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Les enzymes de conjugaison à l’ubiquitine dans l’autismeBlanc-Tailleur, Caroline 17 December 2009 (has links)
L’autisme est une pathologie neurodéveloppementale impliquant des facteurs génétiques. Nous utilisons une stratégie d’étude de gènes candidats choisis pour leur rôle clé dans la voie de l’ubiquitine, impliquée dans des mécanismes de neurogénèse ou de plasticité synaptique mis en cause dans l’autisme.L’identification des 37 enzymes de conjugaison à l’ubiquitine E2 humaines, groupées en 17 familles, a permis de sélectionner 6 enzymes pour mener une recherche de mutation chez 195 autistes : UBE2H, UBE2A, UBE2K, UBE2I, UBE2N, UBE2E3.Aucune mutation n’a été détectée dans notre population d’autistes, et aucune preuve génétique n’a pu impliquer les gènes UBE2K, UBE2A et UBE2N. En revanche des associations significatives ont été mises en évidence avec des polymorphismes des gènes UBE2E3, UBE2I et UBE2H.Des études in vitro ont mis en évidence les rôles importants d’enzymes E2 lors de la neurogénèse : UBE2H favorise la prolifération des CSN tout en empêchant la différenciation neuronale, tandis qu’UBE2A modifie la différenciation des CSN par une augmentation de la taille des neurites.Les recherches restent donc encouragées par ces premiers résultats très prometteurs. / Autism is a neurodevelopmental disorder involving genetic factors. We use a candidate genes strategy selected for their key role in the ubiquitin pathway involved in mechanisms of neurogenesis and synaptic plasticity implicated in autism.Identification of the 37 human ubiquitin conjugating enzymes E2, grouped into 17 families, helped to select 6 enzymes to conduct a mutation screening in 195 autistic patients: UBE2H, UBE2A, UBE2K, UBE2I, UBE2N, UBE2E3.No mutation was detected in our autistic population, and no genetic evidence could involve UBE2K, UBE2A and UBE2N genes. However significant associations were identified with polymorphisms from UBE2E3, UBE2I and UBE2H genes.In vitro studies highlighted the important role of E2 enzymes during neurogenesis: UBE2H promotes the proliferation of NSC while preventing neuronal differentiation, while UBE2A alters differentiation of NSC by increasing the neurites size.Researches therefore remain encouraged by these very promising initial results.
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Etude de la voie de la SUMOylation dans la sclérose latérale amyotrophique associée à des mutations de SOD1 / Study of pathway of SUMOylation in Amyotrophic Lateral Sclerosis associated with SOD1 gene mutationDangoumau, Audrey 15 October 2014 (has links)
La sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative des motoneurones impliquant des facteurs environnementaux et génétiques. Notre étude porte sur l’étude des relations entre la voie de la SUMOylation post-Traductionnelle des protéines et les effets du stress oxydant et de mutants SOD1. Nous montrons tout d’abord que 2 nouveaux mutants, SOD1V31A et SOD1E121G identifiés chez des patients SLA à évolution lente, entraîne la formation d’agrégats cellulaires Ub/SUMO dans la formation des agrégats était suggérée. Nous montrons 1) que les NSC-34 exposées à un stress oxydant et exprimant SOD1 mutée présentent une modification d’expression de plusieurs gènes des voies de l’Ub/SUMO ; 2) que l’expression de SOD1 mutée réduit le pool de protéine SUMO-1 libre dans les cellules motoneuronales, possible conséquence d’une séquestration dans les agrégats ; 3) qu’inhiber la SUMOylation de SOD1 mutée réduit la quantité de cellules avec agrégats. Nos résultats indiquent qu’une meilleure connaissance de la voie de SUMO pourrait conduire à de nouvelles cibles thérapeutiques intéressantes dans la SLA. / Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease of motor neurones involving a combination of environmental and genetics factors. Ours work focuses on the relathionship between the SUMOylation pathway and the effects of oxidative stress and SOD1 mutants. We first show that 2 new mutants, SOD1V31A and SOD1E121G identified in ALS patients with a slowly progressive disease, induce the formation of Ub/SUMO positive aggregates in motor neuronal cells NSC-34. The implication of the Ub/SUMO pathways has been proposed in the formation of aggregates in ALS. We show 1) modification of expression of several genes of the Ub/SUMO pathways in NSC-34 exposed to oxidative stress and expressing various mutated SOD1 proteins; 2) that the expression of mutants SOD1 reduces free-SUMO1 concentration in motor neuronal cell, perhaps by a sequestration in aggregates; 3) that the inhibition of SUMIylation of various mutants SOD1 reduces the amount of cells with aggregates. Our results support further studies on the SUMO pathway that may lead to new therapeutics targets in ALS.
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Étude structurale et fonctionnelle des propriétés d'interaction à l'ubiquitine de la protéine CEP55, un régulateur essentiel de la cytocinèse / Structural and functional study of the ubiquitin binding properties of the CEP55 protein, an essential regulator of cytokinesisNabhane Said Halidi, Keis 07 December 2017 (has links)
La protéine CEP55 pour Centrosomal protein 55 kDa est un régulateur essentiel de la dernière étape de la division cellulaire appelée cytocinèse. En utilisant des approches de bioinformatique, structure-fonction et de biologie cellulaire, nous montrons que CEP55 comporte deux nouveaux domaines d'interaction à l'ubiquitine, qui sont similaires à ceux de la protéine NEMO, NOACEP55 et ZFCEP55 et qui régulent différemment la fonction de CEP55 durant la cytocinèse. Des études de modélisation structurale, mutagénèse dirigée et de biophysique de ces domaines ont permis de mettre en évidence que NOACEP55 adopte une structure dimérique de type " coiled-coil " et interagit préférentiellement avec des chaines d'ubiquitine linéaires (M1). Néanmoins, ZFCEP55 présente une architecture de type zinc finger ou UBZ et se lie préférentiellement avec des chaines d'ubiquitine K63 et M1. De plus, nous mettons en évidence que ZFCEP55 est indispensable au recrutement de CEP55 au midbody de façon dépendante de son interaction avec l'ubiquitine. A contrario, NOACEP55 joue un rôle déterminant en aval du recrutement de CEP55 au midbody. Dans un second volet, nous montrons que NOACEP55 et ZFCEP55 qui sont séparés par un domaine charnière riche en proline, interagissent in vitro de manière coopérative avec de longues chaines d'ubiquitine K63 et que cette interaction est modulée par phosphorylation et isomérisation d'acteurs physiologiques associés à CEP55. Enfin, ces résultats ont permis d'identifier par criblage de siRNA des ubiquitine ligases et déubiquitinases impliquées dans la cytocinèse, qui permettent de discuter du rôle de la signalisation de l'ubiquitine dans ce processus cellulaire. / CEP55 (Centrosomal protein 55 KDa) critically regulates the final step of cell division termed cytokinesis. In the first part, using bioinformatical, structure-function and cell biology approaches, we showed that CEP55 contains two new NEMO-like ubiquitin binding domains, NOACEP55 and ZFCEP55, which differentially regulate CEP55 function during cytokinesis. Structural modeling, mutagenesis and biophysical studies of both domains pointed out that NOACEP55 adopts a dimeric coiled-coil structure and selectively interacts with linear ubiquitin chains (M1). However, ZFCEP55 presents a zinc-finger scaffold – or UBZ – and preferentially binds to K63 and M1 ubiquitin chains. Moreover, our results highlight that ZFCEP55 functions as a cargo receptor to the midbody in an ubiquitin dependent manner whilst NOACEP55 plays a crucial role in cytokinesis but acts downstream of CEP55 recruitment to the midbody. In the second part, we showed that NOACEP55 and ZFCEP55 separated by a proline rich linker cooperatively interact with long K63 poly-ubiquitin chains and this interaction can be modulated by phosphorylation and isomerization via CEP55 physiological partners. Finally, these results allowed us to identify E3-ligases and deubiquitinases involved in cytokinesis, which permit to discuss the role of ubiquitin signaling in this cellular process.
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Etude de la voie de signalisation activée par les acides aminés extracellulaires chez la levure: rôle du complexe ubiquitine ligase SCFgrr1 et inhibition exercée par la perméase Gap1Jean, Cathy 22 June 2009 (has links)
La détection des nutriments extracellulaires est cruciale pour une croissance cellulaire optimale. Certaines protéines de la catégorie des transporteurs membranaires sont dépourvues d’activité de transport et agissent plutôt comme senseurs des nutriments externes. Les senseurs de glucose Snf3 et Rgt2 ainsi que le senseur des acides aminés Ssy1 de la levure sont les représentants les mieux connus de cette classe de senseurs. Au cours de ce travail, nous nous sommes concentrés sur la voie de signalisation activée par Ssy1, le senseur d’acides aminés extracellulaires. L’activation de cette voie conduit à l’induction transcriptionnelle de plusieurs gènes codant pour des perméases d’acides aminés. La protéine Ssy1 insérée dans la membrane plasmique est associée à une protéine membranaire périphérique, Ptr3, elle-même associée à une endoprotéase, la protéine Ssy5. La protéine Ssy1 détecte la présence d’acides aminés dans le milieu, ce qui conduit à l’activation Ptr3-dépendante de l’endoprotéase Ssy5 selon un processus nécessitant également la présence du complexe ubiquitine ligase SCFGrr1. Une fois activée, l’endoprotéase Ssy5 catalyse le clivage endoprotéolytique des facteurs de transcription Stp1 et Stp2. Les facteurs Stp1 et Stp2 ainsi libérés de leur extrémité N-terminale inhibitrice migrent alors du cytoplasme vers le noyau où ils activent, avec l’aide du facteur de transcription Uga35, la transcription du gène AGP1 et d’autres gènes de perméases d’acides aminés. Au début de ce travail, le rôle précis du facteur Ptr3 ainsi que le mécanisme d’activation de l’endoprotéase Ssy5 par les acides aminés n’étaient pas encore connus. Il en était de même du mode d’action du complexe ubiquitine ligase SCFGrr1 au niveau du complexe Ssy1-Ptr3-Ssy5. <p>Dans ce travail de thèse, nous avons pu montrer par des analyses bioinformatiques que la protéine Ptr3 possède deux régions très conservées. La partie N-terminale contient un domaine présentant les caractéristiques à la fois du domaine RING et du domaine U-Box. La partie C-terminale contient quant à elle sept répétitions WD40 qui confèrent généralement une structure en tonneau créant une zone d’interaction avec d’autres protéines. Nous proposons que cette région constitue probablement la plate forme d’interaction avec Ssy1, Ssy5 et elle-même. Notre étude a montré que la région formée des sept répétitions WD40 est essentielle et suffisante pour la fonction de Ptr3 dans la transmission du signal. Nous avons ensuite mis en évidence que la protéine Ptr3 est instable. Ce résultat suggérait un rôle éventuel du complexe ubiquitine ligase SCFGrr1 dans l’ubiquitination de Ptr3. Cependant, nos travaux ne nous ont pas permis d’établir clairement que la protéine Ptr3 est ubiquitinée par le complexe SCFGrr1. Nous nous sommes alors tournés vers l’endoprotéase Ssy5 comme cible potentielle de ce complexe. Au moment d’entamer nos expériences, le mécanisme d’activation de l’endoprotéase Ssy5 suite à la détection des acides aminés par Ssy1 demeurait encore inconnu. Nos résultats ont permis de montrer que le pro-domaine N-terminal de l’endoprotéase Ssy5 subit une ubiquitination catalysée par le complexe SCFGrr1 en réponse aux acides aminés. Nous proposons que cette modification permet la levée de l’inhibition exercée par ce pro-domaine sur le domaine catalytique C-terminal de l’endoprotéase et par conséquent permet le clivage endoprotéolytique des facteurs Stp1 et Stp2. <p>La perméase générale des acides aminés, Gap1, est la principale voie d’entrée des acides aminés quand les cellules sont cultivées sur un milieu pauvre en azote. Si la concentration en acides aminés du milieu devient plus élevée, la perméase Gap1 est ubiquitinée et emportée dans des vésicules d’endocytose pour être dégradée. En parallèle, l’expression des gènes d’autres perméases d’acides aminés, tel que AGP1, est induite via la voie de signalisation Ssy1. Les perméases ainsi synthétisées rejoignent la membrane plasmique pour assurer l’entrée des acides aminés dans la cellule. Des études antérieures de notre laboratoire avaient révélé que la stabilisation de la perméase Gap1 à la membrane plasmique a pour effet d’empêcher l’induction du gène AGP1 via la voie Ssy1. Pour étudier ce phénomène, nous avons commencé par mieux caractériser les facteurs de transcription Stp1 et Stp2 ce qui nous a permis de montrer que ces deux protéines – considérées jusqu’ici comme étant de fonction redondante – sont activées dans des conditions différentes de disponibilité en acides aminés externes. Nous avons ensuite pu montrer que l’inhibition exercée par la perméase Gap1 sur l’induction d’AGP1 se produit non pas aux étapes de clivage endoprotéolytique ou de translocation dans le noyau des facteurs Stp, mais bien au niveau de leur recrutement au promoteur du gène cible.<p>Finalement, nous présentons un modèle de la voie de signalisation Ssy1 rassemblant l’ensemble de nos résultats. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished
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Caractérisation de MSI2 et MSI3 : deux sous-unités du CRL4 et potentiels régulateurs chromatiniens chez Arabidopsis thaliana / Characterization of MSl2 and MSl3 : two CRL4 subunits and potential chromatin regulators in Arabidopsis thalianaJung-Romeo, Sabrina 22 July 2014 (has links)
La dégradation sélective des protéines par un mécanisme ubiquitine et protéasome 26S dépendant est conservée chez tous les eucaryotes. Les E3 ubiquitine ligases sont les derniers acteurs de la cascade d’ubiquitinylation et sont responsables de la sélection spécifique des protéines cibles pour leur dégradation. Les enzymes E3 de type CRL4 forment des complexes multiprotéiques dont les récepteurs de substrats sont appelés DCAF pour DDB1-CUL4 Associated Factor. Les études réalisées chez les mammifères et les levures ont permis d’identifier une signature spécifique des DCAF : le motif WDxR à la fin d’un domaine WD40. L’analyse bioinformatique a montré l’existence de plus de 85 DCAF potentielles chez Arabidopsis thaliana. Parmi ces récepteurs, nous nous sommes intéressés à une famille multigénique appelée MSI (Multicopy Suppressor of IRA1). Des études précédentes ont permis de montrer que MSI1 et MSI4 participaient chacune à un complexe CRL4 différent capable d’interagir fonctionnellement avec un complexe PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) pour moduler une régulation épigénétique.Les résultats obtenus et décrits dans ce manuscrit mettent en évidence une interaction physique entre les protéines MSI (2 ou 3) et DDB1a suggérant l’existence d’un complexe multimérique incluant CUL4. L’interrogation des données publiques confrontées à nos données expérimentales, nous a permis d’établir que l’expression des deux gènes était régulée de manière cycle cellulaire dépendante. De plus, un mutant perte de fonction msi3 présente un phénotype de retard de croissance suggérant une fonction de contrôle du cycle cellulaire. D’autre part, leur capacité d’interagir avec des régulateurs chromatiniens permet d’envisager une régulation par voie épigénétique. Toutefois, le rôle exact de ces protéines reste à déterminer. / Selective protein degradation by the UPS (Ubiquitin Proteasome System) is highly conserved in all eukaryotes. The E3 ubiquitin ligases are the last actors in the ubiquitylation pathway and target specifically the proteins for degradation. CRL4 E3 ligases form multiprotein complexes where the substrate receptors are called DCAFs for DDB1-CUL4 Associated Factor. Studies made in mammals and yeast allowed to highlight a characteristic signature for the DCAFs: the WDxR motif at the end of a WD40 domain. Bioinformatic studies could identify around 85 potential DCAFs in Arabidopsis thaliana. Among those receptors, we were interested in a small multigenic family called MSIs (Multicopy Suppressor of IRA1). Previous studies showed that MSI1 and MSI4 belong to different CRL4 complexes functionally connected to a PRC2 complex (Polycomb Repressive Complex 2). The results obtained and described in this manuscript highlight a physical interaction between MSI (2 or 3) and DDB1a suggesting the existence of a multimeric complex including CUL4. Furthermore, bioinformatic as well as experimental data, allowed us to establish that MSI2 and MSI3 gene expression are cell cycle regulated. Moreover, phenotypic analysis of an msi3 loss of function mutant showed a delayed growth implying a function as cell cycle regulator. On the other hand, the ability of MSI3 to interact with chromatin regulators points to an epigenetic regulatory pathway. However, the exact function of these proteins remains to be determined.
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Uncovering ubiquitylation pathways in liver metabolism by a proteomic approach / Mise en évidence de la voie de signalisation de l'ubiquitine dans le métabolisme hépatique par une approche protéomiqueMagliarelli, Helena 09 October 2014 (has links)
Chez les vertébrés, le foie est un des organes majeurs du métabolisme en étant le siège de la régulation de différentes voies du métabolisme qui contrôlent l’homéostasie du glucose et des lipides. En se basant sur des travaux de recherche récents suggérant que le système de conjugaison de l'ubiquitine est engagé en réponse à différents signaux métaboliques, nous avons réalisé une analyse protéomique globale dans le but d’identifier des protéines ubiquitylées dans le foie de souris soumises á un protocole de jeûne – re-nourrissage. Parmi les 117 protéines différemment ubiquitylé sur le jeûne ou le re-nourrissage, nous avons identifié complément 3 (C3) dans le foie de souris réalimentées. Nous avons observé qu'un produit d'activation de C3, C3a, est ubiquitylé dans les hépatocytes primaires traités avec les médias riches en nutriments. Ainsi, nous proposons que l'ubiquitination de C3 joue un rôle dans la régulation des fonctions inflammatoires ou métaboliques de C3 dans le foie. / In vertebrates, the liver has developed to be a major metabolic organ able to control glucose and lipid homeostasis. It activates or inhibits specific pathways in a regulated manner, depending on the metabolic state of our organism. Based on the emerging experimental evidence suggesting that the ubiquitin conjugation system is engaged in response to different metabolic cues, we conducted a global proteomic analysis to identify metabolic pathways modified by ubiquitylation. To this end, we used livers of mice subjected to a fasting – refeeding protocol. Amongst the 117 proteins differentially ubiquitylated upon fasting or refeeding conditions, we identified complement 3 (C3) to be ubiquitinated in livers of refed mice. We observed that an activation product of C3, C3a, is ubiquitylated in primary hepatocytes treated with nutrient-rich media. Thus, we suggest that the ubiquitylation of C3 plays a role in the regulation of inflammatory or metabolic functions of C3 in the liver.
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Light-induced protein degradation : a chemical biology approach / Dégradation de protéines induite par la lumière : une approche de biologie chimiqueDelacour, Quentin 25 September 2015 (has links)
La régulation de la protéolyse est un outil efficace pour le contrôle de la fonction d'une protéine dans des cellules. Nous présentons dans ce travail une stratégie générique permettant d'activer la protéolyse de façon conditionnelle par la lumière, améliorant ainsi la résolution spatio-temporelle. Notre approche repose sur un système de dégradation inductible par l'auxine (AID), mis au point en transposant des composants de la voie de dégradation contrôlée par l'auxine existant chez les plantes dans des cellules de mammifères. Nous présentons une version optimisée du système AID qui a permis de diminuer de façon significative la stabilité de protéines cibles en présence d'auxine. Nous avons en parallèle développé un déclencheur de dégradation photo-activable sous la forme d'une auxine cagée. Une illumination courte et locale permet la libération efficace de l'auxine dans les cellules et induit la dégradation de protéine d'intérêt avec un bon contrôle spatiotemporel. Cette méthode générique a été utilisée dans des contextes nucléaires et cytoplasmiques. / The regulation of proteolysis is an efficient way to control protein function in cells. Here, we present a general strategy enabling to increase the spatiotemporal resolution of conditional proteolysis by using light activation as trigger. Our approach relies on the auxin-inducible degradation (AID) system obtained by transposing components of the plant auxin-dependent degradation pathway in mammalian cells. We developed an optimized version of the AID which enables to significantly destabilize target proteins in presence of auxin. Parallely, we developed a photoactivatable auxin that acts as a photoactivatable inducer of degradation. Upon local and short light illumination, auxin is released in cells and triggers the degradation of a protein of interest with spatiotemporal control. This generic method was implemented in nuclear and cytoplasmic contexts.
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Role of HDAC6 in Skeletal Muscle Atrophy / Rôle de l’Histone Deacetylase 6 au cours de l’atrophie musculaireRatti, Francesca 02 April 2014 (has links)
HDAC6 est une histone déacétylase hautement conservée, principalement cytoplasmique. Contrairement à d'autres désacétylases, HDAC6 a une spécificité de substrat unique pour les protéines non - histones . Outre les domaines de désacétylation, HDAC6 contient également un domaine de liaison à l'ubiquitine , qui relie HDAC6 de la voie ubiquitine / protéasome .L’atrophie du muscle squelettique est une condition sévère de perte progressive de masse musculaire au cours de certaines maladies telles le cancer, le diabète, le SIDA ou également immobilizations prolongées. Le contrôle de la masse musculaire est sous la dépendance d’un équilibre entre les processus anaboliques et cataboliques. L’atrophie se caractérise par une augmentation substantielle de la dégradation des protéines par le système ubiquitine-protéasome, causée par l'expression d'une série de gènes spécifiques, les atrogenes . Un des atrogenes induits plus spectaculaire est le muscle spécifique de l'ubiquitine ligase E3 MAFbx/Atrogin-1, qui prend soin de la dégradation de MyoD et de eIF3 -f. La dégradation de ces deux protéines inhibe l'expression de gènes et la traduction myotrophiques empêchant le remplacement de protéines dégradées.Récemment, nous avons identifié l’Histone Deacetylase 6 (HDAC6) comme un nouvel atrogène. L’expression de HDAC6 augmente au cours de l’atrophie musculaire, à la fois chez la souris et l’homme, à travers un mécanisme FOXO3 -dépendante. La déplétion de cet enzyme in vivo (electroporation de l’shRNA contre HDAC6 dans des muscle squelettiques de souris ou analyse de souris invalidées pour ce gène) protège contre l’atrophie. De plus, l’inhibition de HDAC6 après déclenchement de l’atrophie peut aussi atténuer le phénotype. Lors de la caractérisation du mécanisme d’action de HDAC6, nous avons montré que HDAC6 intéragit avec MAFbx et que elle est nécessaire pour l’ubiquitination de MyoD par MAFbx. Nos résultats montrent que la surexpression d’un mutant MyoD resistant à la degradation par MAFbx protège contre l’atrophie provoqué par la denervation.. De plus, certaines données préliminaires indiquent une implication de HDAC6 dans la dégradation de eIF3-f et dans le processus de autophagy dans le tissu musculaire , révélant une double rôle de HDAC6 dans le muscle squelettique .Ces preuves suggèrent que HDAC6 représente potentiellement une cible utile pour des traitements curatifs. / HDAC6 is a highly conserved histone deacetylase, mostly cytoplasmic. Unlike other deacetylases, HDAC6 has unique substrate specificity for non-histone proteins. Besides the deacetylation domains, HDAC6 also contains an ubiquitin-binding domain, which links HDAC6 to the ubiquitin/proteasome pathway. Skeletal muscle atrophy is a severe condition of muscle mass loss occurring during aging or in many clinical disorders as cancer, diabetes and AIDS. The maintenance of muscle mass is subtly controlled by an equilibrium between catabolic and anabolic processes. Muscle atrophy results as a partial suppression of protein synthesis and a substantial increase of protein breakdown by the ubiquitin-proteasome system, caused by the expression of a series of specific genes, the atrogenes. One of the atrogenes induced more dramatically is the muscle specific E3 ubiquitin ligase MAFbx/Atrogin-1, which takes care of the degradation of MyoD and of eIF3-f. Degradation of those two proteins inhibits expression of myotrophic genes and translation preventing the replacement of degraded proteins.We identified HDAC6 as a new atrogene. HDAC6 expression is up regulated during muscle atrophy in mouse and human through a mechanism FoxO3-dependent. In vivo depletion of this enzyme by shRNA electroporation or homologous recombination gives protection against atrophy and its inhibition during atrophy can partially reverse the muscle wasting phenotype. HDAC6 can interact with MAFbx and is required for MAFbx-mediated degradation of MyoD. According to our results, forced expression of a MyoD mutant resistant to HDAC6 and MAFbx dependent degradation prevents muscle wasting induced by denervation. Furthermore, some preliminary data show an involvement of HDAC6 in the degradation of eIF3-f and in the autophagy process in muscle tissue, revealing a double role of HDAC6 in skeletal muscle.These evidences suggest that HDAC6 potentially represents a valuable target for curative treatments.
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Analyses structure fonction du module de déubiquitination du complexe SAGA / Structural and functional analyses of the SAGA deubiquitination moduleBonnet, Jacques 19 March 2012 (has links)
Pour faciliter l’initiation de la transcription par l’ARN Polymérase II, le complexe co-activateur de la transcription SAGA possède une activité d’acétylation des histones H3 et une activité de déubiquitination des histones H2B, catalysée chez l’homme par l’enzyme USP22. Mon travail de thèse a porté sur l’étude de la régulation de cette activité de déubiquitination.Au sein de SAGA, USP22 interagit fortement avec trois protéines pour former un module structural appelé module de déubiquitination (DUBm). Nous avons montré que la formation d’un tel module était requise pour activer USP22. D’autre part, deux sous-unités du DUBm humain, ATXN7 et ATXN7L3, contiennent un domaine SCA7. Nos résultats montrent que le repliement structural adopté par ces deux doigts de zinc n’avait pas encore été décrit. Nous avons démontré que le domaine SCA7 de ATXN7 peut interagir avec un nucléosome in vitro et que cette interaction participe à la régulation fine de l’activité de déubiquitination de SAGA. Nous proposons qu’en interagissant avec le nucléosome, le domaine SCA7 de Sgf73 ou de ATXN7 pourrait positionner le DUBm de façon optimale par rapport à son substrat. / The SAGA complex is one of the most studied transcriptional co-activator complexes. To facilitate transcription by RNA Polymerase II, SAGA presents a modular organization and harbours two enzymatic activities. In human cells, these two enzymes are called GCN5 and USP22 and they can respectivelly acetylate histones H3 and deubiquitinate histones H2B. During my PhD thesis, I have worked on the regulation of SAGA deubiquitination activity. In the SAGA complex, USP22 interacts strongly with three other subunits to form a structural and functionnal module, named deubiquitination module (DUBm). We have shown that the free recombinant USP22 enzyme is not active, but that the formation of a stable DUBm triggers a strong stimulation of USP22 catalytic activity. Secondly, in human cells, two subunits of the DUBm, ATXN7 and ATXN7L3, contain a domain, called SCA7, that is not found in any other protein. Our results show that the new structural fold adopted by these two domains is specific to these zinc-fingers. These two SCA7 domains share a common structural heart, but their atomic structures reveal also differences, especially in the spatial organization of secondary structure elements. Indeed, we have shown that ATXN7 SCA7 domain can interact in vitro with a nucleosome which is not the case of ATXN7L3 SCA7 domain. Finally, I could show that in vivo the SCA7 domain of Sgf73, the ortholog of ATXN7 has a role in fine tunning SAGA deubiquitination activity. We hypothesize that the interaction between a nucleosome and the SCA7 domain of ATXN7 or Sgf73 would regulate SAGA deubiquitination activity by an optimal positionning of the module to its substrate.
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Caractérisation des interactions moléculaires entre la GTPase Rac1 et son régulateur HACE1 : perspectives en infectiologie et en cancérologie / Characterization of molecular interactions between the E3 ubiquitin-ligase HACE1 and its target Rac1Lotte, Romain 24 October 2017 (has links)
La GTPase Rac1 est une protéine de signalisation intracellulaire qui joue notamment un rôle clé dans la prolifération cellulaire. Notre laboratoire a montré que la toxine CNF1, produite par les Escherichia coli pathogènes, catalyse l’activation de Rac1. Nous avons également identifié le rôle de la E3 ubiquitine-ligase HACE1, un suppresseur de tumeur avéré, dans la régulation par ubiquitylation de Rac1 actif. S’il est prouvé que la forme activée de Rac1 est une cible d’HACE1, le mode d’interaction de ces deux protéines reste à définir ainsi que le rôle de ces interactions dans l’infection et le cancer. L’objectif de mon travail a été de caractériser les interactions moléculaires entre HACE1 et Rac1. Nous avons testé l’hypothèse que des mutations ponctuelles d’HACE1 identifiées dans les cancers pourraient interférer avec son interaction avec Rac1 et sa capacité de contrôle de la croissance cellulaire. J’ai ainsi pu mettre en évidence que 13 mutations somatiques d’HACE1 issues de tumeurs séquencées altèrent sa fonction de contrôle de la croissance cellulaire. De plus, l’étude de ces mutations nous a permis d’identifier un groupe d’acides aminés, situés sur les ankyrin-repeats 5 à 7 d’HACE1, qui contrôle l’interaction d’HACE1 avec Rac1 et de ce fait son ubiquitylation. Enfin dans cette étude nous précisons le rôle du domaine intermédiaire d’HACE1 (MID) dans la spécificité d’interaction de la ligase avec la forme active de Rac1. In fine, la caractérisation de mutants d’interaction entre HACE1 et Rac1 ainsi que l’effet de la toxine CNF1 sur cet axe de signalisation doit nous renseigner sur l’importance de cette voie de régulation dans le cancer et l’infection. / The small GTPase Rac1 plays a key role in various intracellular signaling pathways including cell proliferation. Our laboratory has shown that the CNF1 toxin, produced by pathogenic Escherichia coli, catalyzes the activation of Rac1. We also identified the role of the E3 ubiquitin-ligase HACE1, a tumor suppressor, in the regulation by ubiquitylation of active Rac1. If the activated form of Rac1 is proved to be a target of HACE1, the mode of interaction between these two proteins remains to be define as well as the role of these interactions in infection and cancer. The aim of my work was to characterize the molecular interactions between HACE1 and Rac1. We tested the hypothesis that HACE1 point mutations identified in cancers could interfere with its interaction with Rac1 and its ability to control cell growth. We showed that 13 cancer-associated somatic mutations of HACE1, led to a defective control of cell proliferation. Moreover, the study of these mutations allowed us to identify a group of amino acids, located on the ankyrin-repeats 5 to 7 of HACE1, which controls the interaction of HACE1 with Rac1 and thus its ubiquitylation. We also identified a role for the intermediate domain of HACE1 (MID) in conferring the specificity of association of HACE1 to the active form of Rac1. Ultimately, the characterization of interaction mutants between HACE1 and Rac1 as well as the effect of the CNF1 toxin on this signaling axis will give us more insight on this regulatory pathway in cancer and infection.
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