Não consta resumo na publicação. / The gene encoding actin in the cellulolytic filamentus fungus Trichoderma reesei has been isolated and sequenced. The nucleotide sequence reveals that the gene is composed of 6 exons separated by 5 introns within the coding region. The positions of the introns were predicted by comparison of sequence homology to the genes coding for actin with known amino acid sequence and by identification of splice-site signal sequences. The actin protein of Trichoderma reesei shows extensive homology to the actins of other fungi E. nidulans, 95% , T. lanuginosus, 92% and S. pombae. The T. reesei actin promoter has a CT-rich region, CAAT and GC. There is no obvious TATA sequence in the T. reesei actin promoter. The absence of TATA-like sequence were also observed in anothers genes of T. reesei. An important aspect in molecular biology of filamentous fungi is the analysis, under a specific metabolic events, of the mechanism(s) regulating the expression of constitutive and induced genes. The filamentous fungus Trichoderma reesei is considered to be one of the most efficient producer of cellulase, and it serves as a model system for enzymatic cellulose hydrolysis. Expression of the cellulase genes are stringently regulated by the carbon source. Growth on cellulose results in induction of the cellulase transcripts, whereas glucose strongly represses their expression. The availability of a constitutive expressed genes of T. reesei provides not only important information regarding the molecular biology of the fungi, but also is essential for a better understanding of the mechanism(s) controlling the expression of the cellulase transcripts. Under inductive process of the of the major cellulase transcript (cbh1) and its repression by glucose, actin mRNA is constitutively expressed. The present results should be useful for further structural and functional analysis of the elements involved in inductive and constitutive expression of cellulase and actin transcripts.

A crescente demanda por energia e a necessidade de promover o desenvolvimento sustentável colocam em foco os combustíveis renováveis. Dentro de biocombustíveis, os 2G ou segunda geração, têm como objetivo a utilização da energia contida na biomassa vegetal. Muitos microorganismos são capazes de excretar enzimas que quebram a lignocelulose, o principal componente das paredes celulares da planta, em açúcares fermentáveis. Os objetivos deste trabalho foram selecionar fungos filamentosos que produzem enzimas que degradam a biomassa e otimizar suas condições de cultivo. Quatro isolados e duas linhagems padrão foram testadas para a produção de celulases e identificadas pelo sequencimaneto da região ITS (Internal Transcribed Spacer). Após a caracterização inicial, três linhagens foram selecionadas e testadas em diferentes fontes de nitrogênio e carbono, e agentes tamponantes, visando o cultivo ótimo para cada delas. As condições ideais foram escolhidas com base em critérios de atividade enzimática, proteínas totais liberadas e pH. Após o estabelecimento das condições ótimas, os sobrenadantes das culturas foram liofilizados e o teor de proteínas determinado. O mesmo extrato foi testado quanto à FPA (Filter Paper Activity), atividades de β-glicosidase e xilanases, e quanto sua capacidade hidrolitica na biomassa pré-tratada. As linhagens selecionadas foram identificadas como Phanerochaete chrysosporium (F88), Aspergillus brasiliensis (F811) e a linhagem padrão Trichoderma reesei QM9414. A melhor combinação de fontes de nitrogênio foi a razão 4:3:3; 5:3:2 e 6:3:1 (sulfato de amónio, ureia e extrato de levedura) para F88, F811 e T. reesei, respectivamente. O ácido cítrico foi selecionado como agente tamponante para F88 e T. reesei, e PIPES para F811. Bagaço pré-tratado por explosão a vapor (BPT), como fonte de carbono, foi o melhor para induzir a produção de celulases e xilanases por F88 e F811, enquanto, Solka-Floc® foi a melhor para T. reesei. As atividades de β-glicosidase e xilanase foram maiores em F811 do que para T. reesei. No entanto, para FPA, T. reesei apresentou o melhor rendimento. Nos ensaios de hidrólise, as conversões de glicana e xilana foram semelhantes para ambas as linhagens, mesmo havendo acúmulo de celobiose no ensaio de T. reesei. Comparando os dados obtidos para ambas linhagens, uma selvagem e outra que é considerada referência industrial, F811 se mostrou promissor para a produção de enzimas hidrolíticas e como consequência, a habilidade em transformar a biomassa em açúcares fermentáveis. / The increasing demand for energy and the necessity to promote sustainable development has focused on renewable fuels. Within the available biofuels, 2G or second generation, has the aim of releasing the energy contained in plant biomass. Many microorganisms are able to secret enzymes capable of breaking down lignocellulose, the main component of plant cell walls, into fermentable sugars. The objectives of this project was to select filamentous fungi that produce enzymes that degrade biomass and optimize the growth conditions for them. Four isolates and two standards strains were tested for the production of cellulases and identified by ITS (Internal Transcribed Spacer) sequencing. After initial characterization, three strains were selected and tested in different sources of nitrogen and carbon, and buffering agents for optimal growth. The ideal conditions were chosen based on the criteria of enzymatic activity, total proteins released and pH. After the ideal condition for each strain were established, cell free extracts from each culture were lyophilized and the total protein content determined. This extract was tested for FPA (Filter Paper Activity), β- glucosidase and xylanase activity and the hydrolysis assays were carried out using pretreated biomass. The selected strains were identified as Phanerochaete chrysosporium (F88), Aspergillus brasiliensis (F811) and the standard strain Trichoderma reesei QM9414. The best combination of nitrogen sources was the ratio 4:3:3; 5:3:2 and 6:3:1 (ammonium sulfate, urea and yeast extract) for F88, F811 and T. reesei, respectively. Citric acid was selected as buffering agent for F88 and T. reesei, and PIPES for F811. Steam exploded bagasse, as a carbon source, was the best to induce the cellulase and xylanase production for F88 e F811, while, Solka-floc® was better for T. reesei. The activities of β-glucosidase and xylanase were higher for F811 than for T. reesei. However, for FPA, T. reesei showed the best yield. In the hydrolysis assays, conversions of glucan and xylan were similar for both strains, even though there was an accumulation of celobiose in the T. reesei\'s assay. Comparing the data obteined for both strains, a wild type and an industrial reference, F811 showed as a promising strain to produce hydrolytic enzymes and as consequence, break down biomass into fermentable sugars.

O fungo filamentoso Trichoderma reesei é um dos principais fungos utilizados para a produção em larga escala de enzimas devido a sua grande capacidade de produção e secreção de holocelulases para aplicação em processos de sacarificação da biomassa vegetal lignocelulósica. Embora o T. reesei seja utilizado como um dos principais produtores de celulases a nível industrial, diversos processos e estudos são realizados com o objetivo de aprimorar o entendimento de todo o mecanismo de degradação de biomassa vegetal além de prover o aumento da eficiência tanto da produção quanto da atividade das celulases. No presente trabalho foi realizado a construção de uma linhagem mutante para o gene cel74a (codificando para uma xiloglucanase) e a caracterização funcional de CEL74A na regulação gênica de holocelulases durante o cultivo em bagaço de cana-de-açúcar. Os nossos resultados mostraram que deleção de cel74a possivelmente pode estar envolvida no sinergismo da regulação da expressão de holocelulases durante o cultivo em bagaço de cana-de-açúcar. A partir da análise do perfil de expressão gênica, foi possível observar a redução na expressão de todos os genes de celulases testados (cel7a, cel7b e cel6a) embora não tenha afetado a atividade enzimática, ao passo que as hemicelulases (xyn1 e xyn2) apresentaram aumento tanto na expressão quanto na atividade enzimática. Na linhagem ?cel74a, foi observado redução na liberação de glicose, xilose e galactose após a hidrólise de xiloglucano. Além disso, a atividade de CEL74A foi modulada na presença de cálcio e pode ser necessária para a atuação mais eficiente de outras enzimas envolvidas na degradação de xiloglucano. Desta forma, em T. reesei, CEL74A apresenta um papel importante tanto na regulação de genes holocelulolíticos quanto para a degradação eficiente de bagaço de cana-de-açúcar, contribuindo para a elucidação de mecanismos pelos quais este fungo utiliza para a utilização do bagaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono / The filamentous fungus Trichoderma reesei is one of the main fungi used for the large-scale production of enzymes due to their great capacity of production and secretion of holocellulases for application in saccharification processes of lignocellulosic plant biomass. Although T. reesei is used as one of the main producers of cellulases at industrial level, several processes and studies are carried out with the aim of improving the understanding of the whole plant biomass degradation mechanism, as well as increasing the efficiency of both the production and cellulase activity. In the present work the construction of a mutant lineage for the cel74a gene (coding for a xyloglucanase) and the functional characterization of CEL74A in the gene regulation of holocellulases during the cultivation of sugarcane bagasse were carried out. Our results showed that deletion of cel74a may be involved in the regulation of holocellulase expression during sugarcane bagasse cultivation. From the analysis of the gene expression profile, it was possible to observe the reduction in the expression of all tested cellulase genes (cel7a, cel7b and cel6a), although it did not affect the enzymatic activity, whereas the hemicellulases (xyn1 and xyn2) presented increase in both expression and enzymatic activity. In the ?cel74a strain, a reduction in glucose, xylose and galactose release was observed after xyloglucan hydrolysis. In addition, the activity of CEL74A was modulated in the presence of calcium and may be required for the more efficient performance of other enzymes involved in the degradation of xyloglucan. Thus, in T. reesei, CEL74A plays an important role both in the regulation of holocellulolytic genes and in the efficient degradation of sugarcane bagasse, contributing to the elucidation of mechanisms by which this fungus uses for the use of sugarcane bagasse as source of carbon

Glicose e oxigênio são moléculas essenciais para a maioria dos organismos vivos. Além de sua importância nos processos de produção de energia - glicose como fonte de carbono e energia e oxigênio como aceptor dos elétrons doados por NADH e FADH2 - estes dois compostos funcionam como efetuadores, modulando vários processos metabólicos e fisiológicos nas células. Visto que a mitocôndria é um dos alvos afetados pelas disponibilidades destas duas moléculas, nós isolamos e seqüenciamos o genoma mitocondrial de Trichoderma reesei, um fungo multicelular empregado neste trabalho como sistema modelo. Foi estudado o efeito da variação de concentração de glicose e oxigênio sobre a expressão de transcritos do genoma mitocondrial, bem como sua implicação no metabolismo de glicose. São apresentadas análises da expressão gênica de aproximadamente 2000 transcritos de T. reesei submetido a concentrações limitantes de oxigênio dissolvido, realizadas com o emprego da técnica de microarrays de cDNA. Pelo menos 330 transcritos foram diferencialmente expressos em função da disponibilidade de oxigênio. Aqueles envolvidos nos processos de síntese protéica e divisão celular foram regulados negativamente, enquanto transcritos relacionados com funções de defesa celular e síntese de RNA foram positivamente regulados. Uma fração substancial de outros genes afetados pela baixa disponibilidade de oxigênio não possui, atualmente, funções celulares conhecidas. Esta observação deve contribuir para a posterior anotação funcional do genoma de T. reesei. Também foram identificados reguladores transcricionais diferencialmente expressos em baixas tensões de oxigênio. O perfil de expressão destes reguladores aponta-os como potenciais candidatos ao envolvimento com a expressão de genes afetados pela disponibilidade de oxigênio. / Glucose and oxygen are essential molecules in most of living organisms. In addition to their importance in production of energy - glucose as a carbon and energy source and oxygen as an acceptor of electrons donated by NADH and FADH2 - both molecules function as effectors modulating various metabolic and physiological processes in the cell. Because one of the targets affected by both molecules is the mitochondrion, we isolated and sequenced the mitochondrial genome of Trichoderma reesei, a multicellular fungus that is used in this study as a model system. The effect of varying the concentration of glucose and oxygen on the expression of the transcripts of the mitochondrial genome, and its implication on the metabolism of glucose, was studied. Gene-wide expression analyses of nearly 2000 transcripts of T. reesei under limited concentration of dissolved oxygen, using cDNA microarry technique, are presented. At least 330 transcripts were differentially expressed with respect to oxygen availability. Those involved in protein synthesis and cell division processes were downregulated, while transcripts involved in cell defense and RNA synthesis were upregulated. A substantive fraction of other anaerobically affected genes have currently unknown cellular roles, and these results should therefore contribute to further functional annotation of the genome. ln addition, we have identified transcriptional regulators that are differentially expressed at a low oxygen tensions. The expression profile of these regulators points them out as potential candidates involved in the expression of genes affected by oxygen availability.

O fungo filamentoso Trichoderma reesei é um dos principais fungos utilizados para a produção em larga escala de enzimas devido a sua grande capacidade de produção e secreção de holocelulases para aplicação em processos de sacarificação da biomassa vegetal lignocelulósica. Embora o T. reesei seja utilizado como um dos principais produtores de celulases a nível industrial, diversos processos e estudos são realizados com o objetivo de aprimorar o entendimento de todo o mecanismo de degradação de biomassa vegetal além de prover o aumento da eficiência tanto da produção quanto da atividade das celulases. No presente trabalho foi realizado a construção de uma linhagem mutante para o gene cel74a (codificando para uma xiloglucanase) e a caracterização funcional de CEL74A na regulação gênica de holocelulases durante o cultivo em bagaço de cana-de-açúcar. Os nossos resultados mostraram que deleção de cel74a possivelmente pode estar envolvida no sinergismo da regulação da expressão de holocelulases durante o cultivo em bagaço de cana-de-açúcar. A partir da análise do perfil de expressão gênica, foi possível observar a redução na expressão de todos os genes de celulases testados (cel7a, cel7b e cel6a) embora não tenha afetado a atividade enzimática, ao passo que as hemicelulases (xyn1 e xyn2) apresentaram aumento tanto na expressão quanto na atividade enzimática. Na linhagem ?cel74a, foi observado redução na liberação de glicose, xilose e galactose após a hidrólise de xiloglucano. Além disso, a atividade de CEL74A foi modulada na presença de cálcio e pode ser necessária para a atuação mais eficiente de outras enzimas envolvidas na degradação de xiloglucano. Desta forma, em T. reesei, CEL74A apresenta um papel importante tanto na regulação de genes holocelulolíticos quanto para a degradação eficiente de bagaço de cana-de-açúcar, contribuindo para a elucidação de mecanismos pelos quais este fungo utiliza para a utilização do bagaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono / The filamentous fungus Trichoderma reesei is one of the main fungi used for the large-scale production of enzymes due to their great capacity of production and secretion of holocellulases for application in saccharification processes of lignocellulosic plant biomass. Although T. reesei is used as one of the main producers of cellulases at industrial level, several processes and studies are carried out with the aim of improving the understanding of the whole plant biomass degradation mechanism, as well as increasing the efficiency of both the production and cellulase activity. In the present work the construction of a mutant lineage for the cel74a gene (coding for a xyloglucanase) and the functional characterization of CEL74A in the gene regulation of holocellulases during the cultivation of sugarcane bagasse were carried out. Our results showed that deletion of cel74a may be involved in the regulation of holocellulase expression during sugarcane bagasse cultivation. From the analysis of the gene expression profile, it was possible to observe the reduction in the expression of all tested cellulase genes (cel7a, cel7b and cel6a), although it did not affect the enzymatic activity, whereas the hemicellulases (xyn1 and xyn2) presented increase in both expression and enzymatic activity. In the ?cel74a strain, a reduction in glucose, xylose and galactose release was observed after xyloglucan hydrolysis. In addition, the activity of CEL74A was modulated in the presence of calcium and may be required for the more efficient performance of other enzymes involved in the degradation of xyloglucan. Thus, in T. reesei, CEL74A plays an important role both in the regulation of holocellulolytic genes and in the efficient degradation of sugarcane bagasse, contributing to the elucidation of mechanisms by which this fungus uses for the use of sugarcane bagasse as source of carbon

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RodrigoCG_DISSERT_2010.pdf: 836774 bytes, checksum: 86ff894110e71c4fda4b7950daeb0674 (MD5) Previous issue date: 2010-02-26 / Nowadays generation ethanol second, that t is obtained from fermentation of sugars of hydrolyses of cellulose, is gaining attention worldwide as a viable alternative to petroleum mainly for being a renewable resource. The increase of first generation ethanol production i.e. that obtained from sugar-cane molasses could lead to a reduction of lands sustainable for crops and food production. However, second generation ethanol needs technologic pathway for reduce the bottlenecks as production of enzymes to hydrolysis the cellulose to glucose i.e. the cellulases as well as the development of efficient biomass pretreatment and of low-cost. In this work Trichoderma reesei ATCC 2768 was cultivated under submerged fermentation to produce cellulases using as substrates waste of lignocellulosic material such as cashew apple bagasse as well as coconut bagasse with and without pretreatment. For pretreatment the bagasses were treated with 1 M NaOH and by explosion at high pressure. Enzyme production was carried out in shaker (temperature of 27?C, 150 rpm and initial medium pH of 4.8). Results showed that T.reesei ATCC 2768 showed the higher cellulase production when the cashew apple bagasse was treated with 1M NaOH (2.160 UI/mL of CMCase and 0.215 UI/mL of FPase), in which the conversion of cellulose, in terms of total reducing sugars, was of 98.38%, when compared to pretreatment by explosion at high pressure (0.853 UI/mL of CMCase and 0.172 UI/mL of Fpase) showing a conversion of 47.39% of total reducing sugars. Cellulase production is lower for the medium containing coconut bagasse treated with 1M NaOH (0.480 UI/mL of CMcase and 0.073 UI/mL of FPase), giving a conversion of 49.5% in terms of total reducing sugars. Cashew apple bagasse without pretreatment showed cellulase activities lower (0.535 UI/mL of CMCase and 0,152 UI/mL of FPase) then pretreated bagasse while the coconut bagasse without pretreatment did not show any enzymatic activity. Maximum cell concentration was obtained using cashew nut bagasse as well as coconut shell bagasse treated with 1M NaOH, with 2.92 g/L and 1.97 g/L, respectively. These were higher than for the experiments in which the substrates were treated by explosion at high pressure, 1.93 g/L and 1.17 g/L. Cashew apple is a potential inducer for cellulolytic enzymes synthysis showing better results than coconut bagasse. Pretreatment improves the process for the cellulolytic enzyme production / Recentemente o etanol de segunda gera??o, obtido da fermenta??o dos hidrolisados de celulose, vem despertando a aten??o mundial por ser uma alternativa vi?vel e ambientalmente correta ao petr?leo, uma vez que aumentar a produ??o de etanol a partir do mela?o da cana-de-a??car, o etanol de primeira gera??o, implicaria na utiliza??o de terras destinadas a produ??o de alimentos. Entretanto, o etanol de celulose exige rotas tecnol?gicas que ainda o tornam pouco competitivo, como a produ??o de enzimas que quebrem a celulose em glicose, as celulases, e a ado??o de um processo de pr?-tratamento eficiente e de baixo custo capaz de diminuir o grau de intera??o que existe nas fibras vegetais. No presente trabalho, Trichoderma reesei ATCC 2768 foi cultivada em meio submerso para produ??o de celulases utilizando como substratos res?duos lignocelul?sicos, baga?o do ped?nculo de caju e baga?o de coco, sem tratamento e tratados com NaOH 1M e por explos?o a alta press?o. Os experimentos de produ??o das enzimas foram realizados em meio submerso e conduzidos em incubador rotat?rio (temperatura de 27?C, velocidade de agita??o de 150 rpm e pH inicial do meio de 4,8). Os resultados mostraram que T. reesei ATCC 2768 apresentou maior produ??o de celulases em meio contendo baga?o do ped?nculo de caju tratado com NaOH 1M (2,160 UI/mL de CMCase e 0,215 UI/mL de FPase), onde o consumo de celulose em forma de a??cares redutores totais foi de 98,38%, quando comparado com o mesmo tratado por explos?o a alta press?o (0,853 UI/mL de CMCase e 0,172 UI/mL de Fpase), apresentando um consumo de 47,39% de ART s. Os resultados mostraram ainda que a produ??o de celulase ? menor em meio contendo baga?o de coco tratado com NaOH 1M (0,480 UI/mL de CMcase e 0,073 UI/mL de FPase), chegando-se a 49,5% de ART s consumidos. O baga?o do ped?nculo de caju sem tratamento apresentou uma atividade bem inferior (0,535 UI/mL de CMCase e 0,152 UI/mL de FPase) quando comparado aos baga?os com tratamento e o baga?o de coco n?o-tratado n?o apresentou atividade enzim?tica. A concentra??o m?xima de c?lulas foi maior quando se utilizou como substrato os baga?os do ped?nculo de caju e casca de coco tratados alcalinamente, 2,92 g/L e 1,97 g/L, respectivamente, do que aqueles tratados por explos?o a alta press?o, 1,93 g/L e 1,17 g/L. Conclui-se que o ped?nculo de caju ? um potencial indutor ? s?ntese de enzimas celulol?ticas, apresentando-se melhor que o baga?o de coco bem como o tratamento melhora bastante o processo de s?ntese das enzimas.

La fermentation en milieu solide est un bioprocédé pouvant éventuellement être utilisé comme technologie de rupture pour diminuer le coût des biocatalyseurs utilisés dans la conversion de biomasse lignocellulosique comme le son de blé. La première partie de ces travaux de recherche a donc étudié le potentiel de cette technologie par rapport à celle de fermentation en milieu submergé lors d'une comparaison en application. Plusieurs tests de saccharification ont ainsi été réalisés sur différentes matières premières (cellulose, son de blé) et ont permis de montrer l'avantage différentiateur des biocatalyseurs produits par fermentation en milieu solide. Ensuite, la deuxième partie de ces travaux de recherche a porté sur l'étude des facteurs de la récalcitrance du son de blé à l'hydrolyse enzymatique. Deux principaux facteurs ont ainsi pu être démontrés : un facteur physique, lié à l'accessibilité des biocatalyseurs aux polysaccharides, et un facteur biochimique, lié à l'absence ou à la faible présence de certaines activités enzymatiques (féruloyl estérase,…) dans le complexe enzymatique de Trichoderma reesei Rut-C30. Cette étude a également permis d'identifier l'origine des différentes fractions glucidiques hydrolysées et de déterminer le potentiel glucidique actuellement hydrolysable à partir de cette biomasse. Enfin, la dernière partie de ces travaux de recherche a été consacrée à l'étude pratique d'un concept innovant de procédé permettant de favoriser la conversion des polysaccharides contenus dans le son de blé. Une levée de la barrière physique au transfert de masse et par conséquent une validation de ce concept a finalement pu être réalisée. / Solid-state fermentation is a bioprocess that can optionally be used as disruptive technology to reduce the cost of biocatalysts used in the lignocellulosic biomass conversion like wheat bran. The first part of this research has explored the potential of this technology compared to submerged fermentation in an application comparison. Several saccharification tests have thus been carried on different feedstocks (cellulose, wheat bran) and have shown the differentiator advantage of biocatalysts produced by solid state fermentation. Then, the second part of this research has investigated the recalcitrance factors of wheat bran to enzymatic hydrolysis. Two main factors have thus been demonstrated: a physical factor, related to the accessibility of biocatalysts to the polysaccharides, and a biochemical factor, related to the absence or the low presence of some enzymatic activities (feruloyl esterase, ...) in the enzymatic complex of Trichoderma reesei Rut-C30. This study has also identified the origin of the various carbohydrate moieties hydrolyzed and has determined the carbohydrate potential currently releasable from this biomass. Finally, the last part of this research has been devoted to the practical study of an innovative concept of process to promote the conversion of polysaccharides in wheat bran. A removal of the physical barrier to mass transfer and therefore a validation of this concept has finally been achieved.

Glicose e oxigênio são moléculas essenciais para a maioria dos organismos vivos. Além de sua importância nos processos de produção de energia - glicose como fonte de carbono e energia e oxigênio como aceptor dos elétrons doados por NADH e FADH2 - estes dois compostos funcionam como efetuadores, modulando vários processos metabólicos e fisiológicos nas células. Visto que a mitocôndria é um dos alvos afetados pelas disponibilidades destas duas moléculas, nós isolamos e seqüenciamos o genoma mitocondrial de Trichoderma reesei, um fungo multicelular empregado neste trabalho como sistema modelo. Foi estudado o efeito da variação de concentração de glicose e oxigênio sobre a expressão de transcritos do genoma mitocondrial, bem como sua implicação no metabolismo de glicose. São apresentadas análises da expressão gênica de aproximadamente 2000 transcritos de T. reesei submetido a concentrações limitantes de oxigênio dissolvido, realizadas com o emprego da técnica de microarrays de cDNA. Pelo menos 330 transcritos foram diferencialmente expressos em função da disponibilidade de oxigênio. Aqueles envolvidos nos processos de síntese protéica e divisão celular foram regulados negativamente, enquanto transcritos relacionados com funções de defesa celular e síntese de RNA foram positivamente regulados. Uma fração substancial de outros genes afetados pela baixa disponibilidade de oxigênio não possui, atualmente, funções celulares conhecidas. Esta observação deve contribuir para a posterior anotação funcional do genoma de T. reesei. Também foram identificados reguladores transcricionais diferencialmente expressos em baixas tensões de oxigênio. O perfil de expressão destes reguladores aponta-os como potenciais candidatos ao envolvimento com a expressão de genes afetados pela disponibilidade de oxigênio. / Glucose and oxygen are essential molecules in most of living organisms. In addition to their importance in production of energy - glucose as a carbon and energy source and oxygen as an acceptor of electrons donated by NADH and FADH2 - both molecules function as effectors modulating various metabolic and physiological processes in the cell. Because one of the targets affected by both molecules is the mitochondrion, we isolated and sequenced the mitochondrial genome of Trichoderma reesei, a multicellular fungus that is used in this study as a model system. The effect of varying the concentration of glucose and oxygen on the expression of the transcripts of the mitochondrial genome, and its implication on the metabolism of glucose, was studied. Gene-wide expression analyses of nearly 2000 transcripts of T. reesei under limited concentration of dissolved oxygen, using cDNA microarry technique, are presented. At least 330 transcripts were differentially expressed with respect to oxygen availability. Those involved in protein synthesis and cell division processes were downregulated, while transcripts involved in cell defense and RNA synthesis were upregulated. A substantive fraction of other anaerobically affected genes have currently unknown cellular roles, and these results should therefore contribute to further functional annotation of the genome. ln addition, we have identified transcriptional regulators that are differentially expressed at a low oxygen tensions. The expression profile of these regulators points them out as potential candidates involved in the expression of genes affected by oxygen availability.

Não consta resumo na publicação. / The gene encoding actin in the cellulolytic filamentus fungus Trichoderma reesei has been isolated and sequenced. The nucleotide sequence reveals that the gene is composed of 6 exons separated by 5 introns within the coding region. The positions of the introns were predicted by comparison of sequence homology to the genes coding for actin with known amino acid sequence and by identification of splice-site signal sequences. The actin protein of Trichoderma reesei shows extensive homology to the actins of other fungi E. nidulans, 95% , T. lanuginosus, 92% and S. pombae. The T. reesei actin promoter has a CT-rich region, CAAT and GC. There is no obvious TATA sequence in the T. reesei actin promoter. The absence of TATA-like sequence were also observed in anothers genes of T. reesei. An important aspect in molecular biology of filamentous fungi is the analysis, under a specific metabolic events, of the mechanism(s) regulating the expression of constitutive and induced genes. The filamentous fungus Trichoderma reesei is considered to be one of the most efficient producer of cellulase, and it serves as a model system for enzymatic cellulose hydrolysis. Expression of the cellulase genes are stringently regulated by the carbon source. Growth on cellulose results in induction of the cellulase transcripts, whereas glucose strongly represses their expression. The availability of a constitutive expressed genes of T. reesei provides not only important information regarding the molecular biology of the fungi, but also is essential for a better understanding of the mechanism(s) controlling the expression of the cellulase transcripts. Under inductive process of the of the major cellulase transcript (cbh1) and its repression by glucose, actin mRNA is constitutively expressed. The present results should be useful for further structural and functional analysis of the elements involved in inductive and constitutive expression of cellulase and actin transcripts.

Superóxido dismutases (SODs) são metaloenzimas que convertem o ânion superóxido em oxigênio molecular (O2) e peróxido de hidrogênio (H2O2). A presença de metal nessas enzimas está diretamente relacionada com seus mecanismos de catálise e com suas estruturas tridimensionais. Evolucionariamente, FeSOD e MnSOD podem ter evoluído de um gene ancestral comum, porque possuem sequências homólogas e estruturas cristalográficas sobreponíveis. Entretanto, a nível catalítico, ambas as proteínas divergiram o suficiente para que seus metais não possam ser intercambiáveis, produzindo uma enzima funcional, indicando que essas proteínas possuem alta especificidade por metal. O objetivo deste projeto de pesquisa é Identificar os determinantes estruturais do ajuste fino da especificidade por metal de MnSOD e FeSOD. Inicialmente, pretendese selecionar resíduos para mutagênese sítio-dirigida em TrMnSOD e TbFeSODB2, a partir de análise de acoplamento estatístico (SCA). Em seguida, mutantes serão construídos, expressos, purificados e cristalizados. A estrutura tridimensional dos mutantes será resolvida por cristalografia e sua atividade enzimática determinada, bem como a acomodação estrutural dos metais por Resonância Paramagnética Eletrônica. Nossa hipótese de trabalho é que através de SCA é possível elencar resíduos de aminoácidos candidatos para mutagênese sítio-dirigida para desenhar novas SODs, com características intermediárias de ligação por Fe/Mn, como possibilidade de interconversão de especificidade, caminhando na história evolutiva dessas moléculas. / Superoxide dismutases (SODs) are metalloenzymes that convert the superoxide anion in molecular oxygen (O2) and hydrogen peroxide (H2O2). The metal in the catalytic center of such enzymes is directly related to their catalysis mechanisms and tridimensional structures. Evolutionarily, FeSOD and MnSOD may have evolved from a common ancestor, because both proteins have homologous primary sequences and superposable crystallographic structures. However, at the catalytic level, both proteins diverged sufficiently to prevent interchange of their metallic centers, which would generate non-functional enzymes, indicating that these proteins have high metal specificity. The objective of this research project is to identify structural determinants of Fe/MnSODs necessary to metal specificity. We intend to use statistical coupling analysis (SCA) to select amino acid residues for site-directed mutagenesis in TrMnSOD e TbFeSODB2. Mutant genes will be constructed and their proteins expressed, purified and crystallized. The tridimensional structure of such mutants will be solved by X-ray crystallography and their enzymatic activities determined, as well as their electron paramagnetic resonance spectra. We hypothesize that SCA is useful to identify amino acid candidates for site-directed mutagenesis to design new SODs with intermediated Fe/Mn specificity, and even metal specificity interconversion, by studying the evolutionary history of these proteins.