Unter Verwendung eines mathematischen Hämatopoese-Modells werden verschiedene Fragen adressiert, die im Zusammenhang mit einer möglichen Optimierung der gegenwärtigen Therapie chronischer myeloischer Leukämie (CML) stehen. Es handelt sich um ein agentenbasiertes Modell, das heißt, jede Zelle wird als einzelnes Objekt repräsentiert und gemäß festgelegter Regeln im Computer simuliert. Es werden proliferative von ruhenden Stammzellen unterschieden, wobei sich der Proliferationszustand reversibel ändern kann. Das Modell basiert auf der Annahme, dass sich normale und maligne Stammzellen in einem Wettbewerb um gemeinsame Ressourcen befinden, wobei der CML-Klon einen kompetitiven Vorteil besitzt. Es ist ungeklärt, ob Tyrosinkinaseinhibitoren wie Imatinib (IM) in der Lage sind, die Erkrankung zu heilen. Es gibt Evidenz, dass residuale leukämische Stammzellen im Knochenmark persistieren, welche in einem Ruhezustand (G0-Phase des Zellzyklus) von IM nicht eradiziert werden können. Proliferativ aktive Zellen sind der IM-Wirkung hingegen ausgesetzt. Das Modell sagt voraus, unter welchen Bedingungen eine Kombinationsstrategie von IM mit stammzellaktivierenden Substanzen Synergieeffekte hervorbringen könnte. Ein verwandtes Problem ist die Frage, in welchen Fällen nach Reduktion der Tumorlast auf ein mittels hochsensitiver Messmethoden undetektierbares Niveau ein Therapieabbruch gerechtfertigt ist. Basierend auf dem dynamischen Modell wird in dieser Arbeit ein Prädiktor vorgeschlagen, der vorhersagt, ob ein Patient nach Abbruch der Therapie einen molekularen Rückfall zu erwarten hat. Zusätzlich wird approximativ ein modellunabhängiger Prädiktor angegeben, der die Vorhersage nur auf Basis klinisch messbarer Größen gestattet.

Recent clinical findings in chronic myeloid leukemia (CML) patients suggest that the risk of molecular recurrence after stopping tyrosine kinase inhibitor (TKI) treatment substantially depends on an individual’s leukemia-specific immune response. However, it is still not possible to prospectively identify patients that will remain in treatment-free remission (TFR). Here, we used an ordinary differential equation (ODE) model for CML, which explicitly includes an anti-leukemic immunological effect and applied it to 21 CML patients for whom BCR-ABL1/ABL1 time courses had been quantified before and after TKI cessation. Immunological control was conceptually necessary to explain TFR as observed in about half of the patients. Fitting the model simulations to data, we identified patient-specific parameters and classified patients into three different groups according to their predicted immune system configuration ('immunological landscapes”). While one class of patients required complete CML eradication to achieve TFR, other patients were able to control residual leukemia levels after treatment cessation. Among them were a third class of patients, that maintained TFR only if an optimal balance between leukemia abundance and immunological activation was achieved before treatment cessation. Model simulations further suggested that changes in the BCR-ABL1 dynamics resulting from TKI dose reduction convey information about the patient-specific immune system and allow prediction of outcome after treatment cessation. This inference of individual immunological configurations based on treatment alterations can also be applied to other cancer types in which the endogenous immune system supports maintenance therapy, long-term disease control or even cure.

Hintergrund und Fragestellung: Seit der Zulassung des Tyrosinkinase-Inhibitors (TKI) Imatinib im Jahre 2001 hat sich die Therapie der chronisch myeloischen Leukämie (CML) grundlegend verändert. Imatinib inhibiert die konstitutiv aktive Tyrosinkinase BCR-ABL, welche die verstärkte Proliferation der leukämischen Zellen und die Entwicklung der CML bedingt. Das sehr gute klinische Ansprechen auf eine Imatinib-Behandlung resultierte in einer beschleunigten Zulassung dieses TKI auch bei pädiatrischen Patienten im Jahre 2003. Aufgrund von Punktmutationen und/oder strukturellen Änderungen innerhalb des BCR-ABL Fusionsproteins können sich Resistenzen gegenüber Imatinib entwickeln. Deshalb wurden Zweit- und Drittgenerations TKI wie Dasatinib und Bosutinib entwickelt. Imatinib wirkt nicht hoch spezifisch und hemmt neben BCR-ABL auch weitere Tyrosinkinasen, wie z.B. c-KIT, PDGF-R und c-FMS, welche am Knochenstoffwechsel beteiligt sind. Die Stimulation des Rezeptors c-FMS bewirkt die Differenzierung monozytärer Vorläuferzellen in knochenabbauende Osteoklasten. Zusätzlich unterliegt die Entwicklung der knochenaufbauenden Osteoblasten spezifischen Signalkaskaden an denen PDGF-R und c-Abl beteiligt sind. Als Nebenwirkung einer TKI-Therapie beeinträchtigt die Inhibition dieser Signaltransduktionswege somit das Knochen-“Remodelling“, indem die Entwicklung und funktionelle Aktivität von Osteoklasten reduziert wird. Gleichzeitig wird die Aktivität von Osteoblasten gestärkt, aber deren Proliferation inhibiert. Diese Dysbalance von Knochenaufbau und -abbau mit gestörter Kalziumhomöostase bedingt bei erwachsenen CML-Patienten veränderte endokrinologische Parameter des Kalziumhaushaltes, eine vermehrte Knochenmineralisation und eine erhöhte trabekuläre Knochendichte. Dagegen wurden bei pädiatrischen CML-Patienten unter Imatinib-Therapie Längenwachstumsstörungen beobachtet, welche bezüglich des Wirkmechanismuses von Imatinib auf den wachsenden Knochen bis heute noch nicht im Detail geklärt sind. Spekulativ ist auch, ob Zweit- und Drittgenerations-TKI ebenso wie Imatinib den Knochenstoffwechsel bei pädiatrischen Patienten stören. Angelehnt an ein erfolgreiches Applikationsschema bei erwachsenen CML-Patienten steht zusätzlich die Frage im Raum, ob eine intermittierende Gabe von TKIs (einen Monat Therapie, einen Monat Pause) eine Minderung der Nebenwirkung auf den Knochen bewirken könnte, ohne die Wirkung auf die CML-Behandlung zu beeinträchtigen. Vor diesem Hintergrund wurde ein Nagermodel etabliert, um Nebenwirkungen auf den Knochenstoffwechsel unter TKI-Exposition zu analysieren. Junge, wachsende Ratten wurden hierzu vom präpubertären Alter bis zur Adoleszenz kontinuierlich oder intermittierend mit den TKIs Imatinib, Dasatinib und Bosutinib exponiert und die Wirkung auf das wachsende Skelettsystem untersucht. Methoden: 4 Wochen alte männliche Wistar Ratten wurden über einen Zeitraum von 10 Wochen chronisch mit jeweils einem der drei im Trinkwasser gelösten TKIs exponiert. Neben einer unbehandelten Kontrollkohorte erhielt eine Gruppe jeweils eine Standarddosis und eine hohe Dosis (entsprechend der doppelten Standarddosis) des entsprechenden TKIs kontinuierlich. Eine weitere Gruppe erhielt die hohe Dosis intermittierend (an drei aufeinanderfolgenden Tagen TKI, danach vier Tage nur Wasser). Die Konzentrationen im Trinkwasser betrugen für Imatinib 1 mM und 2 mM und für Dasatinib und Bosutinib jeweils 50 µM und 100 µM. Nach zweiwöchiger (präpubertär), vierwöchiger (pubertäres Stadium) und zehnwöchiger Exposition (postpubertär) wurden die Tiere aller Gruppen nekropsiert und Röhrenknochen, Lendenwirbel und Blut asserviert. Zur Beurteilung des Knochenmetabolismus wurden folgende Parameter erhoben: Knochenlängen, Knochendichten mittels pQCT, trabekuläre Strukturen mittels µCT, Knochenfestigkeit mittels des 3-Punkt-Biege-Test und endokrinologische Parameter im Serum mittels ELISA. Zusätzlich wurde der jeweilige TKI Serum-Spiegel bestimmt. Ergebnisse: Die Gewichtsentwicklung, körperliche Entwicklung und das Sozialverhalten zeigten keine Unterschiede beim Vergleich von Kontrollkohorten mit exponierten Tieren. Die kontinuierliche Exposition mit Imatinib und Dasatinib bewirkte dosisabhängig eine Reduktion der Knochenlängen der Femura und der Tibiae. Bosutinib zeigte diesen Effekt nicht. Die intermittierende Exposition mit hoher Dosis resultierte in einer Knochenlängenreduktion, welche exakt dem Effekt der Standarddosis entsprach. Weiterhin resultierte aus der Exposition mit Imatinib oder Dasatinib eine Verminderung der trabekulären Knochendichten der Femura und Tibiae im präpubertären Stadium. Ratten, welche hoch dosiert Imatinib erhielten, zeigten diese Reduktion ebenfalls im pubertären Stadium, nicht jedoch unter Dasatinib- und Bosutinib-Exposition. Postpubertär unterschieden sich die trabekulären Dichten von Femura und Tibiae der exponierten Gruppen nicht von den Kontrollkohorten. Auf die kortikale Knochendichte und die kortikale Dicke dieser Röhrenknochen zeigte sich kein messbarer Effekt der TKI. Dennoch trat - nur nach Exposition der hohen Imatinibdosis - eine signifikant verminderte femorale Bruchfestigkeit postpubertär auf. Am Lendenwirbelkörper war pubertär und postpubertär die Höhe unter Imatinib-Exposition vermindert, während die Gesamt- und kortikale Knochendichte präpubertär erhöht war bei tendenziell erniedrigter trabekulärer Knochendichte. Die kortikale Dicke wurde durch alle TKI nicht beeinflusst. Dasatinib und Bosutinib bewirkten keinen Effekt auf die Wirbelhöhe, aber eine tendenzielle Minderung der trabekulären Knochendichte. Der serologisch erfassbare Knochenresorptionsmarker „tatrate resistant acidic phosphatase“ (TRAP) war unter kontinuierlicher Exposition mit hoher Dosis von Imatinib zu allen Zeitpunkten erniedrigt. Postpubertär zeigte sich dieser Effekt auch unter Standard- und Hochdosis von Bosutinib. Der Knochenformationsmarker Osteocalcin war unter Imatinib bei allen Kohorten zu allen Analysezeitpunkten erniedrigt, während Dasatinib und Bosutinib keinen Effekt auf diesen Parameter zeigten. Die erfassten Serum-Hormonparameter (Wachstumshormon, Parathormon) lagen unter der Exposition mit Imatinib als erhöhte Wachstumshormonspiegel pubertär und als verminderte Parathormonspiegel prä- und pubertär vor. Unter der Exposition mit Dasatinib kam es ebenfalls pubertär zu einer Erhöhung der Wachstumshormonspiegel und präpubertär zu einer tendenziellen Erhöhung der Parathormonspiegel. Postpubertär normalisierten sich beide Parameter unter der Exposition mit Imatinib und Dasatinib wieder. Unter Bosutinib konnte nur postpubertär erniedrigte Parathormonspiegel ermittelt werden. Eine intermittierende TKI-Exposition resultierte in einem Aufholwachstum und einer teilweise Normalisierung der knochenspezifischen Serumparameter. Als wichtige unerwartete Nebenwirkung zeigte sich unter Langzeitexposition mit Imatinib und Dasatinib eine Zunahme des Herzgewichtes. Unter Imatinib resultierten daraus keine klinischen Auffälligkeiten, während unter Dasatinib eine Herzinsuffizienz zum Tod eines Tieres führte. Bosutinib zeigte keine weiteren makropathologisch erfassbaren Nebenwirkungen. Bis heute sind keine kardialen Nebenwirkungen bei pädiatrischen Patienten nach mehrjähriger TKI-Therapie publiziert. Schlussfolgerung: Das etablierte juvenile Nagertiermodell ist gut geeignet, um die Nebenwirkungen einer Langzeitexposition von TKI auf den wachsenden Knochen zu erfassen. Bei Kindern und Adoleszenten klinisch beschriebene Wachstumsretardierungen unter Imatinib ließen sich zweifelsfrei bei Ratten verifizieren. Bei fehlenden klinischen Daten von Kindern zu Dasatinib präjudiziert das Modell, dass Dasatinib so wie Imatinib den gleichen, Bosutinib hingegen kaum einen Effekt auf den Knochen ausübt. Eine intermittierende Gabe der TKI scheint die Nebenwirkungen auf den Knochen abzumildern und könnte eine neue Möglichkeit der TKI-Therapie für pädiatrische Patienten darstellen. Aus dem Tiermodell der Langzeit-exponierten juvenilen Ratte lässt sich ableiten, dass beim wachsenden Kind unter jahrelanger TKI-Therapie klinisch sorgfältig der Knochenstoffwechsel und das Längenwachstum überwacht und unter Dasatinib zusätzlich kardiale Nebenwirkungen beachten werden sollten.:I. Abkürzungsverzeichnis II. Abbildungsverzeichnis III. Tabellenverzeichnis IV. Tabellenverzeichnis des Anhangs 1. Einleitung 1.1 Die chronisch myeloische Leukämie 1.1.1 Pathogenese 1.1.2 Klinisches Erscheinungsbild der chronisch myeloischen Leukämie 1.1.3 Die chronisch myeloische Leukämie im Erwachsenenalter 1.1.4 Die chronisch myeloische Leukämie im Kindes- und Jugendalter 1.1.5 Entwicklung der Therapie der chronisch myeloischen Leukämie 1.2 Einsatz von Tyrosinkinase-Inhibitoren zur Therapie der chronisch myeloischen Leukämie 1.2.1 Wirkmechanismus von Tyrosinkinase-Inhibitoren 1.2.2 Tyrosinkinase-Inhibitoren der nächsten Generation 1.2.3 „Off-target“ Effekte von Tyrosinkinase-Inhibitoren 1.3 Das menschliche Skelett 1.3.1 „Remodelling“ des Knochens 1.3.2 Knochenstoffwechselparameter 1.3.2.1 Anabole Parameter des Knochenaufbaus Osteocalcin und Amino-terminales-Propeptid des Typ-I-Kollagens 1.3.2.2 Katabole Parameter des Knochenabbaus Carboxy-terminales Telopeptid des Typ-I-Kollagens und Tatrat-resistente saure Phosphatase 1.3.2.3 Endokrine Parameter des Knochenstoffwechsels Wachstumshormon und Parathormon 1.4 Einfluss von Tyrosinkinase Inhibitoren auf das Knochen-„Remodelling“ 2. Zielsetzung und Fragestellung 3. Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Versuchstiere 3.1.2 Tierversuchsaufbau 3.1.3 Herstellung der Trinklösungen 3.2 Methoden 3.2.1 Lösungen und Arbeitsmaterialien 3.2.2 Geräte 3.2.3 Knochen-/Organpräparation und Verwendung 3.2.4 Serumgewinnung 3.2.5 Serumspiegelbestimmung der Tyrosinkinase-Inhibitoren 3.2.5.1 Imatinib 3.2.5.2 Dasatinib 3.2.5.3 Bosutinib 3.2.6 Bestimmungen von Knochenstoffwechselmarkern im Serum 3.2.7 Bestimmungen der Längen der Röhrenknochen und der Höhen der Lendenwirbelkörper 3.2.8 Computertomographisch gestützte Untersuchungen der Knochen 3.2.8.1 Knochendichtemessungen der unentkalkten Knochen mittels.. peripherer quantitativer Computertomographie 3.2.8.2 Messungen der unentkalkten Knochen mittels mikro-Computertomographie 3.2.9 Biomechanik am unentkalkten Knochen 3.2.10 Statistik 4. Ergebnisse 4.1 Entwicklung und Sozialverhalten der Versuchstiere unter Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.2 Todesfälle unter 10-wöchiger Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.3 Gewichtsentwicklungen der Versuchstiere während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.4 Trinkverhalten der Versuchstiere während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.5 Aufgenommene Mengen an Tyrosinkinase-Inhibitoren und Serumspiegel 4.6 Auswirkungen einer chronischen und intermittierenden Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Röhrenknochen 4.6.1 Knochenlängen der Femura und Tibiae 4.6.2 Breiten der Epiphysenfugen der Femura und Tibiae 4.6.3 Dichte und Geometrie der unentkalkten Femura und Tibiae 4.6.4 Trabekelstrukturanalyse der unentkalkten Femura 4.6.5 Biomechanik der unentkalkten Femura 4.7 Auswirkungen einer chronischen und intermittierenden Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Lendenwirbel L2 4.7.1 Höhen der Lendenwirbelkörper 4.7.2 Dichte und Geometrie der unentkalkten Lendenwirbelkörper 4.8 Serumparameter des Knochenstoffwechsels während der Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.8.1 Parameter des Knochenaufbaus 4.8.2 Parameter des Knochenabbaus 4.9 Längenwachstumsbezogene Serumparameter des Hormonhaushaltes 4.10 Weitere beobachtete Nebenwirkungen während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5. Diskussion 5.1 Das Tiermodell der Ratte 5.2 Chronische Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren über das Trinkwasser..… 5.2.1 Trinkmengen und Entwicklungen der Versuchstiere 5.2.2 Zugeführte Dosis an Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.2.3 Serumkonzentrationen der Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.3 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Röhrenknochen 5.3.1 Längen der Röhrenknochen und Breiten der Epiphysenfugen 5.3.2 Knochendichten und trabekuläre Strukturen der Röhrenknochen 5.3.3 Biomechanik der Femura 5.4 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Lendenwirbel 5.5 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf den Knochenstoffwechsel 5.5.1 Veränderungen bei der Knochenresorption 5.5.2 Veränderungen bei der Knochenformation 5.5.3 Spezifische Effekte der Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.6 Hormonelle Regulationen des Knochen-„Remodelling“ während der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.7 Nicht skelettbezogene Nebenwirkungen der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.8 Klinischer Bezug zur Therapie der chronisch myeloischen Leukämie im Kindes-und Jugendalter 6. Zusammenfassung 7. Literaturverzeichnis 8. Anhang 9. Danksagung / Background: Since its approval in 2001 the tyrosine kinase inhibitor (TKI) imatinib has revolutionized the therapy of chronic myeloid leukaemia (CML). Imatinib inhibits the constitutively active tyrosine kinase (TK) BCR-ABL causing the increased proliferation of the leukemic cells and the progress of CML. According to improved survival rates imatinib has been licensed as frontline therapy also for paediatric CML in 2003. However, due to point mutations or structural changes within the BCR-ABL fusion protein resistance to imatinib occurs. Therefore 2nd and 3rd generation TKI like dasatinib and bosutinib have been developed. Beside BCR-ABL, Imatinib exerts also off-target effects on further TKs like c-KIT, PDGF-R, c-FMS which are involved in bone metabolism. Stimulation of the receptor c-FMS leads to the differentiation of monocytic progenitors to bone resorbing osteoclasts. In addition, the development of bone forming osteoblasts underlies specific signalling cascades involving PDGF-R and c-Abl. As a side effect of TKI therapy these specific signalling cascades are inhibited impairing bone remodelling by reducing the development and functional activity of osteoclasts. Simultaneously osteoblasts’ differentiation is promoted while their proliferation is inhibited. This dysbalance of bone formation and resorption results in altered endocrinological serum markers of the calcium homeostasis, increased bone mineralization, and increased trabecular bone density in adult CML patients. In contrast paediatric CML patients show longitudinal growth retardations under imatinib therapy, however, the detailed action of imatinib on the growing bone is not clarified yet. Additionally, it is unclear if 2nd and 3rd generation TKI will also disturb bone metabolism in paediatric CML patients. Based on an effective treatment strategy in adult CML patients, it is also questioned if intermittent TKI treatment (one month “on”, one month “off”) could minimise side effects on the bone without impairing CML therapy. On this background a rodent model was established to study side effects of TKI treatment on bone metabolism. Juvenile growing rats where exposed from prepubertal age till adolescence continuously or intermittently to imatinib, dasatinib, and bosutinib and the effects on the growing skeleton were analysed. Methods: Four weeks old male Wistar rats were chronically exposed to varying concentrations of one of the three TKIs via the drinking water for 10 weeks. Besides untreated controls a standard dosage group and a high dosage group (equalling the twofold standard dose) received every TKI continuously, while an additional group received the high dosage TKI in an intermittent fashion (3 days per week: “on” TKI; 4 days water without TKI). The concentrations applied were 1 mM and 2 mM for imatinib and 50 µM and 100 µM each for dasatinib and bosutinib, respectively. After 2 weeks (prepubertal), 4 weeks (pubertal stage), and 10 weeks (postpubertal) of exposure, respectively, animals were sacrificed and long bones, lumbar vertebra and blood were isolated. To evaluate bone metabolism the following parameters were analysed: bone length, bone mineral density (BMD) by pQCT, trabecular structure by µCT, bone strength by 3-point bending test, and endocrinological parameters by ELISA. Additionally, serum levels of TKIs were investigated. Results: In comparison to controls no alterations of exposed animals’ bodyweight, overall development and social behaviour were observed. Continuous exposure of imatinib and dasatinib led dose dependently to reduced femoral and tibial length. No such effect was observed under bosutinib. Intermitted exposure of high-dose TKIs resulted in reduced effects on femoral and tibial length identical to the effect observed in groups receiving just standard dose. Furthermore, exposure of imatinib and dasatinib lowered femoral and tibial trabecular BMD prepubertally. Rats receiving high dose imatinib showed reduced femoral and tibial trabecular BMD at pubertal stage, while this effect was not observed under dasatinib and bosutinib exposure. Postpubertally, femoral and tibial trabecular BMD of all exposed groups did not differ from controls. Femoral and tibial cortical BMD and cortical thickness were not affected by TKI exposure. However, under high dose imatinib exposure femoral mechanical breaking strength was reduced postpubertally. In vertebra the height was reduced under imatinib exposure pubertally and postpubertally, while the total and cortical BMD were increased prepubertally and trabecular BMD tended to be reduced. Cortical thickness was not affected by any TKI tested. Dasatinib and bosutinib exhibited no effect on the height of the vertebra but trabecular BMD tended to be reduced. The serum bone resorption marker ‘tartrate resistant acidic phosphatase’ (TRAP) was found reduced under continuous exposure of high dose of imatinib at all time points tested. Postpubertally, the same effect was detected after standard and high dosage of bosutinib. The bone formation marker osteocalcin was reduced in all groups and at all time points tested under imatinib exposure, whereas no such effect was observed for dasatinib and bosutinib. Serum bone related hormone markers (growth hormone (GH) and parathyroid hormone (PTH)) revealed under imatinib exposure increased GH levels pubertally whereas PTH was reduced pre- und pubertally. During dasatinib exposure GH levels were elevated pubertally and PTH levels were increased prepubertally. Postpubertally, both parameters normalised again under imatinib and dasatinib exposure. During bosutinib exposure reduced PTH levels were detected postpubertally only. Intermitted TKI exposure resulted in catch-up growth and partial normalisation of bone specific serum parameters. As major unexpected side effect during exposure increasing heart weights could be observed under long-time imatinib and dasatinib exposure. No clinical changes were observed under imatinib, whereas dasatinib led to cardiac insufficiency leading to death of one animal. Bosutinib showed no additional macrospathologic assessable side effects. To date no cardiac side effects were published in paediatric patients under prolonged TKI therapy. Conclusion: The established juvenile rat model is appropriate to examine side effects of long-term TKI exposure on the growing bone. Published longitudinal growth retardation in children and adolescents under imatinib treatment could be unequivocally mimicked in this rat model. Due to not yet available clinical experience with dasatinib in paediatric patients, this model predicts that dasatinib alters bone metabolism like imatinib whereas bosutinib shows less detectable effects. Intermitted TKI treatment may reduce side effects on the growing bone and therefore could represent a new opportunity of TKI therapy for paediatric patients. Summing up, TKI long-term exposure in this juvenile rat model challenges physicians to diligently monitor bone metabolism in not outgrown paediatric patients during long-term TKI treatment and additionally assess cardiac side effects under dasatinib exposure.:I. Abkürzungsverzeichnis II. Abbildungsverzeichnis III. Tabellenverzeichnis IV. Tabellenverzeichnis des Anhangs 1. Einleitung 1.1 Die chronisch myeloische Leukämie 1.1.1 Pathogenese 1.1.2 Klinisches Erscheinungsbild der chronisch myeloischen Leukämie 1.1.3 Die chronisch myeloische Leukämie im Erwachsenenalter 1.1.4 Die chronisch myeloische Leukämie im Kindes- und Jugendalter 1.1.5 Entwicklung der Therapie der chronisch myeloischen Leukämie 1.2 Einsatz von Tyrosinkinase-Inhibitoren zur Therapie der chronisch myeloischen Leukämie 1.2.1 Wirkmechanismus von Tyrosinkinase-Inhibitoren 1.2.2 Tyrosinkinase-Inhibitoren der nächsten Generation 1.2.3 „Off-target“ Effekte von Tyrosinkinase-Inhibitoren 1.3 Das menschliche Skelett 1.3.1 „Remodelling“ des Knochens 1.3.2 Knochenstoffwechselparameter 1.3.2.1 Anabole Parameter des Knochenaufbaus Osteocalcin und Amino-terminales-Propeptid des Typ-I-Kollagens 1.3.2.2 Katabole Parameter des Knochenabbaus Carboxy-terminales Telopeptid des Typ-I-Kollagens und Tatrat-resistente saure Phosphatase 1.3.2.3 Endokrine Parameter des Knochenstoffwechsels Wachstumshormon und Parathormon 1.4 Einfluss von Tyrosinkinase Inhibitoren auf das Knochen-„Remodelling“ 2. Zielsetzung und Fragestellung 3. Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Versuchstiere 3.1.2 Tierversuchsaufbau 3.1.3 Herstellung der Trinklösungen 3.2 Methoden 3.2.1 Lösungen und Arbeitsmaterialien 3.2.2 Geräte 3.2.3 Knochen-/Organpräparation und Verwendung 3.2.4 Serumgewinnung 3.2.5 Serumspiegelbestimmung der Tyrosinkinase-Inhibitoren 3.2.5.1 Imatinib 3.2.5.2 Dasatinib 3.2.5.3 Bosutinib 3.2.6 Bestimmungen von Knochenstoffwechselmarkern im Serum 3.2.7 Bestimmungen der Längen der Röhrenknochen und der Höhen der Lendenwirbelkörper 3.2.8 Computertomographisch gestützte Untersuchungen der Knochen 3.2.8.1 Knochendichtemessungen der unentkalkten Knochen mittels.. peripherer quantitativer Computertomographie 3.2.8.2 Messungen der unentkalkten Knochen mittels mikro-Computertomographie 3.2.9 Biomechanik am unentkalkten Knochen 3.2.10 Statistik 4. Ergebnisse 4.1 Entwicklung und Sozialverhalten der Versuchstiere unter Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.2 Todesfälle unter 10-wöchiger Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.3 Gewichtsentwicklungen der Versuchstiere während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.4 Trinkverhalten der Versuchstiere während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.5 Aufgenommene Mengen an Tyrosinkinase-Inhibitoren und Serumspiegel 4.6 Auswirkungen einer chronischen und intermittierenden Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Röhrenknochen 4.6.1 Knochenlängen der Femura und Tibiae 4.6.2 Breiten der Epiphysenfugen der Femura und Tibiae 4.6.3 Dichte und Geometrie der unentkalkten Femura und Tibiae 4.6.4 Trabekelstrukturanalyse der unentkalkten Femura 4.6.5 Biomechanik der unentkalkten Femura 4.7 Auswirkungen einer chronischen und intermittierenden Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Lendenwirbel L2 4.7.1 Höhen der Lendenwirbelkörper 4.7.2 Dichte und Geometrie der unentkalkten Lendenwirbelkörper 4.8 Serumparameter des Knochenstoffwechsels während der Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.8.1 Parameter des Knochenaufbaus 4.8.2 Parameter des Knochenabbaus 4.9 Längenwachstumsbezogene Serumparameter des Hormonhaushaltes 4.10 Weitere beobachtete Nebenwirkungen während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5. Diskussion 5.1 Das Tiermodell der Ratte 5.2 Chronische Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren über das Trinkwasser..… 5.2.1 Trinkmengen und Entwicklungen der Versuchstiere 5.2.2 Zugeführte Dosis an Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.2.3 Serumkonzentrationen der Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.3 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Röhrenknochen 5.3.1 Längen der Röhrenknochen und Breiten der Epiphysenfugen 5.3.2 Knochendichten und trabekuläre Strukturen der Röhrenknochen 5.3.3 Biomechanik der Femura 5.4 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Lendenwirbel 5.5 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf den Knochenstoffwechsel 5.5.1 Veränderungen bei der Knochenresorption 5.5.2 Veränderungen bei der Knochenformation 5.5.3 Spezifische Effekte der Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.6 Hormonelle Regulationen des Knochen-„Remodelling“ während der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.7 Nicht skelettbezogene Nebenwirkungen der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.8 Klinischer Bezug zur Therapie der chronisch myeloischen Leukämie im Kindes-und Jugendalter 6. Zusammenfassung 7. Literaturverzeichnis 8. Anhang 9. Danksagung

<p dir="ltr">Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths, and although important therapy advancements have been achieved, ~1.6 million people die from lung cancer annually. Non-small cell lung cancer (NSCLC), which makes up ~85% of lung cancer cases, is mainly treated with radiotherapy, chemotherapies, and targeted agents. Targeted agents are selected based on the mutation spectrum of the tumor. In NSCLC the epidermal growth factor receptor (EGFR) is commonly mutated and, leads to increased proliferation and cell survival. The standard-of-care treatment for patients with activating mutations in EGFR is treatment with tyrosine kinase inhibitors (TKI), such as erlotinib. While tumors initially respond to TKIs, after 1-2 years most patients develop resistance. In ~60% of TKI resistant tumors, resistance is the result of a secondary mutation in EGFR, whereas in the remaining 20%, tumors turn on bypass track-signals to overcome inhibition of the EGFR pathway. However, 15-20% of the cases the mechanisms underlying resistance are unknown. Most studies focus on the gain of function of oncogenes as mediators of resistance; however, little is known about the role that tumor suppressors play in TKI resistance. Hence, we performed a genome-wide CRISPR Cas9 knock-out screen to identify genes that when knocked-out would drive erlotinib resistance, and KMT5C was identified as the top candidate. KMT5C is a histone methyltransferase that trimethylates H4K20 (H4K20me3), enabling the establishment of constitutive and facultative heterochromatin. Data from human samples suggests that the <i>KMT5C</i> transcript is globally downregulated in NSCLC and in tumor samples resistant to the third generation TKI osimertinib. Additionally, loss of the modification H4K20me3, influences prognosis of NSCLC, indicating that loss of KMT5C function is a crucial mechanism in carcinogenesis. Here we describe how loss of KMT5C leads to increased transcription of the oncogene MET, due to a loss in H4K20me3-mediated repression of a long non-coding RNA transcription (LINC01510) upstream of MET. This mechanism was found to be partially responsible in driving TKI resistance in EGFR mutant cells. Historically, KMT5C has been associated with generation of constitutive heterochromatin (cHC); however, recent reports, including our own, indicate that KMT5C also regulates transcription in regions outside of cHC. Our preliminary evidence suggests that deposition of H42K0me3 via KMT5C in regions outside of cHC, is less stable than in cHC regions. This novel finding led us to hypothesize that regulation of KMT5C and H42K0me3 at different regions of heterochromatin is a dynamic process.</p>

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23775号 / 医博第4821号 / 新制||医||1057(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 河本 宏, 教授 永井 純正, 教授 濵﨑 洋子 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une hémopathie maligne caractérisée par un syndrome myéloprolifératif. Elle est secondaire à la formation d’un gène chimérique BCR-ABL dont le produit de ce gène de fusion est une protéine possédant une activité tyrosine kinase dérégulée, nécessaire et suffisante à la leucémogénèse. Plusieurs arguments suggèrent l’implication des cellules du système immunitaire dans le contrôle de la LMC.Nous avons montré que les lymphocytes Natural Killer T invariant (iNKT), une population minoritaire de lymphocytes T non conventionnels impliqués dans l’immunosurveillance, sont anergiques chez les patients en phase chronique (LMC-PC). Ce défaut est corrigé chez les patients en rémission cytogénétique complète après traitement par Imatinib Mesylate (LMC-IM) ou IFN-α.Les lymphocytes iNKT sont impliqués chez la Souris dans la génération de cellules T CD8+ « innate-memory », une autre population de lymphocytes T innés découverte récemment chez la Souris. Nous avons mis en évidence chez l’Homme, l’existence d’une population de cellules T ayant un phénotype inné et mémoire, exprimant fortement le facteur de transcription Eomesodermine et capable de produire rapidement de l’IFN-γ en réponse à une stimulation innée par les interleukines (IL)-12 et IL-18.Cette population de cellules est déficiente sur le plan numérique et fonctionnel chez les patients LMC-PC. Ces défauts sont partiellement corrigés chez les patients LMC-IM.L’ensemble de ces résultats souligne le rôle des lymphocytes T innés dans l’immunité anti-leucémique et pourrait permettre le développement de stratégies d’immunothérapies ciblées contre la LMC. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder that results from dysregulated tyrosine kinase activity of the fusion oncoprotein BCR-ABL, which is sufficient to induce malignant transformation. A critical role of the immune system in the control of CML is supported by several reports. Invariant Natural Killer T (iNKT) lymphocytes are a population of non-conventional T cells that are believed to play a key role in cancer immunosurveillance. Here, we showed that CML in chronic phase is associated with anergy of iNKT cells that is restored upon complete cytogenetic remission (CCyR) following Imatinib Mesylate (IM) or IFN-α therapy. In mouse, iNKT cells are involved in the generation of a recently characterized subset of innate CD8 T cells. Importantly, we provided definitive evidence of the existence of an equivalent of these innate CD8 T cells in humans, harboring innate and memory phenotype with high Eomesodermin expression. These cells also exhibited innate functions such as prompt IFN-γ expression in response to innate stimulation by interleukin (IL)-12 and IL-18 and cytolytic activity in a TCR independent manner.Size and functions of this innate-like CD8 T cell subset were severely impaired in CML patients at chronic phase. These defects were partially reversed in patients who achieved CCyR following IM treatment.Altogether, these results reveal a possible contribution of innate CD8 T lymphocytes in anti-leukemic immunity and should contribute to development of immunotherapeutic strategies against CML.

O presente estudo comparou os efeitos da ativação e inibição do EGFR em duas linhagens de câncer de pulmão, cultivadas em monocamada ou esferoides. Os esferoides foram cultivados sem elementos de matriz extracelular. As células A549 e HK2 apresentaram, respectivamente, 3 e 6 cópias do gene ErbB1 por núcleo, embora a expressão de EGFR seja menor nas células HK2. A ativação de EGFR por EGF ou inibição por AG1478 não promoveu mudanças na proliferação celular. Entretanto, as células cultivadas em monocamada, estimuladas com EGF, exibiram alterações na disposição dos microfilamentos de actina e aumento na velocidade de migração celular. UO126 e LY294002 foram adicionados às culturas para inibir, respectivamente, as vias ERK e Akt. A linhagem A549, cultivada em monocamada, não apresentou envolvimento das vias de sinalização de ERK e Akt na migração celular induzida por EGF, mas foi observado o envolvimento dessas vias nos esferoides. Já a linhagem HK2 apresentou o envolvimento de Akt para promover a migração celular após estímulo com EGF nas duas formas de cultivo. / This study compared the effects of activation and inhibition of EGFR in two cell lines of lung cancer, grown in monolayer or spheroids. Spheroids were cultured without extracellular matrix components. HK2 and A549 cells showed, respectively, 3 and 6 ErbB1 gene copies per nucleus, while EGFR expression is lower in the HK2 cells. The activation by EGF or EGFR inhibition by AG1478 did not cause changes in cell proliferation. However, cells cultured in monolayers stimulated with EGF, showed changes in the arrangement of actin microfilaments and increased the speed of cell migration. UO126 and LY294002 were added to the cultures to inhibit, respectively, the ERK and Akt pathways. A549 cells grown in monolayer did not show involvement of ERK and Akt signaling pathways in the cell migration induced by EGF, but was observed involvement of such pathways in the spheroids. HK2 cells showed involvement of Akt to promote cell migration after EGF stimulation in monolayers and in spheroids.

Lorsqu’il est surexprimé ou activé constitutivement par mutation, le récepteur tyrosine kinase KIT est impliqué dans le développement de pathologies prolifératives comme les mastocytoses, les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) et certaines leucémies. La voie de signalisation KIT représente donc une cible thérapeutique majeure en oncologie. Le développement d’une nouvelle classe de molécules pharmacologiques appelées inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) est en plein essor. Un exemple majeur d’ITK est l’imatinib qui cible, entre autre, KIT et est efficace dans la plupart des GIST. Cependant, le traitement aux ITK est souvent confronté au phénomène de résistance primaire ou acquise par mutation secondaire. C’est pourquoi nous cherchons à développer de nouveaux composés ciblant KIT ou les voies de transductions activées par ses formes oncogéniques, et ce par 3 approches.Nous avons récemment montré que les mutants oncogéniques de KIT ont une localisation intracellulaire alors que KIT sauvage est exprimé à la membrane. L’inhibition de l’activité kinase des mutants restaure une localisation normale. A partir de cette observation, nous avons créé et validé un test de criblage par cytométrie mesurant la relocalisation de KIT muté à la surface cellulaire. Le criblage d’une chimiothèque nous a permis de sélectionner de nouveaux inhibiteurs de la signalisation KIT actifs sur des lignées cellulaires mutées pour KIT.Nous avons utilisé la technique du phage display pour sélectionner des anticorps au format scFv et VHH spécifiques de la partie intracellulaire de KIT mutant. Lors de leur expression dans le cytosol (on parle alors d’intrabodies), leur fixation au niveau de KIT inhibe soit directement l’activité kinase, soit le recrutement de partenaires de signalisation. Nous avons obtenu des intrabodies de différentes spécificités vis-à-vis des formes de KIT dont la caractérisation fonctionnelle est en cours Les intrabodies inhibiteurs seront utilisés pour cribler des chimiothèques par ELISA. Les molécules chimiques recherchées empêcheront la fixation des intrabodies sur la région intracellulaire de KIT. On sélectionnera donc des molécules inhibant potentiellement l’oncogénicité de KIT.Nous avons développé des anticorps au format scFv-Fc par phage display qui reconnaissent le domaine extracellulaire de KIT. Deux des anticorps sélectionnés inhibent donc la signalisation induite par le SCF. Dans des lignées de leucémie exprimant KIT WT, nous avons montré que l’utilisation de ces anticorps entraîne une diminution de la viabilité cellulaire. De plus, ils diminuent également la prolifération de lignées de leucémie à mastocytes sensibles et résistantes à l’imatinib (HMC11 et HMC12, respectivement). Ils représentent donc des outils thérapeutiques potentiels pour le traitement des pathologies impliquant KIT ainsi que pour contourner la résistance aux ITK de certains mutants. / When overexpressed or constitutively active by mutation, the tyrosine kinase receptor KIT is involved in some proliferative diseases such as gastro-intestinal stromal tumors (GIST), mastocytosis and some leukemia. Therefore, KIT signaling represents a major target in oncology. Development of a new therapeutic class called tyrosine kinase inhibitors is in full expansion. A major example of TKI is imatinib which targets KIT and is efficient in the majority of GIST cases. However, TKI treatment is often unpaired by primary or acquired resistance due to secondary mutations. That is why we aim to develop new compounds to target KIT or associated signaling pathways by three strategies.We have recently shown that oncogenic KIT mutants are intracellularely localized whereas WT KIT is expressed at the cell surface. Kinase activity inhibition leads to membrane mutants’ relocalization. Based on this finding, we developed and validated a screening assay measuring mutants’ relocalization by cytometry. Chemicals library screening allows us to select new KIT signaling inhibitors active on KIT mutant cell lines.We used phage display to generate scFv and VHH antibodies which are specific to KIT intracellular domain. When expressed in cytoplasm (they are called intrabodies), their binding on KIT inhibits kinase activity directly or signaling partners’ recruitment. Selected intrabodies are specific to various KIT isoforms and their functional characterization is ongoing. KIT inhibitory intrabodies will be used to screen chemical libraries by ELISA for drugs that block intrabodies binding on KIT intracellular domain. We will then select molecules that potentially inhibit KIT oncogenicity.We developed scFv-Fc antibodies by phage display that recognize KIT extracellular domain. Two selected antibodies inhibit SCF induced signaling. In WT KIT expressing leukemic cell lines, we showed that antibody treatment reduces cell viability. Moreover, they also diminish cell proliferation of 2 imatinib sensitive and resistant mast cell leukemia cell lines (HMC1.1 and HMC1.2, respectively). They represent potential therapeutic tools for treatment of KIT involved diseases and for bypass TKI resistance of some mutants.

During recent years, significant advances have been made in the field of molecular therapy in urologic oncology, mainly for advanced renal cell carcinoma. In this hitherto largely treatment-refractory disease, several agents have been developed targeting the von Hippel-Lindau metabolic pathway which is involved in carcinogenesis and progression of the majority of renal cell carcinomas. Although cure may not be expected, new drugs, such as the multikinase inhibitors sorafenib and sunitinib and the mammalian target of rapamycine inhibitor temsirolimus, frequently stabilize the disease course and may improve survival. Fewer data are available supporting molecular therapies in prostate, bladder, and testicular cancers. Preliminary data suggest a potential role of high-dose calcitriol and thalidomide in hormone-refractory prostate cancer, whereas targeted therapies in bladder and testicular cancers are still more or less limited to single-case experiences. The great theoretical potential and the multitude of possible targets and drug combinations, however, support further research into this exciting field of medical treatment of urologic malignancies. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

O presente estudo comparou os efeitos da ativação e inibição do EGFR em duas linhagens de câncer de pulmão, cultivadas em monocamada ou esferoides. Os esferoides foram cultivados sem elementos de matriz extracelular. As células A549 e HK2 apresentaram, respectivamente, 3 e 6 cópias do gene ErbB1 por núcleo, embora a expressão de EGFR seja menor nas células HK2. A ativação de EGFR por EGF ou inibição por AG1478 não promoveu mudanças na proliferação celular. Entretanto, as células cultivadas em monocamada, estimuladas com EGF, exibiram alterações na disposição dos microfilamentos de actina e aumento na velocidade de migração celular. UO126 e LY294002 foram adicionados às culturas para inibir, respectivamente, as vias ERK e Akt. A linhagem A549, cultivada em monocamada, não apresentou envolvimento das vias de sinalização de ERK e Akt na migração celular induzida por EGF, mas foi observado o envolvimento dessas vias nos esferoides. Já a linhagem HK2 apresentou o envolvimento de Akt para promover a migração celular após estímulo com EGF nas duas formas de cultivo. / This study compared the effects of activation and inhibition of EGFR in two cell lines of lung cancer, grown in monolayer or spheroids. Spheroids were cultured without extracellular matrix components. HK2 and A549 cells showed, respectively, 3 and 6 ErbB1 gene copies per nucleus, while EGFR expression is lower in the HK2 cells. The activation by EGF or EGFR inhibition by AG1478 did not cause changes in cell proliferation. However, cells cultured in monolayers stimulated with EGF, showed changes in the arrangement of actin microfilaments and increased the speed of cell migration. UO126 and LY294002 were added to the cultures to inhibit, respectively, the ERK and Akt pathways. A549 cells grown in monolayer did not show involvement of ERK and Akt signaling pathways in the cell migration induced by EGF, but was observed involvement of such pathways in the spheroids. HK2 cells showed involvement of Akt to promote cell migration after EGF stimulation in monolayers and in spheroids.