Le maintien de la masse musculaire est étroitement lié à la balance entre la synthèse et la dégradation des protéines. L'exercice physique est un puissant régulateur de la balance protéique et plus particulièrement l'exercice en résistance. S'intéresser à la balance protéique après un exercice s'inscrit dans une compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant aux phénomènes d'hypertrophie et/ou d'atrophie musculaire. Nos travaux mettent en évidence que l'hypertrophie obtenue dans le muscle FDP après 10 semaines d'un entraînement en résistance chez le rat, est en lien avec l'activation chronique de la voie IL-6/STAT3 après chaque exercice aigu, en partie au sein du pool de cellules satellites activées. En phase proliférative, les cellules dont la voie de signalisation STAT1/STAT3 est activée, répriment l'expression des facteurs myogéniques comme MyoD et retournent ainsi à l'état quiescent, concourant à augmenter le pool de réserve. Ces mécanismes participent à la synthèse protéique par l'apport de nouveau matériel génétique au sein des fibres musculaires conduisant à une augmentation de leur surface de section ainsi qu'à leur conversion phénotypique avec l'entraînement. L'exercice en résistance favorisant la protéolyse, nos travaux ont cherché à caractériser les systèmes protéolytiques (autophagique-lysosomal, ubiquitine-protéasome) impliqués dans la balance protéique post-exercice. Les marqueurs moléculaires étudiés (activités enzymatiques du protéasome et de la cathepsine L, expression protéique et génique de LC3B, des E3 ligases…) ne permettent pas d'expliquer clairement les +30% de protéolyse obtenus une heure après des contractions excentriques sur muscle EDL isolé de rat en condition à jeun. Des perspectives d'étude des systèmes des calpaines, des caspases et/ou des métalloprotéases matricielles sont alors à envisager. / The maintain of muscle mass is closely controlled by protein synthesis and degradation balance. Physical activity and mainly resistance exercise is a powerful stimulus to positive muscle protein balance. To understand how protein balance is regulated after exercise, cellular and molecular mechanisms leading to muscular hypertrophy and/or atrophy have to be elucidated. Our works point out that FDP muscular hypertrophy after 10 weeks of resistance training in rat is partly due to the chronically activation of IL-6/STAT3 signaling pathway, occurring in the activated satellite cell pool, after each single exercise bout. Once activated and engaged in the myogenic program, cells in which STAT1/STAT3 signaling pathway is activated, could downregulate MyoD and return to a quiescent state, leading to increase satellite cell reserve's pool. These events participate to enhance protein synthesis by the incorporation of new genetic material into muscle fiber leading to increase their cross sectional area and phenotypic shift after training. As resistance exercise increases proteolysis, our works attempt to characterize the proteolysis systems (lysosomal-autophagic, ubiquitin-proteasome) involved in protein balance after exercise. The molecular markers measured ( chymotrypsin-like and cathepsin L activities, protein and gene expressions of LC3B, E3 ligases…) could not explain the +30% of proteolysis obtained one hour after resistance eccentric contractions on EDL muscle of starved rats. Further studies based on calpains, caspases and metalloproteinase activities and/or expressions should bring us valuable information.

Le facteur de transcription NF-κB régule l’expression d’une pléthore de gènes impliqués dans divers processus physiologiques notamment la prolifération et la survie cellulaires, l’inflammation ainsi que les réponses immunes. Il intervient également dans de nombreux processus pathologiques à l’exemple de certains cancers et maladies auto-immunes.L’activation de NF-κB suite à l’engagement de différents immunorécepteurs requiert la mise en place de larges signalosomes formés suite au recrutement de différents adaptateurs au niveau des immunorécepteurs engagés. Ces adaptateurs subissent des ubiquitinations non-dégradatives nécessaires pour la transduction du signal. Nous avons démontré dans un précédent travail que ces protéines ubiquitinylées s’accumulent au niveau de la membrane du réticulum endoplasmique (RE) via la protéine réticulaire Métadhérine (MTDH). De plus, nos résultats suggèrent que l’ubiquitination est un prérequis nécessaire à l’adressage de ces protéines au RE. Afin d’évaluer la contribution des E3 ubiquitine ligases en charge de relayer NF-κB au niveau des organites, nous avons effectué le crible d’une banque de siRNAs dirigés contre les 46 E3 ligases transmembranaires en utilisant comme modèle la signalisation du TNF récepteur. Ce crible nous a permis d’identifier l’E3 ligase RNF121 comme régulateur positif de NF-κB. Bien que le mécanisme d’action de RNF121 ne soit pas complètement élucidé, nos données suggèrent qu’il agirait au niveau de la régulation de l’inhibiteur de NF-κB « IκBα ».Durant la deuxième partie de cette thèse, je me suis intéressée à la dynamique mitochondriale. Les mitochondries sont des organites dynamiques, dont la forme est maintenue grâce à une balance entre deux processus antagonistes appelés : fission et fusion. Il a été rapporté qu’en présence de certains stress modérés, les mitochondries hyperfusent, ce processus est appelé SIMH (Stress-Induced Mitochondrial Hyperfusion). Nous avons pu démontrer que la SIMH s’accompagne de l’activation de la voie canonique du facteur de transcription NF-κB via l’E3 ubiquitine ligase mitochondriale MULAN. Nos résultats suggèrent que durant le SIMH, MULAN forme un complexe avec TRAF2 et module son ubiquitination. Ces résultats suggèrent que la mitochondrie, de part sa dynamique, convertie un signal de stress en un signal de survie via l’activation de NF-κB. Pris dans leur ensemble, nos résultats illustrent la complexité de la régulation de NF-κB par ubiquitination et attribuent aux organites un nouveau rôle dans la transduction de la signalisation. / The transcription factor NF-κB regulates the expression of several genes implicated in various physiological processes such as cell proliferation and survival, inflammation and immune responses. Dysregulation of its activation is involved in diverse pathologies such as cancer and auto-immune diseases. Following the engagement of immunoreceptors, NF-κB signaling requires a large signalosome assembly containing different adaptor proteins. These adaptors undergo poly-ubiquitinylation in a non-degradative manner, which is essential for signal transduction. We demonstrated in previous work that these ubiquitinylated proteins accumulate at the surface of the endoplasmic reticulum (ER) via a reticular protein called “Methaderin” (MTDH). Furthermore, our results suggest that ubiquitinylation is a necessary prerequisite for protein addressing to the ER. To evaluate the contribution of E3 ubiquitin ligases in this process we performed a screen of a siRNA bank, targeting the 46 human transmembrane E3 ligases, using the TNF receptor signaling as a model. This screen enabled the identification of RNF121, a Golgi E3 ligase, as a positive regulator of NF-κB. Although the mechanism by witch RNF121 acts is not yet elucidated, our data suggest that it acts on the regulation of NF-κB inhibitor (IκBα). In the second part of this thesis, we investigated mitochondrial dynamics. Mitochondria are dynamic organelles; their shape is maintained due to a balance between two antagonist processes called: fusion and fission. It is known that moderate stress triggers mitochondrial hyperfusion, this process is called: SIMH (Stress-Induced Mitochondrial Hyperfusion). During this thesis, we demonstrated that SIMH is accompanied by NF-κB activation through the mitochondrial E3 ubiquitin ligase MULAN. Our results suggest that during SIMH, MULAN forms a complex with the protein TRAF2 and modulates its ubiquitinylation to allow NF-κB signaling transduction. This work shows that, through their dynamics, mitochondria convert stress signals into a prosurvival response via NF-κB activation.In summary, our results illustrate the complexity of the ubiquitin-dependant regulation of NF-κB and attribute a new role in signaling transduction to the organelles.

La plupart des êtres vivants possèdent une horloge circadienne (période de 24heures). Elle leur permet notamment d’anticiper les changements quotidiens (lumière,température) imposés par la rotation de la terre et d’y adapter leur comportement et leurphysiologie. L’horloge est présente dans la plupart des cellules et repose sur deux boucles derégulation transcriptionnelle négative qui génèrent des oscillations d’ARNm des gènesd’horloge. Un délai entre l’accumulation des ARNm et celle des protéines assure lefonctionnement de la boucle de rétroaction. Ce délai est dû à des modifications posttraductionnellesdes protéines PERIOD et TIMELESS. Les oscillations protéiques sontnotamment contrôlées par leur phosphorylation, l’ubiquitination et la dégradation via leprotéasome. L’ubiquitine ligase SCFSlmb induit la dégradation circadienne de PER et de TIM.SCFJetlag contrôle la dégradation de TIM par la lumière, cette dernière intervenant dans lasynchronisation de l’oscillateur.Au cours de notre étude, nous avons identifié une nouvelle ubiquitine ligase, uncomplexe Cul-3, qui contrôle principalement la stabilité de TIM. Nos résultats indiquent queCul-3 contrôle surtout la stabilité de TIM peu phosphorylé, de façon indépendante de PER,tandis que Slmb contrôle principalement la stabilité de TIM phosphorylé. Nous proposons unmodèle dans l'oscillation de TIM régie par deux systèmes d'ubiquitination: Cul-3 pourretarder l'accumulation nocturne de la protéine, et Slmb pour précipiter sa disparition en finde nuit. / Most living organisms possess a circadian clock (24 hours period). This internal clockallows them to anticipate the daily changes (light, temperature) due to the rotation of theearth and consequently adapt their behavior and physiology. The molecular clock relies ontwo negative feedback loops that generate oscillations of the clock gene mRNA. A delaybetween the accumulation of the mRNAs and the proteins is required for the feedback loop,and is generated by post-translational modifications of PERIOD and TIMELESS. The proteinoscillations are controlled by their phosphorylation, ubiquitination and proteasomedependentdegradation. The ubiquitin ligase SCFSlmb induces the circadian degradation ofPER and TIM. SCFJetlag controls the light-dependent degradation of TIM, which is involved inthe resetting of the clock.In our study, we have identified Cul-3, as a new clock ubiquitin ligase that controlsTIM stability. Our results indicate that Cul-3 mostly controls the stability ofhypophosphorylated TIM, independently of PER, whereas SLMB controls the stability ofphosphorylated TIM. We propose a model where TIM oscillations are regulated by twoubiquitination process. Cul-3 delays the night accumulation of TIM, whereas Slmbprecipitates its degradation at the end of the night.

Le bon fonctionnement de notre organisme repose sur de nombreux réseaux de communication intercellulaires (neurotransmetteurs, hormones, facteurs de croissance, lymphokines, molécules d'adhésion, etc.) prolongés par les voies de signalisation intracellulaires. Les signaux moléculaires sont des ligands reconnus par des récepteurs exprimés à la surface des cellules cibles. La fixation du ligand à son récepteur déclenche des voies de signalisation intracellulaires qui commandent la réponse fonctionnelle. Mes travaux scientifiques m'ont conduit à étudier diverses voies de signalisation intracellulaires qui seront évoquées dans cette HDR avec une emphase particulière sur les études les plus récentes.<br />Les cellules de la réponse immune cellulaire, les lymphocytes T, reconnaissent leur antigène spécifique à l'aide d'un récepteur multi-protéique, le complexe TCR/CD3. Le contrôle de son expression de surface est essentiel car le nombre de récepteurs stimulés par l'antigène et la durée de cette interaction déterminent la réponse fonctionnelle. Au cours de ma thèse au Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, j'ai participé à l'étude des mécanismes qui contrôlent l'expression de surface du récepteur et son internalisation suite à l'interaction avec l'antigène. Ces travaux ont permis 1) de corroborer que l'expression de surface du complexe TCR/CD3 est dépendante de l'assemblage complet de toutes les sous-unités qui le composent, 2) et surtout d'aborder le lien entre voies de signalisation associées au complexe TCR/CD3 et son internalisation stimulées par la liaison d'un ligand spécifique.<br />Le récepteur aux poly-immunoglobulines (pIgR) exprimé à la surface des cellules épithéliales qui tapissent la cavité interne de nos organes transcytose les anticorps sécrétés dans le milieu basal vers le lumen. Ainsi, ce récepteur approvisionne-t-il continuellement les sécrétions mucosales en anticorps (pIgA et pIgM). La forte augmentation de la quantité d'anticorps produits en réponse à une infection nécessite un transport accru de ces anticorps vers les surfaces mucosales à protéger. Pendant mon stage post-doctoral à UCSF (University of California, San Francisco) j'ai contribué 1) à montrer que la liaison des pIgA au pIgR stimulait une voie de signalisation, 2) à décrire au niveau moléculaire le fonctionnement de cette voie de signalisation, 3) à montrer in vivo que cette voie de signalisation stimule fortement la transcytose des pIgAs.<br />Les épithéliums représentent une barrière à la pénétration d'agents pathogènes mais également une surface d'échange avec le milieu extérieur. Pour accomplir leurs fonctions les cellules épithéliales maintiennent un phénotype polarisé avec un coté orienté vers les tissus sous-jacents (pôle basal) et un autre tourné vers le milieu extérieur (pôle apical). Ces cellules doivent établir entre elles des contacts physiques pour maintenir la cohésion de l'ensemble du tissu qu'elles constituent. Les contacts cellulaires sont assurés par des molécules d'adhésion (E-cadhérine) qui se comportent comme des récepteurs couplés à des voies de signalisation transduisant notamment des signaux qui participent au maintien de la polarité épithéliale. Depuis mon arrivée à l'IPMC (Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire), j'ai mis au jour une nouvelle voie de signalisation associée aux molécules de E-cadhérine qui comprend un facteur d'échange (EFA6) et son substrat la petite protéine G Arf6. Cette voie de régulation contrôle notamment la mise en place de la structure moléculaire, appelée jonction étroite, qui régule les échanges paracellulaires de l'épithélium et contribue à la polarité épithéliale. EFA6, connecté à deux voies de signalisation qui agissent de façon coordonnée, participe à l'organisation du cytosquelette d'actine qui soutient la jonction étroite. Par ailleurs, nous avons trouvé que le niveau d'expression d'EFA6 est étroitement régulé pendant le développement de la polarité. Cette régulation post-traductionnelle est assurée par la machinerie de dégradation cytosolique appelée système ubiquitine-protéasome. Nous avons identifié certains acteurs de cette voie de régulation et commencé de montrer son importance pour le développement et le maintien de la polarité épithéliale. Les résultats les plus récents pointent vers un rôle de ces protéines dans les cancers épithéliaux qui se caractérisent toujours par une perte de la polarité cellulaire.

La protéine Rev du HIV-1 joue un rôle essentiel dans le cycle viral en permettant l'export vers le cytoplasme des ARNm viraux non ou partiellement épissés. Dans la perspective d'inhiber cette fonction, nous avons mis au point des peptides capables de reconnaître Rev et d'inhiber sa fonction, appelés SHPR (Sumo Heptapeptide Protein transduction domain for binding Rev). Nous avons établi que ces peptides sont capables de diffuser à travers les membranes plasmiques pour atteindre ensuite le noyau, où ils induisent la dégradation de la protéine virale, principalement par la voie du protéasome. Des expériences de mutagenèse ont précisé la contribution des différents domaines des SHPR dans l'action antivirale, et ont démontré que peu d'améliorations sont possibles pour optimiser leurs propriétés. Enfin, nous avons montré que Rev n'est pas régulée par sumoylation mais qu'elle peut être modifiée par addition d'une chaîne de polyubiquitine, qui stabilise la protéine mais module son activité

La plupart des êtres vivants possèdent une horloge circadienne (période de 24heures). Elle leur permet notamment d'anticiper les changements quotidiens (lumière,température) imposés par la rotation de la terre et d'y adapter leur comportement et leurphysiologie. L'horloge est présente dans la plupart des cellules et repose sur deux boucles derégulation transcriptionnelle négative qui génèrent des oscillations d'ARNm des gènesd'horloge. Un délai entre l'accumulation des ARNm et celle des protéines assure lefonctionnement de la boucle de rétroaction. Ce délai est dû à des modifications posttraductionnellesdes protéines PERIOD et TIMELESS. Les oscillations protéiques sontnotamment contrôlées par leur phosphorylation, l'ubiquitination et la dégradation via leprotéasome. L'ubiquitine ligase SCFSlmb induit la dégradation circadienne de PER et de TIM.SCFJetlag contrôle la dégradation de TIM par la lumière, cette dernière intervenant dans lasynchronisation de l'oscillateur.Au cours de notre étude, nous avons identifié une nouvelle ubiquitine ligase, uncomplexe Cul-3, qui contrôle principalement la stabilité de TIM. Nos résultats indiquent queCul-3 contrôle surtout la stabilité de TIM peu phosphorylé, de façon indépendante de PER,tandis que Slmb contrôle principalement la stabilité de TIM phosphorylé. Nous proposons unmodèle dans l'oscillation de TIM régie par deux systèmes d'ubiquitination: Cul-3 pourretarder l'accumulation nocturne de la protéine, et Slmb pour précipiter sa disparition en finde nuit.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), l’agent étiologique du SIDA, est un rétrovirus complexe arborant plusieurs protéines accessoires : Nef, Vif, Vpr, et Vpu. Celles-ci sont impliquées dans la modulation de la réplication virale, dans l’évasion immunitaire et dans la progression de la pathogenèse du SIDA. Dans ce contexte, il a été démontré que la protéine virale R (Vpr) induit un arrêt de cycle cellulaire en phase G2. Le mécanisme par lequel Vpr exerce cette fonction est l’activation, ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-dépendante, du point de contrôle de dommage à l’ADN, mais les facteurs et mécanismes moléculaires directement impliqués dans cette activité demeurent inconnus. Afin d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires interagissant avec Vpr, nous avons utilisé une purification d’affinité en tandem (TAP) pour isoler des complexes protéiques natifs contenant Vpr. Nous avons découvert que Vpr s’associait avec CRL4A(VprBP), un complexe cellulaire d’E3 ubiquitine ligase, comprenant les protéines Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) et VprBP (Vpr-binding protein). Nos études ont mis en évidence que le recrutement de la E3 ligase par Vpr était nécessaire mais non suffisant pour l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2, suggérant ainsi que des événements additionnels seraient impliqués dans ce processus. À cet égard, nous apportons des preuves directes que Vpr détourne les fonctions de CRL4A(VprBP) pour induire la polyubiquitination de type K48 et la dégradation protéosomale de protéines cellulaires encore inconnues. Ces événements d’ubiquitination induits par Vpr ont été démontrés comme étant nécessaire à l’activation d’ATR. Finalement, nous montrons que Vpr forme des foyers ancrés à la chromatine co-localisant avec VprBP ainsi qu’avec des facteurs impliqués dans la réparation de l’ADN. La formation de ces foyers représente un événement essentiel et précoce dans l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2. Enfin, nous démontrons que Vpr est capable de recruter CRL4A(VprBP) au niveau de la chromatine et nous apportons des preuves indiquant que le substrat inconnu ciblé par Vpr est une protéine associée à la chromatine. Globalement, nos résultats révèlent certains des ménanismes par lesquels Vpr induit des perturbations du cycle cellulaire. En outre, cette étude contribue à notre compréhension de la modulation du système ubiquitine-protéasome par le VIH-1 et son implication fonctionnelle dans la manipulation de l’environnement cellulaire de l’hôte. / Human immunodeficiency virus 1 (HIV-1), the etiologic agent of AIDS, is a complex retrovirus with several accessory proteins. HIV-1 accessory proteins Nef, Vif, Vpr, and Vpu have been implicated in the modulation of viral replication, enhancement of viral fitness, immune evasion, and progression of AIDS pathogenesis. In that regard, viral protein R (Vpr) induces a cell cycle arrest in the G2 phase by activating the canonical ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-mediated DNA damage checkpoint, but cellular factors and mechanisms directly engaged in this process remain unknown. To identify novel Vpr-interacting cellular factors, we used tandem affinity purification (TAP) to isolate native Vpr-containing complexes. We found that Vpr hijacks a cellular E3 ubiquitin ligase complex, CRL4A(VprBP), composed of Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) and VprBP (Vpr-binding protein). Moreover, we observed that recruitment of the E3 ligase by Vpr was necessary but not sufficient for the induction of G2 cell cycle arrest, suggesting that additional events are involved. In this context, we provide direct evidence that Vpr usurps the function of CRL4A(VprBP) to induce the K48-linked polyubiquitination and proteasomal degradation of as-yet-unknown cellular proteins. These ubiquitination events mediated by Vpr were necessary for the activation of ATR. Moreover, we show that Vpr forms chromatin-associated foci that co-localize with VprBP and DNA repair factors. Our data indicate that formation of these foci represent a critical early event in the induction of G2 arrest. Finally, we show that Vpr is able to recruit CRL4A(VprBP) on chromatin and we provide evidence that the unknown substrate targeted by Vpr is a chromatin-associated protein. Overall, our results reveal some of the mechanisms by which Vpr induces cell cycle perturbations. Furthermore, this study contributes to our understanding of the modulation of the ubiquitin-proteasome system by HIV-1 and its functional implication in the manipulation of the host cellular environment.

Itch est la seule ligase de l'ubiquitine de type C2-WW-HECT capable d'interagir avec les protéines à domaine SH3. Ce domaine est particulièrement représenté parmi les protéines régulatrices de l'endocytose. Les travaux présentés ici visaient à examiner la capacité d'Itch à interagir avec plusieurs protéines endocytiques. Nous avons utilisé la technique du BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) pour examiner quelques protéines candidates. Nous avons ensuite confirmé les résultats obtenus par BRET avec des tests d'interaction in vitro, puis déterminé la capacité d'Itch à ubiquityler les protéines liées via leurs domaines SH3. Nous avons ainsi découvert deux nouveaux partenaires d'interaction et substrats d'Itch parmi les protéines endocytiques, amphyphisine et pacsine. De plus, Itch interagit avec les domaines SH3 isolés d'intersectine, mais pas avec la protéine complète, suggérant que cette dernière n'est pas un substrat d'Itch. Itch est donc bien positionnée pour exercer un rôle régulateur de l'endocytose en ubiquitylant ses substrats. / Itch is the only C2-WW-HECT type ubiquitin ligase that can bind SH3 domain proteins. This domain is particularly frequent in accessory endocytic proteins. We have used Bioluminescent Resonance Energy Transfer to examine a few candidate endocytic proteins, in addition to the already known substrate of Itch, endophilin. We then used standard in vitro techniques to confirm these interactions, and tested Itch capacity to ubiquitylate these putative substrate proteins. We thus discovered two new substrates of Itch, amphiphysin and pacsin. We also determined that although Itch interacts with the isolated SH3 domains of intersectin, it does not recognize the full length protein, thus rulling out Intersectin as a substrate of Itch. Itch is thus a putatively important regulator of endocytosis, through its capacity to recognize and ubiquitylate several SH3-domain proteins.

Le virus de l’Herpès simplex de type 1 (HSV-1) est le pathogène humain responsable des lésions herpétiques labiales, plus communément appelé « feux sauvages ». Annuellement, il est responsable de plusieurs cas d’encéphalites et d’infections de l’appareil visuel qui sont la principale cause de cécité en Amérique du Nord. Bien qu’il existe quelques traitements antiviraux, aucun vaccin ou médicament ne permet de prévenir ou de guérir les infections causées par ce virus. Aujourd’hui, les infections produites par l’HSV-1 sont présentes partout sur la planète. Récemment, une étude en protéomique effectuée sur les virus matures extracellulaires a permis d’identifier la présence d’ubiquitines libres et d’enzymes reliées à la machinerie d’ubiquitination dans le virus. De plus, le virus exploite cette machinerie au cours de l’infection. Il est connu que certaines protéines virales sont ubiquitinées durant une infection et que le virus imite même certaines enzymes d’ubiquitination. Nous avons donc entrepris des recherches afin d’identifier des protéines virales ubiquitinées qui pourraient être présentes dans les virus matures ainsi que leurs rôles potentiels. La protéine majeure de la capside, VP5, un constituant très important du virus, a été identifiée. Nos recherches nous ont permis de caractériser le type d’ubiquitination, une monoubiquitination sur les lysines K810 et/ou K1275 de VP5. Le rôle que pourrait jouer l’ubiquitination de VP5 dans le cycle de réplication virale et dans les virus matures n’est toutefois pas encore connu. / Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is the human pathogen responsible for herpetic lesion such as cold sores. On a yearly basis, it is responsible for many cases of encephalitis and infections of the eye that are the most common cause of blindness in North America. Antiviral treatments exist, but no vaccines or drugs are able to prevent or cure the diseases caused by this virus. Today, infections caused by HSV-1 are present all around the world. Recently a proteomics approach was used to study mature extracellular viruses. This study highlighted the presence in the virus of free ubiquitin and ubiquitin related enzymes. Furthermore, the virus exploits this machinery during the course of infection. Also, it is known that certain virally encoded proteins are ubiquitinated and that the virus mimics some ubiquitin related enzymes. Our researches focused on identifying ubiquitinated viral proteins that could be present in mature extracellular viruses and their potential roles. The major capsid protein, VP5, an important virus component, was identified. We characterised the type of ubiquitination, a monoubiquitination of lysine K810 and/or K1275 of VP5. The role that could play the ubiquitination of VP5 in the viral cell cycle and in mature virions has yet to be identified.

Le VIH-1 a développé plusieurs mécanismes menant à la dégradation de son récepteur cellulaire, la molécule CD4, dans le but d’augmenter la relâche de particules virales infectieuses et d’éviter que la cellule soit surinfectée. L’un de ces mécanismes est la dégradation, induite par la protéine virale Vpu, du CD4 nouvellement synthétisé au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Vpu doit lier CD4 et recruter l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP, via sa liaison à β-TrCP, afin de dégrader CD4. Puisque CD4 doit être retenu au RE pour permettre à Vpu d’induire sa dégradation via le système ubiquitine-protéasome, il a été suggéré que ce processus implique un mécanisme semblable à une voie cellulaire de dégradation des protéines mal-repliées appelée ERAD (« endoplasmic reticulum-associated degradation »). La dégradation par ERAD implique généralement la dislocation des protéines du RE vers le cytoplasme afin de permettre leur poly-ubiquitination et leur dégradation par le protéasome. Nous avons démontré que Vpu induit la poly-ubiquitination de CD4 dans des cellules humaines. Nos résultats suggèrent aussi que CD4 doit subir une dislocation afin d’être dégradé par le protéasome en présence de Vpu. De plus, un mutant transdominant négatif de l’ATPase p97, qui est impliquée dans la dislocation des substrats ERAD, inhibe complètement la dégradation de CD4 par Vpu. Enfin, nos résultats ont montré que l’ubiquitination sur des résidus accepteurs de l’ubiquitine (lysines) de la queue cytoplasmique de CD4 n’était pas essentielle, mais que la mutation des lysines ralentit le processus de dégradation de CD4. Ce résultat suggère que l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 pourrait représenter un événement important dans le processus de dégradation induit par Vpu. L’attachement de l’ubiquitine a généralement lieu sur les lysines de la protéine ciblée. Toutefois, l’ubiquitination sur des résidus non-lysine (sérine, thréonine et cystéine) a aussi été démontrée. Nous avons démontré que la mutation de tous les sites potentiels d’ubiquitination cytoplasmiques de CD4 (K, C, S et T) inhibe la dégradation par Vpu. De plus, la présence de cystéines dans la queue cytoplasmique apparaît suffisante pour rendre CD4 sensible à Vpu en absence de lysine, sérine et thréonine. Afin d’expliquer ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 serait nécessaire à sa dégradation et où les sites d’ubiquitination de CD4 seraient sélectionnés de façon non spécifique par l’ubiquitine ligase recrutée par Vpu. Enfin, nous avons observé que la co-expression d’une protéine Vpu incapable de recruter β-TrCP (Vpu S52,56/D) semble stabiliser le CD4 qui est retenu au RE. De plus, d’autres mutants de Vpu qui semblent capables de recruter β-TrCP et CD4 sont toutefois incapables d’induire sa dégradation. Ces résultats suggèrent que l’association de Vpu à CD4 et β-TrCP est essentielle mais pas suffisante pour induire la dégradation de CD4. Par conséquent, ces résultats soulèvent la possibilité que Vpu puisse recruter d’autres facteurs cellulaires pour induire la dégradation de CD4. Les résultats présentés ont permis de mieux définir le mécanisme de dégradation de CD4 par Vpu dans des cellules humaines. De plus, ces résultats nous ont permis d’élaborer un modèle dans lequel l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP démontre de la flexibilité dans le choix des résidus à ubiquitiner afin d’induire la dégradation de CD4. Enfin, ces études jettent un oeil nouveau sur le rôle de Vpu dans ce processus puisque nos résultats suggèrent que Vpu doive recruter d’autres partenaires cellulaires, mis à part β-TrCP, pour induire la dégradation de CD4. / HIV-1 has developed many mechanisms leading to the down-regulation of its cellular receptor, the CD4 molecule, in order to increase the release of infectious viral particles and to inhibit superinfection of the target cell. One of these mechanisms is the HIV-1 Vpu-mediated degradation of newly synthesized CD4 at the level of endoplasmic reticulum (ER). Vpu must interact with CD4 and recruit the cellular ubiquitin ligase SCFβ-TrCP, via its binding to β-TrCP, in order to induce CD4 degradation. Because CD4 has to be retained in the ER to allow Vpu to induce its degradation via the ubiquitin-proteasome system, it has been suggested that this process involves a mechanism reminiscent of a cellular degradation pathway involved in the proteolysis of unfolded proteins called ERAD (endoplasmic reticulum-associated degradation). The ERAD degradation usually involves the dislocation of proteins from the ER to the cytoplasm in order to induce their poly-ubiquitination and subsequent degradation by the proteasome. We demonstrated that Vpu induces the poly-ubiquitination of CD4 in human cells. Our results also suggest that CD4 has to be dislocated in order to be degraded by the proteasome in presence of Vpu. Furthermore, the expression of a transdominant negative mutant of the ATPase p97, that is involved in the dislocation of ERAD substrates, inhibits completely the Vpu-mediated CD4 degradation process. Finally, our results demonstrated that the ubiquitination of putative ubiquitin acceptor residues (lysines) in the cytosolic tail of CD4 is not essential but the mutation of these lysines slowed down the process of CD4 degradation induced by Vpu. This results suggests that ubiquitination of CD4 cytosolic tail could represent an important step during Vpu-mediated CD4 degradation. Ubiquitin is usually attached on lysine residues in the targetted protein. However, the ubiquitination on non-lysine residues (S, T and C) has also been demonstrated. We demonstrated that the mutation of all cytosolic potential ubiquitination sites (K, C, S and T) of CD4 abolishes Vpu-mediated degradation. In addition, the presence of cysteines in the cytosolic tail of CD4 appeared sufficient to render CD4 sensitive to Vpu in absence of lysine, serine or threonine. In order to explain these results, we propose a model in which CD4 cytosolic tail ubiquitination is necessary for its degradation and where ubiquitination sites are selected non specifically by the ubiquitin ligase recruited by Vpu. Finally, we observed that co-expression of a phosphorylation mutant of Vpu unable to interact with β-TrCP (Vpu S52,56/D) appears to stabilize ER-retained CD4 molecules. In addition, other Vpu mutants seem able to recruit β-TrCP and CD4 without inducing CD4 degradation. These results suggest that Vpu association with CD4 and β-TrCP is essential but not sufficient for CD4 degradation. Consequently, these results raised the possibility that other cellular factors could be recruited by Vpu in order to induce CD4 degradation. The results presented here allowed us to better define the mechanism underlying Vpu-mediated CD4 degradation. In addition, these results allowed us to elaborate a model in which the ubiquitin ligase SCFβ-TrCP show some flexibility in the choice of ubiquitination sites in order to induce CD4 degradation. Finally, theses studies shed a new light on the role of Vpu in the CD4 degradation process because our results suggest that Vpu could recruit, in addition of β-TrCP, other cellular partners in order to induce CD4 degradation.