Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le cancer colorectal est une cause majeure de morbidité et de mortalité dans le monde entier. Des études épidémiologiques révèlent une corrélation inverse entre le risque de développer un cancer du côlon et un régime alimentaire riche en ail. De nombreux travaux scientifiques rapportent l'activité anti-cancéreuse des polysulfures de diallyle (PSDA) dérivés de l'ail dans divers types de cancer in vitro et in vivo. Le mécanisme d'action le mieux connu repose sur l'induction de l'arrêt mitotique suivi de l'apoptose. La tubuline est identifiée comme nouvelle cible thérapeutique des PSDA. La tubuline est fondamental dans la progression de l'autophagie, source nutritionnelle essentielle pour le développement du cancer au stade avancé, et l'activation de l'autophagie joue un rôle de chimiorésistance dans le traitement du cancer du côlon. L'hypothèse de ce projet est que les PSDA dérivés de l'ail interagissent avec la tubuline pour altérer l'organisation du réseau microtubulaire responsable de l'inhibition de la prolifération cellulaire et de la modulation de l'autophagie dans le cancer du côlon. Dans un premier temps, nous avons analysé l'impact du TTSDA/TTSDB sur le réseau microtubulaire. Nous avons montré que le TTSDA/TTSDB interagissait avec la tubuline par spectrométrie en masse. Nous avons montré que l'organisation microtubulaire est altérée dans les trois lignées cellulaires : HT-29 (mutées BRAF), SW480 (mutées KRAS) et SW620 (mutées KRAS, métastatiques), plus sensibles au TTSDB que le TTSDA. Dans un deuxième temps, nous avons étudié le rôle anticancéreux du TTSDB dans le cancer du côlon. Nous avons montré que le TTSDB induisait un arrêt mitotique suivi de la mort cellulaire dans toutes lignées confondues. Son activité antiproliférative est validée dans un système de culture 3D et in vivo. Nous avons aussi montré que l'effet du TTSDB est comparable aux agents altérant les microtubules. Dans un troisième temps, nous avons évalué l'impact du TTSDB dans l'autophagie. L'inhibition de l'autophagie est accompagnée par l'accumulation de la protéine p62, qui joue un rôle de survie dans les cellules HT-29 uniquement. Ensemble, nous avons identifié l'autophagie comme mécanisme de survie lors de l'arrêt mitotique prolongé en fonction du type cellulaire. Cette étude permettra d'envisager un ciblage thérapeutique selon le profil génétique du cancer du côlon / Colorectal cancer is a major cause of morbidity and mortality worldwide. Epidemiological studies reveal an inverse correlation between the risk of developing colon cancer and a garlic-rich diet. Many scientific studies reported the anti-cancer activity of diallyl polysulfides (DAPS) derived from garlic in various types of cancer in vitro and in vivo. The best-known mechanism of action is the induction of mitotic arrest followed by apoptosis. Here tubulin is identified as a new therapeutic target for DAPS. Tubulin is fundamental in the progression of autophagy, an essential energy source for the development of advanced cancer, and autophagy activation plays a role of chemoresistance against the treatment of colon cancer.The hypothesis of this project is that garlic-derived DAPS interact with tubulin to alter the microtubule network organization responsible for the inhibition of cell proliferation and modulation of autophagy in colon cancer.First, we analyzed the impact of DATTS/DBTTS on the microtubular network. We have shown that DATTS/DBTTS interacts with tubulin by mass spectrometry. We have shown that the microtubule organization is altered in the three cell lines: HT-29 (BRAF mutated), SW480 (KRAS mutated) and SW620 (metastatic, KRAS mutated), which were more sensitive to DBTTS than DATTS. In a second step, we studied the anticancer activity of DBTTS in colon cancer. We showed that DBTTS induced mitotic arrest followed by cell death in all cell lines. Its anti-proliferative activity is validated in a 3D culture system and in vivo. We have also shown that the effect of DBTTS is comparable to microtubule altering agents. In a third step, we evaluated the impact of DBTTS in autophagy. Inhibition of autophagy is accompanied by accumulation of the p62 protein, which plays a survival role in HT-29 cells only.Altogether, we identified here autophagy as a survival mechanism during prolonged mitotic arrest depending the cell type. This study will allow us to consider targeted therapy according to the genetic profile of colon cancer

Les résultats insuffisants de la radiochimiothérapie conventionnelle ont motivé l’évaluation de nouvelles cibles afin de moduler la radiosensibilité tumorale: voies intrinsèques impliquées dans la réponse aux rayonnements ionisants, vascularisation tumorale, stroma non vasculaire. A travers cette thèse, nous avons évalué trois nouvelles stratégies de radiosensibilisation pharmacologique. Nous avons d’abord étudié en association à la radiothérapie l’intérêt de la modulation de l’axe p53/Mdm2 par le JNJ26854165, un inhibiteur de la dégradation de p53 par le protéasome. Les résultats in vitro et in vivo dans des xénogreffes sous-cutanées de cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) montrent que cette stratégie permet d’améliorer significativement l’efficacité de la radiothérapie. Nous avons également rapporté des résultats encourageants in vitro dans plusieurs lignées cellulaires tumorales avec un nouvel agent antivasculaire ciblant la tubuline, l’EHT 6706. Cette stratégie augmentait l’efficacité de l’irradiation et potentialisait l’effet antiprolifératif de certains agents de chimiothérapie conventionnelle. Enfin, le développement le plus abouti a consisté en l’évaluation de l’association d’un triple inhibiteur de MET/AXL/FGFR en association à l’irradiation in vitro et dans des modèles de CBNPC implantés en xénogreffes sous-cutanées, mais également sous forme de tumeurs pulmonaires orthotopiques. Cet agent pharmacologique potentialisait l’efficacité de la radiothérapie dans des lignées ne surexprimant pas MET. Il est apparu que l’activité de la drogue faisait intervenir, au moins partiellement, l’inhibition de l’activité d’acteurs de la cytocinèse. Ces trois évaluations, qui s’inscrivent dans la recherche translationnelle, montrent l’importance de la recherche préclinique pour les études d’association aux rayonnements ionisants. Seul un développement préclinique rationnel permettra de faire émerger de nouveaux standards dans le domaine de la biomodulation pharmacologique de la radiosensibilité tumorale. / Insufficient results of conventional chemoradiation have encouraged assessment of new targets for radiosensitization: intrinsic cellular pathways involved in radiation response, tumor angiogenesis, and nonvascular stroma. We have investigated these three strategies for pharmacological radiosensitization. First, we examined the usefulness of targeting p53/Mdm2 pathway in combination with irradiation. In vitro and in vivo results obtained in non-small cell lung carcinoma (NCSLC) showed that this strategy was promising for enhancing radiation efficacy. We also found encouraging results within several cell lines with a novel vascular disrupting agent targeting tubulin. This strategy enhanced radiation effects and also increased the antiproliferative effects of various chemotherapeutics. Finally, the most advanced preclinical development was obtained with a novel MET/AXL/FGFR inhibitor, which improved effectiveness of radiation therapy in vitro and in subcutaneous and orthotopic models of non MET-dependent cell cancer lines. This effect was not only related to an inhibition of stroma/cancer cell interactions, as it probably involved activity toward actors of cytocinesis. These studies, which are part of translational research, highlight the importance of preclinical investigations in the area of radiation research. Only rationale preclinical development will allow new standards to emerge for pharmacological modulation of tumor radiosensitivity.

Les champignons ont développé diverses interactions avec les végétaux. Ces interactions peuvent être bénéfiques pour la plante dans le cas des champignons établissant des symbioses mutualistes ou néfastes si le champignon est pathogène. Elles reposent sur des mécanismes moléculaires mal élucidés. Des études réalisées sur le champignon mutualiste Hebeloma cylindrosporum associé au pin Pinus pinaster ont permis de créer une collection de mutants affectés dans leur capacité à interagir avec les plantes et à former l’organe mixte de la symbiose, l’ectomycorhize. L’objectif de ma thèse a été d’étudier un mutant affecté dans le gène codant une alpha-tubuline Hctubα2. Les tubulines sont des protéines présentes chez tous les Eucaryotes et permettent la formation des microtubules, des éléments clés du cytosquelette. Chez les champignons, on trouve une ou deux alpha tubuline(s). H. cylindrosporum en possède deux. J’ai étudié l’expression de ces deux tubulines lors l’établissement de l’interaction avec les racines de l’hôte. Les résultats indiquent que ces deux gènes sont différentiellement exprimés lors de l’interaction. J’ai étudié au niveau protéomique l’impact de la mutation en comparant les protéomes intracellulaires des deux souches. On retrouve deux alpha-tubulines chez certains champignons phytopathogènes comme Botrytis cinerea. L’hypothèse de l’implication de l’alpha-tubuline 2 dans l’établissement de la pathogénie a été émise. J’ai donc construit des mutants de Botrytis cinerea dans lesquels ce gène a été inactivé. J’ai également tenté de localiser à l’aide de fusions traductionnelles chacune des alpha-tubulines chez le champignon mycorhizien et chez le pathogène / In all terrestrial ecosystems, plants live in close interaction with numerous fungi. The interaction has a negative or positive effect on host plant depending upon the pathogenic or symbiotic status of the fungus. The establishment of these interactions is based on a tightly regulated molecular dialog between symbiotic partners. Previous studies on the ectomycorrhizal fungi, Hebeloma cylindrosporum associated with maritime pine (Pinus pinaster), created a collection of mutants affected in their mycorrhizal abilitiy. The aim of my thesis was to characterize one of these mutants affected in a gene, Hctubα2, encoding an alpha tubulin. Tubulins are eukaryotic cytoskeletal proteins involved in microtubules formation. Fungi have one or two alpha-tubulin. For example, H.cylindrosporum has two alpha-tubulin. The site of mutagenic DNA insertion in fungal genome was characterized. I studied the expression of both alpha-tubulins during the establishement of mycorrhizal interaction. Results showed that the two genes are differentially expressed during the interaction with host plant. At proteomic level, I studied the impact of the mutation comparing the two strains using 2D gel electrophoresis and sequencing differentially accumulated spots. Pathogenic fungi also bear two alpha-tubulins, as Botrytis cinerea. The hypothesis of the involvement of the alpha-tubulin 2 in pathogenesis was investigated. I created Botrytis cinerea mutants deleted for this gene. I also created translational fusions in order to visualize both alpha-tubulins in Hebeloma cylindrosporum and in Botrytis cinerea

L'histone déacétylase HDAC6 est une enzyme multifonctionnelle possédant deux domaines déacétylases en tandem et un domaine fixant l'ubiquitine. Localisée exclusivement dans le cytoplasme, cette protéine peut déacétyler les microtubules acétylés et participer à la prise en charge des protéines ubiquitinées lors de la formation d'agrésomes. Elle possède également une activité sur d'autres substrats comme les histones ou HSP90, et elle contribue à divers processus cellulaires. Le travail présenté dans cette thèse décrit un rôle supplémentaire de cette déacétylase dans la réponse après un stress. Il vise à comprendre comment HDAC6 participe dans les mécanismes d'activation des gènes HSPs, et dans les processus de récupération cellulaire à la suite d'un choc thermique. La découverte d'un nouveau domaine nommé SE14 chez la protéine HDAC6 humaine, présente un dispositif supplémentaire de régulation nucléocytoplasmique pour cette protéine. Ce domaine permet la rétention dans le cytoplasme de cette protéine en renforçant le mécanisme d'export nucléaire. A coté de ce contrôle, le fonctionnement des deux domaines déacétylases est analysé. Des expériences in vitro et in vivo confirment l'importance de l'arrangement spatial des deux domaines dans la réaction de déacétylation. Finalement, ce travail montre que la protéine HDAC6 intervient lors de la différenciation ostéoclastique. Par son activité catalytique sur les microtubules acétylés et grâce à son interaction avec l'effecteur mDIA2, cette déacétylase est impliquée dans la maturation des ostéoclastes.

La tubuline est une protéine essentielle de la cellule. En polymérisant sous forme de microtubules, elle crée notamment le fuseau mitotique le long duquel migrent les chromosomes pendant la mitose. Les médicaments qui inhibent la polymérisation et/ou la dépolymérisation de la tubuline sont des composés majeurs de la thérapie anticancéreuse. Les vinca-alcaloïdes en sont des représentants importants. Ils induisent la mort des cellules par apoptose, en inhibant la dynamique des microtubules. D'autres molécules d'origine naturelle, comme la phomopsine A, se fixent sur la tubuline à proximité ou dans le même site de fixation que celui des vinca-alcaloïdes. C'est la raison pour laquelle nous avons envisagé d'élaborer des composés antimitotiques hybrides entre la vinblastine et la phomopsine A. Dans ce contexte, deux séries de composés ont été conçues. La première série d'hybrides correspondant à des dérivés de l'anhydrovinblastine fonctionnalisés en position 7'. Cependant, aucune des trois stratégies étudiées n'a permis d'accéder à ces composés. La deuxième série d'hybrides, dérivés de la 7'-homo-anhydrovinblastine a pu être synthétisée grâce à une réaction originale d'insertion d'acétylènes activés au niveau du pont gramine de la vinorelbine, suivie d'une réduction avec un contrôle totale de la régio- et stéréoselectivité. Dans un premier temps, les réactions d'insertion et de réduction ont été mise au point. Ensuite, deux familles d'hybrides portant la chaîne latérale de l'octahydrophomopsine en position 8' ou 7' ont été synthétisés. La plupart des composés ainsi obtenus possédent une excellente activité sur la tubuline et sont très cytotoxique.

Universiẗat, Diss., 2001--Frankfurt (Main).

SIRT1 histone deacetylase acts towards many epigenetic and non-epigenetic targets. The involvement of SIRT1 in oocyte maturation is assumed and the importance of ooplasmic SIRT1 pool for further destiny of matured oocyte is strongly suggested. We hypothesized that SIRT1 play role of the signal molecule in mature oocyte through selected epigenetic and non- epigenetic regulation. We observed SIRT1 re-localization in mature oocyte and the association with spindle microtubules. In matured oocyte, SIRT1 shows a spindle-like pattern and spindle- specific SIRT1 action is supported decreasing α-tubulin acetylation. Based on the observation of histone code in immature and matured oocytes, we suggest that SIRT1 is mostly predestined for epigenetic mode of action in germinal vesicle (GV) of immature oocyte. Accordingly, SIRT1- driven trimethylation of histone H3 on lysine K9 in matured oocyte is considered to be an inheritance of GV epigenetic transformation. Taken together, our observations point out the dual spatiotemporal SIRT1 action in oocyte capable to be switched from epigenetic to the non- epigenetic mode of action readily depending on meiosis progress. Keywords: oocyte, SIRT1, histone, developmental competence, tubuline, epigenetics

Résumé confidentiel / Résumé confidentiel

Dans les cellules, les microtubules interviennent dans de nombreux événements comme le maintien de l'architecture, la division du matériel génétique, la migration cellulaire ou encore le transport de vésicules et d'organites. Les modifications post-traductionnelles du le C-terminus de la tubuline, bloc de base des microtubules, apparaissent comme très impliquées dans la régulation de ces fonctions car elles régulent le recrutement de leurs nombreux partenaires protéiques. Durant ma thèse, je me suis particulièrement intéressée à une de ces modifications post traductionnelles : le cycle de détyrosination/tyrosination du C-terminus de l'α-tubuline. Ce cycle implique deux enzymes la Tubuline CarboxyPeptidase (TCP), qui clive la tyrosine à l'extrémité de l'α-tubuline, et la Tubuline Tyrosine Ligase (TTL) qui ré-additionne une tyrosine à la tubuline détyrosinée. Des études menées sur ce cycle et notamment la découverte de la TTL ont permis de montrer que la présence d'une tyrosine à l'extrémité C-terminale de l'α-tubuline est indispensable au développement neuronal et que son absence favorise la progression tumorale. La TCP quant à elle est encore inconnue et sa découverte apparaît essentielle afin de pouvoir appréhender le cycle de détyrosination/tyrosination dans sa globalité. Avec pour fil rouge l'identification de la TCP, mon travail s'est déroulé en trois temps. Je me suis tout d'abord intéressée à la protéine EB1. Cette protéine se lie à l'extrémité positive des microtubules où elle recrute de nombreux partenaires microtubulaires. EB1, présente le même C-terminus que l'α-tubuline et notamment une tyrosine terminale indispensable à la liaison des protéines à CAP-Gly. Dans des cellules et des tissus sains j'ai montré qu'EB1 n'existe pas sous forme détyrosinée ce qui souligne la spécificité de la TCP pour l'α-tubuline. Dans un second temps, j'ai participé à l'étude d'une famille de carboxypeptidases cytosoliques impliquées dans la neurodégénérescence, les CCPs, parmi lesquelles nous pensions trouver la TCP. Nous avons montré que quatre de ces enzymes (CCP1, 4, 5, et 6) retirent les glutamates présents de manière latérale au C-terminus de la tubuline. Les CCP1, 4 et 6 peuvent également cliver le dernier glutamate de la tubuline détyrosiné générant de l'α-tubuline où les deux derniers acides aminés ont été clivés (tubuline-Δ2). Aucune de ces carboxypeptidases ne se révélant être la TCP, j'ai mis en place une méthode biochimique dans le but de purifier cette enzyme. Après plusieurs étapes de purification à partir de cerveaux de souris, des préparations enrichies en activité carboxypeptidase ont été obtenues. Les analyses spectrométriques et bioinformatiques de ces préparations ont permis d'isoler des candidats TCP actuellement testés pour leur potentielle activité de détyrosination du C-terminus de l'α-tubuline. Si la TCP n'est pas présente parmi eux, les outils développés lors de cette étude devraient permettre une très prochaine identification de cette enzyme essentielle. / Microtubules control many aspects of cellular function. Those polymers of tubulin are involved in numerous events ranging from the maintenance of cell architecture to cell division and migration through the transport of vesicles and organelles. The post-translational modifications of the C-terminus of tubulin appear to be involved in the regulation of microtubule functions by recruiting different effectors at the growing end of microtubules. During my PhD, I focused on one of these post-translational modifications: the detyrosination/tyrosination cycle of the C-terminal α-tubulin. This cycle involves the enzymatic removal of the C-terminal tyrosine of α-tubulin by an uncharacterized tubulin carboxypeptidase (TCP) and the re-addition of a tyrosine residue by the Tubulin-Tyrosine-Ligase (TTL) isolated in 1975. On one hand, tubulin tyrosination is important in neuronal organization whereas TTL suppression in human cancers is associated with tumor aggressiveness. Those defects are in part due to the failure of microtubule partners to bind detyrosinated microtubules. My project was divided into three main parts. I have first studied EB1, a microtubule plus end tracking protein which recruits many proteins at the microtubule plus end. This protein ends with the same amino acids as does α-tubulin. As in tubulin, the tyrosine terminal is important for the binding of EB1 partners. I showed that EB1 does not exist under detyrosinated form underlying the TCP specificity. Then, I collaborated to identify the function of a carboxypeptidase family within which we thought we could find the TCP. Four members of this family are deglutamylating enzymes (CCP1, CCP4, CCP5 and CCP5). Three of them (CCP1, CCP4 and CCP6) can cleave the last glutamate of detyrosinated tubulin to generate tubulin without the last two C-terminus amino acids (Δ2-tubulin). However, none of them was identified as the TCP. I consequently developed a biochemical approach to find this enzyme. Extracts enriched in carboxypeptidase activity after purification steps from mice brain were analyzed by mass spec and bioinformatics. Some candidates are currently tested for their potential C-terminus α-tubulin detyrosinating activity. The tools developed here should allow for pending identification of the TCP.