Memoria para optar el título de Bioquímico / TGF-β1 es uso de los miembros de la superfamilia de TGF-β, capaz de activar vías de señalización dentro de la célula que modulan la expresión de diversos genes. Entre estas vías encontramos a los complejos Smad2, Smad3 y ERK1, 2. La modulación y/o regulación de estas vías activadas por TGF-β1 es de vital importancia, puesto que se piensa que esta regulación podría servir como blanco farmacológica contra el desarrollo de tumores. En nuestro laboratorio nos hemos enfocado en buscar proteínas o factores capaces de regular la activación de las vías del factor de crecimiento. Basado en la evidencia de la presencia de la proteína QM en ciertos tipos de tumores y la capacidad de ésta de interaccionar con factores transcripcionales, hemos propuesto que QM tiene la capacidad de regular a los factores Smad2,Smad3 y ERK1,2 activados por TGF-β1. Nuestros resultados indicaron que QM es capaz de modular las tres vías estudiadas en respuesta a un estímulo con TGF-β1 en células COS-7, PDV y CarC, sin embargo esta modulación fue diferente en los tres tipos celulares. Se observó que al sobre-expresar QM en células COS-7 que representan un estadio normal, las vías de Smad2 y ERK1,2 aumentan su actividad. La actividad de la vía Smad3 en células COS-7 se ve potenciada en respuesta a un estímulo con TGF-β1 en conjunto con la sobre-expresión de QM. En (el caso de) células humanas PC3 que representan un estado muy tumorogénico se observó que al sobre-expresar QM, la actividad de la vía Smad2 se ve disminuida al comparar el efecto que se observa al estimular con TGF-β1. Se obtuvo un efecto similar cuando determinamos la trans-activación del sistema Smad2-Gal4 y junto con los resultados obtenidos por western blot notamos una caída en los niveles de proteína fosforilada. Por el contrario, la actividad de la vía Smad3 se ve aumentada cuando estimulamos con TGF-β1 y sobre-expresamos QM. El efecto sobre la trans-activacion del sistema Smad3-Gal4 en conjunto con los niveles de p-Smad3 determinados por western blot muestran un aumento de la fosforilación de la proteína, lo que indicaría la mayor actividad de la vía. La actividad de la vía ERK1,2 se ve fuertemente estimulada por la presencia de QM. La trans-activación del sistema Elk1-Gal4 sugiere que la presencia de QM colabora con la fosforilación del factor Elk1 lo que indicaría la mayor actividad de la vía ERK1,2. En (el caso de las) células de ratón PDV, al sobre-expresar QM se observó que aumenta la actividad de las vías Smad2 y Smad3. Además la presencia de QM potenciaría el efecto de TGF-β1. Al determinar el efecto de QM sobre la trans-activación del sistema Smad2-Gal4 y Smad3-Gal4 esta aumento. Además los resultados obtenidos por western blot para p-Smad2 y pSmad3, muestran un aumento en los niveles de p-Smad2 y p-Smad3 cuando sobre-expresamos QM. El efecto contrario se observó cuando inhibimos la expresión de QM con siRNA. Estos resultados sugieren que QM tendría un efecto sobre la fosforilación de Smad2 y Smad3, lo que explicaría la mayor actividad de estas vías. Al sobre-expresar QM en células PDV observamos también un gran aumento de la actividad de la vía ERK1,2. La trans-activación del sistema Elk1-Gal4 aumentó al sobre-expresar QM, sugiriendo que QM tendría un efecto sobre la fosforilación de ERK, lo que explica el aumento de la actividad de la vía. Al suprimir QM en células PDV y analizar el efecto sobre la expresión de u-PA y MMP9, se observó que u-PA decae y también disminuye MMP9, aunque en menor medida. Nuestros datos también indicaron que QM tendría implicancias sobre la migración celular en células PDV. Los resultados obtenidos en nuestro trabajo permiten concluir que QM activa las vías de señalización de TGF-β1 involucradas en procesos tumorales, además de alterar la expresión de u-PA y MMP9 y favorecer la migración en células transformadas. En su conjunto, estos datos sugieren que la posibilidad de modular la expresión de QM en células tumorales aparece como una posible herramienta terapéutica para el tratamiento del cáncer en humanos

Uma série de equipamentos de eletrônica de potência é ligada à rede de corrente alternada através de transformadores, que exercem as funções de isolamento galvânico, elevação/abaixamento de tensão, etc. Estes transformadores podem sofrer saturação em condições transitórias (inrush) ou quando o conversor ligado a ele impõe valor médio não nulo de tensão. O problema é normalmente sanado nas malhas de controle do conversor, no entanto o ajuste destas malhas em ambiente de simulação computacional requer um modelo que represente adequadamente a característica de saturação do núcleo ferromagnético. Este trabalho apresenta um modelo de simulação computacional adequado para transformadores operando em saturação intensa, visando aplicações em projetos de equipamentos de eletrônica de potência com transformador monofásico alimentado por inversor. Além disso, é demonstrado um método experimental de obtenção da característica de saturação do núcleo, sem necessidade das suas características construtivas. Resultados de simulação obtidos são comparados com resultados experimentais para validação do modelo e método. / Several power electronics based equipments are connected to the alternating current network through transformers, which perform galvanic insulation, voltage increasing/lowering, etc. These transformers may experience saturation under transitory conditions (inrush), or when its converter imposes non-zero average voltage. Such problem is commonly treated in the converter\'s control loops, but the tuning of these loops in a computer simulation environment requires a transformer model that represents adequately the ferromagnetic core saturation effect. The current work proposes a computer simulation model that adequately describes the operation of the transformer at deep saturation, suitable for design of power electronics applications with single phase transformers connected to power inverter. Additionally, an experimental method for determining its core saturation characteristic is demonstrated. This method does not require previous knowledge of the core\'s constructive parameters. Simulation and experimental results are presented to confirm the validity of the model and the method.

Uma série de equipamentos de eletrônica de potência é ligada à rede de corrente alternada através de transformadores, que exercem as funções de isolamento galvânico, elevação/abaixamento de tensão, etc. Estes transformadores podem sofrer saturação em condições transitórias (inrush) ou quando o conversor ligado a ele impõe valor médio não nulo de tensão. O problema é normalmente sanado nas malhas de controle do conversor, no entanto o ajuste destas malhas em ambiente de simulação computacional requer um modelo que represente adequadamente a característica de saturação do núcleo ferromagnético. Este trabalho apresenta um modelo de simulação computacional adequado para transformadores operando em saturação intensa, visando aplicações em projetos de equipamentos de eletrônica de potência com transformador monofásico alimentado por inversor. Além disso, é demonstrado um método experimental de obtenção da característica de saturação do núcleo, sem necessidade das suas características construtivas. Resultados de simulação obtidos são comparados com resultados experimentais para validação do modelo e método. / Several power electronics based equipments are connected to the alternating current network through transformers, which perform galvanic insulation, voltage increasing/lowering, etc. These transformers may experience saturation under transitory conditions (inrush), or when its converter imposes non-zero average voltage. Such problem is commonly treated in the converter\'s control loops, but the tuning of these loops in a computer simulation environment requires a transformer model that represents adequately the ferromagnetic core saturation effect. The current work proposes a computer simulation model that adequately describes the operation of the transformer at deep saturation, suitable for design of power electronics applications with single phase transformers connected to power inverter. Additionally, an experimental method for determining its core saturation characteristic is demonstrated. This method does not require previous knowledge of the core\'s constructive parameters. Simulation and experimental results are presented to confirm the validity of the model and the method.

Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / La deposición excesiva de proteínas de matriz extracelular (MEC) se conoce como fibrosis y es una de las características de las enfermedades musculares degenerativas como la distrofia muscular de Duchenne (DMD). En esta enfermedad, la función muscular se pierde cuando las miofibras son reemplazadas por deposición de colágeno y otras proteínas de MEC. Entre los factores que desencadenan la fibrosis muscular se encuentran el Factor de Crecimiento Transformante tipo (TGF- ) y Angiotensina II (Ang II), éste último perteneciente al Sistema Renina-Angiotensina (RAS). Los principales efectos biológicos ejercidos por Ang II están mediados a través de los receptores tipo 1 y tipo 2 para Ang II denominados AT-1 y AT-2. El receptor AT-1 es responsable de mediar los efectos fibróticos dependientes de Ang II mientras que AT-2 participa como inductor de los efectos antifibróticos. En fibrosis de tejidos cardiaco, pulmonar y renal, TGF- 1 aumenta los niveles de AT-1 y AT-2, adicionando mayor complejidad a los mecanismos que regulan la fibrosis. Los efectos de TGF- 1 sobre los niveles de los receptores de Ang II en el músculo esquelético aún no se conocen. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de TGF- 1 sobre los niveles proteicos de los receptores AT-1 y AT-2 en mioblastos C2C12 y en músculo esquelético de ratón. Los resultados que se obtuvieron de los análisis in vitro en células musculares esqueléticas expuestas a TGF-b1, mostraron un aumento en los niveles proteicos de AT-2 de una manera dependiente de la dosis de TGF- 1 con un efecto máximo a las 48 h en paralelo a la inducción de fibrosis determinada por la acumulación de fibronectina y colágeno III. Sin embargo, los niveles proteicos de AT-1 no fueron afectados. Experimentos in vivo de inyección de TGF- 1 a músculo esquelético dañado de ratón, mostraron un aumento en los niveles del receptor AT-2, sin cambios en los niveles del receptor AT-1. Utilizando inhibidores farmacológicos de la actividad quinasa del receptor tipo I de TGF- y de la actividad p38 MAPK se pudo establecer que ambos eran requeridos para el aumento de los niveles proteicos de AT-2 inducido por TGF- 1, sugiriendo que el efecto es directamente mediado por los receptores de TGF- y por la vía MAPK p38. En un modelo murino de la distrofia muscular de Duchenne (ratones mdx), el cual presenta fibrosis y niveles aumentados de TGF- 1, se observó un aumento de los niveles proteicos del receptor AT-2 en diversos músculos esqueléticos comparados a los niveles observados en un ratón normal, sin embargo, los niveles del receptor AT-1 no se observó cambios. Durante la diferenciación de los mioblastos C2C12, proceso en el cual la vía de señalización de TGF- 1 se encuentra disminuida, los niveles proteicos de los receptores AT-1 y AT-2, disminuyó. Estos resultados sugieren que los niveles proteicos de AT-2, y no los de AT-1, son modulados por el factor profibrótico TGF- 1 en células musculares esqueléticas y en músculo esquelético, y que, durante la diferenciación, tanto AT-1 como AT-2 son modulados, sugiriendo así que estos receptores tienen un papel en el desarrollo y fisiopatología de la DMD / The excessive deposition of extracellular matrix (ECM) proteins is known as fibrosis and is a key hallmark of degenerative muscle diseases such as Duchenne muscular dystrophy (DMD). In this disease, muscle function is lost when myofibers are replaced by deposition of collagen and other ECM proteins. Among the factors that triggers muscle fibrosis are Transforming Growth Factor Type beta (TGF- ) and Angiotensin II (Ang II) from the Renin-Angiotensin System (RAS). Ang II exerts its biological effects mainly through two receptors, AT-1 and AT- 2, where AT-1 is responsible for Ang II fibrotic effects and AT-2 mediates antifibrotic effects. In cardiac, pulmonary and renal fibrotic tissues TGF- 1 increases AT-1 and AT-2 levels adding more complexity to the mechanisms that regulate fibrosis. The effects of TGF-b on the AngII receptor levels in skeletal muscle are not know. The aim of this work was to evaluate the effect of TGF- 1on protein levels of AT-1 and AT-2 receptors. The results were determined by western blot assays, and they show that TGF- 1 increases fibronectin and collagen III expression in C2C12 cells. We also determined that AT-2 protein levels were increased in a dose-dependent manner with a maximal effect at 48 h. However, levels of AT-1 remain unchanged. In vivo experiments in a mice damage skeletal muscle model injected with TGF- 1 shown an increase of AT-2 protein level and no changes were observed in AT-1 protein level. TGF- 1-dependent increase of AT-2 is abolished when cells were treated with a specific inhibitor of the TGF- receptor I kinase activity and with an inhibitor of p38 MAPK pathway, suggesting that the effect is directly mediated by TGF- receptors and p38 MAPK pathway. In a murine model of DMD (mdx mice), which presents fibrosis and augmented TGF- 1 levels, AT-1 and AT-2 receptors were evaluated in several muscles, AT-1 levels remain unchanged and AT-2 levels were augmented in dystrophic muscles. However, during differentiation, in which TGF- pathway is downregulated, C2C12 myoblasts, diminished the expression of AT-1 and AT-2 receptors. These results suggest that AT-2 protein levels, and not AT-1 levels, are differentially modulated by the profibrotic factor TGF- 1 in skeletal muscle cells and skeletal muscle, and during differentiation AT-1 and AT-2 are modulated, suggesting that these receptors have a role in the development and physiopathology of DMD. / FONDECYT

Made available in DSpace on 2014-06-12T17:37:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo980_1.pdf: 2020019 bytes, checksum: 40c1f258550dae6f86a1d0dd8c559e29 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / O problema da localização de reservas técnicas em instalações industriais tem caráter bastante específico, sendo raramente encontrado na literatura. Não obstante, essa questão se reveste de grande relevância para o desempenho do processo produtivo subjacente, uma vez que a disposição desses ativos tem influência direta sobre a mantenabilidade do sistema e, por conseguinte, afeta a disponibilidade da planta de produção. Tais efeitos refletem na qualidade do produto, especialmente no caso dos sistemas de produção de serviço. Além disso, a percepção do cliente em relação às falhas ou não conformidades do produto é imediata; as conseqüências desses eventos são geralmente irreversíveis para o usuário do serviço, podendo ocasionar prejuízos de ordem econômica ou de natureza intangível. Este estudo trata da localização de reservas técnicas para transformadores de potência em subestações de uma concessionária de energia elétrica. O problema é abordado mediante uma metodologia multicritério de apoio à decisão, fundamentada na teoria da utilidade multiatributo, para a obtenção de soluções eficientes, interpretadas como recomendações aos gerentes responsáveis pela gestão desses ativos. É proposta uma série de modelos de localização que são adotados de acordo com a conveniência, a fim de contemplar diferentes cenários para reservas únicas ou múltiplas. A progressiva evolução entre os modelos permite incorporar aspectos específicos do sistema de produção em apreço, tais como: arranjo das subestações, propensão à falha dos equipamentos, capacidade e raio de cobertura das reservas técnicas. Como os resultados obtidos do estudo de caso se mostraram coerentes e robustos, indicando soluções que refletem o melhor compromisso entre o conjunto de objetivos previamente estabelecidos para o atendimento global do sistema de produção abordado, fica evidenciado que a adoção desses modelos, no contexto do planejamento da manutenção, propicia um aproveitamento mais racional dos recursos de reserva técnica disponíveis

Resumo não disponível.

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:09:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 patricia_ferrao_ioc_dout_2014.pdf: 4007869 bytes, checksum: 0e78144e6b2359cfeef2c86295e32ff0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas é a principal causa de lesões cardíacas em jovens adultos economicamente produtivos em áreas endêmicas da América Latina. A cardiopatia chagásica (CC) se caracteriza como uma doença progressivamente debilitante, na qual o TGF-\03B2 desempenha papel fundamental para o desenvolvimento da fibrose e hipertrofia cardíacas, através da regulação de componentes da matriz extracelular (MEC), tais como a fibronectina, as metaloproteases (MMPs) e os inibidores teciduais das MMPs (TIMPs). No presente estudo, foi verificada a capacidade do inibidor farmacológico da via de TGF-\03B2, SB-431542, em restaurar o equilíbrio da MEC, rompido pela infecção por T. cruzi, e os prováveis mecanismos envolvidos neste processo. Para tal, utilizamos um modelo tridimensional (3D) de cultivo de células cardíacas (denominados esferóides cardíacos), capaz de mimetizar aspectos da arquitetura e fisiologia do tecido cardíaco. O tratamento dos esferóides cardíacos infectados por T. cruzi com SB-431542 resultou na redução parcial da hipertrofia e fibrose dos esferóides cardíacos, por mecanismos envolvendo a redução na expressão de TIMP-1, o aumento na atividade das MMPs 2 e 9, a redução na expressão da fibronectina e a redução da carga parasitária Através de uma abordagem proteômica, conseguimos ainda identificar outras proteínas possivelmente envolvidas no processo de reversão da fibrose e hipertrofia dos esferóides cardíacos a partir do tratamento com SB-431542, como as integrinas, fibulinas, proteínas de ligação ao selênio, a titina, entre outras. Além disso, as análises proteômicas nos permitiram identificar alguns dos componentes moleculares envolvidos no processo de remodelamento do tecido cardíaco disparado pela infecção por T. cruzi, auxiliando assim, na compreensão dos mecanismos associados à progressão da hipertrofia e da fibrose ao longo do desenvolvimento da CC. Dessa forma, nosso estudo fornece novas perspectivas sobre os mecanismos moleculares através dos quais o composto SB-431542 é capaz de reverter a fibrose e a hipertrofia gerada pelo T. cruzi durante a CC, além de validar o modelo 3D de cultivo de células cardíacas como uma ferramenta eficaz para a avaliação in vitro de compostos anti-fibróticos e agentes tripanossomicidas / Chagas disease represents the leading cause of cardiac lesions in economically productive adults in endemic areas of Latin America. Chagasic cardiomyopathy (CC) is a progressive dysfunctional illness, in which TGF - β plays a central role in development of f ibrosis and hypertrophy through regulation of extracellular matrix (ECM) components, such as fibronectin, matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs). In the present study we tested the efficacy of a pharmacological inhibitor of TGF - β signaling pathway, SB - 431542, in restoring ECM balance disrupted by T. cruzi infection and the possible mechanisms involved in this process. For that, we used a three - dimensional (3D) model of cardiac cells culture (named cardiac sphero ids) that can mimic aspects of architecture and physiology of living cardiac tissues better than conventional two - dimensional (2D) models. Treatment of T. cruzi - infected - cardiac spheroids with SB - 431542 resulted in a reduction of spheroids hypertrophy and fibrosis by mechanisms involving a decrease in the expression of TIMP - 1, an increase in the activities of MMP - 2 and MMP - 9, a reduction in the expression of fibronectin and a reduction of parasite load. Moreover, we identified through a proteomic approach , other proteins possibly involved in reversion of fibrosis and hypertrophy of cardiac spheroids after treatment with SB - 431542, such as integrins, fibulins, selenium binding proteins and titin, among others. In addition, the proteomic analysis allowed us to identify molecular components involved in tissue remodeling generated by T. cruzi infection, assisting in the comprehension of mechanisms related to fibrosis and hypertrophy progression during CC’s development. Thus, our study provides new insights over t he molecular mechanisms by which SB - 431542 reverts fibrosis and hypertrophy generated by T. cruzi during CC and also validates the 3D model of cardiac cells culture as a powerful tool to evaluate in vitro the effect of anti - fibrotic and trypanocidal agents

Made available in DSpace on 2016-03-01T13:55:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 tatiana_silva_ioc_mest_2015.pdf: 3067653 bytes, checksum: 41c1cf15490ae626f7e3749c47bd19a5 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As manifestações mais severas da doença de Chagas são a cardiomiopatia e fibrose cardíaca, mas o tecido muscular esquelético também é afetado pela infecção pelo T. cruzi, resultando em necrose e miosite. O acúmulo de matriz extracelular (MEC) durante o processo de fibrose está envolvido com a patogenia da doença de Chagas, mas seus mecanismos de regulação durante a infecção ainda não estão elucidados. Assim, nos propomos a comparar a resposta de cardiomiócitos (CM), fibroblastos cardíacos (FC) e mioblastos esqueléticos (L6E9) infectados pelo T. cruzi frente ao estímulo de TGF-\03B2, importante citocina fibrogênica envolvida no desenvolvimento da cardiomiopatia chagásica, analisando também os mecanismos de sinalização envolvidos neste processo. FC foram purificados a partir de culturas de CM. Purificação adequada de FC foi obtida somente a partir da 5ª dissociação de culturas de CM, revelada pela baixa detecção de desmina, proteína específica de cardiomiócitos. Culturas de CM, FC e L6E9 normais e infectados pelo T. cruzi (cepa Y) foram tratadas por 1h ou 48h com TGF-\03B2 (1-10 ng/ml). A expressão de FN, SMAD 2 fosforilada (PS2), fosfo-p38 e fosfo-c-Jun foram avaliadas por Western blot (WB) após 1h e 48h de tratamento com TGF-\03B2 (1-10 ng/ml). Análises de WB revelaram que mioblastos L6E9 e FC apresentam aumento de FN já a partir de 1ng/ml de TGF-\03B2, em contraste com CM, em que só foi observado aumento de MEC com 15ng/mL. A infecção pelo T. cruzi induziu uma diminuição da expressão deste componente de MEC em L6E9. FC, por sua vez, apresentam modulação de FN de acordo com o grau de infecção da cultura, com culturas com baixo grau de infecção apresentando redução de FN e culturas altamente infectadas mostrando aumento desta proteína de MEC. A distribuição de fibronectina (FN) também foi analisada por imunofluorescência indireta FC e L6E9 apresentaram um aumento na expressão de FN a partir de 1ng/ml de TGF-\03B2, confirmando o WB. Após infecção pelo T. cruzi, foi observada uma desorganização e redução na expressão de FN em CM, FC e L6E9 infectados, enquanto células não infectadas adjacentes apresentaram perfis de FN similares ao controle. A resposta diferencial entre os tipos celulares frente ao estímulo com TGF-\03B2 resulta de mecanismos distintos de sinalização intracelular, uma vez que FC e L6E9 apresentam maior disparo da via de SMADs que CM, enquanto a via de p38 (independente de SMADS) é menos estimulada em FC quando comparados com CM e L6E9. Também foi avaliado o perfil de expressão de proteínas das vias de sinalização clássica e alternativa do TGF-\03B2 em culturas de FC normais e infectados com T. cruzi e tratados com 10ng/ml da citocina. Culturas infectadas e tratadas com TGF-\03B2 (10ng/ml) apresentaram uma redução nos níveis de fosforilação de SMAD 2 quando comparados com células normais tratadas. Culturas de FC infectadas não apresentaram aumento de fosfo-p38MAPK, mas disparo na via foi observado após tratamento com 10ng/ml de TGF-\03B2 em FC infectados. Aumento na fosforilação de c-Jun após a infecção e após tratamento com 10ng/ml de TGF-\03B2 também foi detectado em FC. Em conjunto, nossos dados sugerem que a expressão de FN é modulada diferencialmente por TGF-\03B2 em mioblastos L6E9, FC e CM, e que as vias moduladas por SMADS, p38 MAPK e c-Jun possam estar participando no processo de regulação de fibrose mediado pela citocina TGF-\03B2 após infecção pelo T. cruzi / The most severe manifestations of Chagas disease are cardiomyopathy and cardiac fibrosis, but the skeletal muscle tissue is also affected by T. cruzi infection, resulting in necrosis and myositis. The accumulation of extracellular matrix (ECM) during the fibrosis process is involved in the pathogenesis of Chagas disease, but the mechanisms of its regulation during infection are not clear yet. Therefore, we propose to compare the response of cardiomyocytes (CM), cardiac fibroblasts (CF) and skeletal myoblasts (L6E9) infected with T. cruzi after TGF - β stimulation, which is an important fibrogenic cytokine involved in the development of Chagas cardiomyopathy, also analyzing the signaling mechanisms involved in this process. CF were purified from CM cultures . Adequate purification was obtained after the 5th dissociation of CM cultures , as revealed b y low detection of desmin, a cardiomyocyte - specific protein. Cultures of normal and T. cruzi (Y strain) infected CM, CF and L6E9 were treated for 1h or 48 hs with TGF - β (1 - 10 ng/ml) . The expression of FN , phosphorylated SMAD 2 (PS2), phospho - p38, and phospho - c - Jun were also evaluated by Western blot (WB) after 1h and 48h treatment with TGF - β (1 - 10 ng / ml). WB analysis revealed that CF and L6E9 showed an increase in FN expression from 1ng/ml of TGF - β , contrasting to CM, in which an increased in ECM was only o bserved after 15ng/ml treatment . T. cruzi infection induced a decrease in the expression of this ECM component in L6E9. CF presented FN modulation according to the d egree of infection of the culture, with cultures containing a low degree of infection presenting a reduction of FN and highly infected cultures showing an increase of this ECM protein. T he distribution of fibronectin (FN) was also analyzed by indirect immu nofluorescence. CF and L6E9 displayed a raise in FN expression rfom 1 ng/mL, confirming WB. After T. cruzi infection, disorganization and reduced FN expression was observed in infected CM , CF and L6E9, while adjacent uninfected cells showed similar FN prof iles as controls. The differential response between cellular types facing TGF - β stimulation results from distinct intracellular signaling mechanisms, since CF and L6E9 have higher activation of SMAD s pathway than CM, while p38 pathway (independent of SMAD S ) is less stimulated in CF when compared to CM and L6E9. We also evaluated the protein expression profile of classical and alternative TGF - β signaling pathways in normal and T. cruzi infected CF cultures, treated with 10 ng/ml of the cytokine. Infected CF cultures treated with TGF - β (10ng/ml) showed a reduction in the levels of phosphorylation of SMAD 2 when compared with normal and treated controls. CF infected cultures did not show increased phosphorylation of p38MAPK, but activation in the pathway was ob served after treatment with 10 ng/ml TGF - β . An increase in phosphorylation of c - Jun after infection and after treatment with 10 ng/ml TGF - β was also detected in CF. When considered together, o ur data suggest that FN expression is differentially modulated b y TGF - β in L6E9 mioblasts, CF and CM, and pathways modulated by SMAD S, p38 MAPK and c - Jun may be participating in fibrosis regulatory process mediated by with TGF - β cytokine after T. cruzi infection

Made available in DSpace on 2016-03-28T12:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 patricia_ferrao_ioc_dout_2014.pdf: 5118660 bytes, checksum: d25122b18e1bcb82dee22e425b2ed062 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Estudos recentes mostraram que TGF-\03B2 esta envolvido na cardiopatia chagásica aguda e crônica. O aumento de seus níveis plasmáticos e a ativação da sua via de sinalização celular são aspectos peculiares da doença chagásica crônica. Além do seu relevante papel na patologia chagásica, também se observou que esta citocina está intimamente associada ao T. cruzi como um regulador de diferentes etapas de seus ciclo de vida. Trabalhos anteriores demostraram que T. cruzi é capaz de ativar TGT-\03B2 latente, utilizando-o na invação às células hospedeiras e que amastigotas de T. cruzi se ligam e internalizam TGF-\03B2 recombinante, estando este evento relacionado à capacidade de proliferação de amastigotas e sua diferenciação em tripomastigotas no final do ciclo intracelular. Este conjunto de informações nos levou ao questionamento de quais moléculas de T. cruzi poderiam estar envolvidas nos processos de proliferação e diferenciação celular frente ao estímulo por TGF-\03B2. Neste sentido, o presente projeto tem por principal objetivo a caracterização de moléculas responsivas ao estimulo de TGF-\03B2 através de uma abordagem fosfoproteômica. Para tal, extratos de proteínas totais de epimastigotas de T. cruzi (cepa Y), incubadas ou não com TGF-\03B2, foram preparados durante a fase exponencial de crescimento do parasito. Evidenciamos que a dose ótima de TGF-\03B2 para maior indução de fosforilação seria de 5 ng/ml. em seguida, o tempo ótimo de indução com TGF-\03B2 (1,5,15,30 e 60 minutos) foi testado e concluímos que as diferenças entre os padrões de fosforilação são muitos sutis em géis unidimensionais, nos fazendo optar pela análise exclusiava dos perfins em géis bidimensionais de 7 cm com faiza de PH 3-10 não-linear. A avaliação dos perfis bidimensionais demonstrou diferenças nos padrões de fosforilação entre os tempos estudados, nos levando a manter um estudo de cinética de tempo. As imagens dos géis foram analisadas e algumas das proteínas consideradas responsivas a TGF-\03B2 foram identificadas por espectrometria de massas. Observamos que as proteínas de choque térmico, tubulinas, desidrogenases, enolases, ciclofilina A, GrpE, cruzipaína, fator de elongamento 1-\03B1, fator de iniciação eucariótica 5a, entre outras, têm sua fosforilação e/ou expressão moduladas em resposta a TGF-\03B2. Buscamos correlacionar a função já descrita na literatura para cada proteína com seu possível papel na sinalização intracelular dsparada por TGF-\03B2, em concordância com o comportamento de fosforilação e/ou expressão apresentado em novas análises. Por último, foi avaliado se a adição de TGF-\03B2 a culturas de epimastigotas teria algum efeito sobre a proliferação dos parasitos. Verificamos que a adição de TGF-\03B2 promoveu um aumento de até 73% no crescimento dos parasitos nas primeiras 24 horas de estudo. O conjunto de dados obtidos contribui para a elucidação dos mecanismos moleculares relacionados à sinalização de TGF-\03B2, proporcionando uma fonte para detecção de novos alvos terapêuticos para a doença de Chagas / Recent studies show that TGF - β is involved in the acute and chronic chagasic cardiopathy. High levels of TGF - β and the activation of its signaling pathway were shown to be peculiar aspects of patients with chron ic Chagas disease. Besides its relevant role in the pathology of Chagas dis ease, this cytokine was also observed to be intimately associated with Trypanosoma cruzi as a regulator of different stages of the parasite ́s life cycle. Previous works have show n that T. cruzi , using it in the process of h ost cell invasion. In addition, amastigote forms are able to bind and internalize recombinant TGF - β , and this event is related to their capacity to proliferate and differentiate int o trypomastigote forms at the end of the intracellular cycle. Taken togethe r, this set of information raises the question as molecules are involved in the processe of cellular proliferation and differentiation stimulated by TGF - β . Therefore, this work aims to characterize TGF responsive molecules through a pho sphoproteomic approach. For this purpose, total T. cruzi epimastigotes (Y strain), incubated or not with TGF were prepared from parasites in the exponential gro wth phase. We determined that 5 was the dose that induce d the highest number of phosphorylation events. Next, the optimal induction time (1, 5, 15, 30 and 60 minutes) was evaluated and we concluded that the phosphorylation patterns from the studied times showed only subtle differences using 1 -DE analysis, leadi ng us to evaluate these profiles DE gels (7cm pH 3 -10 non- linear). The profiles obtained showed differences in phosphorylation patterns duri ng the time - which led us to maintain a time - kinetics study. Gel images wer responsive proteins were identified by mass spectr ometry. We observed that heat shock proteins, tubulins, dehydr ogenases, enolases, cyclophilin A, GrpE, cruzipain, elongation factor - 1 α , eukaryotic initiation factor their phosphorylation and/or expression levels modu lated by TGF correlate the function already described in the lit erature for each protein with their possible role in intracellular signaling triggered by TGF - β , in agreement with thei phosphorylation and/or expression behavior shown in our analysis. Finally, we assessed whether the addition of TGF - β to epimastigotes cultures would have some effect on parasite proliferation. We found that TGF - β addition led to an increase of up in parasite growth in the first 24 hours of culture . The data presented here contributes to the elucidation of the molecular mec hanisms related to TGF , providing a source of new potential therapeutic t argets against in response to TGF - β is involved in the acute and chronic chagasic and the activation of its signaling pathway were shown to be peculiar aspects of patients with chron ic Chagas disease. Besides its ease, this cytokine was also observed to as a regulator of different stages of T. cruzi is able to activate ost cell invasion. In addition, amastigote , and this event is related to their capacity to proliferate and differentiate int o trypomastigote forms at the end of r, this set of information raises the question as molecules are involved in the processe of cellular proliferation and . Therefore, this work aims to characterize TGF - β sphoproteomic approach. For this purpose, total epimastigotes (Y strain), incubated or not with TGF - β , were prepared from parasites in the exponential gro wth phase. We determined that 5 d the highest number of phosphorylation events. Next, the optimal induction time (1, 5, 15, 30 and 60 minutes) was evaluated and we concluded that the phosphorylation patterns from the studied times showed ng us to evaluate these profiles linear). The profiles obtained - course under study, kinetics study. Gel images wer e analyzed and responsive proteins were identified by mass spectr ometry. We observed that heat shock proteins, tubulins, dehydr ogenases, enolases, cyclophilin , eukaryotic initiation factor -5a and others had their phosphorylation and/or expression levels modu lated by TGF - β . We tried to correlate the function already described in the lit erature for each protein with their , in agreement with thei r phosphorylation and/or expression behavior shown in our analysis. Finally, we to epimastigotes cultures would have some addition led to an increase of up in parasite growth in the first 24 hours of culture . The data presented here contributes to the elucidation of the molecular mec hanisms related to TGF - β , providing a source of new potential therapeutic t argets against Chagas disease

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 fabiane_oliveira_ioc_mest_2011.pdf: 3896096 bytes, checksum: 9a40f48ee5a31a58097d262a13401dc9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O fator de crescimento de transformação beta (TGF-\03B2) é uma citocina multifuncional envolvida na modulação de diversos processos celulares, como proliferação celular, formação e degradação de matriz extracelular, tanto em eventos fisiológicos como patológicos. Nosso grupo tem demonstrado o papel regulador de TGF-\03B2 na invasão, crescimento e diferenciação do Trypanosoma cruzi (T. cruzi), o agente etiológico da doença de Chagas, uma importante causa de mortalidade e morbidade em países endêmicos na América latina. Haja vista que o remodelamento da matriz extracelular está diretamente relacionado à extensa fibrose observada no curso da doença de Chagas, nosso objetivo foi avaliar a ação terapêutica de um inibidor da via de sinalização de TGF-\03B2 (GW-788388) sobre a infecção aguda experimental pelo T. cruzi. Para essa análise foi utilizado o modelo de infecção pelo T. cruzi (cepa Y) em camundongos suíços submetidos ao tratamento oral com o composto em diferentes dias pós-infecção (3º, 13º e 20º dpi). Nossos dados revelaram diferentes respostas terapêuticas de acordo com o dia pós-infecção no qual o composto foi administrado. Quando administrado no 3º dpi, GW-788388 foi capaz de reduzir: (i) o parasitismo tissular e inflamação no coração e fígado; (ii) os níveis plasmáticos de AST, ALT e uréia e; (iii) a deposição de colágeno I e fibronectina no coração dos animais infectados. Neste esquema de tratamento, GW-788388 reverteu ainda a queda na expressão de conexina-43 e os danos de condução elétrica, sugerindo um papel protetor contra os danos cardíaco, hepático e renal, induzidos na infecção por este parasito. Interessantemente, o tratamento no 13º dpi com GW-788388, apesar de não alterar os parâmetros parasitológicos e clínicos avaliados em relação ao grupo não tratado, aumentou a mortalidade, sugerindo a relevância da via de TGF-\03B2 neste período da infecção em que os camundongos estão em choque sistêmico. No entanto, quando a administração do composto foi realizada no 20º dpi, os resultados revelaram uma significativa diminuição na expressão de colágeno I, indicando a eficiência deste tratamento em promover a degradação dos elementos de matriz no tecido cardíaco infectado. Em resumo, a inibição da via de sinalização de TGF-\03B2 reduziu a infecção pelo T. cruzi, previniu os danos cardíacos e reverteu a deposição de componentes de matriz extracelular, observados durante esta infecção in vivo. O conjunto dos resultados apresentados sugere que o bloqueio da atividade de TGF-\03B2 pode representar uma importante intervenção terapêutica a ser investigada em modelos de infecção aguda e crônica pelo T. cruzi. / Transforming growth factor beta (TGF - β ) is a multifunctional cytokine involved in modulating many cellular processes such as cell prolife ration, formation and degradation of extracellular matrix in physiological and pathological events. Our group has demonstrated the regulatory role of TGF - β in parasite host - cell invasion, growth and differentiation of Trypanosoma cruzi ( T. cruzi ), the eti ologic agent of Chagas disease, an important cause of morbidity and mortality in endemic countries in Latin America. Considering that the extracellular matrix remodeling is directly related to the extensive fibrosis observed in Chagas disease outcome, our objective was to evaluate the therapeutic action of an inhibitor of the signaling pathway of TGF - β (GW - 788388) during acute experimental T. cruzi infection. For this analysis we used the model of T. cruzi infection (Y strain) in Swiss mice subjected to oral treatment with the compound at different days post - infection (3 rd , 13 th and 20 th dpi). Our data revealed different therapeutic responses according to the day post - infection in which the compound was administered. When administered in the 3 rd dpi, GW - 788388 was able to reduce: (i) the tissue parasitism and inflammation in heart and liver, (ii) the pl asma levels of AST, ALT and urea, and (iii) collagen I and fibronectin deposition in the hearts of infected animals. In this treatment scheme, GW - 788388 reversed the decrease of connexin - 43 expression and electrical conduction damages, suggesting a protect ive role of this compound in the heart, kidney and liver damage, induced by this parasitic infection. Interestingly, treatment in the 13 th dpi with GW - 788388, although presented similar parasitological parameters in relation to the untreated group, an incr eased mortality was observed, suggesting the relevance of TGF - β pathway in this period of the infection, in which mice were in systemic shock. However, when the compound administration was performed at the 20 th dpi, the results revealed a significant collagen I expression decrease, indicating the effectiveness of thi s treatment in promoting the degradation of extracellular matrix elements in the infected cardiac tissue. In summary, TGF - β signaling pathway inhibition reduced the infection by T. cruzi , prevented heart damage and reversed the extracellular matrix compone nts deposition, observed during this infection in vivo . The combined results suggest that blocking the activity of TGF - β may represent an important therapeutic intervention to be investigated in acute and chronic models of T. cruzi infection.