Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. [130]-146. Publié aussi en version électronique.

Streptococcus pneumoniae, le pneumocoque, est un pathogène majeur causant plus d'un million de morts par an dans le monde. De plus en plus de souches de pneumocoques sont résistants aux antibiotiques, en faisant un problème majeur de santé publique dans le monde. Une partie des ces antibiotiques sont les peptides anti-microbiens (AMP), qui sont produit aussi bien par l'hôte que des bactéries pathogènes en tant que premier système de défense. On trouve dans le pneumocoque un transporteur ABC (ATP-Binding Cassette) lié à un système de deux composants (TCS) – la kinase d'histidine (HK) et le régulateur de réponse (RR), qui cible les AMP. Récemment, il a été démontré, que l'absence du transporteur ABC augmente la sensibilité à la bacitracine. Dans ce projet, nous avons essayé à comprendre le mécanisme fonctionnel entre le transporteur ABC et TCS en utilisant des outils in vivo et in vitro. / Streptococcus pneumoniae, the pneumococcus, is a major human pathogen causing over a million deaths each year. Many pneumococcal strains display resistance towards antibiotics causing world-wide health concern. Some of these antibiotics are antimicrobial peptides (AMP), which are produced as a primary defense by hosts as well as pathogens. The pneumococcus harbors a system comprised of an ATP-binding cassette (ABC) transporter and a two-component system (TCS) composed of a histidine kinase (HK) and a response regulator (RR), which targets these molecules. It has been shown recently that the removal of this ABC transporter increases the sensitivity of the bacteria towards bacitracin. In this project, we tried to understand the functioning mechanism of the ABC transporter and the co-operation with the TCS using both in vivo and in vitro techniques.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

ABCB4/MDR3 est le transporteur canaliculaire de la phosphatidylcholine. Il est exprimé à la membrane canaliculaire des hépatocytes et est essentiel à la sécrétion biliaire. Un défaut d’ABCB4 entraîne des pathologies hépatobiliaires, dont la PFIC3 (cholestase intrahépatique familiale progressive de type 3), caractérisée par une cholestase précoce qui progresse vers la cirrhose et l’insuffisance hépatique avant l’âge adulte. Dans la majorité des cas, la seule thérapie efficace est la transplantation hépatique. Cette thèse s’intéresse aux rôles de l’extrémité C-terminale dans la régulation de la stabilité et l’expression de ce transporteur au canalicule biliaire. Nous avons délété le motif Q-N-L de cette extrémité et montré que cette délétion affecte la stabilité d’ABCB4/MDR3 en augmentant son endocytose. Son interaction avec des protéines à domaines PDZ est alors étudiée. Nous avons montré une interaction par le motif Q-N-L avec la protéine à domaines PDZ, EBP50. Cette interaction est nécessaire pour l’expression canaliculaire et la stabilité du transporteur. / ABCB4 is a phosphatidylcholine translocator specifically expressed at the bile canalicular membrane of hepatocytes. Mutations of the ABCB4 gene cause progressive familial intrahepatic cholestasis type 3 (PFIC3), a rare genetic disease characterized by early onset of cholestasis and evolution to cirrhosis and liver failure before adulthood. Little is known regarding the molecular mechanisms which control the canalicular expression and membrane stabilization of ABCB4 in hepatocytes. The aim of this work was to study the role of the C-terminal domain of ABCB4 for its expression and stability. potential interaction with EBP50, a PDZ protein highly expressed in hepatocytes. The experimental approach consisted in the deletion of the QNL motif at the C-terminus of ABCB4. The truncation of the QNL motif leds to a reduction of ABCB4 stability by increasing its endocytosis. ABCB4 co-precipitated with EBP50, an interaction that required the QNL motif. This interaction plays a critical role in the canalicular expression and stabilization of ABCB4.

L’appréhension des mécanismes d’action biologiques des protéines membranaires nécessite de comprendre les interactions des xénobiotiques avec ces protéines et avec les membranes lipidiques. Les méthodes expérimentales sont parfois coûteuses et ne permettent d’obtenir que des informations partielles sur les interactions xénobiotiques-membrane-protéine. La modélisation moléculaire est une sérieuse alternative. Les simulations de dynamique moléculaire et de dynamique biaisées ont ouvert de nombreuses perspectives en permettant de décrire ces interactions moléculaires à l’échelle atomique. Grâce à des simulations de dynamique moléculaire, nous avons été capables de construire un modèle de transporteur humain ABC : ABCC4/MRP4. Cette protéine a été choisie pour sa présence dans le rein, notamment, et son importance clinique. Nous avons évalué l’influence du cholestérol sur cette protéine. L’étude de domaines spécifiques et l’impact d’un polymorphisme a été reliée à l’activité de transport de cette protéine. Nous avons également étudié l’interaction de xénobiotiques avec ce transporteur humain. Le cycle de transport des transporteurs ABC a été examiné afin de comprendre leur fonctionnement. L’incorporation de cholestérol a montré un impact significatif sur la protéine humaine ABCC4/MRP4 et sur les xénobiotiques étudiés. L’importance de domaines constituant la protéine ABCC4/MRP4 ainsi que l’importance de résidus individuels a clairement été prouvée. Nous avons également pu observer des intermédiaires du cycle de transport d’un transporteur ABC conjointement avec des changements structuraux. / Understanding the biological mechanisms of action of membrane proteins requires the comprehension of the interactions of xenobiotics with these proteins and with lipid membranes. Experimental methods are often demanding and only partially respond to xenobiotic-membrane-protein interactions. In silico molecular modeling is a serious alternative to tackle these issues. Molecular dynamics (MD) and biased dynamics simulations have opened many perspectives by providing an atomistic description of these intermolecular interactions. Using MD simulations, we built a model of the human ABC ABCC4/MRP4 transporter. We explored the influence of cholesterol on this protein as well as the impact of a polymorphism known to shut down the transport activity of this protein. We also studied the interaction of xenobiotics with this human transporter. The transport cycle of the ABC transporters was investigated in an attempt to better understand how it works.Interactions between lipid membranes and xenobiotics were explored by examining their ability to incorporate lipid membranes. Lipid mixtures with cholesterol showed a significant impact on the human protein ABCC4/MRP4 and on the xenobiotics studied. The importance of regions, domains constituting the ABCC4/MRP4 protein as well as the importance of specific residues has been clearly demonstrated. We also observed intermediates in the transport cycle of an ABC transporter in conjunction with structural changes occurring during this cycle.

Le glioblastome (GBM) est le cancer du cerveau le plus fréquent et grave chez l’adulte. Son pronostic sombre est en partie dû à la résistance de ces tumeurs aux chimiothérapies. L’une des principales causes de ces résistances est l’incapacité des chimiothérapies à pénétrer dans le cerveau depuis le sang à cause de la barrière hémato-encéphalique (BHE), une spécificité des vaisseaux sanguins cérébraux. Par l’injection de microbulles et l’envoi d’ultrasons dans le cerveau, il est possible d’ouvrir cette BHE pour permettre à des chimiothérapies d’entrer dans le cerveau. Nous avons montré quela chimiothérapie carboplatine gagnait en efficacité lorsqu’elle était injectée après ce procédé. Les GBM peuvent aussi montrer une résistance aux chimiothérapies par des mécanismes génétiques intrinsèques à la tumeur. Nous avons étudié l’expression et l’impact sur le pronostique des patients atteints de GBM des gènes de la famille des transporteurs ABC, dont le membre ABCA13 s’est avéré important. / Glioblastoma (GBM) is the most frequent and severe brain cancer for adults. Its dark prognosis in partly due to the resistance of these tumors to chemotherapies. One of the main causes of these resistances is the incapacity of chemotherapies to enter the brain from the blood circulation because of the bloodbrain barrier (BBB), a specificity of cerebral blood vessels. By the injection of microbubbles and the delivery of ultrasound into the brain, it is possible to open this BBB to allow chemotherapies to enter the brain. We have showed that the chemotherapeutic agent carboplatin gained efficacy when it was injectedafter this procedure. GBM can also exhibit resistance to chemotherapies by genetic mechanisms intrinsic to the tumor. We studied the expression and the impact on prognosis for GBM patients of the genes of the ABC transporters family, which member ABCA13 appeared important.

Première cause de décès par cancer chez la femme, le cancer du sein développe souvent une résistance à la chimiothérapie pouvant impliquer des transporteurs ABC (ATP Binding Cassette). Ils transportent les médicaments hors de la cellule et diminuent leur efficacité thérapeutique. Nous nous sommes intéressés à la protéine ABCC11 ou MRP8 (Multidrug Resistance Protein 8), exprimée dans le sein et responsable de l'efflux de certains anticancéreux (5FdUMP et méthotrexate). Nous avons démontré que l'expression d'ABCC11 était dépendante des voies de signalisation impliquant ER (Récepteur aux œstrogènes) ou PR (Récepteurs à la Progestérone). De plus, le tamoxifène (antagoniste d'ER) et la dexaméthasone (activateur de PR), utilisés en association avec la chimiothérapie, induisent l'expression d'ABCC11 et influenceraient négativement la réponse aux traitements anticancéreux à base de substrats d'ABCC11. L'expression d'ABCC11 a été positivement corrélée à celles d'ER et PR dans des cancers du sein. En parallèle, nous avons généré 2 modèles in silico en conformation ouverte vers l'intracellulaire ou vers l'extracellulaire et identifier des acides aminés potentiellement critiques dans l'architecture de la protéine ainsi que dans la liaison avec certains substrats (5FdUMP et GMPc). Nous avons également généré les outils moléculaires permettant l'étude de l'impact de 13 SNP (Single Nucleotide Polymorphism) non synonymes d'ABCC11. En raison d'une instabilité des lignées cellulaires, l'étude n'a pu être menée à son terme. Notre travail a ainsi contribué à une meilleure caractérisation d'ABCC11 et souligne sa potentielle valeur pronostic et prédictive dans le traitement du cancer du sein.

L’efficacité des chimiothérapies est limitée par la surexpression de pompes d’efflux adressées à la membrane plasmique des cellules cibles. En effet, celles-ci réduisent le taux intracellulaire des médicaments anticancéreux, antiviraux, antifongiques et antibactériens. La P-gp/ABCB1 est la plus impliquée dans ce phénomène, suivie de MRP1/ABCC1 et de BCRP/ABCG2. Une approche pour surmonter ce phénomène est de développer des médicaments qui ne soient pas expulsés par ces pompes. Dans ce contexte, nous avons développé une nouvelle classe d’inhibiteurs de la protéase du VIH-1 qui ne sont ni transportés par P-gp ni par BCRP. Ils sont ainsi des candidats intéressants aux trithérapies contre le SIDA. Un point clé pour comprendre comment ces transporteurs font traverser les médicaments à travers la membrane est d’identifier des nouvelles structures. Ainsi, nous avons résolu trois structures de P-gp de souris. Une d’entre-elles est complexée à un nano-anticorps lié au premier NBD («nucleotide-binding domain»), qui fige la P-gp dans une nouvelle conformation ouverte vers l'intérieur. Pour finir, nous avons localisé deux sites de liaison de P-gp en caractérisant les modes d'inhibition de deux inhibiteurs précédemment cocristallises avec la pompe. Ceci permet de mieux comprendre le mécanisme de translocation et offre la possibilité de cibler plus précisément ces sites pour développer des modulateurs de cette pompe / Resistance to chemotherapy is partly due to efflux pumps expressed in the plasma membrane which prevents the accumulation of anticancer, antiviral, antifungal and antibacterial drugs in target cells. Three human ABC transporters are particularly involved in MDR phenotype: P-gp/ABCB1, MRP1/ABCC1 and BCRP/ABCG2. Among the different approaches used to overcome the resistance linked to these transporters, the development of non-substrate drugs MDR-ABC transporters has been described. Here, new class of HIV-1 protease inhibitors not recognized by P-gp/BCRP were identified, promising to be attractive candidates to HAART therapy. Since the determination of the X-ray structures in different conformations is a key point to understand how MDR-ABC transporters translocate drugs across the plasma membrane, the crystal structures of three inward-facing conformations of mouse P-gp were resolved. One structure has a camel nanobody bound to the C-terminal side of the first nucleotide-binding domain, revealing a unique epitope on P-gp and freezing a new open-inward conformation. Finally, the enzymatic characterization of two inhibitors co-crystallized with the mouse P-gp has allowed to localize two main binding sites by which drugs efflux occurs. These results bring new findings of the drug-efflux mechanism and offer the possibility to target more precisely those sites to develop modulators of this pump

La surexpression de pompes d'efflux par les cellules cancéreuses permet l'élimination d'agents cytotoxiques, induisant alors une résistance à la chimiothérapie. Trois transporteurs ABC sont principalement impliqués dans cette résistance : P-gp/ABCB1, MRP1-ABCC1 et BCRP/ABCG2. La surexpression des ces transporteurs peut également être le "talon d'Achille" des cellules cancéreuses résistantes en les sensibilisant à certains composés. Ce phénomène, appelé sensibilité collatérale, pourrait constituer un nouvel outil thérapeutique conter les les cancers intrinséquement ou rendus résistants en éliminant sélectivement les cellules cancéreuse résistances. Ainsi, le S-vérapamil provoque la mort sélective par apoptose des cellules surexprimant suite à l'extrusion rapide et massive du glutathion 5GSH) intracellulaire par MRP1. Nous avons démontré que le vérapamil est capable de dépléter s"lectivement de leur contenu en GSH les tumeurs de cancer du poumon H69AR, MRP1 positives et résistantes, dès 3 heures d'exposition aiguë. Le vérapamil étant fortemnt carditoxique, nous avons développé de nouveaux agents de sensibilité collatérale, plus sélectif que le vérapamil, comme le xanthone 9, le flavonoïde 36 et le dimère de flavonoïde 4e. Enfin, grâce à l'étude de chimères MRP1/MRP2, nous avons démontré que la région comprenant les boucles L0 et L1-TM12 pourrait constituter les sites modualteurs et substrat du GSH sur MRP1. / Resistance to chemotherapy is partly due to efflux pumps expressed in the plasma membrane, which prevent the accumulation of anticancer drugs in tumor cells. Three human ABC transporters are particulary involved in this chemoresistance : P-gp/ABCB1, MRP1-ABCC1 and BCRP/ABCG2. The overexpression of these trnasporters can also be an "Achille heel" for resistant cancer cells by sensitizing them to various drugs. This phenomenom, called collateral sensitivity, could constitute a new chemotherapy to eradicate cancers becoming resistant or cancer which ara resistant prioir to any treatment. Thus, S-verapamil triggers selective apoptosis of MRP1 overexpressing correlated to the massive and rapide extrusion of cellular glutathione by MRP1. We showed that verapamil is able to selectivity deprive H69AR MRP1 positive and resistant lung tumors, as soon as 3 hours of acute exposure. Verapamil being highly cardiotoxic, we have developed new collateral sensitivity drugs, more selective than verapamil, such as xanthone 9, flavonoïdd 36 and flavonoïd dimer 4e. Finally, thanks to the characterization of MRP1/MRP2 chimera, we showed that the MRP1 region including the intracellular loop L0 L1-TM12 might constitute the substrate and the modulator binding sites for GSH.

Les canaux potassiques sensibles à l'ATP (KATP) jouent un rôle primordial dans la sécrétion pancréatique d'insuline et participent au contrôle du tonus vasculaire ainsi que de l'excitabilité des cellules musculaires cardiaques et neuronales. Constitués de l'assemblage unique d'un récepteur membranaire de la famille des transporteurs ABC, le récepteur des sulphonylurées SUR, et d'un canal potassique rectifiant entrant, Kir6.2, ces canaux couplent le métabolisme cellulaire au potentiel membranaire et constituent en ce sens un modèle naturel de biocapteur.<br />Le caractère unique de cet assemblage tient au fait que SUR est capable de réguler l'activité de Kir6.2 suite à la fixation de ligands: nucléotides, activateurs ou inhibiteurs pharmacologiques. Nous nous sommes intéressés aux déterminants moléculaires intervenant dans le couplage fonctionnel de SUR au canal Kir6.2. Utilisant une stratégie chimérique, nous avons identifié une région C-terminale de l'isoforme SUR2A essentielle aux mécanismes d'activation du canal, assurant le lien entre la fixation de ligands à SUR et l'ouverture de Kir6.2.<br />Nous avons également utilisé notre connaissance du modèle du canal KATP pour développer un nouveau type de biocapteur électrique, les Ion Channel Coupled Receptors (ICCR), fondé sur le couplage fonctionnel artificiel entre Kir6.2 et des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR). Par ingénierie protéique, nous avons créé deux modèles d'ICCR impliquant respectivement les récepteurs muscarinique M2 et dopaminergique D2: la fixation d'agonistes ou antagonistes spécifiques sur ces récepteurs entraîne une activation ou une inhibition du canal mesurables électriquement en temps réel, jetant les bases prometteuses d'une nouvelle génération de biocapteurs acellulaires.