Le système nerveux central est un organe complexe et privilégié, protégé, entre autres, par la barrière hémato-encéphalique (BHE), sur laquelle se trouvent des transporteurs d'efflux telle que la P-glycoprotéine (Pgp).<br />La BHE est impliquée dans la neuro-inflammation et les maladies cérébrales associées, et la littérature laisse penser que l'endothéline 1 (ET-1) y joue un rôle important. En utilisant un modèle in vitro autologue de BHE humaine adulte et un modèle in vitro de BHE humaine fœtale (co-culture de cellules gliales et de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales), nous avons étudié l'effet de l'ET-1 sur la Pgp.<br />Une différence, en termes de modulation de l'activité de la Pgp, a été observée entre la BHE fœtale et la BHE adulte suite à l'exposition à l'ET-1. Nous avons également évalué la modulation induite par l'ET-1 sur la sécrétion de la MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein 1) et de l'IL-8. Les résultats montrent que l'ET-1 diminue l'activité de la Pgp et induit la sécrétion de MCP-1 et d'IL-8.

L'acquisition du phénotype de résistance des cancers est souvent corrélée à l'expression de transporteurs membranaires appartenant à la superfamille des transporteurs ABC (« ATP-Binding Cassette »). Un de ces transporteurs, MRP1 (« Multidrug Resistance Protein 1 »), permet l'efflux de nombreux substrats, de type anioniques, conjugués au GSH, glucuronates ou sulfates, ou en co-transport avec le GSH.<br />Dans un premier temps, ce travail a porté sur l'étude des domaines de fixation des nucléotides isolés. Une étude biochimique a montré leur caractère fonctionnel asymétrique concernant les nucléotides, prouvant que seul la séquence primaire de ces NBD est responsable de cette fonctionnalité différentielle. L'étude de la fixation de substrats sur les NBD, a montré que ceux-ci pourraient, de part leur proximité avec les domaines transmembranaires, avoir un rôle dans la fixation des substrats.<br />La deuxième étape de ce travail a concerné la caractérisation de l'activité des énantiomères du vérapamil. Les résultats ont montré que le S-vérapamil est l'isomère responsable de la stimulation du transport du GSH, conduisant à la mort des cellules surexprimant MRP1. Le R-vérapamil est caractérisé comme un inhibiteur de MRP1. Ces résultats ont des répercussions importantes en terme de thérapie.<br />Deux études préliminaires de relation structure/fonction ont été menées en ce qui concerne des dérivés du vérapamil et des dérivés de flavonoïdes, afin de trouver des molécules plus efficaces contre MRP1.

La multichimiorésistance est caractérisée par une résistance simultanée à des agents chimiothérapeutiques de structures diverses, induite notamment par l'efflux des substances actives hors des cellules. Les transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette) sont des protéines transmembranaires impliquées dans cet efflux et qui participent à l'échec du traitement de certains cancers. Par ailleurs, ce mécanisme d'efflux a également été évoqué dans le cadre de la résistance de certains microorganismes aux antimicrobiens. Dans cette étude, nous avons conçu et synthétisé des dérivés susceptibles d'inhiber certains transporteurs ABC, en particulier, la glycoprotéine-P (Pgp) impliquée dans la multichimiorésistance des tumeurs humaines, et CpABC3, rencontré chez le parasite Cryptosporidium parvum. Dans un premier temps, nous avons synthétisé trois dérivés de type 4-alkyl-imidazo[4,5-b]pyridin-7-one, hétérocycles destinés à se fixer sur le site à ATP des transporteurs ABC. L'activité de ces composés a été évaluée vis-à-vis d'un fragment recombinant (H6-NBD1) de CpABC3, et un de ceux-ci a montré une liaison (faible) à ce fragment. Nous avons ensuite préparé dix-sept dérivés bivalents susceptibles d'inhiber la Pgp, constitués d'une molécule d'adénine (ciblant le site à ATP) reliée à la progestérone (ciblant le site aux stéroïdes) par un bras de géométrie variable. Ces dérivés ont été testés sur des lignées cellulaires K562/R7 surexprimant la Pgp, et un de ceux-ci a montré une activité supérieure à celle de la progestérone. Enfin, nous avons mis au point une synthèse de chaînes de type oligocyclohexylidène, qui sont de bons candidats pour constituer des bras espaceurs rigides

ABCB1 (ou P-gp pour "glycoprotéine-P"), ABCC1 (ou MRP1 pour "Multidrug Resistance Protein 1") et ABCG2 (ou BCRP pour "Breast Cancer Resistance Protein") sont les trois transporteurs ABC humains les plus impliqués dans la chimiorésistance de certaines cellules cancéreuses. Deux stratégies sont possibles pour éradiquer cette résistance : 1) l'élimination ciblée des cellules surexprimant ces transporteurs, grâce au talon d'Achille qu'elles ont développé comme conséquence de leur chimiorésistance : la sensibilité collatérale (ou hypersensibilité), et 2) l'identification et l'optimisation d'inhibiteurs spécifiques. Lors de ce projet, nous nous sommes particulièrement intéressés au transporteur ABCG2. Dans un premier temps, comme la sensibilité collatérale avait été décrite dans le cas de la surexpression d'ABCB1 ou d'ABCC1, nous voulions vérifier son implication éventuelle dans le cas de la surexpression d'ABCG2. Sans pouvoir finalement conclure sur son existence, nous avons démontré que le mécanisme d'action ne pouvait pas impliquer un efflux massif de glutathion par la protéine, comme c'est le cas pour ABCC1, contrairement à certaines données de la littérature. Dans le cadre de la seconde approche, nous avons criblé différentes séries de composés, apparentés aux flavonoïdes, pour identifier des inhibiteurs spécifiques d'ABCG2. Nous avons ainsi pu mettre en évidence des relations structure-activité démontrant l'importance de certains substituants, notamment des groupements méthoxy, non seulement pour l'inhibition de l'activité du transporteur mais aussi pour la cytotoxicité des molécules. Ces études nous ont également permis de classer les inhibiteurs identifiés en 4 familles distinctes, quant à leur mécanisme d'action à la fois sur l'efflux de drogues comme la mitoxantrone et l'activité ATPasique d'ABCG2. Enfin, le meilleur inhibiteur spécifique d'ABCG2 décrit à ce jour, la chromone 6g (ou MBL-II-141) a été caractérisé plus en détails. Son efficacité in vivo pour empêcher la croissance de tumeurs humaines xénogreffées chez la souris nous incite à être optimistes sur la possibilité de proposer un inhibiteur d'ABCG2 comme candidat médicament pour de futures études précliniques

Chez les procaryotes, les systèmes ABC (ATP-binding cassette) canoniques permettent un import efficace et de haute affinité du nickel, en grande partie via l'action de la Ni-BP (nickel-binding protein) qui va jouer le rôle de récepteur extracytoplasmique du nickel avant son passage à travers la membrane interne. Dans ces travaux, nous avons cherché à mieux caractériser les stratégies d'import de nickel par les bactéries, notamment par l'étude cristallographique des Ni-BP. La résolution des structures de cinq de ces protéines, en interaction avec du nickel, nous a permis d'identifier les sites de fixation et ainsi de mettre en évidence les différents modes d'interaction de ce métal avec les Ni-BP. Nos résultats montrent notamment que la coordination du nickel requiert toujours la présence d'un métallophore exogène, appelé nickelophore. En parallèle, des études in vivo ont été conduites sur Escherichia coli, montrant que cette bactérie semble être capable de synthétiser son propre nickelophore. D'autre part, ces travaux ont permis la résolution de la structure de HypB de Helicobacter pylori en interaction avec du nickel. Celle-ci permet de mieux appréhender le rôle central de cette protéine au sein des voies de maturation des enzymes à nickel. / In prokaryotes, canonical ABC (ATP-binding cassette) importers allow an efficient uptake of nickel with high affinity through the inner membrane, largely via the action of the extracytoplasmic nickel-binding protein (Ni-BP). In this work, we intended to better understand the strategies developed by bacteria to scavenge nickel in the environment, especially through the structural studies of several Ni-BP. The resolution of the crystal structures of five Ni-BPs from diverse bacteria, in interaction with nickel, led us to identify their nickel-binding sites and shed light on the different binding modes. Our results show that the presence of an exogenous metallophore, called nickelophore, is always required. In vivo studies in Escherichia coli were also conducted, showing that this bacteria seems to be able to synthesize its own nickelophore. In addition, we have solved the crystal structure of Helicobacter pylori HypB in complex with nickel. This result provides insight into its cellular function in nickel enzyme maturation pathways.

Notre projet vise à déterminer la structure 3D du transporteur BmrA de Bacillus subtilis. La protéine a été purifiée dans six détergents différents. L'utilisation de foscholine 12, a conduit à cristalliser OmpF, une porine de la membrane externe d'E. coli. Nous montrons que les conditions de cristallisation influencent directement l'empilement cristallin d'OmpF. Le protocole de purification de BmrA, optimisé en utilisant du triton X100 à l'extraction puis un mélange β-D-dodecyl maltoside-cholate pour les étapes chromatographiques nous a permis d'obtenir à 4°C des cristaux, pour lesquels nous avons vérifié qu'ils sont constitués de BmrA. Ces cristaux ont permis d'obtenir un jeu complet jusqu'à 7 Å. Ces données de diffraction constituent une avancée significative pour résoudre à court terme la structure 3D de BmrA. Nous avons développé une nouvelle méthode de dosage des détergents qui est basée sur la détermination par spectrométrie de masse de type MALDI du ratio d'isotopes deutérés/ protonés. La méthode a été validée avec la FC12, le DDM, le β-OG, le LMNG, le CHAPS, le cholate et des détergents calix[4]aréniques, en mesurant la concentration de ces détergents dans différentes conditions d'extraction/purification, de concentration, dialyse et gel filtration, de différentes protéines membranaires. Cette méthode nous a permis (i) d'estimer la taille de la ceinture de détergent associée à BmrA et d'autres protéines membranaires (ii) de moduler cette taille en fonction de mélange de détergents et (iii) d'apporter des informations sur le comportement des complexes protéine-détergent / Our project aims to determine the 3D structure of BmrA from Bacillus subtilis. The protein was purified in six different detergents. Using foscholine 12, led to crystallize OmpF, an outer membrane porin of E. coli. We show that the crystallization conditions directly influence the crystal packing of OmpF. The BmrA purification protocol optimized by using Triton X100 at the extraction and a mixture β-D-dodecyl-maltoside cholate for chromatographic steps allowed us to get to 4°C crystals, for which we verified they consist of BmrA. These crystals have yielded full data to 7 Å. These diffraction data are a significant advance in the short term to resolve the 3D structure of BmrA. We have developed a new detergents dosage assay which is based on the determination by MALDI-type mass ratio of deuterated isotopes / protonated. The method was validated with the FC12, the DDM, the β-OG, the LMNG, CHAPS, cholate detergents and calix [4] aréniques by measuring the concentration of these detergents in different conditions of extraction/ purification, concentration, dialysis and gel filtration, of different membrane proteins. This method allowed us (i) to estimate the size of the detergent belt associated to BmrA and other membrane proteins (ii) to modulate this size in terms of the detergent mixture and (iii) to provide information on the behavior of complex protein-detergent

L’Adrénoleucodystrophie liée à l’X est une maladie neurodégénérative rare due à des mutations dans le gène ABCD1. Ce gène code un demi-transporteur ABC peroxysomal, impliqué dans l’importation d’acides gras à très longue chaîne. Deux autres demi-transporteurs sont localisés dans la membrane peroxysomale : ABCD2 et ABCD3. La surexpression d’ABCD2 permet de compenser la déficience en ABCD1, ouvrant ainsi des perspectives thérapeutiques. Dans cette optique, l’objectif principal de ma thèse était d’étudier la fonction et la structure d’ABCD2, et plus largement des transporteurs ABC peroxysomaux.Les demi-transporteurs doivent au minimum se dimériser pour constituer un transporteur fonctionnel. Leur dimérisation alternative pourrait moduler leur spécificité de substrat. Afin de tester cette hypothèse, nous avons réalisé des constructions plasmidiques codant différents dimères chimériques, dont la fonctionnalité a été vérifiée par transfection transitoire dans deux modèles cellulaires (fibroblastes humains et levures). D’après nos résultats, ABCD1 et ABCD2 seraient fonctionnels quel que soit leur agencement dimérique. De plus, comme d’autres transporteurs ABC, les transporteurs ABC peroxysomaux pourraient s’oligomériser. En utilisant différentes techniques biochimiques (co-immunoprécipitation, sédimentation sur gradient de sucrose et électrophorèse en conditions natives), sur un modèle cellulaire surexprimant ABCD2-EGFP, nous démontrons qu’ABCD2-EGFP interagit avec ABCD1 et ABCD3, et que les transporteurs ABC peroxysomaux sont capables de s’oligomériser. Il reste désormais à déterminer les facteurs qui contrôlent cette oligomérisation et comprendre la valeur fonctionnelle de ces interactions. / X-linked Adrenoleukodystrophy (X-ALD) is a rare neurodegenerative disease caused by deficiency of the peroxisomal half-transporter ABCD1, implicated in very long chain fatty acids import. Two additional half-transporters are located in the peroxisomal membrane: ABCD2 and ABCD3. Over-expression of ABCD2 is known to compensate for ABCD1 deficiency, making ABCD2 a therapeutic target for X-ALD treatment. In this context, the main objective of my thesis was to investigate the function and the structure of ABCD2, and more broadly, of peroxisomal ABC transporters.Half-transporters must at least dimerize to form a functional transporter. Alternative dimerization could modulate substrate specificity. In order to test this hypothesis, we engineered plasmidic constructs encoding chimeric ABCD dimers, whose functionality has been evaluated by transient transfection in two cell models (human fibroblasts and yeasts). Our results show that, ABCD1 and ABCD2 are functional whatever their dimeric organization. Besides, like other ABC transporters, peroxisomal ABC transporters could oligomerize. By using a multi-technical approach (co-immunoprecipitation, velocity sucrose gradient and native polyacrylamide gel electrophoresis experiments) on stably transfected hepatoma cells expressing ABCD2-EGFP, we demonstrate that ABCD2-EGFP interacts with ABCD1 and ABCD3, and that peroxisomal ABC transporters oligomerize. The perspectives will consist in determining which factors control the oligomerization process and understanding the functional value of these interactions.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le transport des molécules à travers les membranes est un processus cellulaire fondamental. Les transporteurs ABC (pour ATP-binding cassette) sont des protéines transmembranaires médiant le transport actif de substrats variés (peptides, ions, acides aminés, antibiotiques, etc). Le gène ATMI de Saccharomyces cerevisiae code pour un transporteur ABC de 690 acides aminés localisé dans la membrane interne de la mitochondrie. La protéine Atml est une proche homologue de la P-glycoprotéine impliquée dans la résistance aux agents anticancéreux. Il a été démontré qu'Atml est essentielle pour la croissance des cellules, procurant ainsi un phénotype idéal pour l'analyse fonctionnelle de ce transporteur. Nous utilisons une technique, appelée plasmid shuffling', basée sur l'échange de plasmides par contre-sélection d'un plasmide portant le marqueur de sélection URA3 en présence d'acide 5-fluoroorotique (5-F0A) pour étudier Atml. Nous avons construit une souche haploïde de S. cerevisiae dans laquelle la copie chromosomique du gène ATMI est excisée mais qui est viable grâce à la présence d'un plasmide URA3 portant une copie fonctionnelle du gène ATMI. Cette souche a été transformée avec une banque d'allèles mutés d'ATM1 portés par un plasmide LEU2 et criblée pour des mutants thermosensibles (ts) d'Atml après contre-sélection du plasmide URA3 sur 5-F0A. Trois mutants ts d'Atml ont été isolés et les mutations causant le phénotype ts ont été identifiées par séquençage de l'ADN. Des courbes de croissance de ces mutants ont été tracées, démontrant une croissance normale à température permissive mais un arrêt de croissance après quelques divisions à température restrictive. Nous avons produit des anticorps polyclonaux anti-Atml qui nous ont permis d'étudier la protéine de type sauvage et celle des trois mutants ts. Ces études ont révélé l'absence d'Atml seulement dans les mitochondries des mutants ts à température restrictive. D'autre part, des expériences de coimmunoprécipitation ont démontré qu'Atml forme des homodimères et que cette interaction est médiée par la partie C-terminale d'Atml, qui contient le domaine de liaison à l'ATP. Nos expériences ont donc permis d'identifier des acides aminés importants pour la fonction d'Atml ainsi qu'un domaine impliqué dans la structure quaternaire de ce transporteur.

La multichimiorésistance est caractérisée par une résistance simultanée à des agents chimiothérapeutiques de structures diverses, induite notamment par l’efflux des substances actives hors des cellules. Les transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette) sont des protéines transmembranaires impliquées dans cet efflux et qui participent à l’échec du traitement de certains cancers. Par ailleurs, ce mécanisme d’efflux a également été évoqué dans le cadre de la résistance de certains microorganismes aux antimicrobiens. Dans cette étude, nous avons conçu et synthétisé des dérivés susceptibles d’inhiber certains transporteurs ABC, en particulier, la glycoprotéine-P (Pgp) impliquée dans la multichimiorésistance des tumeurs humaines, et CpABC3, rencontré chez le parasite Cryptosporidium parvum. Dans un premier temps, nous avons synthétisé trois dérivés de type 4-alkyl-imidazo[4,5-b]pyridin-7-one, hétérocycles destinés à se fixer sur le site à ATP des transporteurs ABC. L’activité de ces composés a été évaluée vis-à-vis d’un fragment recombinant (H6-NBD1) de CpABC3, et un de ceux-ci a montré une liaison (faible) à ce fragment. Nous avons ensuite préparé dix-sept dérivés bivalents susceptibles d’inhiber la Pgp, constitués d’une molécule d’adénine (ciblant le site à ATP) reliée à la progestérone (ciblant le site aux stéroïdes) par un bras de géométrie variable. Ces dérivés ont été testés sur des lignées cellulaires K562/R7 surexprimant la Pgp, et un de ceux-ci a montré une activité supérieure à celle de la progestérone. Enfin, nous avons mis au point une synthèse de chaînes de type oligocyclohexylidène, qui sont de bons candidats pour constituer des bras espaceurs rigides / Multi-drug resistance (MDR) is characterized by a simultaneous resistance to a wide range of structurally unrelated chemotherapeutic agents, partly caused by the efflux of active compounds out of the cell. ABC transporters (ATP-Binding Cassette) are transmembrane proteins implicated in this efflux, and thus, they contribute to the failure of some cancer treatments. Furthermore, this mechanism was evoked in some microorganism resistances to antimicrobial agents. In this study, we designed and synthesized potential inhibitors of ABC transporters, especially P-glycoprotein (Pgp) implicated in human tumors multi-drug resistance, and CpABC3, a transporter found in a human parasite, Cryptosporidium parvum. First, we synthesized three 4-alkyl-imidazo[4,5-b]pyridin-7-one derivatives, targeting ATP-binding site of ABC transporters. Their biological activities were evaluated toward a recombinant fragment of the CpABC3 transporter (H6-NBD1 fragment). One of these compounds showed a weak-binding to this fragment. Next, we prepared seventeen progesterone-adenine hybrids as potential bivalent ligands which may bind simultaneously to the ATP-binding site and the steroid-binding region. We chose to synthesize derivatives with rather short-length linkers with different conformational flexibilities. These bivalent compounds were tested on K562/R7 human leukemic cells overexpressing Pgp. One of them has showed a better activity than progesterone. Finally, we optimized the synthesis of oligocyclohexylidene chains, which are good candidates to constitute rigid linkers

Première cause de décès par cancer chez la femme, le cancer du sein développe souvent une résistance à la chimiothérapie pouvant impliquer des transporteurs ABC (ATP Binding Cassette). Ils transportent les médicaments hors de la cellule et diminuent leur efficacité thérapeutique. Nous nous sommes intéressés à la protéine ABCC11 ou MRP8 (Multidrug Resistance Protein 8), exprimée dans le sein et responsable de l’efflux de certains anticancéreux (5FdUMP et méthotrexate). Nous avons démontré que l’expression d’ABCC11 était dépendante des voies de signalisation impliquant ER (Récepteur aux œstrogènes) ou PR (Récepteurs à la Progestérone). De plus, le tamoxifène (antagoniste d’ER) et la dexaméthasone (activateur de PR), utilisés en association avec la chimiothérapie, induisent l’expression d’ABCC11 et influenceraient négativement la réponse aux traitements anticancéreux à base de substrats d’ABCC11. L’expression d’ABCC11 a été positivement corrélée à celles d’ER et PR dans des cancers du sein. En parallèle, nous avons généré 2 modèles in silico en conformation ouverte vers l’intracellulaire ou vers l’extracellulaire et identifier des acides aminés potentiellement critiques dans l’architecture de la protéine ainsi que dans la liaison avec certains substrats (5FdUMP et GMPc). Nous avons également généré les outils moléculaires permettant l’étude de l’impact de 13 SNP (Single Nucleotide Polymorphism) non synonymes d’ABCC11. En raison d’une instabilité des lignées cellulaires, l’étude n’a pu être menée à son terme. Notre travail a ainsi contribué à une meilleure caractérisation d’ABCC11 et souligne sa potentielle valeur pronostic et prédictive dans le traitement du cancer du sein. / Leading cause of woman death by cancer, breast cancer can unfortunately develops chemotherapy resistance involving ABC (ATP Binding Cassette) transporters. They transport drugs out of cells and decrease their therapeutic efficiency. We studied one ABCC sub-family member: ABCC11 or MRP8 (Multidrug Resistance Protein 8), expressed in breast and responsible for anticancer agent efflux (5FdUMP and methotrexate). We have demonstrated that ABCC11 expression was associated with ER (Estrogen Receptor) and PR (Progesterone Receptor) signaling pathways. Furthermore, tamoxifen (ER antagonist) and dexamethasone (PR activator), used in association with chemotherapy, increased ABCC11 expression and would negatively influence the response of ABCC11 substrate based anticancer treatments. Moreover, ABCC11 expression was positively correlated to ER and PR expression in breast cancer. In parallel, we have generated two in silico models obtained by homology. They represent two different spatial conformations: intracellular-facing (ready to bind substrate) or extracellular-facing (ready to release substrate). This has allowed us to identify amino acid residues potentially essential for the protein architecture and for substrate binding (5FdUMP and cGMP). In order to analyze SNP (Single Nucleotide Polymorphism) impact on ABCC11 expression and function, we generated vectors coding a wild-type or a mutated ABCC11 with 13 nonsynonymous SNPs. But, we did not succeed to create stable expressing cell lines to make a complete study of those SNPs. In conclusion, our work led to ABCC11 better characterization and underlined its putative prognostic and predictive value in breast cancer treatment.