Disfunções da glândula tireóide são, frequentemente, associadas a manifestações cardiovasculares e, em situações de hipertireoidismo, o coração hipertrofia. A hipertrofia cardíaca (HC) consiste em uma resposta adaptativa caracterizada pelo aumento de síntese de proteínas estruturais. O Sistema Ubiquitina Proteassoma (UPS) corresponde ao principal mecanismo de proteólise intracelular e crescentes evidências sugerem seu envolvimento no desenvolvimento da HC. O objetivo do presente estudo foi avaliar a modulação do UPS no tecido cardíaco de animais submetidos ao hipertireoidismo. Os resultados referentes ao aumento da atividade e expressão do proteassoma (PT) cardíaco apresenta-se mais contundente no grupo tratado por 7 dias, período em que a HC já encontra-se estável. Ao término de 14 e 21 dias, a modulação desse sistema tende à normalização. Os resultados obtidos atestam evidências da literatura que sugerem o aumento da atividade do PT cardíaco como resposta compensatória ao aumento de síntese proteica. / Thyroid gland disorders are often associated with cardiovascular events and hyperthyroidism state promotes cardiac hypertrophy (CH). CH consists in adaptive response characterized by increased synthesis of structural proteins. The Ubiquitin Proteasome System (UPS) is the major mechanism of intracellular proteolysis and increased evidences suggest its involvement in the development of CH. The aim of this study was to evaluate the modulation of UPS in cardiac tissue of animals subjected to hyperthyroidism. The results related to the increased proteasome (PT) activity and expression in the heart was more accentuated in the group treated for 7 days, when the CH process finds stable. At the end of 14 and 21 days of hyperthyroidism, the modulation of cardiac UPS achieves standard values. These results suggest an increased activity of cardiac PT as a compensatory response to protein synthesis induced by thyroid hormones.

Em trabalho anterior, identificamos a mutação c.382C8594;T no gene UBE2A, localizado em Xq24 e codificador de enzima conjugadora de ubiquitina, como causa de nova síndrome de deficiência mental (DM) de herança ligada ao cromossomo X. Foi a primeira descrição de mutação nesse gene e a primeira associação de mutação em gene que codifica conjugase de ubiquitina com patologia humana. Neste trabalho, focalizamos o gene UBE2A quanto a expressão dos transcritos alternativos, função das isoformas por eles codificadas e o efeito da mutação c.382C 8594; T como causa de deficiência mental (DM). No Capítulo I, revisamos os aspectos genéticos da DM, dando ênfase à herança ligada ao cromossomo X, principal causa de DM herdada e resumimos o estudo que levou à identificação da mutação em UBE2A como causa de quadro sindrômico de DM. Revisamos o papel da via de ubiquitinação de proteínas e das enzimas que participam do processo, em especial as conjugases de ubiquitina. Levantamos evidências na literatura que não deixam dúvida sobre a importância da via de ubiquitinação no sistema nervoso, tanto em processos de neurodesenvolvimento como neurodegeneração. No Capítulo II, avaliamos a contribuição de mutações em UBE2A como causa de DM. Apresentamos os resultados do sequenciamento direto da região codificadora do gene UBE2A em afetados de 23 famílias em que a DM segrega ligada à segmento que inclui Xq24, onde está localizado o gene UBE2A. Uma dessas famílias foi averiguada no Serviço de Aconselhamento Genético do Laboratório de Genética Humana do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociência, USP (LGH-IB/USP), coordenado pelo Dr. Paulo A. Otto e pela Dra. Angela Vianna Morgante. As demais 22 famílias pertencem ao banco de amostras do Consórcio Europeu de Deficiência Mental (European Mental Retardation Consortium EURO-MRX). A triagem foi também realizada em um indivíduo afetado por DM sindrômica que compartilha características clínicas com nossos pacientes. Como acontece com a maioria dos genes do cromossomo X, o gene UBE2A não parece ser responsável por parcela significativa dos casos de DM, já que novas mutações em UBE2A não foram detectadas nessa triagem. Avaliamos o efeito da mutação c.382C 8594; T nos níveis da transcrição e da tradução em homem afetado e em mulher portadora. A presença da mutação que leva a um códon de parada prematura não resultou na degradação do RNA, que detectamos nas células do afetado. Já na mulher portadora, apenas o transcrito normal foi detectado, de acordo com nossos dados anteriores que mostraram desvio completo no padrão de inativação do cromossomo X nas portadoras da mutação, tendo um mesmo cromossomo X ativo nas células do sangue. A vantagem proliferativa das células em que o cromossomo X com alelo mutado estava inativo deve ter levado a esse padrão de inativação desviado do casual, evidenciando o efeito deletério da mutação. Entretanto, o mecanismo pelo qual a mutação afeta a via de UBE2A permanece interrogado. A proteína UBE2A alterada foi encontrada em baixa quantidade nas células do paciente, o que pode ser o resultado de síntese prejudicada ou de degradação pós-traducão. Independente do mecanismo responsável, o fato de apenas uma pequena quantidade da proteína mutada ter sido encontrada, nos permite afirmar que, nas células desses indivíduos, há perda de função de UBE2A. Devemos, contudo, considerar que a proteína mutada é sintetizada e que, no caso de a menor quantidade dever-se à degradação pós-tradução, esse processo pode prejudicar a homeostase celular e contribuir para o quadro clínico. O capítulo II focaliza os transcritos alternativos de UBE2A. Diversos bancos de dados apontam para a existência de três transcritos alternativos do gene UBE2A humano, mas não há trabalho científico que caracterize os tecidos em que os transcritos são expressos ou a função das proteínas por eles codificadas. A mutação c.382C 8594; T localiza-se no éxon 6 do gene, comum a todos os transcritos, de forma que, no caso de eles codificarem proteínas funcionais, a mutação comprometeria três proteínas, e não apenas uma. Demonstramos que os três transcritos de UBE2A são xpressos em leucócitos, pré-adipócitos, placenta, córtex cerebral e hipocampo humanos. Detectamos também os três transcritos nas células de sangue e pré-adipócitos de um de nossos pacientes portador da mutação c.382C 8594; T. Embora os bancos de dados apontem para a existência de apenas um transcrito de UBE2A em camundongos, identificamos um transcrito alternativo correspondente ao transcrito alternativo 3 humano. Este foi detectado inclusive em camundongos nocaute quanto ao gene UBE2A o processo de geração do animal nocaute foi realizado por recombinação homóloga em que o cassete de neomicina foi inserido no éxon 1 do gene, de maneira que não eliminou a existência do transcrito correspondente ao transcrito 3 humano, que utiliza uma 5 UTR alternativa localizada no íntron 3. Entretanto, as proteínas codificadas pelos transcritos alternativos não foram detectadas nos extratos protéicos analisados humanos e de camundongo. Esse resultado poderia ser explicado pela falta de especificidade do anticorpo utilizado ou por essas isoformas representarem pequena parcela do pool de proteínas da célula. Os anticorpos comerciais anti-RAD6 e anti-HR6A/HR6B foram produzidos após imunização de coelhos com a porção N-terminal da isoforma 1. Seria, portanto, possível que não fossem capazes de detectar as isoformas 2 e 3, em que o segmento utilizado para a produção dos anticorpos está total ou parcialmente ausente. No caso de as proteínas estarem pouco representadas na célula, experimentos de co-imunoprecipitação auxiliariam na identificação dessas isoformas nos extratos protéicos. Entretanto, para a detecção de todas as isoformas de UBE2A seria necessário anticorpo que reconhecesse a porção C-terminal de UBE2A. Em 2009, duas novas mutações em UBE2A foram descritas em estudo colaborativo realizado no Welcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridge, Reino Unido, após sequenciamento em larga escala de aproximadamente 700 genes do cromossomo X de cerca de 200 indivíduos com DM de herança ligada ao X. Ambas as mutações c.215C 8594; T e c.328C 8594; G eram do tipo missense. Não foram fornecidas informações quanto ao quadro clínico dos portadores dessas mutações e também não foi esclarecido porque apenas a alteração c.215C 8594; T que resulta na troca do resíduo de fenilalanina da posição 72 por um resíduo de serina (F72S) foi considerada pelos autores como possivelmente patogênica. Nossos estudos in vitro, apresentados no Capítulo III, sugerem que ambas as alterações afetam a função de UBE2A. Em 2010, foram publicados dois trabalhos associando novas alterações em UBE2A a quadro de DM. Honda e col. (2010) descreveram uma microdeleção em Xq24 que inclui UBE2A e outros oito genes, em um menino com DM e características também presentes em nossos pacientes. Budny e col. (2010) descreveram mutações missense em UBE2A em duas famílias em que segregava quadro de DM sindrômica semelhante ao de nossos pacientes. Por comunicação pessoal de Arjan de Brouwer (Departamento de Genética Humana da Universidade Radboud, Nijmegen, Holanda), soubemos da existência de três outras microdeleções de segmentos do cromossomo X que incluem UBE2A, em pacientes do sexo masculino, não aparentados. Comparamos as características clínicas de nossos pacientes com as dos portadores das microdeleções em Xq24 e com aquelas dos portadores de mutações missense em UBE2A. A DM grave e o comprometimento significativo ou ausência de fala são comuns a todos. Outras características como baixa estatura, sinófris, boca grande e lábios finos com comissuras voltadas para baixo, pescoço curto e largo, implantação baixa de cabelos na nuca, mamilos espaçados, pênis pequeno, hirsutismo generalizado e a ocorrência de convulsões parecem predominar. Entretanto, enquanto a microcefalia aparece em dois dos três portadores de microdeleções avaliados, a macrocefalia parece predominar no grupo em que ocorrem as mutações de ponto. No Capítulo III, abordamos estudos funcionais in vivo e in vitro para avaliar se as isoformas alternativas de UBE2A compartilham suas funções de conjugase de ubiquitina e compreender o efeito da mutação c.382C8594;T na função de UBE2A. Buscamos estabelecer modelo celular para avaliar o efeito da mutação na formação de neuritos. Trabalho previamente publicado havia demonstrado que a diferenciação neuronal de células PC12 concomitantemente com a inibição parcial do mRNA de UBE2B (parálogo de UBE2A) resultava na redução de 20-30% do comprimento de neuritos. Entretanto, nossos ensaios de diferenciação de pré-adipócitos não responderam nossas questões sobre o efeito da mutação na formação de neuritos, pois não conseguimos obter, nas células do controle ou nas do paciente, a densidade de neuritos descrita anteriormente na diferenciação de pré-adipócitos. Diferentemente das células PC12, de origem ectodérmica, os pré-adipócitos tem origem mesodérmica, o que dificulta sua diferenciação em linhagem derivada de outro folheto germinativo. A elevada conservação entre as proteínas ortólogas UBE2A e UBE2B humanas e RAD6 de levedura e a observação de que ambas as parálogas humanas são capazes de complementar os fenótipos apresentados pela linhagem 916;rad6 de Saccharomyces cerevisiae nos levou a considerar a linhagem de levedura 916;rad6 como modelo para nossos estudos funcionais. Também, avaliamos a capacidade das isoformas 2 e 3 e da isoforma Q128X de UBE2A para ubiquitinar histonas H2A in vitro, conforme previamente descrito para a isoforma UBE2A/1. Os resultados dos ensaios in vivo indicam que apenas a expressão do transcito 1 de UBE2A é capaz de complementar os fenótipos apresentados pela linhagem 916;rad6 de S. cerevisiae. A expressão dos transcritos 2 ou 3 não resulta na restituição do fenótipo de sensibilidade à UV - a expressão gera certa toxicidade, agravada quando as células são cultivadas a 37o C. Entretanto, as isoformas por eles codificadas não parecem ser estáveis na levedura: assim como nos tecidos humanos testados, não conseguimos detectá-las nos extratos protéicos das leveduras que expressavam esses transcritos. A expressão do transcrito 1 contendo a mutação c.382CT revelou que a isoforma UBE2A/Q128X, por sua vez, é estável na linhagem 916;rad6, porém, além de não restituir o fenótipo de sensibilidade à UV, foi, dentre as isoformas de UBE2A, a mais tóxica. Os fenótipos de toxicidade não foram observados após expressão em linhagem selvagem de S. cerevisiae. Esses resultados indicam que as isoformas 2 e 3 de UBE2A não apresentam atividade de conjugase de ubiquitina e que são, aparentemente, degradadas imediatamente após sua expressão em levedura. O fato de o fenótipo de toxicidade ser agravado, em condições de choque térmico, apóia a hipótese de degradação dessas isoformas, em levedura. A degradação pode ser resultado da ausência de parceiro que permita sua estabilidade, mas a ausência das isoformas também em extratos protéicos de tecidos humanos sugere que o mesmo processo de degradação ocorra em mamíferos. Segundo a classificação das E2, as diversas conjugases de ubiquitina têm em comum o domínio UBC altamente conservado e as variações observadas consistem em inserções ou extensões C-terminais, mas nunca deleções, como ocorre nas isoformas 2 e 3 de UBE2A. Os transcritos alternativos teriam, assim, função regulatória. Os ensaios in vitro confirmaram a capacidade de UBE2A/1 ubiquitinar histonas H2A. Os ensaios com UBE2A/2 e UBE2A/3 não foram conclusivos, uma vez que a incapacidade de ubiquitinação de histonas que observamos pode ter consequência da renaturação in vitro, que pode ter ocorrido prejudicando sua função. Entretanto a obtenção das isoformas puras nos permitiu verificar que, caso a isoforma 2 estivesse presente nos extratos de levedura, ela seria reconhecida pelo anticorpo anti-RAD6. Verificamos que a proteína mutada UBE2A/Q128X é capaz de interagir com a E1, da qual recebe a molécula de ubiquitina, mas não é capaz de transferi-la para a histona. O segmento C-terminal ausente nessa isoforma é, portanto, importante nesse processo. Os ensaios in vitro despertaram nossa atenção para o fenômeno de autoubiquitinação de UBE2A, possível mecanismo de autorregulação previamente considerado na literatura. O fato de alguns trabalhos sugerirem que as E2 atuem também como dímeros in vivo e in vitro e a elevada conservação entre as parálogas humanas UBE2A e UBE2B nos levaram a considerar a possibilidade de mecanismo de regulação recíproca. Dessa maneira, a degradação de UBE2A/Q128X nas células do paciente poderia ser dependente de UBE2B. A reduzida capacidade de autoubiquitinação da isoforma mutada dificultaria sua degradação e tornaria necessária a atividade da paráloga. Isso explicaria porque ela é estável quando expressa na linhagem de levedura 916;rad6, mas não nas células do paciente. A presença de RAD6 estaria diretamente relacionada à ausência de toxicidade após a expressão de UBE2A/Q128X em linhagem selvagem a degradação da isoforma mutada está ocorrendo nessas células. A não viabilidade de camundongo duplo-nocaute quanto as parálogas UBE2A e UBE2B não permite testar a estabilidade da isoforma mutada em células de mamíferos. Observamos, de fato, que a inibição do proteassoma nas células do paciente leva ao acúmulo dessa proteína. A presença da mutação c.382C8594;T nas células do paciente parece resultar no fenótipo de DM devido à perda de função de UBE2A: a isoforma mutada não restitui o fenótipo de sensibilidade à UV de S. cerevisiae e não foi capaz de ubiquitinar histonas H2A in vitro. Além disso, indivíduos com microdeleções de UBE2A apresentam fenótipo semelhante ao de nossos pacientes. Por outro lado, a presença da proteína mutada que necessitaria de UBE2B para ser degradada pode caracterizar um ganho tóxico de função - comprometeria a função de ambas as parálogas. É possível que os dois mecanismos contribuam para o quadro clínico. Os dados dos ensaios in vivo e in vitro abrem caminhos de investigação do processo de regulação de UBE2A e UBE2B no nível da proteína, sugerindo a autoubiquitinação e a ubiquitinaão recíproca como possíveis mecanismos reguladores, que podem explicar a conservação das duas parálogas de RAD6 em mamíferos. / We have previously described a nonsense mutation (c.382C8594;T) in the UBE2A gene, at Xq24, which encodes a ubiquitin conjugating enzyme (E2), as the cause of a new X-linked mental retardation syndrome. The predicted protein lacks the 25 C-terminal amino acid residues conserved in vertebrates and in Drosophila. This was the first description of a mutation in a ubiquitin conjugating enzyme gene causative of a human disease. In the present work, we focused on the UBE2A gene, its alternative transcripts and isoforms, and the effect of the c.382C8594;T mutation. We screened for UBE2A mutations 23 males presenting X-linked mental retardation (XLMR), previously mapped to the interval encompassing this gene, and one isolated case, who shared clinical features with our previously described patients. No mutations were detected in this selected series of patients suggesting that mutations in UBE2A is not a common cause of XLMR, similarly to the majority of the XLMR genes hereto described. Very recently four Xq24 microdeletions encompassing UBE2A and three missence mutations were found by other groups in mentally retarded males that shared several clinical features with our patients. Comparing these and our patients, a clinical picture emerges of mental retardation associated with severe speech impairment, present in all of them. Short stature, large mouth with downturned corners and thin lips, short and broad neck, low posterior hairline, widely spaced nipples, marked generalized hirsutism and seizures are common features. However, microcephaly was observed only in patients carrying UBE2A deletions, while carriers of missense or nonsense mutations showed macrocephaly. We evaluated the effect of the UBE2A c.382C8594;T mutation on transcription and translation. This mutation affects the last UBE2A exon and, as expected, does not lead to nonsense mediated RNA decay, demonstrated by the presence of UBE2A mRNA in leucocytes of an affected male. However, only a small amount of the mutated protein was detected in the patients cells, suggesting the loss of UBE2A function as the cause of the syndrome. The posttranslational degradation of the mutated protein could also disturb the cellular homeostasis, a gain of function that remained a possibility. The detrimental effect of the c.382C8594;T mutation was further supported by the presence of only the normal transcript in leucocytes of a heterozygous woman, who had completely skewed X inactivation, thus pointing to the selective advantage of lymphocytes carrying the normal allele on the active X chromosome. Our search in DNA and protein sequence databases suggested that the UBE2A gene produces three alternative transcripts all classified as protein coding. These three tanscripts contain the mutation site (c.382C8594;T). We showed that all three UBE2A transcripts are expressed in human leucocytes, adipocytes, placenta, cerebral cortex and hippocampus. We also detected an alternative transcript in murine, which corresponds to the human transcript 3. This alternative transcript was present in all murine tissues analyzed, including samples from a UBE2A knockout mouse. However, we failed to detect the proteins encoded by the alternative transcripts. This could result from low affinity of the used commercial antibody to the isoforms. Alternatively, a small amount of these proteins in the pool of cellular proteins, might have not been detected by Western blotting. We performed in vivo and in vitro assays to address the role of the alternative UBE2A isoforms, and to evaluate the effect of c.382C-T mutation on UBE2A function. Taking into account the high amino acid conservation between the human UBE2A and the Saccharomyces cerevisiae ortholog RAD6, we used a 916;rad6 yeast strain to verify whether UBE2A alternative and mutated isoforms were able to complement its UV-sensitivity phenotype, as previously demosntrated for UBE2A isoform 1. We also performed in vitro assays to evaluate their ubiquitination activity towards histone H2A, a known in vitro substrate of RAD6 and UBE2A. Only UBE2A isoform 1 could rescue the UV sensitivity phenotype of the knockout yeast strain. The expression of the alternative isoforms 2 and 3 was partially toxic to this yeast strain, and toxicity increased under heat shock conditions. However, these two isoforms do not seem to be stable in yeast cells: as in human tissues, we failed to detect UBE2A isoforms 2 and 3 in yeast cells expressing the corresponding transcripts. The mutant isoform was stable in yeast, but was unable to rescue the UV-sensitivity phenotype, its expression resulting in severe toxicity to the 916;rad6 strain. On the other hand, toxicity was not observed when the mutant UBE2A isoform was expressed in wild type yeast. These findings suggest that isoforms 2 and 3 do not have ubiquitin conjugating activity and, apparently, are degraded immediately after translation. The fact that toxicity is enhanced when these isoforms are expressed under heat shock conditions supports Degradation hypothesis. The degradation could also be due to the absence of a functional partner, in yeast, that could contribute to their stability. Since the alternative isoforms were not detected in the human tissues analyzed, the degradation might occur in human cells as well. E2 enzymes share a catalytic domain and variations among them consist of insertions or terminal extensions, never deletions. Both isoforms 2 and 3 would have deletions of the catalytic domain, suggesting that they are not functional. A regulatory role for these transcripts is a possibility. Our in vitro assays confirmed that UBE2A isoform 1 is capable of histone H2A ubiquitination. The assays for isoforms 2 and 3 were inconclusive, since their lack of ubiquitin conjugating activity could be caused by incorrect in vitro refolding, required because the proteins were obtained from bacterial inclusion bodies after heterologous expression. The mutated protein, however, was able to interact with the ubiquitin molecule, but failed to transfer it to histones, thus pointing to the importance of the C-terminal segment in this process. Our in vitro assays stongly suggested that UBE2A autoubiquitination occur, an activity previously considered a possible E2 regulatory mechanism. Since there is evidence that some E2s form functional dimers, we hypothesized that, due to their high amino acid conservation, UBE2A and its paralog UBE2B might form heterodimers in vivo, as a mutual regulating mechanism. Under this hypothesis, the degradation of the mutated protein could be UBE2B dependent. The reduced autoubiquitination capacity of the mutated isoform could impair its degradation, and require the participation or the paralog. This would explain why the mutated protein was stable in the 916;rad6 yeast strain, but not in the patient´s cells with a functional UBE2B. Following the same reasoning, in wild type yeast, the presence of RAD6 would explain the absence of the mutated protein and toxicity. The non-viability of the double (UBE2A and UBE2B) knockout cells prevented testing whether the mutated protein was stable in the absence of its paralog. However, proteasome inhibition in cultured cells from one of our patients resulted in accumulation of the mutated protein, confirming its degradion via the ubiquitin-proteasome pathway. In conclusion, the UBE2A c.382C8594;T mutation seems to lead to mental retardation in our patients due to loss of UBE2A function: the mutated isoform is unable to rescue the UV-sensitivity phenotype of 916;rad6 yeast or to ubiquitinate histones in vitro. In addition, patients carrying UBE2A deletions share clinical manifestations with our patients. On the other hand, the possibility remains of a clinical effect of the requirement of UBE2B for degrading the mutated UBE2A. Our data suggest reciprocal ubiquitination in addition to autoubiquitination as UBE2A and UBE2B regulatory mechanism that would explain the conservation of the two paralog genes in mammals.

O câncer cervical é o segundo câncer mais comum entre mulheres no mundo. A maioria dos casos (83%) ocorre em países em desenvolvimento, onde são encontrados em estágios relativamente avançados e, conseqüentemente, a sobrevida média é de cerca de 49% após cinco anos. Portanto, uma vacina eficaz contra as infecções pelo HPV pode levar ao controle do câncer do colo do útero. Apesar de prevenir, a vacina profilática não é acessível em função do alto custo, além de não eliminar o vírus em mulheres já infectadas pelo HPV. Assim, propusemos o desenvolvimento de uma vacina terapêutica eficaz utilizando duas abordagens: VLPs (virus-like particles) quiméricas, que poderiam apresentar propriedades profiláticas e terapêuticas, obtidas da fusão das proteína L1 e E7; proteínas quiméricas obtidas a partir da fusão de epítopos das proteínas E6 e E7 do HPV16, com e sem ubiquitina. Após subclonagens, com a obtenção dos vetores pPICHOLI-L1ΔCE71-50 e pPICHOLI-L1ΔCE743-77, partiu-se para a indução da expressão das VLPs quiméricas em Pichia pastoris, das quais não foram detectadas expressão protéica. Realizaram-se inúmeras modificações no protocolo de indução. Mesmo após essas alterações não foi detectada nenhuma expressão das fusões L1ΔCE71-50 ou L1ΔCE743-77. Como alternativa de uma vacina terapêutica, nos propusemos a expressar em E. coli proteínas sintéticas originadas da fusão entre epítopos das proteínas E6 e E7 do HPV16, com ou sem Ubiquitina, visando aumentar a apresentação de peptídeos via MHC de classe I de modo a estimular a eliminação de células infectadas com HPV16, evitando e regredindo o desenvolvimento dessas células cancerosas. Com a proteína E6E7 solúvel e purificada, realizou-se um ensaio de imunização. Nesse experimento, 20% dos animais imunizados com a proteína E6E7 não apresentaram desenvolvimento de tumor após a inoculação de células TC1. Assim isso nos leva a crer que com o aumento da concentração de proteína e utilização de adjuvantes seria possível aumentar o número de animais resistentes ao desenvolvimento do tumor. Em um segundo experimento de imunização, comparamos as proteínas E6E7 e E6E7Ub, em duas concentrações, 15 e 40 µg, e também com ou sem o adjuvante whole cell pertussis (WCP). Independentemente da concentração e presença ou ausência de WCP, os grupos imunizados com E6E7Ub apresentaram proteção contra o tumor entre 80% e 100% dos camundongos, enquanto os grupos imunizados com E6E7 apresentaram proteção entre 0% e 25%. Esses resultados são promissores, ainda que preliminares, indicando um potencial de uso da proteína E6E7Ub como imunógeno para vacina terapêutica contra o câncer cervical induzido por HPV16 / Cervical cancer is the second most common cancer among women worldwide. Most cases (83%) occur in developing countries, where they are found in relatively advanced stages and, consequently, the median survival is about 49% after five years. Therefore, an effective vaccine against HPV infections can lead to control of cancer of the cervix. Although preventable, the prophylactic HPV vaccine is not accessible to all due to their high cost and in addition the vaccine does not eliminate the HPV in infected women. We have therefore proposed the development of effective therapeutic vaccines using two approaches: chimeric VLPs (virus-like particles), endowed with prophylactic and therapeutic properties, obtained from the fusion protein L1 and E7; chimeric proteins derived from the fusion of epitopes of proteins E6 and E7 of HPV16 with and without ubiquitin. After subcloning, we obtained the vectors pPICHOLI-L1ΔCE71-50 and L1 pPICHOLI- L1ΔCE743-77. After transformation of yeast Pichia pastoris with these constructions, the cells were induced, but it was not possible to detect any recombinant protein expression. As an alternative, we proposed the expression of synthetic proteins in E. coli derived from the fusion between epitopes of E6 and E7 proteins of HPV16 with or without Ubiquitin, in order to enhance the presentation of peptides through MHC class I to stimulate the elimination of HPV16-infected cells, preventing and regressing the development of cancer cells. Soluble E6E7 protein was purified and, 20% of the animals immunized with this protein did not develop tumor after inoculation of TC1 cells. In a second immunization experiment we compared the proteins E6E7 and E6E7Ub, in two concentrations, 15 and 40µg, with or without the adjuvant whole cell pertussis (WCP). Regardless of concentration and presence or absence of WCP, all the groups immunized with E6E7Ub showed protection against tumor between 80% and 100%, while the groups immunized with E6E7 showed protection from 0% to 25%. These results are promising and although preliminary, indicate the potential of E6E7Ub protein as an immunogen, for a therapeutic vaccine against cervical cancer induced by HPV16

A atrofia está associada ao aumento da degradação protéica em doenças sistêmicas, sendo o sistema proteolítico ubiquitina proteassoma (SUP) uma das principais vias envolvidas. Contudo, pouco é conhecido sobre a contribuição do SUP à atrofia desencadeada pela insuficiência cardíaca (IC). Sabendo dos benefícios do treinamento físico aeróbico (TFA) e que os mecanismos moleculares envolvidos na atrofia na IC ainda não estão esclarecidos, nessa dissertação investigamos: 1) a contribuição do SUP para a atrofia associada à IC em 2 modelos experimentais: um modelo genético de camundongos com hiperatividade simpática (HS), e um modelo de infarto do miocárdio (IM) em ratos e 2) o efeito do TFA sobre a atrofia associada à IC e sobre o SUP. Na HS verificamos aumento da expressão das E3 ligases, da deubiquitinase USP28, das proteínas ubiquitinadas e da atividade do proteassoma no sítio quimiotripsina, sendo que o TFA reduziu a expressão dos componentes alterados. No IM, observamos disfunção cardíaca não associada à IC, porém, com aumento da expressão de Atrogin-1; enquanto o TFA não produziu efeitos significantes. Dessa forma, os dados sugerem a participação do SUP na atrofia desencadeada pela IC na HS e, que o TFA previne a atrofia por reduzir a expressão/atividade de alguns componentes do SUP; e, que no IM, o aumento da expressão de Atrogin-1 precedeu a perda de massa muscular / Skeletal muscle atrophy is associated with increased protein degradation in systemic diseases, which seems to be mainly related to ubiquitin-proteasome system (UPS). However, little is known about UPS contribution to the heart failure-induced muscle atrophy (HF-MA). Likewise, aerobic exercise training (AET) has been established as an adjuvant therapy for HF and molecular mechanisms underlying HF-MA has not been clarified yet. The objectives of the study were: 1) to verify UPS contribution for HF-MA in 2 experimental models: sympathetic hyperactivity-induced HF (α2A/α2CARKO) in mice, and myocardial infarction model (MI) in rats and 2) AET effects on HF-MA and UPS. In α2A/α2C ARKO mice, we observed activation of UPS characterized by increased mRNA levels of E3 ligases Atrogin-1 and E3-a, deubiquitinating enzyme USP28, increased levels of ubiquitinated proteins and chymotrypsin-like proteasome activity. AET prevented HF-MA in the α2A/α2C ARKO by reducing of UPS activity. In MI model, rats displayed cardiac dysfunction and exercise intolerance with no signs of atrophy. However, Atrogin-1 mRNA and protein levels were increased. Therefore, alterations in Atrogin-1expression might precede atrophy and HF in this model. In conclusion, our data provide evidence for skeletal muscle anti-atrophic effect upon AET in α2A/α2C ARKO that is related, at least in part, to a reduced UPS

Orientador: Maria Cristina Cintra Gomes Marcondes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T06:14:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ventrucci_Gislaine_D.pdf: 735812 bytes, checksum: 9ccc59181ffe68918015bc1467e83a50 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Caquexia, presente na maioria dos hospedeiros com câncer, é um estado caracterizado pela perda involuntária de peso. Pacientes com caquexia apresentam expectativa de vida muito reduzida e menor qualidade de vida. Nos pacientes com câncer-caquexia há intensa mobilização de substratos dos tecidos da carcaça do organismo hospedeiro ocorrendo, preferencialmente, depleção de proteína muscular em função da redução da síntese e/ou aumento da degradação protéica no músculo. Este aumento da taxa de proteólise muscular tem como função prover aminoácidos para síntese de glutamina, bem como para a demanda de síntese das células neoplásicas. Trabalhos da literatura mostram que o desenvolvimento de câncer dá-se de forma mais agressiva e severa quanto mais jovem for o paciente. Pacientes acometidos pelo crescimento de neoplasia maligna concomitante à gravidez sofrem da mesma agressividade desta doença, com um agravante maior tratam se de dois pacientes: mãe e feto. Neste trabalho analisamos os efeitos de uma dieta rica em leucina sobre o metabolismo protéico em animais jovens prenhes portadores ou não do carcinossarcoma de Walker 256. Ratas Wistar foram distribuídas em grupos experimentais de acordo com a inoculação ou não do carcinossarcoma de Walker 256 e submetidas ou não a dieta rica em leucina. Após 20 dias de experimento foi realizado ensaios com o músculo esquelético (gastrocnêmio) a fim de elucidar o mecanismo de catabolismo tecidual que ocorre durante o processo de câncer-caquexia. Os grupos apresentaram aumento da taxa de proteólise muscular e redução da taxa de síntese protéica muscular. Porém, o grupo inoculado com tumor e tratado com dieta rica em leucina apresentou aumento da síntese protéica e menor espoliação de proteína muscular quando comparado com o grupo inoculado com tumor e não tratado com leucina na dieta. A suplementação de leucina na dieta, uma vez que este aminoácido é utilizado como fonte energética pelo músculo esquelético pode prevenir a depleção da carcaça, preservar a massa protéica corpórea e impedir o estado caquético do animal / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Mon travail de thèse aborde différents développements physico-chimiques qui reposent sur le principe de transfert d'énergie par résonance de Foster (FRET). Le but est de parvenir à étudier et caractériser des assemblages moléculaires ainsi que des changements structurels de biomo-lécules (ou macro-ions) en phase gazeuse. Le transfert d'énergie par résonance de type Förster est un procédé par lequel de l'énergie s'échange de manière non radiative entre un chromo-phore dit donneur dans un état excité et un second chromophore accepteur en proximité di-recte. Conventionnellement, cette technique permet de localiser et déterminer l'écart entre deux molécules (de l'ordre de 10 à 100nm). Principalement utilisée pour étudier des systèmes biologiques, des résultats marquants ont été obtenus sur l'étude de système tel que l'appareil de Golgi, le cytosquelette ou les membranes cellulaires. Elle n'est cependant appliquée qu'à des systèmes en phase liquide. Il nous a paru intéressant de transposer cette technique en phase gazeuse, en utilisant la capacité des spectromètres de masse à sélectionner, isoler et activer des espèces moléculaires, nous permettant d'obtenir de nouvelles informations structurelles. Une grande partie de ma thèse a consisté à premièrement, valider le concept de FRET en phase gaz puis à développer et optimiser, la technique FRET dit ‘d'action'. L'Action-FRET est une tech-nique d'analyse par couplage de spectrométrie de masse et spectroscopie LASER mise au point par l'équipe Spectrobio afin d'étudier les molecules isolées en phase gazeuse. A travers ce dis-positif, je me suis particulièrement investi à contrôler, étudier et caractériser l'évolution des conformations de biomacromolécules d'intérêt biochimique et biologique. Dans une première partie je ferai une courte introduction générale sur les fondamentaux des protéines, de leur composition et élaboration en entités structurelles complexes, diverses et fonctionnelles. La manière dont les protéines s'arrangent successivement en niveaux structural quaternaire est aussi décrite. La deuxième partie est consacrée à une présentation des chromo-phores utilisés. Je présente ensuite leurs utilisations et détaille la synthèse des édifices molécu-laires produits pour réaliser les expériences de FRET. Ceux-ci sont constitués de composés bio-logiques (peptides ou protéines), couplés aux chromophores, (donneur-accepteur). Dans le contexte de ce chapitre se trouve également une discussion sur les mécanismes et produits uti-lisés lors de l'étape de conjugaison qui permet d'obtenir les composants désirés. En troisième partie vient un chapitre qui relate le fonctionnement des appareils utilisés dans le montage expérimental; le LASER et le spectromètre de masse. La méthode de couplage est dé-crite et spécifiée, détaillant comment les appareils commerciaux ont été modifiés pour interagir avec l'un avec l'autre. Avec ce nouveau montage, un suivi de la signature optique de FRET ap-partenant aux protéines entières greffées et à différents états de charge a été possible. Le quatrième chapitre est dédié dans les premières sections à la théorie et l'état de l'art en ce qui concerne le FRET. Les éléments emblématiques et leurs applications en solution de ces der-nières années et les travaux plus récents en phase gazeuse y sont présentés. Par ailleurs, nous avons voulu démontrer dans ce chapitre que nos diverses manipulations ont l'avantage critique de ne pas dépendre d'une mesure de l'émission de lumière suite au transfert résonant d'éner-gie. A la place, on dispose de la fragmentation spécifique de l'ion piégé du chromophore à tra-vers l'analyse de masse conventionnelle du spectromètre de masse pour détecter et quantifier une manifestation de FRET. Nous démontrerons aussi la possibilité cette méthode appliquée à la biologie moléculaire... [etc] / In this thesis, I discuss the application and development of mass spectrometry (MS) - LASER coupled techniques for the characterization and measurement of trapped biomolecules in the gas phase. In broad terms, this thesis demonstrates the potential and perspectives of action-FRET a novel structural biology tool amenable to the gas phase. The fundamentals rely on a well attested resonance quantic process known as Förster resonance energy transfer (FRET). As of yet it has been a widely utilized method to scrutinize molecular structure in solution. The mo-tivation has been to transpose this occurrence to the instrumental settings of a mass spectrom-eter, its gas confinement and, in doing so, overcome the earlier limitations of the technique and stride into the theoretical and experimental study of well determined systems as well as those whose structure were presently undetermined - all without the influence of the environment of a solvated medium. The first chapter of this thesis offers a general overview on peptides and proteins plus how they can be studied. Subsequent chapters include how the work carried out herein ads towards their study, moving the technique towards a gold standard of native mass spectrometry (native MS). In the second chapter, a treatment of the synthetic steps and preparations is given detailing the mechanistics of the reactions at play and above all outlining the experimental procedures and providing any information on any observations made. The third chapter describes, and is devoted to an introduction of the instrumental setup outlaid as it stands giving an account on the LASER, optical pieces and the mass spectrometer employed throughout the course of this thesis, effectively setting the premises of thought and understand-ing for subsequent chapters and methodology. Chapter four presents energy transfer, in particular to the Foster Resonance Energy Transfer and furthermore outlines the developed technique central to the mass spectrometry method to look at donor-acceptor chromophores espoused to biomolecular systems and their photofrag-ments — what is nicknamed as action-FRET. Chapter five reviews and discusses the study of a macromolecule: Ubiquitin, by action-FRET. The first gas phase experiment on the protein to have ever been realised. The information and content gathered from this adapted experiment is compared to work found elsewhere giving an appraisal on the potential of action-FRET and providing an idea to what future insights the technique could bring. In chapter six the reader is introduced to the project of establishing action-FRET in the negative mode of the mass spectrometer’s ionization source as opposed to its positive mode. Suitable pairs of donor-acceptor chromophores to validate the energy transfer under a negative regime were explored. These where profiled and characterized before being adapted to a biomolecular system. The results provide a different flavor of complimentary structural and conformation information, the first of its kind for negative mode action-FRET. The seventh and final chapter is devoted to future developments. The conclusive work tends to grant a further understanding of neurodegenerative diseases that afflict our societies. Chiefly that of the likes of Alzheimer’s: it’s the mechanism of action pertinent to other neurodegenera-tive pathologies; Parkinson’s, Huntington’s but also prion diseases or amyloid neuropathy. In doing so a contribution is presented on a way to trace a strategy in how to tackle and treat such diseases

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont considérés comme la pathologie neurologique la plus sévère en termes de mortalité et d’infirmité. Ils touchent plus de 140 000 personnes chaque année. L’AVC ischémique, qui représente 80% des AVC, est causé par l’occlusion localisée d’un vaisseau conduisant à un arrêt de l’apport en oxygène et en glucose au cerveau. Il est ainsi responsable de déficits moteurs, sensitifs et cognitifs qui peuvent gravement compromettre l’autonomie et la qualité de vie des patients. Les patients qui ont subi un AVC ischémique développent notamment une atrophie musculaire qui se produit principalement dans le membre parétique, mais aussi dans une moindre mesure dans le membre non parétique. Toutefois, les mécanismes moléculaires à l’origine de cette atrophie musculaire sont méconnus. Dans une première étude, l’objectif a été d’identifier les déterminants moléculaires mis en jeu dans l’atrophie musculaire induite par une ischémie cérébrale. Pour répondre à cet objectif, les travaux ont été menés sur un modèle d'ischémie cérébrale chez la souris qui consiste en l’occlusion de l'artère cérébrale moyenne par un monofilament en nylon. Nous avons montré que l’ischémie cérébrale entraînait, 3 jours après son induction, une atrophie musculaire des muscles quadriceps, soleus et tibialis anterior du côté parétique. Cette atrophie musculaire était associée à des déficits moteurs touchant l’équilibre, la coordination, la force musculaire, la posture ou la marche. Au niveau moléculaire, nous avons reporté un déséquilibre de la balance entre la synthèse et la dégradation des protéines musculaires en faveur d’une augmentation de la dégradation dans les muscles parétique et non parétique des souris ischémiées. Nous avons notamment montré que l’expression de la myostatine, un régulateur négatif majeur de la masse musculaire, était significativement augmentée. Dans une seconde étude, l’objectif a été d’identifier une cible d’intervention thérapeutique pour préserver la masse musculaire suite à une ischémie cérébrale. Au vu des résultats obtenus dans la première étude, nous avons ciblé la myostatine. Nous avons montré que l’inhibition de la myostatine entraînait, une meilleure récupération du poids de corps et du poids de divers muscles, 15 jours après une ischémie cérébrale. De plus, l’inhibition de la myostatine tendait à améliorer le comportement moteur des souris ischémiées (équilibre, coordination, force musculaire). En revanche, nous n’avons reporté aucune variation majeure des niveaux en ARNm ou protéines d’acteurs impliqués dans les voies de signalisation Akt/mTOR, Smad2/3, ubiquitine-protéasome et autophagie-lysosome, 15 jours après une ischémie cérébrale. Ces données préliminaires suggèrent que l’inhibition pharmacologique de la myostatine pourrait représenter une stratégie thérapeutique efficace pour limiter la perte de masse musculaire suite à une ischémie cérébrale / Strokes are considered as the most severe neurological disease in terms of mortality and disability. The incidence of stroke in France is estimated at 140 000. Ischemic stroke, which represents about 80% of strokes occur as a result of an obstruction of a blood vessel supplying blood to the brain. Motor, cognitive and sensory deficits are common impacts of stroke and can seriously compromise the autonomy and patient quality of life. Ischemic stroke leads to muscle atrophy, wich occurs primarily in the paretic limb, but also to a lesser extent in the nonparetic limb. However, the molecular mechanisms of muscle atrophy is unknown. In a first study, the purpose was to identify the molecular determinants involved in skeletal muscle atrophy following cerebral ischemia. To meet this objective, the work was carried out on a mouse model of cerebral ischemia, which involves the occlusion of the middle cerebral artery (MCAO) with a nylon monofilament. We have shown that cerebral ischemia leads to skeletal muscle atrophy of quadriceps, soleus and tibialis anterior muscles of the paretic side, 3 days after MCAO. This muscular atrophy was associated with motor deficits in the balance, coordination, muscle strength, posture and walking. From a molecular point of view, we reported an imbalance between the rates of synthesis and degradation of muscle protein, in favour of protein degradation in both paretic and nonparetic muscles. In particular, we showed that the expression of myostatin, a master negative regulator of skeletal muscle mass was significantly increased. In a second study, the purpose was to identify a target for therapeutic intervention in order to maintain muscle mass following cerebral ischemia. In view of the results obtained in the first study, we targeted the myostatin. Our results show that myostatin inhibition increases body weight and muscle mass recovery, 15 days after cerebral ischemia. In addition, myostatin inhibition tends to improve motor behavior (balance, coordination, strength). From a molecular point of view, we reported no major change in mRNA or protein level of actors involved in Akt/mTOR, Smad2/3, autophagy-lysosome and ubiquitin-proteasome pathways, involved in the control of muscle mass, 15 days after cerebral ischemia. These preliminary results strongly suggest that pharmacological inhibitors of myostatin may provide significant therapeutic benefit for muscle atrophy following cerebral ischemia

Posttranslational modification (PTM) of proteins is essential to maintain homeostasis and viability in all eukaryotic cells. Hence, besides the sequence and 3D folding of a polypeptide, modification by multiple types of PTMs, ranging from small molecular groups to entire protein modules, adds another layer of complexity to protein function and regulation. The ubiquitin-like modifiers (UBLs) are such a group of evolutionary conserved protein modifiers, which by covalently conjugating to target proteins can modulate the subcellular localization and activity of their targets. One example of such a UBL, is the Ubiquitin related modifier 1 (Urm1). Since its discovery in 2000, Urm1 has been depicted as a dual function protein, which besides acting as a PTM, in addition functions as a sulfur carrier during the thio-modification of a specific group of tRNAs. Due to this dual capacity, Urm1 is considered as the evolutionary ancestor of the entire UBL family. At present, it is well established that Urm1, with help of its dedicated E1 enzyme Uba4/MOCS3, conjugates to multiple target proteins (urmylation) and that Urm1 thus plays important roles in viability and the response against oxidative stress. The aim of this thesis has been to, for the first time, investigate the role of Urm1 and Uba4 in a multicellular organism, utilising a multidisciplinary approach that integrates Drosophila genetics with classical biochemical assays and proteomics. In Paper I, we first characterized the Drosophila orthologues of Urm1 (CG33276) and Uba4 (CG13090), verified that they interact physically as well as genetically, and that they together can induce urmylation in the fly. By subsequently generating an Urm1 null Drosophila mutant (Urm1n123), we established that Urm1 is essential for viability and that flies lacking Urm1 are resistant to oxidative stress. Providing a molecular explanation for this phenotype, we demonstrated an involvement of Urm1 in the regulation of JNK signaling, including the transcription of the cytoprotective genes Jafrac1 and gstD1. Besides the resistance to oxidative stress, we have moreover (Manuscript IV) made an in-depth investigation of another phenotype displayed by Urm1n123 mutants, an overgrowth of third instar larval neuromuscular junctions (NMJs), a phenotype which is shared also with mutants lacking Uba4 (Uba4n29). To increase the understanding of Urm1 in the fly, we next employed a proteomics-based approach to identify candidate Urm1 target proteins (Paper II). Using this strategy, we identified 79 Urm1-interacting proteins during three different stages of fly development. Of these, six was biochemically confirmed to interact covalently with Urm1, whereas one was found to be associated with Urm1 by non-covalent means. In Manuscript III, we additionally identified the virally encoded oncogene Tax as a target of Urm1, both in Drosophila tissues and mammalian cell lines. In this study, we established a strong correlation between Tax urmylation and subcellular localization, and that Urm1 promoted a cytoplasmic accumulation and enhanced signalling activity of Tax, with implications for a potential role of Urm1 in Tax-induced oncogenesis. Taken together, this thesis provides a basic understanding of the potential roles and targets of Urm1 in a multicellular organism. The four studies included cover different aspects of Urm1 function and clearly points towards a highly dynamic role of protein urmylation in fly development, as well as in adult life.

La cachexie est un syndrome clinique et métabolique caractérisé par une perte de tissu adipeux et de tissu musculaire, fréquemment observé chez les patients atteints de cancer. La myostatine (Mstn) régule négativement la masse musculaire. Bien que la régulation des mécanismes moléculaires impliqués dans le contrôle de la masse musculaire joue un rôle central dans la cachexie associée au cancer, les relations existant entre la Mstn et les mécanismes physiopathologiques restent largement inconnues. Suite à l’inoculation de cellules Lewis lung carcinoma (LLC) à des souris, nous avons montré que l’invalidation du gène de la Mstn (souris Mstn-/-) confère une résistance au développement de la cachexie associée au cancer par rapport à des souris sauvages. La déficience en Mstn prévient la perte de masse musculaire et réduit la croissance tumorale, 35 jours après l’injection des cellules LLC, et est associée à un allongement de la durée de vie des souris. L’invalidation du gène de la Mstn provoque aussi une augmentation de l’apoptose des cellules LLC et une diminution de l'expression de gènes impliqués dans la prolifération et le métabolisme tumoraux. L’activation des systèmes protéolytiques ubiquitine-protéasome et autophagie-lysosome, due au développement tumoral, est réduite voire supprimée dans le muscle des souris Mstn-/-. L’accumulation de céramides intramusculaires, un sphingolipide formé suite à une lipolyse exacerbée, est corrélée à la perte de masse musculaire, suggérant que les céramides pourraient être un médiateur cellulaire impliqué dans la cachexie associée au cancer. Ces résultats montrent que la Mstn joue un rôle essentiel dans la cachexie associée au cancer / Cachexia is a complex clinical and metabolic syndrome, whose definition is imprecise, characterized by an uncontrolled loss of adipose tissue and skeletal muscle mass, frequently observed in cancer patients, and leading to death in 25% of cancer patients. Myostatin (Mstn) is a negative regulator of skeletal muscle mass and a critical determinant of skeletal muscle homeostasis. Although the regulation of the molecular mechanisms involved in the control of skeletal muscle mass plays a central role in the pathogenesis of cancer cachexia, the relationships between Mstn and the pathophysiological mechanisms remain largely unknown. Following subcutaneous inoculation of Lewis lung carcinoma cells (LLC) in mice, we showed that the Mstn gene inactivation (Mstn-/- mice) confers resistance to the development of cancer cachexia, compared to wild type mice. Mstn deficiency prevents the loss of skeletal muscle mass and reduces tumor growth, 35 days after the inoculation of LLC cells, and this is associated with a longer life of mice. Mstn gene inactivation also causes an increased apoptosis of LLC cells and decreases expression of genes involved in tumor proliferation and metabolism. Activation of ubiquitin-proteasome and autophagy-lysosome proteolytic systems, triggered by tumor growth is significantly reduced or suppressed in skeletal muscle of Mstn-/- mice. Accumulation of intramuscular ceramides, a sphingolipid synthesized due to excessive lipolysis, is correlated with the loss of muscle mass, suggesting that ceramides may be a cellular mediator involved in the pathogenesis of cancer cachexia. These results show that Mstn plays a critical role in the pathogenesis of cancer cachexia

Le système ubiquitine-protéasome joue un rôle central dans le contrôle de la progression du cycle cellulaire par la dégradation régulée de nombreuses protéines. Dans ce système, Fbw7 (aussi appelée Fbxw7, hCdc4, hAgo, Sel-10), est l'une des protéines F-box qui sert d'adaptateur de substrats pour l'une des plus importantes familles d'ubiquitine ligases : les complexes SCF (Skp1/Cullin/ F-box). Fbw7 assure la dégradation de plusieurs régulateurs positifs du cycle cellulaire : la cycline E, cMyc, c-Jun, Notch, Aurora A, mTOR, MCL1. En conséquence, l'altération des fonctions de Fbw7 conduit à des défauts de prolifération cellulaire, de différenciation et à de l'instabilité génomique. La mutation de Fbw7 dans les cancers entraîne une dérégulation de l'expression périodique cycline E qui n'est alors plus restreinte à la transition G1/S du cycle cellulaire. Nos résultats montrent qu'une isoforme, Fbw7, est exprimée dans les œufs de xénope matures arrêtés en métaphase II mais n'est pas fonctionnelle, expliquant la présence de grande quantité de cycline E dans les œufs à cette phase mitotique. Nous montrons que Fbw7 est maintenue inactive sous forme poly-ubiquitylée suite à sa phosphorylation par une PKC jusqu'à la fin des cycles embryonnaires rapides, au moment où la cycline E est brutalement dégradée. Nous montrons que la régulation négative de Fbw7 par PKC est conservée au cours des cycles cellulaires somatiques des cellules humaines, et contribue à l'expression périodique de la cycline E. Ces résultats mettent en évidence un nouveau mécanisme critique pour la régulation de Fbw7 au cours du cycle cellulaire et suggèrent que les fonctions de Fbw7 peuvent être altérées par une dérégulation de PKC, un phénomène observé dans de nombreux types de tumeurs humaines. / The ubiquitin-proteasome system plays a central role in the control of cell cycle progression through the regulated degradation of numerous critical proteins. In this process, one key family of ubiquitin ligases are the SCF (Skp1/Cul-1/F-box) complexes, in which F-box-bearing proteins act as substrate-recruiting factors. Fbw7 (also known as Fbxw7, hCdc4, hAgo, Sel-10) is one such F-box protein. It controls the stability and thus the levels of several positive regulators of the cell cycle, including cyclin E, cMyc, c-Jun, Notch, Aurora A, mTOR, Mcl1. As a consequence of its biological roles, alterations of the functions of Fbw7 lead to defects in cellular proliferation, differentiation and genetic instability. As seen in cancers, mutation of Fbw7 leads to deregulation of cyclin E expression, which is no more restricted to the G1-S phase boundary of the cell cycle. Here we report that Fbw7, although expressed in mature Xenopus eggs arrested in metaphase II, is not functional, explaining why cyclin E can be stockpiled in this mitotic-like phase. We found that, in these eggs as well as in early Xenopus embryos, Fbw7 is maintained under a PKC-dependent poly-ubiquitylated state until the end of the early rapid cleavage cycles where cyclin E is abruptly degraded. Importantly, we show that this PKC-dependent negative regulation of Fbw7 is conserved during human somatic cell cycles, resulting into the periodic expression of cyclin E. These findings reveal a novel mechanism critical for the temporal regulation of Fbw7 and suggest that the key functions of Fbw7 can be altered by PKC dysregulation, a mechanism known to occur in many types of human tumours.