímulos se ve alterado el correcto proceso de plegamiento se produce lo que se conoce como estrés de retículo endoplasmático. La acumulación de proteínas mal plegadas en el lumen del RE contribuye al desarrollo de un gran número de enfermedades neurodegenerativas, inmunes, endocrinas y cardiovasculares. En el RE existe toda una maquinaría traduccional que mantiene un correcto flujo de la información para el correcto plegamiento proteico, entre las que destacan los sensores de estrés de RE como PERK, IRE, ATF6, las chaperonas BiP y PDI y la proteína CHOP que funciona como un inductor de apoptosis. Este es el primer estudio que considera evaluar el efecto del estrés de RE sobre la viabilidad celular y la secreción de proteínas de la MEC en fibroblastos cardiacos de ratas neonatas y para ello utilizamos Tunicamicina (Tn), un antibiótico que induce estrés de RE. Nuestros resultados mostraron que los fibroblastos cardiacos presentan una alta sensibilidad a la apoptosis inducida por Tn, junto con un cambio en la expresión de las proteínas marcadoras de estrés de RE. Además de lo anterior, nuestros resultados mostraron que el pre-tratamiento con TGFβ1 (un agente pro-fibrótico de marcada acción sobre fibroblastos cardiacos) fue capaz de prevenir la muerte por apoptosis inducida por Tn en los fibroblastos cardiacos, a través de un mecanismo de adaptación al estrés de RE, modificando los niveles de expresión de las proteínas marcadoras de estrés de RE. Sin embargo, TGFβ1 no fue capaz de revertir la disminución en la secreción de colágeno inducida por efecto de Tn. En conclusión, TGFβ1 protege de la apoptosis inducida por Tn, abriendo perspectivas como un mecanismo de prevención de patologías en las que participa el estrés de RE / In the heart, fibroblasts, the cells more abundant, have structural features, act as sensors of the changing environment, react to external stimuli secreting growth factors, have a high proliferative capacity and secretion of extracellular matrix proteins. The endoplasmic reticulum (ER) is responsible for the synthesis and proper folding of proteins, but when a stimulus alters the proper folding process occurs endoplasmic reticulum stress. The accumulation of bad folded proteins into the ER lumen contributes to the development of a large number of neurodegenerative diseases, immune, endocrine and cardiovascular disorders. In ER there is a whole translational machinery that maintains the proper flow of information to the proper protein folding, including ER stress sensors as PERK, IRE1α, ATF6, proteins like BiP and PDI and the protein CHOP that works as an inducer of apoptosis. This is the first study that considers assess the effect of ER stress on the feasibility of cell and secretion of the MEC proteins in neonate rat cardiac fibroblasts and for that we use Tunicamicina (Tn), an antibiotic that induces stress of ER. Our results showed that cardiac fibroblasts have a high sensitivity to apoptosis induced by Tn, along with a change in the expression of the protein marker of stress ER. In addition, our results showed that pre-treatment with TGF β1 (an agent with marked pro-fibrotic action on cardiac fibroblasts) was able to prevent death by apoptosis induced by Tn in cardiac fibroblasts, through a mechanism of adaptation to ER stress, by changing levels of expression of the protein marker of stress RE. However, TGF β1 was not able to reverse the decline in the secretion of collagen induced by effect of Tn. In conclusion, TGF-β1 protects apoptosis induced Tn, opening prospects as a mechanism for the prevention of diseases in which participates ER stress

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / En el corazón, los fibroblastos son las células más abundantes y tienen características estructurales y funcionales muy determinadas: a) actúan como sensores de los cambios del entorno reaccionando frente a estímulos externos; b) secretan factores de crecimiento, citoquinas, y poseen sus receptores; c) tienen una alta capacidad proliferativa; d) secretan una gran cantidad de proteínas de matriz extracelular; e) se diferencian a un fenotipo conocido como miofibroblasto, los que participan activamente del proceso de cicatrización tisular después de una injuria cardiaca. En el proceso de secreción de proteínas, una vez sintetizadas, estas deben ser plegadas al interior del retículo endoplásmico (RE) a través de un complejo proceso en el que participan proteínas conocidas como proteínas chaperonas. Cuando por diversos factores como alteración de la homeostasis del calcio, estrés oxidativo, estado redox, isquemia o isquemia/reperfusión, se altera la homeostasis del RE, se afecta el plegamiento y maduración de proteínas en vías a ser secretadas, conduciendo a un estado celular conocido como Estrés de Retículo Endoplásmico (ERE). Esta nueva condición activa la Respuesta a Proteínas Mal Plegadas, que induce mecanismos compensatorios que llevan al aumento de la expresión de chaperonas del RE. Cuando esta respuesta no es capaz de recuperar la homeostasis del plegamiento de proteínas, se gatilla la expresión del factor transcripcional CHOP que activa la expresión de genes que conducen a la muerte celular de tipo apoptótica. En este estudio se demostró que tanto isquemia como Isquemia/Reperfusión (I/R) simuladas (cultivo de fibroblastos en medio isquémico y cámara hipóxica), son capaces de generar una pérdida significativa en la viabilidad celular de fibroblastos cardíacos neonatos de rata (FCNR). La pérdida de viabilidad celular es debido a que tanto isquemia como I/R son capaces de inducir ERE, evidenciado por un aumento de los niveles de CHOP (8 horas de isquemia y 8 horas de isquemia seguidas de 24 horas de reperfusión), resultando en una pérdida de un 25% y un 50% de la viabilidad celular en isquemia e I/R respectivamente. Muchos han sido los intentos para solucionar el principal problema que se genera ante un evento isquémico, la muerte celular. En la literatura se ha reportado que TGF-β1 es capaz de generar un efecto cardioprotector en cultivos primarios de cardiomiocitos sometidos a isquemia e I/R. Nuestros resultados muestran que TGF-β1 a una concentración de 5 ng/mL, disminuye, aunque no totalmente, la pérdida de viabilidad de FCNR inducida por isquemia e I/R. De igual manera, nuestros resultados muestran que esta citoquina es capaz de bloquear totalmente el aumento en la expresión de CHOP inducidos por isquemia e I/R simuladas. De estos resultados se concluye que tanto en isquemia como I/R, la pérdida de la viabilidad celular se debe, al menos en parte, al ERE, un efecto que es atenuado por TGF-β1, no descartando que existen otros mecanismos no regulados por ERE que generan la pérdida de viabilidad celular. Una segunda alternativa para enfrentar este problema, fue la utilización de la chaperona química Ácido 4-fenilbutírico (4-PBA, quien ha demostrado proteger del ERE por tapsigargina en FCNR). Nuestros resultados muestran que distintas concentraciones de 4-PBA en isquemia, o pre-incubando los FCNR 24 horas antes de realizar la isquemia con 4-PBA, no se observó un efecto sobre la pérdida de viabilidad celular. Si bien estos resultados son discordantes con TGF-β1, fortalece la idea de que el ERE es parte de la perdida de viabilidad celular o que TGF-β1 gatilla vías de sobrevida, una de las cuales podría ser frenar la muerte celular inducida por ERE / In the heart, fibroblasts are the most abundant cell type and they have very specific structural and functional features: a) act as sensors of changes in the environment reacting under external stimuli; b) secrete growth factors, cytokines and have their receptors; c) have a high proliferative capacity; d) secrete a large amount of extracellular matrix proteins; e) differentiate into a phenotype known as myofibroblast, which is involved in the wound healing process after a cardiac injury. In the protein secretion process, once synthesized, they have to be fold inside the endoplasmic reticulum (ER) through a complex process in which are involved many proteins known as chaperone proteins. When because of many factors such alterations in calcium homeostasis, oxidative stress, redox state, ischemia or ischemia/reperfusion (I/R), is altered the endoplasmic reticulum homeostasis, the fold and maturation of proteins in the secretory pathways is affected, leading to a state known as Endoplasmic Reticulum Stress (ERS). This new condition activates de Unfolded Protein Response, which induces compensatory mechanisms that leads to an increase of the expression of the chaperone proteins of the endoplasmic reticulum. When this response is not able to restore homeostasis in the correct protein folding, it triggers the expression of the transcriptional factor CHOP that activates the expression of genes that lead to cell death by apoptosis. In this study we demonstrated that either simulated ischemia or I/R (fibroblast culture in ischemic medium and hypoxic chamber), are capable to generate a significant loss of cardiac fibroblast viability. The loss of cell viability is because either ischemia and I/R are capable of inducing ERS, evidenced by an increased levels of CHOP (8 hours for ischemia and 8 hours of ischemia followed by 24 hours of reperfusion), resulting in a loss of 25% and 50% of cell viability in ischemia and I/R. There have been many attempts to solve the principal problem of an ischemic event, the cell death. In literature has been reported that TGF-β1 is capable of generating a cardio protective effect in primary cardiac myocytes cultures under ischemia and I/R. Our results show that TGF-β1 [5 ng/mL], decreases, although not entirely, the loss of cardiac fibroblasts viability induced by ischemia and I/R. Similarly, our results show that this cytokine is able to block totally the increase in the expression of CHOP induced by ischemia and I/R. From these results it is concluded, that either in ischemia as well as in I/R, the loss of cell viability is due, at least in part, to ERS, and it is attenuated by TGF-β1, not ruling out that there are other mechanisms not regulated by ERS that lead to a loss of cell viability. A second alternative to face this problem, was the use of the chemical chaperone 4-PBA (who has demonstrated protect from cardiac fibroblast death thapsigargin-induced by ERS cardiac fibroblasts). Our results show that different concentrations of 4-PBA in ischemia, or pretreatment the cardiac fibroblasts by 24 hours before the ischemia with 4-PBA, don´t have any effect in the loss of cell viability. Although these results are discordant with TGF-β1, they strengthen the idea that the ERS is a part of the loss of cell viability, or that TGF-β1 triggers survival pathways, one of which could be to prevent ERS cell death

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