Resumo não disponível.

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Memoria para optar el título de Bioquímico / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / En las últimas décadas el cáncer se ha establecido como una de las principales causas de muerte. Por eso es importante dilucidar los mecanismos por los cuales se genera esta enfermedad con el fin de combatirla. El estudio de esta enfermedad es complejo, y debido a los modelos que se han generado para estudiar este mal, se ha logrado llegar a comprender mejor esta enfermedad. Entre los modelos actuales de cáncer, se encuentra el modelo de carcinogénesis química de piel de ratón, el cual nos permite abarcar en su totalidad el estudio de la progresión tumoral. Una de las líneas de investigación del cáncer es el estudio de la citoquina TGF-ß1, citoquina multifuncional que modula muchos procesos íntimamente relacionados con cáncer. En la actualidad se acepta que TGF-ß1 posee un rol dual en la progresión tumoral, debido a que este factor puede tanto inhibir como estimular la tumorogénesis, dependiendo del estadío en la progresión tumoral en el cual se encuentren las células que están bajo su estímulo. TGF-ß1 actúa sobre la célula modulando funciones determinadas mediante vías de transducción de señales. Entre estas vías la vía Smad3 y la vía ERK1/2, ambas importantes por su conexión con el cáncer. La activación de las vías de transducción de señales tiene como efecto, entre otros, un aumento en las proteínas relacionadas con la metástasis, como uPA, PAI-1 y MMP9. Estas proteínas participan activamente en la degradación de la matriz extracelular, proceso imprescindible para la migración y por ende la malignidad. Además de una mayor capacidad degradativa, en la célula tumoral se producen cambios morfológicos que facilitan su motilidad y por tanto la malignidad. Las células epiteliales bajo el estímulo de TGF-ß1 sufren un proceso denominado transición epitelio-mesenquimática (TEM). La TEM se relaciona con una mayor independencia celular, y una mayor migración debido a una morfología más fibroblastoidea de las células. Este proceso está asociado a una disminución de cadherina-E y a un aumento de vimentina. La TEM es un proceso importante en la búsqueda de terapias contra el cáncer y es por eso que los esfuerzos se han centrado en entender los mecanismos y las proteínas que modulan las señalizaciones de TGF-ß1, y por ende este proceso. Entre estas proteínas se ha descrito Skip, proteína asociada a la maquinaria de maduración de los mRNA y a la transcripción. Además esta proteína interactúa con proteínas virales relacionadas con el cáncer. Skip también tiene la capacidad de activar la vía Smad3 bajo el estímulo de TGF-ß1, lo cual nos sugiere un posible papel de Skip en la progresión tumoral inducida por TGF-ß1. Nuestros resultados mostraron que Skip puede regular las vías de transducción de TGF-1, Smad3 y ERK1/2, además de la expresión de uPA, PAI-1 y MMP9 tanto en células PDV como en células humanas de cáncer de próstata, PC-3. A su vez TGF-ß1 regula la expresión de Skip en forma dependiente del tipo celular, lo cual podría tener relación con el efecto que produce Skip sobre las vías moduladas por TGF-ß1. También se investigó la relación entre Skip y TEM. En este ámbito nuestros resultados indicaron que la disminución en la expresión de Skip evita que se realice el proceso de TEM. Esto quedó evidenciado en las células con menor expresión de Skip (C14), ya que en estas no se formaron los filamentos de vimentina, así como tampoco las fibras gruesas y largas en la periferia celular que son inducidas normalmente por TGF-ß1 en células PDV. Además nuestros datos indicaron que la disminución en la expresión de Skip produce una meno migración bajo el estímulo de TGF-ß1 en las células PDV, lo que indica que dicha disminución implica una resistencia a la inducción de la malignidad de las células PDV debida a TGF-ß1. Estas evidencias indicarían que Skip podría ser un blanco posible para bloquear procesos de malignidad debido a TGF-ß1, sin embargo antes es necesario estudiar el efecto de Skip sobre la TEM en células humanas. En función de esto se podrían diseñar estrategias para evitar el proceso de TEM, lo que impediría una de las etapas cruciales en la malignidad

Los tumores de mama pertenecen a un grupo de lesiones neoplásicas denominadas tumores desmoplásicos que, bajo la influencia de ciertos factores epiteliales, originan una estructura estromal rígida responsable de la consistencia dura de la masa tumoral. Este proceso fibrótico ocurre en etapas tempranas de la enfermedad, es controlado por una forma de fibroblastos conocidos como miofibroblastos, o fibroblastos activados, y sus mecanismos son pobremente comprendidos. La activación del tejido estromal es una etapa fundamental en la progresión tumoral, permitiendo tanto la adquisición de propiedades malignas en células epiteliales, como la capacidad invasiva y metastásica. En esta memoria de título estudiamos la miodiferenciación de fibroblastos mamarios no tumorales RMF-EG, frente al estímulo de TGF-β1, secretado por células tumorales y que es abundante en el microambiente tumoral. Los resultados mostraron que 5ng/mL de TGF-β1 aumentó la expresión de actina α-SMA, marcador de miofibroblastos, y de CTGF, molécula asociada a diversos desórdenes fibróticos. A través del uso del inhibidor DPI y el knock-down de NOX4 demostramos que TGF-β1 promovió un ambiente oxidativo que favoreció la miodiferenciación fibroblástica de células RMF-EG. Determinamos también que TGF-β1 activó la ruta de señalización JNK1,2 y que esta activación era fundamental para el aumento de la expresión de CTGF, NOX4 y α-SMA. Estudiamos la influencia de la activación de esta ruta alternativa junto con el aumento del tenor oxidativo, sobre la activación de la ruta canónica Smad2,3. Los resultados mostraron que el aumento en la expresión de NOX4 y la fosforilación de JNK1,2 actuaban de manera sinérgica para activar la ruta Smad2,3. En conjunto, estos resultados demuestran que TGF-β1 provoca la miodiferenciación de fibroblastos no tumorales, a través de un mecanismo que requiere de la activación de JNK1,2, el aumento temprano de la expresión de CTGF y NOX4 con un consecuente aumento de los niveles intracelulares de ROS. / Memoria para optar al título de Bioquímico / Brest tumors belong to a group of neoplastic lesions known as desmoplastics or scirrhous tumors which, under the influence of tumor cell factors, originate a fibrous structure responsible for the hard consistency of the tumor mass. This fibrotic process occurs during early stages of the disease, it is orchestrated by activated fibroblast i.e. myofibroblast and its mechanisms are poorly understood. Activation of the stromal compartment is a critical step in tumor progression, enabling the epithelial acquisition of malignant properties, such as invasive and metastatic capacities. In the present study, we investigated the myofibroblastic differentiation of normal human mammary fibroblast RMF-EG, induced by TGF-β1, a growth factor secreted by tumor cells and abundant in tumor microenvironment. Our results reveal that a 5ng/mL TGF-β1 stimulus increased the expression of myofibroblast marker α-SMA and CTGF, a molecule associated to several fibrotic disorders. Using a NOX inhibitor (DPI) and a siRNA for NOX4, we demonstrated that TGF-β1 promoted an oxidative environment that favors myofibroblastic differentiation of RMF-EG cells. We also determined that TGF-β1-dependant activation of JNK1,2 was essential for CTGF, NOX4 and α-SMA increased expression. We assessed the influence of JNK1,2 activation and NOX4 activity on canonical Smad2,3 activation. Our results reveal that the TGF-β1-dependant increase of NOX4 expression and JNK1,2 phosphorylation induced a synergical activation of the canonical TGF-β1 pathway, Smad2,3.Taken together, these results demonstrate that TGF-β1 promotes myofibroblastic differentiation of normal fibroblasts RMF-EG through a mechanism that requires JNK1,2 activation, early increase of CTGF and NOX4 expression with a consequent increase of intracellular ROS levels

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctora en Farmacología / La fibrosis cardiaca se genera por un depósito exagerado de proteínas de matriz extracelular (MEC) producto de la activación de los fibroblastos (FC). Estas células, representan cerca de un 60 a 70% de las células del corazón, y en respuesta a un daño, son activadas por diversas citoquinas y factores de crecimiento (entre ellas, TGF-β1, Ang II, etc.), los que desencadenan en ellas un cambio estructural y funcional que las diferencia a miofibroblastos cardiacos (MFC). Los MFC tienen como principal función la de secretar proteínas de la MEC con el fin de contraer y reparar la zona dañada en el caso de un infarto al corazón. Así, el MFC juega un papel crucial en la respuesta frente a un daño en el tejido cardiaco. A pesar de ello, es muy poco lo que se sabe con respecto al comportamiento de este tipo celular frente al remodelado cardiaco. Además, se tiene un escaso conocimiento acerca de los receptores celulares que presenta este tipo celular, pudiendo ser piezas claves en la regulación de la secreción exacerbada de MEC y por tanto, de la generación de fibrosis del tejido. En la fibrosis cardiaca, adquiere gran importancia la participación del sistema calicreina-cinina. Se ha propuesto que la ausencia de los receptores de cininas es deletérea a nivel del tejido cardiaco, especialmente en la respuesta frente a una injuria. Dentro de este sistema, se encuentran bradicinina (BK) que actúa sobre el receptor B2 de cininas (B2R) y lis-des-Arg-BK (DAKD) que ejercen su acción sobre el receptor B1 (B1R). En FC se ha demostrado que, BK produce liberación de NO y de prostaglandinas, además de reducir la secreción de colágeno. Sin embargo, en MFC se desconocen que subtipos de receptores están presentes, así como las vías transduccionales que se activan tras la estimulación de ambos subtipos de receptores. En la presente tesis y de acuerdo con el contexto, se realizaron diversos experimentos para demostrar la existencia y funcionalidad de los receptores de cininas tanto en FC como en MFC. Por western blot (WB) se evidenció la presencia de ambos receptores tanto en FC como en MFC, no obstante, la expresión de B1R es mayor en MFC que FC; mientras que B2R permanece constante. La expresión de B1R aumentó tras el tratamiento de FC con TGF-β1, principal diferenciador a MFC. Además mediante las técnicas de inmunofluorescencia y ensayos de radioligando, se determinó que en FC el B1R se encuentra localizado principalmente a nivel intracelular, mientras que en MFC se localiza marcadamente en las membranas plasmáticas. Por otro lado, mediante el análisis de los movimientos de calcio intracelular, se demostró que B2R es funcional en ambos tipos celulares, mientras que B1R es funcional en MFC y no así en FC. Sin embargo, en FC la preincubación con el agonista de B1R (DAKD), y la posterior estimulación (30 min) con el mismo agonista, mostró que estos receptores son también funcionales. Mediante inmunofluorescencia se evidenció que tras la preincubación con el agonista existe una relocalización de B1R hacia las membranas plasmáticas, dónde son capaces de generar movimientos de calcio intracelular, demostrando que también son receptores activos. Además, en MFC se demostró que la activación de B1R y B2R por sus respectivos agonistas induce una reducción en la expresión de colágeno I (Col I). En FC, la activación de B2R induce la disminución en los niveles de Col I, mientras que la activación de B1R que provoca la reducción en la expresión de Col I, requiere de un estímulo previo que redistribuya este receptor hacia la membrana plasmática. Finalmente, el uso de distintos inhibidores permitió demostrar que en MFC, tanto la activación de B1R como B2R, conducen a la disminución en la expresión de Col I a través de la activación de una vía transduccional que es compartida por ambos receptores, y que corresponde a: PKC/PLA2/COX-2/PGI2/IPR. En resumen, los resultados de esta tesis sostienen que en MFC la activación de B1R y B2R conduce a la disminución de la expresión de Col I, lo cual se relaciona a los efectos antifibróticos de las cininas en el progreso de patologías como la fibrosis cardiaca / Cardiac fibrosis is generated by an excessive deposit of extracellular matrix proteins (ECM) product of fibroblast (CF) activation. These cells account for about 60 to 70% of the cells in the heart. In response to injury, fibroblasts are activated by various cytokines and growth factors (including TGF-β1, Ang II, etc.), which trigger in them structural and functional changes, differentiating to cardiac myofibroblasts (CMF). The main function of CMF is to secrete ECM proteins to repair the damaged area in the case of a heart attack. Thus CMF play a crucial role in the response to injury in the heart tissue. However, very little is known about the behavior of this cell type versus cardiac remodeling. Furthermore, the knowledge on the receptors present on this cell type is scarce, and they could be key elements in the regulation of the exacerbated secretion of MEC and therefore the generation of tissue fibrosis. In cardiac fibrosis, the participation of the kallikrein-kinin system is very important. It has been proposed that the absence of kinin receptors is deleterious for cardiac tissue, especially in response to an injury. Within this system are bradykinin (BK) which acts on the B2 kinin receptor (B2R) and lis-des-Arg-BK (DAKD) that exerts its action on the B1 receptor (B1R). In CF, it has been shown that BK induces NO release and prostaglandins production, which reduce collagen secretion. However, in CMF it is not known which kinin receptor subtype is present and what signal transduction pathways are activated by these receptors. In this thesis and in accordance with the context, various experiments were conducted to prove the existence and functionality of kinin receptors in both CF and CMF the presence of both receptors in both CF as MFC was observed by Western blot (WB), however, expression of B1R in CMF was greater than in FC, while B2R remained constant. B1R expression increased after treatment of CF with TGF-β1, the main differentiator to CMF. By immunofluorescence techniques and radioligand assays, it was determined that CF B1R was located primarily intracellularly, whereas CMF was markedly located in the plasma membranes. Moreover, by analyzing intracellular calcium movements, B2R was shown to be functional in both cell types, while B1R was functional in CMF, but not in CF. However, when CF were preincubated with the B1R agonist (DAKD) and subsequently stimulated (30 min) with the same agonist, these receptors were also functional. By Immunofluorescence it was shown that after preincubation with the agonist the B1R was relocated to plasma membranes, where they were able to generate intracellular calcium movements, showing they are active receptors. Furthermore, it was demonstrated that B1R and B2R activation in CMF by their respective agonists, induces a reduction in the expression of collagen I (Col I). In contrast in CF, B2R activation induced a decrease in Col I levels, whereas a previous stimulus that redistributes B1R receptor to the plasma membrane is required to induce a reduction in Col I expression after B1R stimulation. Finally, the use of various inhibitors shows that CMF allowed both B1R activation and B2R, leading to a decrease in Col I expression through activation of a signal transduction pathway which is shared by both receptors, and that is mediated by PKC/PLA2/COX-2/PGI2/IPR. In summary, the results of this study argue that B1R and B2R activation in CMF leads to decreased expression of Col I, which is related to antifibrotic effects of kinins in the progress of diseases such as cardiac fibrosis / Conicyt Fondecyt

Doctor en Ciencias Farmacéuticas / Las enfermedades cardiovasculares son, hoy en día, una de las principales causas de muerte. Estas enfermedades generan comúnmente cambios en la estructura del corazón que conlleva a un remodelamiento del tejido generando hipertrofia y fibrosis, lo cual altera la función cardiaca normal y que finalmente se traduce en una insuficiencia cardiaca. La fibrosis cardiaca se genera por un depósito excesivo de proteínas de la matriz extracelular (MEC) producto de la activación de fibroblastos. Estas células, que representan alrededor del 70% del total de las células del corazón humano, frente a una injuria cardiaca, responden a una variedad de citoquinas y factores de crecimiento que promueven su diferenciación a miofibroblastos. Estos a su vez, expresan la proteína α-actina del músculo liso (α-SMA) la que le confiere propiedades contráctiles y durante el proceso de reparación del tejido cardiaco, son los principales responsables de la síntesis de numerosas proteínas de la MEC, las que incluyen colágeno, fibronectina y laminina lo que finalmente se traduce en el cierre de la herida. Asimismo, los miofibroblastos están encargados de liberar citoquinas, factores de crecimiento, como angiotensina II, y en forma adicional, incrementan el número de receptores para estos mismos mediadores. Por otro lado, existen numerosos antecedentes que demuestran que la activación de la vía de transducción del 3’,5’-adenosina monofosfato cíclico (AMPc) podría estar contribuyendo a la reducción de la fibrosis cardiaca, ya que se ha visto que un incremento en los niveles de AMPc en el fibroblasto cardiaco, puede disminuir su función celular así como también inhibir la diferenciación de fibroblasto a miofibroblasto. En este sentido, durante mucho tiempo se ha establecido como regla general que los efectos mediados por el AMPc en las células eucariontes ocurría exclusivamente a través de la activación de la proteína quinasa A (PKA) y que a su vez la PKA mediaba los cambios en la expresión y función de las proteínas. Sin embargo, el descubrimiento de otra proteína llamada EPAC (del acrónimo exchange protein activated directly by cAMP), que regula la actividad de las proteínas G pequeñas Rap 1 y Rap 2, y que también es activada por el AMPc, comenzó a cambiar el campo de investigación relacionado con el estudio de la vía de transducción de este segundo mensajero. A pesar de que los fibroblastos cardiacos expresan EPAC-1, poco se conoce acerca de los mecanismos que regulan la expresión de las isoformas de EPAC en los fibroblastos y miofibroblastos, y de que factores (péptidos, citoquinas, hormonas, entre otros) son los que están involucrados en la regulación de la misma. Estudios han demostrado que los niveles de expresión de EPAC-1 se encuentran aumentados en ratones con hipertrofia cardiaca y que la vía AMPc-EPAC1-Rap1 se encuentra activa bajo estas circunstancias. Estos antecedentes estarían dando cuenta de que EPAC-1 podría estar participando de forma activa en procesos asociados al remodelamiento cardiaco. Paralelamente, se ha observado que el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1), citoquina estrechamente relacionada con el proceso de fibrosis cardiaca, promueve la disminución de la expresión de EPAC-1 en el fibroblasto cardiaco de rata adulta. Sin embargo, se desconoce el mecanismo por el cual TGF-β1 regula la expresión de EPAC-1 tanto en el fibroblasto como en los miofibroblastos cardiacos. Desde el punto de vista de la funcionalidad de EPAC-1, existen algunos estudios que demuestran la participación de esta proteína en algunos procesos celulares asociados al remodelamiento cardiaco, tales como la migración de fibroblastos y secreción de colágeno, pero se desconoce totalmente su participación en los mecanismos asociados a adhesión y contracción de geles de colágeno, procesos celulares importantes en el remodelamiento del miocardio, en donde participan activamente tanto fibroblastos como miofibroblastos. Bajo este contexto, en la presente tesis, se estudió en una primera instancia cómo el TGF-β1 era capaz de regular los niveles de EPAC-1 tanto en fibroblastos como en miofibroblastos de rata neonata. Para ello se realizaron estudios mediante westernblot con el fin de determinar los niveles basales de EPAC-1 en nuestro modelo de estudio, para luego estudiar la influencia del TGF- β1 sobre estos niveles a través de la intervención de sus vías de señalización canónica (Smad2/3) y no canónica (MAPK y Akt). Los resultados obtenidos dieron cuenta de que los miofibroblastos poseían mayores niveles de EPAC-1 comparado a los fibroblastos y que en la regulación de EPAC- 1 en fibroblastos cardiacos participaron proteínas tales como Smad-2 y JNK, mientras que en el miofibroblasto ambas vías de señalización, canónica y no canónica, participaron de la regulación de los niveles de EPAC-1. Posteriormente y con el fin de dilucidar el rol que juega este factor intercambiador de nucleótidos de guanina sobre las funciones de fibroblastos y miofibroblastos, se evaluó la capacidad de EPAC-1 de fosforilar a su efector río abajo Rap-1, utilizando para ello un análogo del AMPc con capacidad de activar selectivamente a EPAC-1. Los resultados demostraron que en ambos fenotipos celulares EPAC-1 fue capaz de activar a su efector río abajo Rap-1, y más aún, que en los miofibroblastos está activación era mucho mayor en comparación a sus precursores los fibroblastos. Finalmente y con el objetivo de dilucidar la participación de EPAC-1 en procesos asociados al remodelamiento cardiaco tales como adhesión, migración, contracción de geles de colágeno y expresión de colágeno; se llevaron a cabo una serie de experimentos destinados a evaluar los procesos antes mencionados en nuestro modelo de estudio. Para ello se utilizaron herramientas mediante las cuales fue posible dilucidar los efectos mediados principalmente por EPAC-1 y a la vez los efectos mediados por PKA, ya que al ser ambas proteínas efectoras del AMPc, era importante poder establecer la contribución real de cada una de ellas a los procesos antes señalados. Los resultados obtenidos sugieren que EPAC-1 participaría aumentando la adhesión de fibroblastos y miofibroblastos a fibronectina, promoviendo la migración de fibroblastos, aumentando la contracción de geles de colágeno tanto en fibroblastos como en miofibroblastos y disminuyendo los niveles de colágeno en ambos fenotipos celulares. Estos resultados se complementan con los obtenidos en relación a la PKA, en donde se logró dilucidar que esta proteína estaría participando en los procesos de contracción de geles de colágeno y expresión de colágeno. PKA al parecer aumentaría la contracción de geles de colágeno en miofibroblastos y además, sería capaz de disminuir la expresión de colágeno tanto en fibroblastos como en miofibroblastos. En resumen, los resultados de la presente tesis sugieren por un lado que, el TGF- β1 regularía diferencialmente los niveles de EPAC-1 en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos y por otro lado, que EPAC-1 estaría regulando importantes funciones asociadas al remodelamiento cardiaco tales como adhesión, migración, contracción de geles de colágeno y expresión de colágeno en ambos fenotipos celulares. / Throughout the last decades cardiovascular diseases has become one of the most important causes of death. These diseases commonly generate changes in the structure of the heart which leads to tissue remodeling and fibrosis, which alters the normal cardiac function and eventually resulting in cardiac failure. Cardiac fibrosis is generated by excessive deposition of extracellular matrix proteins (ECM) produced by the activation of fibroblasts. These cells represent about 70% of total human heart cells and following a cardiac injury, they respond to a wide range of cytokines and growth factors promoting their differentiation into myofibroblasts. These myofibroblasts express the protein α-smooth muscle actin (α-SMA) synonymous with increased contractile force. Enhanced contractility that attends this protein’s expression is believed to be important in allowing these cells to contract during the wound healing in the damaged heart. Myofibroblasts are the primary mediators responsible for synthesis of many ECM proteins, including collagen, fibronectin and laminin, among others. During transition of fibroblast into myofibroblasts they acquire the capability to be avid producers of cytokines and growth factors, and in addition, increase the receptor number for the same mediators. A growing body of literature over the last years has made evident that activation of the transduction pathway of 3', 5'-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) may be contributing to the reduction of cardiac fibrosis. It has been demonstrated that an increase in cAMP levels in cardiac fibroblasts can reduce their cellular function as well as inhibit fibroblast differentiation into myofibroblasts. In this regard, it has become generally accepted, that the effects mediated by cAMP in eukaryotic cells occurred only by activation of protein kinase A (PKA) which once activated was able to mediate expression and protein function. However, the discovery of another protein, called EPAC (exchange protein activated directly by cAMP), which regulates the activity of small G proteins Rap 1 and 2, has begun to innovate the research field of the cAMP transduction pathway. It is known that cardiac fibroblast express EPAC-1, however little is known about the mechanism regulating the expression of this protein in fibroblast and myofibroblasts. In this regard, studies in this area have demonstrated that levels of EPAC-1 expression were increased in mice with cardiac hypertrophy and cAMP pathway EPAC1-Rap1 was very active. These results support the idea that EPAC-1 could be actively involved in processes associated with cardiac remodeling. In parallel, it has been observed that the transforming growth factor β1 (TGF-β1), cytokine closely related to the process of cardiac fibrosis, promotes the decrease of EPAC-1 expression in cardiac fibroblasts. However, the mechanism by which TGF-β1 regulates fibroblasts and myofibroblasts EPAC-1 expression still remains unclear. There are few studies demonstrating the involvement of EPAC-1 in cellular processes associated with cardiac remodeling. There are some investigations related to fibroblast migration and collagen secretion, nevertheless EPAC-1 participation in processes associated to cardiac remodeling such as cellular adhesion and those related to capability to contract collagen gels matrix are completely unknown. In this context, we studied EPAC-1 levels and the effect caused by TGF-β1 on EPAC-1 expression in both cardiac fibroblasts and myofibroblasts through the intervention of TGF-β1 canonical (Smad) and no canonical (MAPK and Akt) signaling pathways. The data obtained showed that cardiac myofibroblasts have greater amounts of EPAC-1 than cardiac fibroblasts. In the presence of chemical inhibitors the results showed that fibroblast EPAC-1 expression is regulated by JNK-MAPK and Smad2 protein, and the myofibroblast EPAC-1 expression is regulated by both signaling pathways (Smad, MAPKs and Akt). Subsequently, in order to determine the EPAC-1 capability to activate its downstream effector Rap1, we stimulated this protein using a cAMP analog able to specifically activate EPAC-1. The results showed that EPAC-1 was able to phosphorylate its downstream effector Rap-1 in both fibroblast and myofibroblasts, however myofibroblasts demonstrated to have higher levels of Rap1-GTP compared to cardiac fibroblasts. Finally and in order to elucidate the EPAC-1 involvement in cardiac remodeling, we performed a series of experiments designed to evaluate cellular adhesion, migration, collagen gel contraction and collagen expression. To evaluate these functions we used selective molecules ables to recognize specifically both EPAC-1 and PKA. The results suggest that EPA-1 increases fibroblast and myofibroblast fibronectin adhesion, promotes fibroblasts migration, enhances collagen gel contraction in both fibroblast and myofibroblast and decrease collagen levels measured by western blot. On the other hand, the results obtained using a PKA agonist suggest that this protein apparently increases myofibroblasts collagen gel contraction and reduces collagen expression measured by western blot in both fibroblast and myofibroblasts. In summary, the results obtained in this thesis suggest TGF-β1 participation in regulating differentially EPAC-1 levels in cardiac fibroblasts and myofibroblasts and EPAC-1 participation in cellular processes related to adhesion, migration, collagen gel contraction and collagen expression; all of them important cellular processes involved in cardiac remodeling in both fibroblast and myofibroblasts. / Fondecyt

Orientador: Flavio Alessandro Serrão Gonçalves / Resumo: A estimação do tempo de vida útil de um transformador de potência pode viabilizar a melhoria do uso do ativo, bem como do planejamento quanto a sua confiabilidade frente ao seu impacto no sistema elétrico de potência por falhas. Neste contexto este trabalho realiza uma análise das principais metodologias de avaliação para ciclos de vida útil de transformadores de potência. As análises utilizam dados de medição de grandezas elétricas, medições de temperatura, além das quantificações dos elementos químicos e físicos presentes nos isolantes líquidos dos transformadores. O desenvolvimento concentra-se no estudo e reprodução de 2 metodologias, a primeira embasada na avaliação de um indexador de saúde dos transformadores e uma segunda metodologia que utiliza uma análise combinatória de indexador de saúde com posterior tratamento estatístico, para as reproduções das metodologias foram utilizados dados de operação, manutenções preventivas e corretivas referentes ao parque instalado de 290 transformadores em operação, com potências nominais entre 12,5 MVA e 50 MVA e com tensões em seu enrolamento de alta tensão de 69 kV e 138 kV, de uma distribuidora de energia. Posteriormente à reprodução dos modelos de forma massiva, foram avaliadas as suas respostas quanto aos dados e realizadas análises críticas do desempenho das máquinas frente as metodologias utilizadas. / The estimation of the useful life of a power transformer can enable the improvement of the asset’s use, as well as the planning of its reliability in relation to its impact on the power system due to fails. In this context this work performs an analysis of the main evaluation methodologies for power transformer life cycles. The analysis uses electrical measurement data, temperature measurements, as well as quantification of chemical and physical elements present in the liquid insulation of the transformers. The development focuses on the study and reproduction of two methodologies, the first one based on the evaluation of a health index of the transformers a second methodology that uses a combinatorial analysis of health index subsequent reprocessing of the methodologies, operation data, preventive and corrective maintenance were used for 290 installed transformers, with rated power between 12.5 MVA and 50 MVA and with voltages in its high voltage winding of 69 kV and 138 kV from an energy distributor. After the application of the models in a massive way, their answers results were evaluated and critical analysis of the performance of the machines were carried out against the methodologies used. / Mestre

No início de século XXI, assiste-se a emergência do constitucionalismo transformador na Bolívia e no Equador como um novo movimento social, político e jurídico, cujos antecedentes são as lutas dos movimentos indígenas da América Latina, os avanços dos seus direitos nas normativas nacionais e internacionais e as intensas mobilizações sociais nos dois países que culminaram na vitória de Rafael Correa e Evo Morales. Como parte do projeto político de alteração do modelo político do Estado a partir da plurinacionalidade e evidenciando um exercício de interculturalidade inédito do âmbito político e jurídico, são promulgadas as novas constituições equatoriana (2008) e boliviana (2009), que incorporam direitos e princípios inovadores, articulados ao Buen Vivir como um novo projeto civilizatório. Inspirado nos saberes e nas práticas sociais indígenas, o Buen Vivir é crítico à modernidade ocidental capitalista e colonial e, em particular, desafia os paradigmas hegemônicos do progresso e do desenvolvimento e o tipo de interpretação e relação mercantilista e utilitarista com a natureza que os caracteriza. O objetivo deste trabalho fundamentalmente teórico e interdisciplinar foi averiguar o potencial contra-hegemônico do constitucionalismo transformador, com foco em uma análise das constituições à luz do arcabouço conceitual que é próprio às Epistemologias do Sul. Para tanto, realizou-se uma análise do processo de ampliação dos direitos indígenas nas normativas nacionais e internacionais ao longo das três últimas décadas, um estudo do conteúdo intercultural incorporado às constituições e uma apresentação do atual processo de desconstitucionalização em andamento nos dois países. Parte-se do pressuposto de que as novas normas constitucionais são instrumentos políticos e jurídicos significativos para a luta dos movimentos indígenas pela sua emancipação e pela defesa da Madre Tierra, no marco de um projeto latino-americano de descolonização social, política e epistemológica da América Latina/Abya Ayala. / Al inicio del siglo XXI, se vela emergencia del constitucionalismo transformador en Bolivia y en Ecuador como un nuevo movimiento social, político y jurídico, cuyos antecedentes son las luchas de los movimientos indígenas de América Latina, los avances de sus derechos en las normativas nacionales e internacionales ylas intensas movilizaciones sociales en los dos países que culminaron en la victoria de Rafael Correa y Evo Morales. Como parte del proyecto político de alteración del modelo político del Estado a partir de la plurinacionalidad y evidenciando un ejercicio de interculturalidad inédito delámbito político y jurídico, son promulgadas las nuevas constituciones ecuatoriana (2008) y boliviana (2009), que incorporan derechos y principios innovadores, articulados al Buen Vivir como un nuevo proyecto civilizatorio. Inspirado en los saberes yen las prácticas sociales indígenas, el Buen Vivir es crítico a la modernidad occidental capitalistay colonial y, en particular, desafía los paradigmas hegemónicos del progreso y del desarrollo yel tipo de interpretacióny relación mercantilista y utilitarista con la naturaleza que los caracteriza. El objetivo de este trabajo fundamentalmente teórico e interdisciplinario fue averiguar el potencial contrahegemónico del constitucionalismo transformador, con enfoque en un análisis de las constituciones a la luz de la estructura conceptual que es propio a las Epistemologías del Sur. Para tanto, se realizó un análisis del proceso de ampliación de los derechos indígenas en las normativas nacionales e internacionales a lo largo de las tres últimas décadas, un estudio del contenido intercultural incorporado a las constituciones y una presentación del actual proceso de desconstitucionalización en marcha en los dos países. Se parte de la suposición de que las nuevas normas constitucionales son instrumentos políticos y jurídicos significativos para la lucha de los movimientos indígenas por su emancipacióny por la defensa de la Madre Tierra, en el marco de un proyecto latinoamericano de descolonización social, política y epistemológica de América Latina/Abya Ayala.

Este trabalho apresenta um procedimento completo de simulação da proteção digital diferencial aplicada a transformadores de potência, visando o emprego deste à avaliação do comportamento de relés comercialmente disponíveis. Foi escolhido o software ATP (Alternative Transients Program) como ferramenta para a simulação de distintas situações sobre um sistema diferencial de proteção aplicado a um transformador de 25 MVA. Dentre as ocorrências evidenciadas, destacam-se: situações de faltas internas, faltas externas, situações de energização e energização com falta interna do transformador, condição de sobreexcitação e de saturação de TC (Transformador de Corrente). Cabe comentar que das simulações a real caracterização sobre o relé em teste, fez-se necessário todo um pré-processamento e análise da informação que será convenientemente abordada e justificada no trabalho apresentado, denotando-se um procedimento comum de teste a ser adotado a esta filosofia de proteção. A metodologia e esquema prático adotado trazem uma contribuição importante para a análise laboratorial de modelagens e simulações aplicadas a relés de proteção presentes no mercado e contribui de maneira substancial para os estudos teóricos de possíveis soluções para limitações eventualmente encontradas / This dissertation presents a complete procedure of simulation of digital differential protection applied to power transformers, focusing on its use to evaluate of the behavior of commercially available relays. Software ATP (Alternative Transients Program) was chosen as a tool for the simulation of distinct situations in a differential protection system applied to a 25 MVA three-phase transformer. Amongst the evidenced occurrences internal and external fault conditions, energization with or without internal fault of a three-phase transformer, overexcitation and CT (Current Transformer) saturation conditions were distinguished. It should be mentioned that from simulations to the characterization the real situations on the relay in test, a pre-processing and analysis of the information were necessary, and will be justified in the present study, denoting a common test procedure to be adopted to this philosophy of protection

Este trabalho apresenta um procedimento completo de simulação da proteção digital diferencial aplicada a transformadores de potência, visando o emprego deste à avaliação do comportamento de relés comercialmente disponíveis. Foi escolhido o software ATP (Alternative Transients Program) como ferramenta para a simulação de distintas situações sobre um sistema diferencial de proteção aplicado a um transformador de 25 MVA. Dentre as ocorrências evidenciadas, destacam-se: situações de faltas internas, faltas externas, situações de energização e energização com falta interna do transformador, condição de sobreexcitação e de saturação de TC (Transformador de Corrente). Cabe comentar que das simulações a real caracterização sobre o relé em teste, fez-se necessário todo um pré-processamento e análise da informação que será convenientemente abordada e justificada no trabalho apresentado, denotando-se um procedimento comum de teste a ser adotado a esta filosofia de proteção. A metodologia e esquema prático adotado trazem uma contribuição importante para a análise laboratorial de modelagens e simulações aplicadas a relés de proteção presentes no mercado e contribui de maneira substancial para os estudos teóricos de possíveis soluções para limitações eventualmente encontradas / This dissertation presents a complete procedure of simulation of digital differential protection applied to power transformers, focusing on its use to evaluate of the behavior of commercially available relays. Software ATP (Alternative Transients Program) was chosen as a tool for the simulation of distinct situations in a differential protection system applied to a 25 MVA three-phase transformer. Amongst the evidenced occurrences internal and external fault conditions, energization with or without internal fault of a three-phase transformer, overexcitation and CT (Current Transformer) saturation conditions were distinguished. It should be mentioned that from simulations to the characterization the real situations on the relay in test, a pre-processing and analysis of the information were necessary, and will be justified in the present study, denoting a common test procedure to be adopted to this philosophy of protection