La voie endo-lysosomale dirige les récepteurs membranaires vers le processus de dégradation lysosomale. En bref, les récepteurs sont marqués par l'ubiquitine, envoyés vers les endosomes précoces puis, pris en charge pas le système ESCRT (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) et intégrés dans des vésicules intraluminales. Ce système est composé des complexes ESCRT-0, I, II, II et VPS4. Certaines protéines ESCRT sont aussi recrutées lors de processus topologiquement similaires comme la cytokinèse ou le bourgeonnment viral de certains virus enveloppés. AMSH (Associated Molecule of the SH3 domain of STAM) est une ubiquitine-hydrolase associée au système ESCRT qui hydrolyse les chaînes d'ubiquitine liées par leur lysine K63. Elle interagit directement avec ESCRT-0 via la sous-unité STAM et avec les membres CHMP1A, 1B et 3 d'ESCRT-III. Bien qu'AMSH pourait recruter ces protéines ESCRT ou être elle-même recrutée par celles-ci, le mécanisme d'activation de son activité d'hydrolase est encore méconnu. Afin de mieux comprendre les bases structurales de l'activation d'AMSH, j'ai essayé danalyser des formes recombinantes de cette protéine par cristallographie aux rayons X et par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) ce qui m'a permis d'obtenir deux modèles à basse résolution. De plus, j'ai caractérisé par SPR (Surface Plasmon Resonance) les interactions entre AMSH et CHMP1A, 1B et 3 et déterminé les résidus clefs du dernier complexe. Cela a montré que les surfaces d'interaction employées par le domaine MIT d'AMSH ne sont pas les mêmes pour CHMP3 et CHMP1A/1B. J'ai aussi découvert que l'activité enzymatique d'AMSH seule est très faible ce qui impliquerait une auto-inhibition en solution. L'hydrolyse des chaînes d'ubiquitine liées par leur lysine K63 pourrait alors être activée par une construction de STAM comprenant le domaine SH3 ainsi que les domaines liant l'ubiquitine VHS et/ou UIM.

Cell surface transport proteins play a crucial role in all cells, from unicellular organisms to mammals, by conferring to the plasma membrane selective permeability to a wide range of ions and small molecules. The activity of these proteins is very often regulated by controlling their amount at the plasma membrane where they are removed by means of selective endocytosis in response to signals and changes in the environment.<p>One of the membrane proteins of the yeast Saccharomyces cerevisiae whose regulation has been extensively studied is the general amino acid permease. Previous studies on Gap1 and other yeast permeases revealed that ubiquitin plays a key role in the membrane trafficking of these proteins by providing a signal that triggers their internalization in endocytic vesicles and that promote their sorting into intra-endosomal vesicles for subsequent delivery into the lumen of the vacuole, the lysosome of yeast. <p>In the first part of this work, we report the isolation of 64 mutant forms of the Gap1 protein and their exploitation in a systematic functional study of the predicted intracellular regions of the permease. The phenotypic analysis of these mutants revealed an important role of certain amino acid sequences in the (i) transport of the permease through the secretory pathway (ii) intrinsic activity of the permease at the plasma membrane (iii) stability of the protein at the cell surface (iv) sorting of the protein into intra-endosomal vesicles. Further investigation of some of these mutants allowed us to unravel an original mechanism for the degradation of the permease that is independent of its ubiquitylation.<p>In the second part of the work, we used yet other Gap1 mutants to study the signals and pathways inducing the ubiquitylation and endocytosis of the permease. Also, we further investigated the molecular mechanisms inducing Gap1 ubiquitylation. <p>All these results together allow us to better understand the mechanisms controlling the ubiquitin dependent down-regulation of plasma membrane proteins. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La mitose assure la répartition égale du génome. La kinase mitotique Aurora B y joue un rôle majeur en contrôlant la fidélité de la ségrégation des chromosomes de par sa localisation aux centromères et aux microtubules, qui nécessite son ubiquitination par CUL3. Cependant, le mécanisme conduisant la forme ubiquitinée d’Aurora B sur ces structures mitotiques reste à déterminer. Dans ce contexte, j’ai pu identifier la protéine UBASH3B, qui contient un domaine de liaison à l’ubiquitine (UBD) comme un régulateur essentiel de la ségrégation chromosomique, agissant comme un récepteur de l’ubiquitine pour Aurora B. UBASH3B interagit directement avec Aurora B et cette interaction est dépendante de la modification d’Aurora B par l’ubiquitine ainsi que de CUL3. UBASH3B ne régule pas le niveau d’expression d’Aurora B. En revanche, UBASH3B se localise aux fuseaux mitotiques et est à la fois nécessaire et suffisant pour transférer Aurora B aux microtubules. De plus, la redistribution d’Aurora B des centromères vers les microtubules contrôle le déroulement et la fidélité de la ségrégation des chromosomes et donc le contenu correct du matériel génétique des cellules. Ainsi, mes résultats expliquent comment la modification par l’ubiquitine régule la localisation et la fonction d’Aurora B, reliant une voie de signalisation impliquant un récepteur à l’ubiquitine à la mitose. / Mitosis ensures equal segregation of the genome. The major mitotic kinase Aurora B controls fidelity of chromosome segregation by its localization to centromeres and microtubules, which requires CUL3-mediated ubiquitylation. However, it remains unknown how ubiquitylated Aurora B is targeted to mitotic structures. Here, I identify ubiquitin-binding domain (UBD) protein UBASH3B that critically regulates chromosome segregation, acting as ubiquitin receptor for Aurora B. UBASH3B directly binds Aurora B, and this interaction is dependent on CUL3 and on ubiquitin recognition. UBASH3B does not regulate protein levels of Aurora B. Instead, UBASH3B localizes to the mitotic spindle and is both required and sufficient to transfer Aurora B to microtubules. Moreover, redistribution of Aurora B from centromeres to microtubules controls timing and fidelity of chromosome segregation and thereby euploidy of cells. Thus, my findings explain how ubiquitin attachment regulates localization and function of Aurora B, linking receptor-mediated ubiquitin signaling to mitosis.

La protéine Promyelocytic Leukemia (PML) est impliquée dans de nombreux processus cellulaires, et identifiée comme un suppresseur de tumeur. Cette protéine est le composant structural des Corps Nucléaires PML (CNs-PML) dont l'intégrité, compromise dans certaines leucémies, dépend strictement de sa SUMOylation. Ce projet de thèse visait à identifier de nouveaux régulateurs des CNs-PML, et par extension de la voie SUMO, en utilisant comme 'read-out' l'anatomie des CNs-PML, laquelle est extrêmement sensible au niveau de SUMOylation cellulaire globale. Ces travaux sont basés sur un criblage siARNs à grande échelle qui a conduit à l'identification de deux candidats SKP1et RBX1, tous deux faisant partie intégrante d'un complexe d'ubiquitine E3 ligase appelé " SKP1-CUL1-F-Box containing complex " (SCF). Nous avons pu démontrer l'implication de SKP1 et RBX1 dans la stabilité de la protéine PML avec des expériences de gain et perte de fonction. Nous avons également identifié FBXO9 comme la protéine F-Box capable de reconnaitre spécifiquement PML, causant son ubiquitination par le complexe SCFFBXO9, suivie de sa dégradation par le protéasome. En revanche, le site d'interaction de FBXO9 sur PML -tout comme la kinase impliquée dans ce processus de reconnaissance- restent encore à identifier. PML étant dégradé dans de nombreux cancers, il apparait essentiel d'avoir une meilleure compréhension des mécanismes post-traductionnels menant à sa dégradation. Ces travaux devraient à long terme permettre de révéler de nouveaux régulateurs des CNs-PML, et potentiellement permettre le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, visant à moduler les CNs-PML dans la cellule tumorale. / ProMyelocytic Leukemia (PML) protein is implicated in a number of key cellular processes, and was identified as a tumor suppressor. This protein is one of the main structural components forming the PML Nuclear Bodies (PML-NBs) whose integrity -compromised in some leukemias- is strictly dependent on PML SUMOylation. The goal of this thesis project was to identify new regulators of PML Nuclear Bodies, and by extension of the SUMO pathway, using PML-NBs, which are extremely sensitive to global cellular SUMOylation level, as a read out. This work is based on a high throughput siRNA screen, which led to the identification of two proteins, SKP1a and RBX1, which are both part of an Ubiquitin E3 ligase complex called SKP-Cullin-F-Box containing complex (SCF). We were able to show the involvement of SKP1 and RBX1 in PML protein stability through gain and loss of function experiments. We also identified FBXO9 as the F-Box capable of specifically recognizing PML, causing its ubiquitination by SCFFBXO9 complex and subsequent degradation by the proteasome. However, FBXO9 site of interaction on PML and the identity of the kinase implicated in this recognition processes are yet to be discovered. PML being degraded in numerous cancers, it is essential to acquire a better understanding of post-translational mechanism leading to the degradation of this tumour suppressor. In the long term, this work should, allow the discovery of new PML Nuclear Body regulators and potentially allow the development of new strategies aiming to modulate PML Nuclear Bodies in tumoral cells.

Chez les eucaryotes, la régulation de l'expression des gènes fait intervenir des mécanismes de contrôle qualité qui préservent l'intégrité des ARN et des protéines par la détection et l'élimination des produits défectueux. Ces processus sont essentiels pour limiter l'accumulation de protéines déficientes qui ont tendance à former des agrégats qui peuvent entraîner une toxicité cellulaire et des pathologies telles que des maladies neurodégénératives. La traduction de certains ARNm aberrants conduit à un blocage des ribosomes, ce qui déclenche le recrutement de facteurs de contrôle qualité permettant la dissociation des ribosomes bloqués et la dégradation de ces ARNm et des peptides aberrants correspondants. Au cours de ma thèse, j'ai découvert l'existence du complexe RQC, composé de Rqc1, Rqc2, Ltn1 et Cdc48, qui se lie aux sous-unités 60S bloquées afin de reconnaître les peptides naissants aberrants. Alors que Ltn1 assure leur polyubiquitinylation, Rqc2 permet l'ajout d'alanines-thréonines à leur extrémité C-terminale (CAT tails), et Cdc48 extrait ces peptides de manière à ce qu'ils soient escortés au protéasome pour être dégradés. Rqc1 est essentiel à la fois pour le recrutement de Cdc48 et pour la prévention de l'agrégation des peptides aberrants. Ce phénomène d'agrégation permet notamment de déclencher la réponse Hsf1 en cas de stress. Enfin, nous avons découvert que de multiples voies de contrôle qualité participent à l'élimination des agrégats de protéines aberrantes lorsque Rqc1 est déplété. L'ensemble de ces mécanismes de contrôle qualité permet aux cellules de répondre efficacement à un stress traductionnel afin de maintenir l'homéostasie des protéines. / Gene expression in eukaryotes requires quality control mechanisms that preserve the integrity of the transcriptome and the proteome by detecting and eliminating defective RNAs and peptides. These processes are essential to prevent the accumulation of deficient proteins that are prone to aggregation, which can cause a cellular toxicity and pathologies such as neurodegenerative diseases. In the cytosol, translation of aberrant mRNAs may lead to ribosome stalling, which triggers the recruitment of quality control factors that enable the dissociation of stalled ribosomes and the degradation of these aberrant transcripts. However, since the polypeptides synthesized from these mRNAs are generally deficient, they must also be degraded. During my thesis, I discovered the existence of the RQC complex, composed of Rqc1, Rqc2, Ltn1 and Cdc48, that bind stalled 60S subunits to detect and eliminate aberrant nascent peptides. Whereas Ltn1 ensures their polyubiquitylation, Rqc2 enables the addition of C-terminal alanine-threonine tails (CAT tails), and Cdc48 extracts these peptides so that the RQC complex can escort them to the proteasome for their degradation. A study of Rqc1 revealed that this factor is essential for Cdc48 recruitment and to prevent the aggregation of aberrant proteins. This aggregation phenomenon is essential to trigger the Hsf1 response in case of stress. Finally, we discovered that multiple quality control pathways participate in the elimination of aberrant protein aggregates when Rqc1 is depleted. This set of quality control mechanisms ensures an efficient cellular response in case of translational stress in order to maintain protein homeostasis.

Le virus de l’Herpès simplex de type 1 (HSV-1) est le pathogène humain responsable des lésions herpétiques labiales, plus communément appelé « feux sauvages ». Annuellement, il est responsable de plusieurs cas d’encéphalites et d’infections de l’appareil visuel qui sont la principale cause de cécité en Amérique du Nord. Bien qu’il existe quelques traitements antiviraux, aucun vaccin ou médicament ne permet de prévenir ou de guérir les infections causées par ce virus. Aujourd’hui, les infections produites par l’HSV-1 sont présentes partout sur la planète. Récemment, une étude en protéomique effectuée sur les virus matures extracellulaires a permis d’identifier la présence d’ubiquitines libres et d’enzymes reliées à la machinerie d’ubiquitination dans le virus. De plus, le virus exploite cette machinerie au cours de l’infection. Il est connu que certaines protéines virales sont ubiquitinées durant une infection et que le virus imite même certaines enzymes d’ubiquitination. Nous avons donc entrepris des recherches afin d’identifier des protéines virales ubiquitinées qui pourraient être présentes dans les virus matures ainsi que leurs rôles potentiels. La protéine majeure de la capside, VP5, un constituant très important du virus, a été identifiée. Nos recherches nous ont permis de caractériser le type d’ubiquitination, une monoubiquitination sur les lysines K810 et/ou K1275 de VP5. Le rôle que pourrait jouer l’ubiquitination de VP5 dans le cycle de réplication virale et dans les virus matures n’est toutefois pas encore connu. / Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is the human pathogen responsible for herpetic lesion such as cold sores. On a yearly basis, it is responsible for many cases of encephalitis and infections of the eye that are the most common cause of blindness in North America. Antiviral treatments exist, but no vaccines or drugs are able to prevent or cure the diseases caused by this virus. Today, infections caused by HSV-1 are present all around the world. Recently a proteomics approach was used to study mature extracellular viruses. This study highlighted the presence in the virus of free ubiquitin and ubiquitin related enzymes. Furthermore, the virus exploits this machinery during the course of infection. Also, it is known that certain virally encoded proteins are ubiquitinated and that the virus mimics some ubiquitin related enzymes. Our researches focused on identifying ubiquitinated viral proteins that could be present in mature extracellular viruses and their potential roles. The major capsid protein, VP5, an important virus component, was identified. We characterised the type of ubiquitination, a monoubiquitination of lysine K810 and/or K1275 of VP5. The role that could play the ubiquitination of VP5 in the viral cell cycle and in mature virions has yet to be identified.

Le VIH-1 a développé plusieurs mécanismes menant à la dégradation de son récepteur cellulaire, la molécule CD4, dans le but d’augmenter la relâche de particules virales infectieuses et d’éviter que la cellule soit surinfectée. L’un de ces mécanismes est la dégradation, induite par la protéine virale Vpu, du CD4 nouvellement synthétisé au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Vpu doit lier CD4 et recruter l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP, via sa liaison à β-TrCP, afin de dégrader CD4. Puisque CD4 doit être retenu au RE pour permettre à Vpu d’induire sa dégradation via le système ubiquitine-protéasome, il a été suggéré que ce processus implique un mécanisme semblable à une voie cellulaire de dégradation des protéines mal-repliées appelée ERAD (« endoplasmic reticulum-associated degradation »). La dégradation par ERAD implique généralement la dislocation des protéines du RE vers le cytoplasme afin de permettre leur poly-ubiquitination et leur dégradation par le protéasome. Nous avons démontré que Vpu induit la poly-ubiquitination de CD4 dans des cellules humaines. Nos résultats suggèrent aussi que CD4 doit subir une dislocation afin d’être dégradé par le protéasome en présence de Vpu. De plus, un mutant transdominant négatif de l’ATPase p97, qui est impliquée dans la dislocation des substrats ERAD, inhibe complètement la dégradation de CD4 par Vpu. Enfin, nos résultats ont montré que l’ubiquitination sur des résidus accepteurs de l’ubiquitine (lysines) de la queue cytoplasmique de CD4 n’était pas essentielle, mais que la mutation des lysines ralentit le processus de dégradation de CD4. Ce résultat suggère que l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 pourrait représenter un événement important dans le processus de dégradation induit par Vpu. L’attachement de l’ubiquitine a généralement lieu sur les lysines de la protéine ciblée. Toutefois, l’ubiquitination sur des résidus non-lysine (sérine, thréonine et cystéine) a aussi été démontrée. Nous avons démontré que la mutation de tous les sites potentiels d’ubiquitination cytoplasmiques de CD4 (K, C, S et T) inhibe la dégradation par Vpu. De plus, la présence de cystéines dans la queue cytoplasmique apparaît suffisante pour rendre CD4 sensible à Vpu en absence de lysine, sérine et thréonine. Afin d’expliquer ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 serait nécessaire à sa dégradation et où les sites d’ubiquitination de CD4 seraient sélectionnés de façon non spécifique par l’ubiquitine ligase recrutée par Vpu. Enfin, nous avons observé que la co-expression d’une protéine Vpu incapable de recruter β-TrCP (Vpu S52,56/D) semble stabiliser le CD4 qui est retenu au RE. De plus, d’autres mutants de Vpu qui semblent capables de recruter β-TrCP et CD4 sont toutefois incapables d’induire sa dégradation. Ces résultats suggèrent que l’association de Vpu à CD4 et β-TrCP est essentielle mais pas suffisante pour induire la dégradation de CD4. Par conséquent, ces résultats soulèvent la possibilité que Vpu puisse recruter d’autres facteurs cellulaires pour induire la dégradation de CD4. Les résultats présentés ont permis de mieux définir le mécanisme de dégradation de CD4 par Vpu dans des cellules humaines. De plus, ces résultats nous ont permis d’élaborer un modèle dans lequel l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP démontre de la flexibilité dans le choix des résidus à ubiquitiner afin d’induire la dégradation de CD4. Enfin, ces études jettent un oeil nouveau sur le rôle de Vpu dans ce processus puisque nos résultats suggèrent que Vpu doive recruter d’autres partenaires cellulaires, mis à part β-TrCP, pour induire la dégradation de CD4. / HIV-1 has developed many mechanisms leading to the down-regulation of its cellular receptor, the CD4 molecule, in order to increase the release of infectious viral particles and to inhibit superinfection of the target cell. One of these mechanisms is the HIV-1 Vpu-mediated degradation of newly synthesized CD4 at the level of endoplasmic reticulum (ER). Vpu must interact with CD4 and recruit the cellular ubiquitin ligase SCFβ-TrCP, via its binding to β-TrCP, in order to induce CD4 degradation. Because CD4 has to be retained in the ER to allow Vpu to induce its degradation via the ubiquitin-proteasome system, it has been suggested that this process involves a mechanism reminiscent of a cellular degradation pathway involved in the proteolysis of unfolded proteins called ERAD (endoplasmic reticulum-associated degradation). The ERAD degradation usually involves the dislocation of proteins from the ER to the cytoplasm in order to induce their poly-ubiquitination and subsequent degradation by the proteasome. We demonstrated that Vpu induces the poly-ubiquitination of CD4 in human cells. Our results also suggest that CD4 has to be dislocated in order to be degraded by the proteasome in presence of Vpu. Furthermore, the expression of a transdominant negative mutant of the ATPase p97, that is involved in the dislocation of ERAD substrates, inhibits completely the Vpu-mediated CD4 degradation process. Finally, our results demonstrated that the ubiquitination of putative ubiquitin acceptor residues (lysines) in the cytosolic tail of CD4 is not essential but the mutation of these lysines slowed down the process of CD4 degradation induced by Vpu. This results suggests that ubiquitination of CD4 cytosolic tail could represent an important step during Vpu-mediated CD4 degradation. Ubiquitin is usually attached on lysine residues in the targetted protein. However, the ubiquitination on non-lysine residues (S, T and C) has also been demonstrated. We demonstrated that the mutation of all cytosolic potential ubiquitination sites (K, C, S and T) of CD4 abolishes Vpu-mediated degradation. In addition, the presence of cysteines in the cytosolic tail of CD4 appeared sufficient to render CD4 sensitive to Vpu in absence of lysine, serine or threonine. In order to explain these results, we propose a model in which CD4 cytosolic tail ubiquitination is necessary for its degradation and where ubiquitination sites are selected non specifically by the ubiquitin ligase recruited by Vpu. Finally, we observed that co-expression of a phosphorylation mutant of Vpu unable to interact with β-TrCP (Vpu S52,56/D) appears to stabilize ER-retained CD4 molecules. In addition, other Vpu mutants seem able to recruit β-TrCP and CD4 without inducing CD4 degradation. These results suggest that Vpu association with CD4 and β-TrCP is essential but not sufficient for CD4 degradation. Consequently, these results raised the possibility that other cellular factors could be recruited by Vpu in order to induce CD4 degradation. The results presented here allowed us to better define the mechanism underlying Vpu-mediated CD4 degradation. In addition, these results allowed us to elaborate a model in which the ubiquitin ligase SCFβ-TrCP show some flexibility in the choice of ubiquitination sites in order to induce CD4 degradation. Finally, theses studies shed a new light on the role of Vpu in the CD4 degradation process because our results suggest that Vpu could recruit, in addition of β-TrCP, other cellular partners in order to induce CD4 degradation.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), l’agent étiologique du SIDA, est un rétrovirus complexe arborant plusieurs protéines accessoires : Nef, Vif, Vpr, et Vpu. Celles-ci sont impliquées dans la modulation de la réplication virale, dans l’évasion immunitaire et dans la progression de la pathogenèse du SIDA. Dans ce contexte, il a été démontré que la protéine virale R (Vpr) induit un arrêt de cycle cellulaire en phase G2. Le mécanisme par lequel Vpr exerce cette fonction est l’activation, ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-dépendante, du point de contrôle de dommage à l’ADN, mais les facteurs et mécanismes moléculaires directement impliqués dans cette activité demeurent inconnus. Afin d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires interagissant avec Vpr, nous avons utilisé une purification d’affinité en tandem (TAP) pour isoler des complexes protéiques natifs contenant Vpr. Nous avons découvert que Vpr s’associait avec CRL4A(VprBP), un complexe cellulaire d’E3 ubiquitine ligase, comprenant les protéines Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) et VprBP (Vpr-binding protein). Nos études ont mis en évidence que le recrutement de la E3 ligase par Vpr était nécessaire mais non suffisant pour l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2, suggérant ainsi que des événements additionnels seraient impliqués dans ce processus. À cet égard, nous apportons des preuves directes que Vpr détourne les fonctions de CRL4A(VprBP) pour induire la polyubiquitination de type K48 et la dégradation protéosomale de protéines cellulaires encore inconnues. Ces événements d’ubiquitination induits par Vpr ont été démontrés comme étant nécessaire à l’activation d’ATR. Finalement, nous montrons que Vpr forme des foyers ancrés à la chromatine co-localisant avec VprBP ainsi qu’avec des facteurs impliqués dans la réparation de l’ADN. La formation de ces foyers représente un événement essentiel et précoce dans l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2. Enfin, nous démontrons que Vpr est capable de recruter CRL4A(VprBP) au niveau de la chromatine et nous apportons des preuves indiquant que le substrat inconnu ciblé par Vpr est une protéine associée à la chromatine. Globalement, nos résultats révèlent certains des ménanismes par lesquels Vpr induit des perturbations du cycle cellulaire. En outre, cette étude contribue à notre compréhension de la modulation du système ubiquitine-protéasome par le VIH-1 et son implication fonctionnelle dans la manipulation de l’environnement cellulaire de l’hôte. / Human immunodeficiency virus 1 (HIV-1), the etiologic agent of AIDS, is a complex retrovirus with several accessory proteins. HIV-1 accessory proteins Nef, Vif, Vpr, and Vpu have been implicated in the modulation of viral replication, enhancement of viral fitness, immune evasion, and progression of AIDS pathogenesis. In that regard, viral protein R (Vpr) induces a cell cycle arrest in the G2 phase by activating the canonical ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-mediated DNA damage checkpoint, but cellular factors and mechanisms directly engaged in this process remain unknown. To identify novel Vpr-interacting cellular factors, we used tandem affinity purification (TAP) to isolate native Vpr-containing complexes. We found that Vpr hijacks a cellular E3 ubiquitin ligase complex, CRL4A(VprBP), composed of Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) and VprBP (Vpr-binding protein). Moreover, we observed that recruitment of the E3 ligase by Vpr was necessary but not sufficient for the induction of G2 cell cycle arrest, suggesting that additional events are involved. In this context, we provide direct evidence that Vpr usurps the function of CRL4A(VprBP) to induce the K48-linked polyubiquitination and proteasomal degradation of as-yet-unknown cellular proteins. These ubiquitination events mediated by Vpr were necessary for the activation of ATR. Moreover, we show that Vpr forms chromatin-associated foci that co-localize with VprBP and DNA repair factors. Our data indicate that formation of these foci represent a critical early event in the induction of G2 arrest. Finally, we show that Vpr is able to recruit CRL4A(VprBP) on chromatin and we provide evidence that the unknown substrate targeted by Vpr is a chromatin-associated protein. Overall, our results reveal some of the mechanisms by which Vpr induces cell cycle perturbations. Furthermore, this study contributes to our understanding of the modulation of the ubiquitin-proteasome system by HIV-1 and its functional implication in the manipulation of the host cellular environment.

Itch est la seule ligase de l'ubiquitine de type C2-WW-HECT capable d'interagir avec les protéines à domaine SH3. Ce domaine est particulièrement représenté parmi les protéines régulatrices de l'endocytose. Les travaux présentés ici visaient à examiner la capacité d'Itch à interagir avec plusieurs protéines endocytiques. Nous avons utilisé la technique du BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) pour examiner quelques protéines candidates. Nous avons ensuite confirmé les résultats obtenus par BRET avec des tests d'interaction in vitro, puis déterminé la capacité d'Itch à ubiquityler les protéines liées via leurs domaines SH3. Nous avons ainsi découvert deux nouveaux partenaires d'interaction et substrats d'Itch parmi les protéines endocytiques, amphyphisine et pacsine. De plus, Itch interagit avec les domaines SH3 isolés d'intersectine, mais pas avec la protéine complète, suggérant que cette dernière n'est pas un substrat d'Itch. Itch est donc bien positionnée pour exercer un rôle régulateur de l'endocytose en ubiquitylant ses substrats. / Itch is the only C2-WW-HECT type ubiquitin ligase that can bind SH3 domain proteins. This domain is particularly frequent in accessory endocytic proteins. We have used Bioluminescent Resonance Energy Transfer to examine a few candidate endocytic proteins, in addition to the already known substrate of Itch, endophilin. We then used standard in vitro techniques to confirm these interactions, and tested Itch capacity to ubiquitylate these putative substrate proteins. We thus discovered two new substrates of Itch, amphiphysin and pacsin. We also determined that although Itch interacts with the isolated SH3 domains of intersectin, it does not recognize the full length protein, thus rulling out Intersectin as a substrate of Itch. Itch is thus a putatively important regulator of endocytosis, through its capacity to recognize and ubiquitylate several SH3-domain proteins.

Les malformations du développement cortical (MDC) résultent d’altérations au niveau de différentes étapes de la corticogénèse telles que la prolifération, la migration et la différenciation neuronale et sont généralement associées à des épilepsies pharmaco-résistantes et à des déficiences intellectuelles sévères. Les causes génétiques des MDC restent encore inconnues dans de nombreux cas, nous avons donc réalisé le séquençage de l’exome entier de nombreux patients présentant des MDC et les analyses ont permis de mettre en évidence l’implication des gènes KIF2A et NEDD4L dans les MDC. Dans le cadre de ma thèse, nous proposons de focaliser sur les conséquences cellulaires et neurodéveloppementales résultant des mutations dans les gènes KIF2A et NEDD4L retrouvées chez les patients atteints de MDC. KIF2A code pour une kinésine-13 qui a pour fonction de réguler la dynamique des microtubules (MT) via son activité MT dépolymérase ATP-dépendante aux niveaux des extrémités des MT. L’approche basée sur la technique d’électroporation in utero nous a permis de mettre en évidence le rôle crucial joué par KIF2A dans la régulation de la neurogénèse, la migration neuronale et le positionnement des neurones dans le cortex. En particulier, nos données révèlent que l’expression des mutants KIF2A responsables de MDC entraîne une augmentation du nombre de cellules à l’état de progéniteurs qui est conséquente à un allongement du temps passé dans le cycle cellulaire. Nos premières données cellulaires et au cours du développement montrent que l’expression des mutants KIF2A induit des altérations dans l’intégrité du fuseau mitotique, dans la progression mitotique et également une localisation anormale de KIF2A au niveau du cil primaire. NEDD4L code pour une E3 ubiquitine ligase qui joue un rôle dans l’ubiquitination de nombreux substrats permettant la régulation de leur dégradation et de leur localisation subcellulaire. Dans un premier temps, nos données cellulaires ont montré que les mutants associées à des MDC ont une sensibilité accrue pour la dégradation par le protéasome. De plus, l’approche d’électroporation in utero a permis de montrer que l’expression des mutants NEDD4L ainsi qu’un excès de NEDD4L WT dérégulent la neurogenèse, le positionnement des neurones et le processus de translocation terminal. Des études complémentaires, incluant le traitement à la rapamycine, ont révélé qu’un excès de NEDD4L WT mène à la dérégulation des voies de signalisations mTORC1 et Dab1 tandis que l’expression des mutants est associée à une dérégulation des voies mTORC1 et Akt. L’ensemble de ces résultats renforce donc dans un premier temps l’importance des protéines liées aux MT dans le développement cortical en décrivant le rôle crucial de la kinésine KIF2A dans des mécanismes tels que la dynamique de migration neuronale et dans la régulation du cycle cellulaire des progéniteurs neuronaux. D’autre part, nous fournissons également de nouvelles données permettant de mieux comprendre le rôle critique de NEDD4L dans la régulation des voies mTOR et de leurs contributions dans le développement cortical. / Malformations of cortical development (MCD) result from alterations in different stages of corticogenesis such as proliferation, migration and neuronal differentiation, and are generally associated with drug-resistant epilepsy and severe intellectual disabilities. The genetics causes of MCD remain largely unknown, we have thus performed the whole-exome sequencing of many patients with MCD and reported the identification of multiple pathogenic missense mutations in KIF2A and NEDD4L genes. Within the frame of my thesis project, we propose to focus on the cellular and neurodevelopmental consequences resulting from KIF2A and NEDD4L mutations shown to be involved in MCD. KIF2A is a member of the kinesin-13 family, which rather than regulating cargos transport along microtubules (MT), regulates MT dynamics by depolymerizing MTs. The in utero electroporation approach allowed us to highlight the crucial role of KIF2A in the regulation neurogenesis, neuronal migration and the neuronal positioning in the cortex. Particularly, our data show that the expression of the KIF2A mutants involved in MDC lead to an increase in the number of cells in proliferative state which is a consequence of a prolonged time spent in the cell cycle. Our first cellular data and during development show that the expression of pathogenic KIF2A mutations induce alterations in the mitotic spindle integrity, in the mitotic progression and also an abnormal localization of KIF2A in the primary cilium. NEDD4L encodes a member of the NEDD4 family of HECT-type E3 ubiquitin ligases known to regulate the turnover and function of a number of proteins involved in fundamental cellular pathways and processes. Firstly, cellular and expression data showed sensitivity of MCD-associated mutants to proteasome degradation. Moreover, the in utero electroporation approach showed that PNH-related mutants and excess wild-type NEDD4L affect neurogenesis, neuronal positioning and terminal translocation. Further investigations, including rapamycin-based experiments, found differential deregulation of pathways involved. Excess wild-type NEDD4L leads to disruption of Dab1 and mTORC1 pathways, while MCD-related mutations are associated with deregulation of mTORC1 and AKT activities. Altogether, these results reinforce the importance of MT-related proteins in cortical development describing the crucial role of KIF2A kinesin in mechanisms such as neuronal migration dynamics and neuronal progenitor’s cell cycle regulation. On the other hand, we also provide new data to better understand the critical role of NEDD4L in the regulation of mTOR pathways and their contributions in cortical development.