Les astrocytes protoplasmiques de la matière grise corticale sont des cellules gliales dont les prolongements très fins et ramifiés sont en contact avec les éléments neuronaux pré- et post-synaptiques d’une part, et les vaisseaux sanguins d’autre part. Ils expriment plusieurs récepteurs des neurotransmetteurs, entre autres des récepteurs purinergiques dont l'activation facilite l’activité calcique astrocytaire et la libération de gliotransmitters (par exemple, le glutamate, le GABA, l'ATP, et la D sérine) qui régulent l’activité des neurones et des cellules gliales situées au voisinage. L’objectif de ma thèse était d’étudier in situ l’activité calcique des astrocytes et de leurs prolongements en réponse à l’application des agonistes purinergiques. Lors de ma thèse, j’ai tout d'abord testé la possibilité d’induire l’expression spécifique de gènes d’intérêt par les astrocytes corticaux de souris adultes par la technique de recombinaison Cre-LoxP. J’ai comparé les performances d’un virus adeno-associé de type 5 (AAV5) flexé (AAV5.FLEX.EGFP) et d’une souris qui exprime un indicateur calcique (GCaMP3) sous contrôle de la recombinase (souris Rosa-CAG-LSL-GCaMP3). L’injection d’AAV5.FLEX.EGFP dans le cortex d’une souris hGFAPcre n’a pas permis l’expression spécifique d’EGFP. La combinaison des souris exprimant le cre recombinase sous contrôle d’un promoteur sélectif des astrocytes (GLAST-CreERT2 et Cx30-CreERT2) avec le AAV5.FLEX.EGFP ou avec une lignée des souris Rosa-CAG-LSL-GCaMP3 permet l’expression spécifique des gènes d’intérêt (EGFP et GCaMP3) par les astrocytes corticaux. J’ai ensuite analysé l’activité calcique des astrocytes qui expriment GCaMP3. J’ai utilisé la microscopie biphotonique et enregistré l’activité calcique spontanée et évoquée par application d’agonistes purinergiques sur des tranches de cortex somatosensoriel primaire de souris adultes GLAST-CreERT2. L’activité calcique spontanée est complexe, généralement locale et désynchronisée, répartie dans les prolongements et la région somatique. Les régions actives ont été identifiées à partir d’une carte de corrélation temporale calculée en MATLAB, et leurs caractéristiques (amplitude, durée, position, fréquence) mesurées grâce à des routines établies sous IGOR. La fréquence et l’amplitude de l’activité calcique paraissent augmenter lors de l’enregistrement, ce qui suggère une sensibilité significative et une photoactivation des astrocytes, en imagerie biphotonique. La durée des impulsions laser modulerait ce phénomène. En présence d'adénosine (1-100 µM) et d’ATP (100 µM), et de façon marginale en présence d’un agoniste P2X7 non sélectif (BzATP 50-100 µM), une activité calcique synchronisée accrue est visible dans le soma et les prolongements astrocytaires en présence de tétrodotoxine qui bloque les potentiels d'action et minimise l’activité synaptique. Le mécanisme de ces réponses synchronisées reste à étudier. Aucun effet significatif n’a été observé en présence d’un agoniste spécifique P2Y1 (MRS2365 50 uM). Mon travail a permis le développement : i) de modèles murins pour l’adressage sélectif de protéines d’intérêt au niveau des astrocytes protoplasmiques ; ii) d’outils d’analyse des signaux calciques astrocytaires au niveau sub-cellulaire. Il a mis en évidence des limites possibles des protocoles standards d'enregistrement de l’activité calcique des astrocytes en imagerie biphotonique. Il confirme l’importance de l’ATP et de l’adénosine pour la signalisation astrocytaire. / Grey matter protoplasmic astrocytes are compact glial cells with highly branched processes, enwrapping synapses, and one or two endfeet contacting the blood vessels. Several neurotransmitter receptors are expressed by astrocytes, among them purinergic receptors. Upon activation of these receptors, intracellular calcium (Ca2+) transients can be induced, that, in turn, trigger gliotransmitter release (e.g. glutamate, GABA, ATP, D-serine) and participate in astrocyte-to-astrocyte signaling as well as in the communication between astrocytes and neurons or other glia. During my PhD work, I first implemented and validated several approaches for targeting transgene expression specifically to cortical astrocytes and employed them to study purinergic signaling in astrocytes. To achieve astrocyte-specific transgene expression, I used either floxed adeno-associated viral (AAV) vectors or a Cre-dependent mouse line and several mouse lines expressing the Cre recombinase under astrocyte-specific promoters. Intracerebral injections of a Cre-dependent AAV serotype 5 containing the ubiquitous CAG promoter and an enhanced green fluorescent protein (AAV5.CAG.flex.EGFP) in adult mice expressing Cre recombinase under the human glial fibrillary protein (hGFAP) promoter resulted in a non-astrocyte specific expression in the cortex. Combining inducible mouse lines expressing Cre recombinase under the glutamate aspartate transporter (GLAST) promoter with the same AAV vector resulted in a virtually astrocyte-specific expression of the reporter gene. As an alternative approach for astrocyte-specific transgene expression, we used a Cre-dependent mouse line expressing the genetically encoded Ca2+ indicator GCaMP3. Crossing this mouse line with the above described GLAST-CreERT2 mouse line or a Connexin30 (Cx30)-CreERT2 line led to selective GCaMP3 expression in cortical astrocytes. Second, I investigated both spontaneous and agonist-evoked Ca2+ transients in astrocytic processes, the investigation of which has presented a major challenge in earlier studies, due to the unspecific and weak labeling by membrane-permeable chemical Ca2+ indicators. Using the strategy developed in the first part of my work allowing an astrocyte-specific expression of the genetically encoded Ca2+ indicator GCaMP3. Using two-photon excitation fluorescence (2PEF) imaging in acute slices of the primary somatosensory cortex, I recorded Ca2+ transients in the astrocytic soma and processes. By aid of a custom-made MATLAB routine based on a temporal Pearson correlation coefficient, active regions could be identified in an unbiased manner. Evoked Ca2+ transients were quantified using custom IGOR routines. Spontaneous desynchronized Ca2+ transients occurred in the processes and rarely in the soma. Ca2+ signals appeared localized in distinct microdomains. Their frequency appeared to increase during long recordings of several hundred images, suggesting that fine astrocytes are vulnerable to photodamage under imaging conditions routine in 2PEF microscopy. The possibility to minimize photodamage, by varying the length of the femtosecond laser pulses is under investigation. Bath application of adenosine (1-100 µM) and adenosine-triphosphate (ATP, 100 µM), as well as the application of the non-selective P2X7 receptor agonist (2'(3')-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosine-5'-triphosphate, BzATP, 50-100 µM), in the presence of tetrodotoxin to block neuronal action potentials, evoked synchronized Ca2+ rises in the soma and the processes of astrocytes. The effect of adenosine was dose-dependent. No significant effect of the specific P2Y1 agonist (MRS2365, 50 µM) was seen. Altogether, my work sets up a powerful and versatile toolbox for studying astrocytic Ca2+ signaling at the sub-cellular level. It also pinpoints possible limits of standard two-photon recording protocols to investigate the local Ca2+ signals in fine astrocytic processes.

Les astrocytes protoplasmiques de la matière grise corticale sont des cellules gliales dont les prolongements très fins et ramifiés sont en contact avec les éléments neuronaux pré- et post-synaptiques d’une part, et les vaisseaux sanguins d’autre part. Ils expriment plusieurs récepteurs des neurotransmetteurs, entre autres des récepteurs purinergiques dont l'activation facilite l’activité calcique astrocytaire et la libération de gliotransmitters (par exemple, le glutamate, le GABA, l'ATP, et la D sérine) qui régulent l’activité des neurones et des cellules gliales situées au voisinage. L’objectif de ma thèse était d’étudier in situ l’activité calcique des astrocytes et de leurs prolongements en réponse à l’application des agonistes purinergiques. Lors de ma thèse, j’ai tout d'abord testé la possibilité d’induire l’expression spécifique de gènes d’intérêt par les astrocytes corticaux de souris adultes par la technique de recombinaison Cre-LoxP. J’ai comparé les performances d’un virus adeno-associé de type 5 (AAV5) flexé (AAV5.FLEX.EGFP) et d’une souris qui exprime un indicateur calcique (GCaMP3) sous contrôle de la recombinase (souris Rosa-CAG-LSL-GCaMP3). L’injection d’AAV5.FLEX.EGFP dans le cortex d’une souris hGFAPcre n’a pas permis l’expression spécifique d’EGFP. La combinaison des souris exprimant le cre recombinase sous contrôle d’un promoteur sélectif des astrocytes (GLAST-CreERT2 et Cx30-CreERT2) avec le AAV5.FLEX.EGFP ou avec une lignée des souris Rosa-CAG-LSL-GCaMP3 permet l’expression spécifique des gènes d’intérêt (EGFP et GCaMP3) par les astrocytes corticaux. J’ai ensuite analysé l’activité calcique des astrocytes qui expriment GCaMP3. J’ai utilisé la microscopie biphotonique et enregistré l’activité calcique spontanée et évoquée par application d’agonistes purinergiques sur des tranches de cortex somatosensoriel primaire de souris adultes GLAST-CreERT2. L’activité calcique spontanée est complexe, généralement locale et désynchronisée, répartie dans les prolongements et la région somatique. Les régions actives ont été identifiées à partir d’une carte de corrélation temporale calculée en MATLAB, et leurs caractéristiques (amplitude, durée, position, fréquence) mesurées grâce à des routines établies sous IGOR. La fréquence et l’amplitude de l’activité calcique paraissent augmenter lors de l’enregistrement, ce qui suggère une sensibilité significative et une photoactivation des astrocytes, en imagerie biphotonique. La durée des impulsions laser modulerait ce phénomène. En présence d'adénosine (1-100 µM) et d’ATP (100 µM), et de façon marginale en présence d’un agoniste P2X7 non sélectif (BzATP 50-100 µM), une activité calcique synchronisée accrue est visible dans le soma et les prolongements astrocytaires en présence de tétrodotoxine qui bloque les potentiels d'action et minimise l’activité synaptique. Le mécanisme de ces réponses synchronisées reste à étudier. Aucun effet significatif n’a été observé en présence d’un agoniste spécifique P2Y1 (MRS2365 50 uM). Mon travail a permis le développement : i) de modèles murins pour l’adressage sélectif de protéines d’intérêt au niveau des astrocytes protoplasmiques ; ii) d’outils d’analyse des signaux calciques astrocytaires au niveau sub-cellulaire. Il a mis en évidence des limites possibles des protocoles standards d'enregistrement de l’activité calcique des astrocytes en imagerie biphotonique. Il confirme l’importance de l’ATP et de l’adénosine pour la signalisation astrocytaire. / Grey matter protoplasmic astrocytes are compact glial cells with highly branched processes, enwrapping synapses, and one or two endfeet contacting the blood vessels. Several neurotransmitter receptors are expressed by astrocytes, among them purinergic receptors. Upon activation of these receptors, intracellular calcium (Ca2+) transients can be induced, that, in turn, trigger gliotransmitter release (e.g. glutamate, GABA, ATP, D-serine) and participate in astrocyte-to-astrocyte signaling as well as in the communication between astrocytes and neurons or other glia. During my PhD work, I first implemented and validated several approaches for targeting transgene expression specifically to cortical astrocytes and employed them to study purinergic signaling in astrocytes. To achieve astrocyte-specific transgene expression, I used either floxed adeno-associated viral (AAV) vectors or a Cre-dependent mouse line and several mouse lines expressing the Cre recombinase under astrocyte-specific promoters. Intracerebral injections of a Cre-dependent AAV serotype 5 containing the ubiquitous CAG promoter and an enhanced green fluorescent protein (AAV5.CAG.flex.EGFP) in adult mice expressing Cre recombinase under the human glial fibrillary protein (hGFAP) promoter resulted in a non-astrocyte specific expression in the cortex. Combining inducible mouse lines expressing Cre recombinase under the glutamate aspartate transporter (GLAST) promoter with the same AAV vector resulted in a virtually astrocyte-specific expression of the reporter gene. As an alternative approach for astrocyte-specific transgene expression, we used a Cre-dependent mouse line expressing the genetically encoded Ca2+ indicator GCaMP3. Crossing this mouse line with the above described GLAST-CreERT2 mouse line or a Connexin30 (Cx30)-CreERT2 line led to selective GCaMP3 expression in cortical astrocytes. Second, I investigated both spontaneous and agonist-evoked Ca2+ transients in astrocytic processes, the investigation of which has presented a major challenge in earlier studies, due to the unspecific and weak labeling by membrane-permeable chemical Ca2+ indicators. Using the strategy developed in the first part of my work allowing an astrocyte-specific expression of the genetically encoded Ca2+ indicator GCaMP3. Using two-photon excitation fluorescence (2PEF) imaging in acute slices of the primary somatosensory cortex, I recorded Ca2+ transients in the astrocytic soma and processes. By aid of a custom-made MATLAB routine based on a temporal Pearson correlation coefficient, active regions could be identified in an unbiased manner. Evoked Ca2+ transients were quantified using custom IGOR routines. Spontaneous desynchronized Ca2+ transients occurred in the processes and rarely in the soma. Ca2+ signals appeared localized in distinct microdomains. Their frequency appeared to increase during long recordings of several hundred images, suggesting that fine astrocytes are vulnerable to photodamage under imaging conditions routine in 2PEF microscopy. The possibility to minimize photodamage, by varying the length of the femtosecond laser pulses is under investigation. Bath application of adenosine (1-100 µM) and adenosine-triphosphate (ATP, 100 µM), as well as the application of the non-selective P2X7 receptor agonist (2'(3')-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosine-5'-triphosphate, BzATP, 50-100 µM), in the presence of tetrodotoxin to block neuronal action potentials, evoked synchronized Ca2+ rises in the soma and the processes of astrocytes. The effect of adenosine was dose-dependent. No significant effect of the specific P2Y1 agonist (MRS2365, 50 µM) was seen. Altogether, my work sets up a powerful and versatile toolbox for studying astrocytic Ca2+ signaling at the sub-cellular level. It also pinpoints possible limits of standard two-photon recording protocols to investigate the local Ca2+ signals in fine astrocytic processes.

Les chromophores classiques ne sont pas toujours efficaces en absorption à deux photons. Leur faible efficacité nécessite l'utilisation de fortes puissances laser et de grandes concentrations en colorants. Dans ce sens, la microscopie à deux photons in vivo requière le développement de nouvelles stratégies de marquage utilisant des chromophores spécialement dédiés à la microscopie à deux photons. Dans le cadre de collaborations avec des chimistes spécialisés dans la synthèse de molécules à forte section efficace d'absorption à deux photons, différents chromophores ont été synthétisés. Ces molécules organiques sont souvent hydrophobes et ne sont pas utilisables directement pour les applications en biologie. Le travail effectuer ici a consisté à encapsuler ces molécules dans des micelles de copolymères biocompatibles, les Pluronic. Les Pluronic sont des matériaux pouvant s'auto assembler en milieu aqueux sous forme de micelles et permettent de solubiliser des composés hydrophobes. Cette stratégie est déjà utilisé pour permettre de transporter différents composés hydrophobes dans les organismes vivants et a été utilisée ici pour transporter des chromophores ultrasensibles à deux photons dans le sang de manière à imager la vascularisation in vivo. / Classic fluorescent dyes are not necessary efficient in two-photon absorption. Their low two-photon absorption efficiency often requires high laser power and important dye concentrations. Therefore, new dyes and other administration strategies need to be developed specifically for intravital two-photon microscopy. In collaboration with chemists, specialized in the synthesis of molecules with a high two-photon absorption cross-section, different dyes have been synthesized. Most of these dyes are hydrophobic and not directly suitable for biological applications. The work presented in this thesis consisted of encapsulating hydrophobic molecules in biocompatible Pluronic block copolymers. In water, Pluronic unimers with hydrophobic and hydrophilic blocks self-assembled in hydrophilic micelles forming a hydrophobic core around the molecules. This strategy has been used already for the transport and delivery of different hydrophobic molecules in living organism. In the present study, this strategy has been transposed to transport ultra sensitive two-photon dyes in the blood plasma for deep vascular imaging in vivo.

Les biofilms sont des communautés microbiennes se développant sur des interfaces, en particulier solide-liquide, où les micro-organismes sont enrobés dans une matrice polymérique auto-sécrétée. Le mode de vie sous forme de biofilm est prédominant dans les milieux naturels (par e.g. la texture glissante des fonds de rivières, les dépôts visqueux des canalisations et la plaque dentaire) et confère aux micro-organismes un environnement propice à leur développement. Ceci est particulièrement vrai dans des milieux poreux qui, de part leur important ratio surface/volume, constituent des substrats favorables à la colonisation. Le cadre des biofilms en milieux poreux forme une complexité multi-physique d’ordre élevée dans laquelle interagissent des mécanismes physiques, chimiques et biologiques multi-échelles encore mal compris et très partiellement maîtrisés. La rétroaction entre l’écoulement, la distribution spatiale des microorganismes et le transport de nutriments (par diffusion et advection) en est un exemple. Le développement de biofilms en milieux poreux est au centre de multiples procédés d’ingénierie, tel que les bio-filtres, la bio-remédiation des sols, le stockage de CO2, et de problèmes médicaux comme les infections. Un verrou significatif à l’avancée des connaissances est la limitation des techniques exploratoires en métrologie et imagerie dans des milieux opaques. L’objectif principal de cette thèse est la proposition de méthodologies expérimentales reproductibles et robustes permettant l’étude de biofilms en milieux poreux. Un dispositif expérimental en conditions physiques et biologiques contrôlées est proposé. De plus, un protocole d’imagerie 3D basé sur la micro-tomographie à rayons X (MT RX) associé à l’utilisation d’un nouvel agent de contraste (sulfate de baryum et gel d’agarose), est validé afin de quantifier la distribution spatiale du biofilm. Dans un premier temps, la méthodologie MT RX est comparée à une des méthodes les plus utilisées pour la visualisation de biofilms : la microscopie photonique par fluorescence, ici biphotonique (MBP). Cette comparaison est réalisée pour des biofilms de Pseudomonas Aeruginosa développés dans des capillaires transparents en verre, ce qui facilite l’application des deux modalités. Dans un second temps, une étude des incertitudes liées à l’imagerie est réalisée à travers l’évaluation de différentes métriques (volume, surfaces 3D, épaisseurs) pour un fantôme d’imagerie et trois algorithmes de segmentation différents. Les analyses quantitatives montrent que le protocole de MT RX permet une visualisation du biofilm avec une incertitude d’environ 17%, ce qui est comparable à la MBP (14%). La reproductibilité et la robustesse de la méthodologie MT RX est démontrée. La troisième étape du travail de recherche permet d’aboutir au développement d’un bioréacteur innovant élaboré par fabrication additive et contrôlé par un système micro-fluidique de haute précision. Le dispositif expérimental que nous avons conçu permet de suivre en temps réel l’évolution des propriétés de transport (perméabilité effective), les concentrations en O2 et le détachement de biofilm par spectrophotométrie ; ceci pour des conditions hydrodynamiques contrôlées. Notre méthodologie permet d’étudier l’influence de paramètres biophysiques sur la colonisation du milieu poreux, par exemple l’influence du débit ou de la concentration de nutriments sur le développement temporel du biofilm. En conclusion, ce travail de thèse propose une méthodologie expérimentale reproductible et robuste pour la croissance contrôlée et l’imagerie 3D de biofilms en milieux poreux en apportant la versatilité du contrôle de la micro-architecture du milieu, de l’écoulement et des conditions biochimiques de culture. A notre connaissance, l’approche scientifique suivie et les dispositifs expérimentaux associés constitue la méthodologie la plus complète à ce jour, pour l’étude de biofilms en milieu poreux. / Biofilms are microbial communities developing at the interface between two phases, usually solidliquid, where the micro-organisms are nested in a self-secreted polymer matrix. The biofilm mode of growth is predominant in nature (for e.g. the slimy matter forming on rocks at river bottoms, the viscous deposit in water pipes or even dental plaque) and confers a suitable environment for the development of the micro-organisms. This is particularly the case for porous media which provide favourable substrates given their significant surface to volume ratio. The multi-physical framework of biofilms in porous media is highly complex where the mechanical, chemical and biological aspects interacting at different scales are poorly understood and very partially controlled. An example is the feedback mechanism between flow, spatial distribution of the micro-organisms and the transport of nutrient (by diffusion and advection). Biofilms developing in porous media are a key process of many engineering applications, for example biofilters, soil bio-remediation, CO2 storage and medical issues like infections. Progress in this domain is substantially hindered by the limitations of experimental techniques in metrology and imaging in opaques structures. The main objective of this thesis is to propose robust and reproducible experimental methodologies for the investigation of biofilms in porous media. An experimental workbench under controlled physical and biological conditions is proposed along with a validated 3D imaging protocol based on X-ray micro-tomography (XR MT) using a novel contrast agent (barium sulfate and agarose gel) to quantify the spatial distribution of the biofilm. At first, the XR MT-based methodology is compared to a commonly used techniques for biofilm observation: one or multiple photon excitation fluorescence microscopy, here two-photon laser scanning microscopy (TPLSM). This comparison is performed on Pseudomonas Aeruginosa biofilms grown in transparent glass capillaries which allows for the use of both imaging modalities. Then, the study of uncertainty associated to different metrics namely volume, 3D surface area and thickness, is achieved via an imaging phantom and three different segmentation algorithms. The quantitative analysis show that the protocol enables a visualisation of the biofilm with an uncertainty of approximately 17% which is comparable to TPLSM (14%). The reproducibility and robustness of the XR MT-based methodology is demonstrated. The last step of this work is the achievement of a novel bioreactor elaborated by additive manufacturing and controlled by a high-performance micro-fluidic system. The experimental workbench that we have designed enables to monitor in real-time the evolution of transport properties (effective permeability), O2 concentrations and biofilm detachment by spectrophotometry, all under controlled hydrodynamical conditions. Our methodology allows to investigate the influence of biophysical parameters on the colonisation of the porous medium, for example, the influence of flow rate or nutrient concentration on the temporal development of the biofilm. In conclusion, the thesis work proposes a robust and reproducible experimental methodology for the controlled growth and 3D imaging of biofilms in porous media; while providing versatility in the control of the substrate’s micro-architecture as well as on the flow and biochemical culture conditions. To our knowledge, the scientific approach followed, along with the experimental apparatus, form the most complete methodology, at this time, for the study of biofilms in porous media.

La fluorescence excitée à deux photons est actuellement largement utilisée pour l’imagerie de tissus biologiques, mais la faible sensibilité des fluorophores utilisés en microscopie confocale (excitation à un photon) à une excitation à deux photons (ADP) rend nécessaire la conception et la synthèse de nouveaux fluorophores spécifiques pour la microscopie de fluorescence par excitation bi-photonique (MFEB). Mon travail de thèse a ainsi porté sur l’ingénierie moléculaire (conception, synthèse et caractérisations) de nouveaux fluorophores pour la MFEB. Nous nous sommes particulièrement intéressés à des systèmes unidimensionnels (1D) de petite taille comportant des systèmes π étendus autour d’un cœur rigide (dicétopyrrolopyrrole ou DPP) et entourés de différents systèmes électro-actifs. Nous avons modifié par la suite les fluorophores précédents de manière à pouvoir les conjuguer à des molécules d’intérêt biologique, comme des protéines. Ces fluorophores bio-conjugables ont été greffés sur un peptide du virus HIV étudié au laboratoire : TAT (Trans-Activator of Transcription). L’imagerie par microscopie biphotonique a été effectuée avec succès sur des cellules HeLa. Nous nous sommes ensuite tourné vers la mise au point de nouvelles sondes multimodales pour associer la MEBP à une autre modalité d’imagerie : la résonance magnétique nucléaire et la microscopie électronique (imagerie corrélative). Pour ce faire nous avons développé des colorants fluorescents par excitation bi-photonique comportant une entité paramagnétique ou dense aux électrons (nanoparticules de magnétite, ion gadolinium III ou atomes lourds comme le platine et l’or). / Two-photon induced fluorescence is nowadays widely used for the imaging of biological tissues. The classical fluorophores used in confocal microscopy exhibit low sensitivity to two-photon excitation for the two-photon excitation microscopy (TPEM), led the researchers towards the development of new fluorophores, specifically engineered for TPEM. This manuscript describes our work on conception, synthesis and characterizations of new one-dimensional fluorophores based on dicétopyrrolopyrrole (DPP) central core, surrounded by various electro-active systems through π conjugated systems. We also modified such fluorophores to be able to conjugate them to molecules of biological interest, such as proteins. These bio-conjugable fluorophores were grafted on a peptide of HIV virus studied in our laboratory: TAT (Trans-Activator of transcription). The imaging by TPEM was successfully performed on HeLa cells. In addition we developed new multimodal probes for the correlative light electronic microscopy and for the correlative imaging fluorescence microscopy/ Magnetic resonance imaging (MRI). Theses multimodal probes associate a fluorescent moiety based on the DPP core associated to a paramagnetic or electron dense entity (magnetite nanoparticles, gadolinium III or heavy atoms such as platinum or gold).

Les changements des connections neuronales interviendraient dans la formation de la mémoire. J’ai développé de nouvelles approches basées sur l’imagerie photonique pour étudier (i) les interactions entre les microglies et les épines dendritiques, et (ii) le renouvellement des épines dans l’hippocampe in vivo. Ces deux phénomènes contribueraient au remodelage des circuits synaptiques intervenant dans la mémoire. (i) Les microglies sont impliquées dans de nouvelles fonctions en condition saine. J’ai examiné l’effet de la plasticité synaptique sur la dynamique morphologique des microglies, et sur leur interaction avec les épines. En combinant l’électrophysiologie et l’imagerie bi-photonique dans des tranches aigües de souris transgéniques, je démontre que la microglie intensifie son interaction physique avec les épines. Ainsi pour continuer l’étude de ces interactions et leur impact fonctionnel plus précisément, j’ai optimisé l’imagerie STED dans des tranches aigües. (ii) La plasticité structurale des épines est cruciale pour la mémoire, mais les connaissances à ce sujet dans l’hippocampe in vivo restent limitées. J’ai donc établi une technique d’imagerie chronique STED in vivo pour visualiser les épines dans l’hippocampe. Cette approche a révélé une densité double de celle reportée précédemment à l’aide de la microscopie bi-photonique. De plus j’ai observé un renouvellement des épines de 40% en 5 jours, représentant un taux important de remodelage synaptique dans l’hippocampe. Les approches d’imagerie super-résolutive permettent l’étude des interactions microglie-épine, et du renouvellement des épines hippocampiques avec une résolution inédite chez la souris vivante. / Activity-dependent changes in neuronal connectivity are thought to underlie learning and memory. I developed and applied novel high-resolution imaging-based approaches to study (i) microglia-spine interactions and (ii) the turnover of dendritic spines in the mouse hippocampus, which are both thought to contribute to the remodeling of synaptic circuits underlying memory formation. (i) Microglia have been implicated in a variety of novel tasks beyond their classic immune defensive roles. I examined the effect of synaptic plasticity on microglial morphological dynamics and interactions with spines, using a combination of electrophysiology and two-photon microscopy in acute brain slices. I demonstrated that microglia intensify their physical interactions with spines after the induction of hippocampal synaptic plasticity. To study these interactions and their functional impact in greater detail, I optimized and applied time-lapse STED imaging in acute brain slices. (ii) Spine structural plasticity is thought to underpin memory formation. Yet, we know very little about it in the hippocampus in vivo, which is the archetypical memory center of the mammalian brain. I established chronic in vivo STED imaging of hippocampal spines in the living mouse using a modified cranial window technique. The super-resolution approach revealed a spine density that was two times higher than reported in the two-photon literature, and a spine turnover of 40% over 5 days, indicating a high level of structural remodeling of hippocampal synaptic circuits. The developed super-resolution imaging approaches enable the examination of microglia-synapse interactions and dendritic spines with unprecedented resolution in the living brain (tissue).

Les astrocytes protoplasmiques de la matière grise corticale sont des cellules gliales dont les prolongements très fins et ramifiés sont en contact avec les éléments neuronaux pré- et post-synaptiques d’une part, et les vaisseaux sanguins d’autre part. Ils expriment plusieurs récepteurs des neurotransmetteurs, entre autres des récepteurs purinergiques dont l'activation facilite l’activité calcique astrocytaire et la libération de gliotransmitters (par exemple, le glutamate, le GABA, l'ATP, et la D sérine) qui régulent l’activité des neurones et des cellules gliales situées au voisinage. L’objectif de ma thèse était d’étudier in situ l’activité calcique des astrocytes et de leurs prolongements en réponse à l’application des agonistes purinergiques. Lors de ma thèse, j’ai tout d'abord testé la possibilité d’induire l’expression spécifique de gènes d’intérêt par les astrocytes corticaux de souris adultes par la technique de recombinaison Cre-LoxP. J’ai comparé les performances d’un virus adeno-associé de type 5 (AAV5) flexé (AAV5.FLEX.EGFP) et d’une souris qui exprime un indicateur calcique (GCaMP3) sous contrôle de la recombinase (souris Rosa-CAG-LSL-GCaMP3). L’injection d’AAV5.FLEX.EGFP dans le cortex d’une souris hGFAPcre n’a pas permis l’expression spécifique d’EGFP. La combinaison des souris exprimant le cre recombinase sous contrôle d’un promoteur sélectif des astrocytes (GLAST-CreERT2 et Cx30-CreERT2) avec le AAV5.FLEX.EGFP ou avec une lignée des souris Rosa-CAG-LSL-GCaMP3 permet l’expression spécifique des gènes d’intérêt (EGFP et GCaMP3) par les astrocytes corticaux. J’ai ensuite analysé l’activité calcique des astrocytes qui expriment GCaMP3. J’ai utilisé la microscopie biphotonique et enregistré l’activité calcique spontanée et évoquée par application d’agonistes purinergiques sur des tranches de cortex somatosensoriel primaire de souris adultes GLAST-CreERT2. L’activité calcique spontanée est complexe, généralement locale et désynchronisée, répartie dans les prolongements et la région somatique. Les régions actives ont été identifiées à partir d’une carte de corrélation temporale calculée en MATLAB, et leurs caractéristiques (amplitude, durée, position, fréquence) mesurées grâce à des routines établies sous IGOR. La fréquence et l’amplitude de l’activité calcique paraissent augmenter lors de l’enregistrement, ce qui suggère une sensibilité significative et une photoactivation des astrocytes, en imagerie biphotonique. La durée des impulsions laser modulerait ce phénomène. En présence d'adénosine (1-100 µM) et d’ATP (100 µM), et de façon marginale en présence d’un agoniste P2X7 non sélectif (BzATP 50-100 µM), une activité calcique synchronisée accrue est visible dans le soma et les prolongements astrocytaires en présence de tétrodotoxine qui bloque les potentiels d'action et minimise l’activité synaptique. Le mécanisme de ces réponses synchronisées reste à étudier. Aucun effet significatif n’a été observé en présence d’un agoniste spécifique P2Y1 (MRS2365 50 uM). Mon travail a permis le développement : i) de modèles murins pour l’adressage sélectif de protéines d’intérêt au niveau des astrocytes protoplasmiques ; ii) d’outils d’analyse des signaux calciques astrocytaires au niveau sub-cellulaire. Il a mis en évidence des limites possibles des protocoles standards d'enregistrement de l’activité calcique des astrocytes en imagerie biphotonique. Il confirme l’importance de l’ATP et de l’adénosine pour la signalisation astrocytaire. / Grey matter protoplasmic astrocytes are compact glial cells with highly branched processes, enwrapping synapses, and one or two endfeet contacting the blood vessels. Several neurotransmitter receptors are expressed by astrocytes, among them purinergic receptors. Upon activation of these receptors, intracellular calcium (Ca2+) transients can be induced, that, in turn, trigger gliotransmitter release (e.g. glutamate, GABA, ATP, D-serine) and participate in astrocyte-to-astrocyte signaling as well as in the communication between astrocytes and neurons or other glia. During my PhD work, I first implemented and validated several approaches for targeting transgene expression specifically to cortical astrocytes and employed them to study purinergic signaling in astrocytes. To achieve astrocyte-specific transgene expression, I used either floxed adeno-associated viral (AAV) vectors or a Cre-dependent mouse line and several mouse lines expressing the Cre recombinase under astrocyte-specific promoters. Intracerebral injections of a Cre-dependent AAV serotype 5 containing the ubiquitous CAG promoter and an enhanced green fluorescent protein (AAV5.CAG.flex.EGFP) in adult mice expressing Cre recombinase under the human glial fibrillary protein (hGFAP) promoter resulted in a non-astrocyte specific expression in the cortex. Combining inducible mouse lines expressing Cre recombinase under the glutamate aspartate transporter (GLAST) promoter with the same AAV vector resulted in a virtually astrocyte-specific expression of the reporter gene. As an alternative approach for astrocyte-specific transgene expression, we used a Cre-dependent mouse line expressing the genetically encoded Ca2+ indicator GCaMP3. Crossing this mouse line with the above described GLAST-CreERT2 mouse line or a Connexin30 (Cx30)-CreERT2 line led to selective GCaMP3 expression in cortical astrocytes. Second, I investigated both spontaneous and agonist-evoked Ca2+ transients in astrocytic processes, the investigation of which has presented a major challenge in earlier studies, due to the unspecific and weak labeling by membrane-permeable chemical Ca2+ indicators. Using the strategy developed in the first part of my work allowing an astrocyte-specific expression of the genetically encoded Ca2+ indicator GCaMP3. Using two-photon excitation fluorescence (2PEF) imaging in acute slices of the primary somatosensory cortex, I recorded Ca2+ transients in the astrocytic soma and processes. By aid of a custom-made MATLAB routine based on a temporal Pearson correlation coefficient, active regions could be identified in an unbiased manner. Evoked Ca2+ transients were quantified using custom IGOR routines. Spontaneous desynchronized Ca2+ transients occurred in the processes and rarely in the soma. Ca2+ signals appeared localized in distinct microdomains. Their frequency appeared to increase during long recordings of several hundred images, suggesting that fine astrocytes are vulnerable to photodamage under imaging conditions routine in 2PEF microscopy. The possibility to minimize photodamage, by varying the length of the femtosecond laser pulses is under investigation. Bath application of adenosine (1-100 µM) and adenosine-triphosphate (ATP, 100 µM), as well as the application of the non-selective P2X7 receptor agonist (2'(3')-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosine-5'-triphosphate, BzATP, 50-100 µM), in the presence of tetrodotoxin to block neuronal action potentials, evoked synchronized Ca2+ rises in the soma and the processes of astrocytes. The effect of adenosine was dose-dependent. No significant effect of the specific P2Y1 agonist (MRS2365, 50 µM) was seen. Altogether, my work sets up a powerful and versatile toolbox for studying astrocytic Ca2+ signaling at the sub-cellular level. It also pinpoints possible limits of standard two-photon recording protocols to investigate the local Ca2+ signals in fine astrocytic processes.

<div>Vibrational spectroscopic imaging has become an emerging platform for chemical visualization of biomolecules and materials in complex systems. For over a century, both Raman and infrared spectroscopy have demonstrated the capability to recognize molecules of interest by harnessing the characteristic features from molecular fingerprints. With the recent development of hyperspectral vibrational spectroscopy imaging, which records the chemical information without sacrificing the spatial-temporal resolution, numerous discoveries has been achieved in the field of molecular and cellular biology. Despite the ability to provide complimentary chemical information to Raman-based approaches, infrared spectroscopy has not been extensively applied in routine studies due to several fundamental limitations: 1). the poor spatial resolution; 2). inevitable strong water absorption; 3). lack of depth resolution.</div><div>Mid-infrared photothermal (MIP) microscopy overcame all the above mentioned problems and for the first time, enabled depth-resolved in vivo infrared imaging of live cells, microorganisms with submicrometer spatial resolution. The development of epi-detected MIP microscopy further extends its application in pharmaceutical and materials sciences. With the deployment of difference frequency generation and other nonlinear optical techniques, the spectral coverage of the MIP microscopy was significantly enhanced to enable chemical differentiation in complex systems across the broad mid-infrared region. In addition to the efforts to directly improve the performance of MIP microscopy, a novel quantitative phase imaging approach based on polarization wavefront shaping via custom-designed micro-retarder arrays was developed to take advantage of the highly sensitive phase measurement in combination with the photothermal effect. Besides, the extended depth-of-field and multifocus imaging enabled by polarization wavefront shaping could both improve the performance of MIP microscopy for volumetric imaging.</div>

La photothérapie dynamique (PTD) est un traitement alternatif du cancer qui nécessite l’utilisation de chromophores (photosensibilisateurs) capables d’induire la mort cellulaire suite à une irradiation lumineuse. Les nanoparticles d’or (AuNP), grâce à leur phénomène de résonance plasmon localisée, peuvent exalter les propriétés photophysiques des chromophores localisés à leur surface. L’utilisation d’une excitation biphotonique, dans le proche infrarouge, peut être utilisée pour améliorer l’action thérapeutique (PTD) ou diagnostique (imagerie de fluorescence) des chromophores en augmentant la profondeur de pénétration dans les tissus et la résolution tridimensionnelle de la microscopie biphotonique.Lors de ce travail, l’élaboration de nouvelles nanoparticules hybrides est proposée, présentant des applications potentielles en bioimagerie (sondes brillantes) et comme photosensibilisateurs pour la PTD. Ces nanoparticules sont composées d’un cœur d’or sur lequel sont greffés des conjugués polymère-chromophores biphotoniques. La stratégie de synthèse a consisté à : i) synthétiser des conjugués polymère-chromophores biphotoniques solubles dans l’eau ; ii) les greffer de manière orientée à la surface des AuNP. La synthèse des conjugués polymère-chromophores hydrosolubles on été synthétisés via le couplage efficace de chromophores hydrophobes en position latérale des copolymères P(NAM-co-NAS) bien-définis, obtenus par la techniques de polymérisation radicalaire contrôlée RAFT. Cette stratégie permet le contrôle à la fois de la longueur des chaînes polymère formées (2 000 g.mol-1 < Mn plus < 37 000 g.mol-1) et du nombre de chromophores couplés par chaîne (de 1 à 21). Le greffage orienté de ces conjugués à la surface des AuNP a été mis en évidence (TEM, ATG) et les densités de greffage se sont avérées élevées (~0.5chaîne/nm²). Un des rôles de la chaîne polymère étant de contrôler la distance entre les chromophores et la surface des AuNP. Il a été mis en évidence que l’augmentation de la longueur de chaine des conjugués induisait, outre une augmentation de la couronne greffée (par MET) sur les AuNP, une augmentation de l’émission de fluorescence de ces conjugués polymère-chromophores. Enfin, les propriétés biologiques des conjugués avant et après greffage sur les AuNP ont été évaluées in cellulo, mettant en valeur leur potentiel pour des applications thérapeutiques et diagnostiques. / Photodynamic therapy (PDT) is an alternative treatment of cancer requiring the use of chromophore molecules (photosensitizers), which can induce cell death after light excitation. Gold nanoparticles (AuNP), exhibiting localized Surface Plasmon Resonance, can enhance the photophysical response of chromophores located in their vicinity, and thus improve their therapeutic action. Moreover, the use of highly localized two-photon chromophores (photosensitizers and fluorophores), capable to undergo a localized excitation by light in the Near InfraRed region, should increase the penetration depth into tissues, thus improve the treatment efficiency (by PDT) and the imaging (by fluorescence microscopy) of cancer tissues.In this work, we describe the elaboration of water-soluble hybrid nano-objects for PDT and fluorescence bioimaging applications, composed of two-photon chromophore-polymer conjugates grafted onto gold nanoparticles. In order to obtain these nano-objects we follow a multistep strategy: i) the synthesis of a well-defined water-soluble chromophore-polymer conjugates; ii) the end-group oriented grafting of chromophore-polymer conjugates onto 20 nm AuNP. The coupling of hydrophobic two-photon chromophores on linear water-soluble copolymer chains (poly(N-acryloylmorpholine-co-N-acryloxysuccinimide)), obtained by controlled/living RAFT polymerization, resulted in well-defined water-soluble chromophore-polymer conjugates, with different polymer lengths (2 000 g.mol-1 < Mn < 37 000 g.mol-1) and architectures (random or block), and a controlled number of chromophores per chain (varying between 1 and 21). Their grafting onto 20 nm AuNP gave water-soluble hybrid nano-objects with high grafting densities (~0.5 chains/nm²). The role of the polymer chain being to tune the distance between chromophores and AuNP surface, we have evidenced the increase in the polymer corona thickness of grafted AuNP (estimated by TEM) with the increasing polymer Mn, corroborating with the corresponding distance-dependent fluorescence properties of those. Finally, the in cellulo biological properties of two-photon chromophore-polymer conjugates, before and after grafting onto AuNP, have been investigated, highlighting their potential for two-photon bioimaging and PDT applications.

The juxtaglomerular niche occupied by renin cells (RCN) plays an important role in glomerular repair but the precise temporal and spatial interrelations remain unclear. This study proposes the hypothesis of a local intra-extraglomerular regenerative feedback system and establishes a new quantifiable system for RCN responses in individual glomeruli in vivo. A strictly intraglomerular twophoton laser-induced injury model was established. Labeled renin cells (RC) in transgenic renin reporter mice were fate-traced in healthy and injured glomeruli over several days by intravital microscopy and quantified via new three-dimensional image processing algorithms based on ray tracing. RC in healthy glomeruli demonstrated dynamic extraglomerular protrusions. Upon intraglomerular injury the corresponding RCN first increased in volume and then increased in area of dynamic migration up to threefold compared to their RCN. RC started migration reaching the site of injury within 3 hours and acquired a mesangial cell phenotype without losing physical RCN-contact. During intraglomerular repair only the corresponding RCN responded via stimulated neogenesis, a process of de novo differentiation of RC to replenish the RCN. Repeated continuous intravital microscopy provides a state-of-the-art tool to prove and further study the local intraglomerular RCN repair feedback system in individual glomeruli in vivo in a quantifiable manner.