Le cycle cellulaire est finement régulé dans le temps et l'espace. Nous avons abordé les aspects dynamiques des interactions que la cycline A2 entretient avec ses partenaires Cdk1, Cdk2 et l'ubiquitine au cours du cycle cellulaire, dans des lignées cellulaires humaines. A cette fin, nous avons eu recours aux approches de FRET (Förster/fluorescence resonance energy transfer) et de FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy). Ceci nous a permis de montrer que les formes ubiquitinylées de la cycline A2 apparaissent principalement sous forme de foyers en prométaphase et se propagent ensuite à l'ensemble de la cellule. En outre, nous avons découvert que l'autophagie participe à la dégradation de cette cycline en mitose. Nous discutons les implications de ces observations quant à un rôle éventuel de la cycline A2 au moment de la formation de l'anneau de constriction, ainsi que de la participation de l'autophagie via cette cycline, dans la réponse aux dommages à l'ADN en mitose. / The cell cycle is finely regulated in time and space. We have studied the dynamical aspect of the interactions between cyclin A2 and its partners Cdk1, Cdk2 and ubiquitin during the cell cycle, in human cell lines. To this aim, we have used FRET (Förster/fluorescence resonance energy transfer) and FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy) techniques. We have thus shown that ubiquitylated forms of cyclin A2 are detected predominantly in foci in prometaphase, before spreading throughout the cell. Moreover, we have shown that autophagy contributes to cyclin A2 degradation in mitosis. We discuss the implications of these observations regarding a possible role of cyclin A2 when the cleavage furrow forms, and the participation of autophagy in DNA damage response in mitosis.

Afin d'améliorer l'efficacité des immunothérapies anti-tumorales, il est crucial de mieux comprendre les régulations cellulaires et moléculaires contrôlant l'initiation et le maintien d'une réponse immunitaire adaptative anti-tumorale. Dans ce contexte, l'équipe a identifié l'E3 ubiquitine ligase ASB2a (Ankyrin repeat-containing protein with a SOCS Box 2 alpha) comme un régulateur de la motilité des cellules hématopoïétiques via la polyubiquitination et la dégradation par le protéasome de la Filamine A. Mon projet de thèse visait à étudier si ASB2a joue un rôle dans la mise en place et/ou le maintien de la réponse immunitaire anti-tumorale. L'analyse des données de séquençage d'ARN issues des biopsies d'une cohorte de patients atteints de cancer colorectaux révèle que l'expression d'ASB2 est plus élevée dans les sous-types de mauvais pronostic et est inversement corrélée avec la survie des patients. Dans le but de déterminer s'il existe un lien fonctionnel entre l'expression d'ASB2 et la progression du cancer du côlon, nous avons utilisé un modèle de tumeurs coliques chez des souris invalidées de façon conditionnelle et inductible pour le gène ASB2 dans les cellules hématopoïétiques. Dans un premier temps, nous avons validé la pertinence de ce modèle d'invalidation en montrant qu'ASB2a était responsable des différents niveaux de Filamine A observés entre les différentes populations de cellules dendritiques conventionnelles de la rate. J'ai ensuite démontré que l'invalidation d'ASB2 réduit le développement des tumeurs coliques, résultats en accord avec la pathologie humaine. Ce phénotype est causé par l'activation d'une réponse immunitaire anti-tumorale adaptative de type 1 plus forte chez les souris invalidées pour ASB2. L'ensemble de ces travaux mettent en évidence le potentiel d'ASB2a comme cible thérapeutique innovante dans le traitement du cancer colorectal. / In order to enhance the efficiency of anti-tumor immunotherapies, it is crucial to better understand the cellular and molecular regulations sustaining the initiation and maintenance of an adaptive anti-tumor immune response. In this context, the team identified the E3 ubiquitin ligase ASB2a (Ankyrin repeat-containing protein with a SOCS Box 2 alpha) as a regulator of hematopoietic cell mobility through the polybiquitination and proteasomal degradation of the Filamin A. My thesis project aimed to study if ASB2a plays a role in the establishment and/or maintenance of the anti-tumor immune response. The analysis of RNA sequencing derived from the biopsy of colorectal cancer patients revealed that ASB2a expression is higher in the subtypes associated with poor prognosis and is inversely correlated with patient relapse-free survival. In order to determine whether there is a functional link between ASB2 expression and colon cancer progression, we used a colorectal cancer model applied to ASB2 knockout mice in hematopoietic cells. First, we validate the relevance of this knockout model by showing that ASB2a was responsible for the different levels of Filamin A observed between the different populations of spleen conventional dendritic cells. Then, I have shown that ASB2 invalidation reduces the development of colonic tumors, in accordance with human pathology. This phenotype is due to the activation of a stronger type 1 adaptive anti-tumor immune response in ASB2 knockout mice. This study highlight the potential of ASB2a as an innovative therapeutic target in the treatment of colorectal cancer.

L’apoptose ou mort cellulaire programmée joue un rôle prépondérant dans l’homéostasie cellulaire. Ce processus est très finement régulé par les protéines de la famille BCL-2 qui contrôlent la perméabilité de membrane mitochondriale externe et la libération du cytochrome c, deux événements majeurs précédant la mort cellulaire. Les protéines anti-apoptotiques de la famille BCL-2 contribuent à la tumorigenèse et sont impliquées dans la résistance des cancers aux molécules chimiothérapeutiques ; à ce titre, elles représentent des cibles importantes pour le développement de nouvelles thérapies. BCL2A1 est un membre anti-apoptotique de la famille BCL-2 impliqué dans la chimiorésistance de nombreuses tumeurs. La protéine BCL2A1 a pour caractéristique d’avoir une demi-vie courte due à sa dégradation constitutive par le système ubiquitine-protéasome. Ceci régule la stabilité et la fonction anti-apoptotique de BCL2A1 et représente un mécanisme suppresseur de tumeur majeur. Cependant, les enzymes qui contrôlent les modifications post-traductionnelles impliquées dans l’ubiquitination et la dégradation de BCL2A1 demeurent, à ce jour, inconnues. Dans la présente thèse, nous donnons un aperçu des acteurs et des mécanismes impliqués dans la régulation de l’ubiquitination de BCL2A1. Nous présentons des preuves que TRIM28 est une E3 ubiquitine-ligase pour BCL2A1. En effet, les protéines TRIM28 et BCL2A1 endogènes interagissent ensemble au niveau des mitochondries et la déplétion de TRIM28 diminue l’ubiquitination de BCL2A1. Nous montrons aussi que TRIM17 stabilise BCL2A1 en empêchant son interaction avec TRIM28 et son ubiquitination médiée par TRIM28, et que l’activité de GSK3 est impliquée dans l’inhibition de la dégradation de BCL2A1. Ainsi, BCL2A1 et son proche homologue MCL-1 sont régulés par des facteurs communs mais de façon opposé. Finalement, la surexpression de TRIM28 ou l’inactivation de TRIM17 diminue le niveau protéique de BCL2A1 et restaure la sensibilité des cellules de mélanomes aux thérapies utilisant des inhibiteurs de la kinase BRAF. Globalement, nos résultats décrivent un rhéostat moléculaire au sein duquel deux protéines de la famille TRIM régulent de façon antagoniste la stabilité de BCL2A1 et modulent ainsi la mort cellulaire. / Apoptosis or programmed cell death plays a crucial role in tissue homeostasis and is regulated by the Bcl-2 proteins, which control mitochondria membrane permeability and cytochrome c release, two events that precede cell demise. Anti-apoptotic Bcl-2 family members can contribute to tumorigenesis and cause resistance to anti-cancer regimens, therefore representing important targets for novel therapeutics. BCL2A1 is an anti-apoptotic member of the BCL-2 family that contributes to chemoresistance in a subset of tumors. BCL2A1 has a short half-life due to its constitutive processing by the ubiquitin-proteasome system. This constitutes a major tumor-suppressor mechanism regulating BCL2A1 function. However, the enzymes involved in the regulation of BCL2A1 protein stability are currently unknown. Here we provide the first insight into the regulation of BCL2A1 ubiquitination. We present evidence that TRIM28 is an E3 ubiquitin-ligase for BCL2A1. Indeed, endogenous TRIM28 and BCL2A1 bind to each other at the mitochondria and TRIM28 knock-down decreases BCL2A1 ubiquitination. We also show that TRIM17 stabilizes BCL2A1 by blocking TRIM28 from binding and ubiquitinating BCL2A1, and that GSK3 is involved in the phosphorylation-mediated inhibition of BCL2A1 degradation. BCL2A1 and its close relative MCL1 are thus regulated by common factors but with opposite outcome. Finally, overexpression of TRIM28 or knock-out of TRIM17 reduced BCLA1 protein levels and restored sensitivity of melanoma cells to BRAF-targeted therapy. Therefore, our data describe a molecular rheostat in which two proteins of the TRIM family antagonistically regulate BCL2A1 stability and modulate cell death.Sommaire

Les cellules sont constamment exposées à des stress « protéotoxiques » qui altèrent leurs protéines. Si les protéines endommagées ne sont pas réparées ou éliminées, elles peuvent former des agrégats toxiques pouvant conduire à l’émergence de plusieurs maladies, telle que les maladies neurodégénératives et le cancer. Pour éviter cette toxicité, les cellules ont développé plusieurs stratégies qui collaborent et communiquent afin d'assurer le contrôle de qualité des protéines et maintenir l’intégrité du protéome cellulaire. L’ensemble de ces stratégies forment le réseau de l’homéostasie protéique ou « protéostasie ». Ce réseau inclus les chaperonnes moléculaires, les systèmes protéolytiques (lysosomes, protéasomes) et des systèmes de séquestration des protéines endommagées. L’Ubiquitine et les protéines apparentées à l’Ubiquitine telle que SUMO et NEDD8, sont des effecteurs essentiels de ce réseau. Ces molécules modifient leurs substrats de façon covalente, grâce à l’action d’une cascade d’enzymes E1, E2 et E3. En principe, on considérait que chacune de ces voies employait sa propre cascade enzymatique pour la modification post-traductionnelle de ses substrats. L’Ubiquitination joue un rôle essentiel dans la réponse au stress cellulaire, surtout en assurant la dégradation protéasomique des protéines mal repliées. Récemment, notre laboratoire a trouvé que plusieurs stress protéotoxiques telle que l’inhibition du protéasome, un choc thermique et un stress oxydatif, causent une augmentation de NEDDylation. De manière remarquable, cette augmentation ne dépend pas de l’enzyme d’activation de NEDD8 NAE, mais plutôt de celle de l’Ubiquitine Ube1. De plus, elle se caractérise par la formation des chaînes poly-NEDD8 et des chaînes mixtes entre NEDD8 et Ubiquitine. Ce processus est réversible et une restauration cellulaire est obtenue une fois le stress atténué. Le but de notre projet est de caractériser la réponse de NEDD8 au stress cellulaire ou ce qu’on appelle « la NEDDylation atypique » en vue de comprendre son effet biologique pendant ces conditions. Nos résultats montrent que la NEDDylation atypique dépend des protéines de stress Hsp70/90 et qu’elle cible principalement les protéines nouvellement synthétisées et mal repliées. On montre que, suite à leur modification par NEDD8/Ubiquitin, ces protéines sont transloquées du cytosol au noyau, où elles sont dégradées par le protéasome. Cependant, des conditions de stress prolongé causent une atténuation de l’activité nucléaire des protéasomes 26S, ce qui provoque alors l’accumulation des protéines endommagées sous forme d’inclusions nucléaires. Ces dernières sont réversibles et peuvent être éliminées par le protéasome une fois le stress atténué. Afin d’identifier les cibles de NEDD8 dans des conditions de stress, nous avons développé une approche protéomique basée sur une stratégie de mutation ponctuelle (NEDD8R74K). Cette stratégie permet l’identification des sites spécifiques de NEDDylation au sein des protéines cibles. Cette approche en combinaison avec le SILAC a permis l’identification de NEDD8, Ubiquitine, SUMO-2 et les protéines ribosomiques en tant que principales cibles de NEDD8 en réponse au stress. Ce qui était plus intéressant est que, en appliquant l’étude protéomique SILAC, on a pu constater que le rôle essentiel de la NEDDylation atypique est d’induire l’agrégation/séquestration d’un ensemble spécifique de protéines au sein des inclusions nucléaires. De plus, nous avons montré que l’agrégation induite par NEDD8 protège les protéasomes nucléaires d’une sévère déficience et permet une meilleure survie cellulaire pendant le stress. Notre étude présente NEDD8 comme un nouvel effecteur dans le réseau de protéostasie, elle identifie une nouvelle inclusion nucléaire cytoprotectrice et montre que la NEDDylation atypique est essentielle pour la réponse cellulaire au stress. / Cells are continuously endangered by a variety of proteotoxic stresses that cause protein misfolding and accumulation. Defects in repair or elimination of protein damage can lead to the formation of toxic aggregates that have been associated with diseases, such as neurodegenerative disorders and cancer. To prevent this toxicity, cells have evolved multiple quality control processes that interact and cooperate to maintain protein homeostasis leading to cellular fitness. These processes form “the proteostasis network”, and include molecular chaperones, proteolytic machineries (lysosomes, proteasomes) and pathways for protein damage sequestration. One of the main effectors of this network is the Ubiquitin and the Ubiquitin-like molecules, such as SUMO and NEDD8. These molecules covalently modify proteins through the action of E1, E2 and E3 enzymes. Historically, it was believed that each pathway employed its own and unique set of enzymes to post-translationally modify its substrates. Ubiquitination is essential for the cellular response to stress, especially by targeting misfolded proteins for proteasomal degradation. However, we recently discovered that proteotoxic stresses including proteasome inhibition, heat shock and oxidative stress induce a global increase in protein NEDDylation. Surprisingly, this increase does not depend on the NEDD8 activating enzyme NAE, but rather on the Ubiquitin activating enzyme Ube1, and is characterized by the formation of poly-NEDD8 chains and mixed chains between NEDD8 and Ubiquitin. Importantly, this process is reversible and cell recovery is accomplished once stress is alleviated. In this study, we focused on characterizing the NEDD8 response to stress or “atypical NEDDylation” in order to understand its biological relevance under these conditions.Our results showed that atypical NEDDylation depends on Hsp70/90 and targets mainly newly synthesized damaged proteins. We showed that, after their NEDDylation/Ubiquitination, misfolded proteins are progressively translocated from the cytosol into the nucleus for proteasomal degradation. However, upon prolonged stress conditions, the activity of nuclear 26S proteasome is compromised, resulting in the accumulation of these conjugates into nuclear inclusions. These inclusions are reversible and eliminated by nuclear proteasomes once stress is alleviated. In order to identify NEDD8 targets upon these conditions, we developed a proteomic approach based on a point mutation strategy (NEDD8R74K) that enables a site-specific analysis of NEDDylated proteins. This approach in combination with SILAC allowed the identification of NEDD8, Ubiquitin, SUMO-2, and ribosomal proteins as the major NEDD8 targets upon stress. Interestingly, by SILAC proteomics we found that the main function of atypical NEDDylation is to induce the aggregation/sequestration of a specific subset of proteins within the nuclear inclusions. We showed that this NEDD8-induced aggregation protects nuclear proteasomes from a severe impairment and allows a better cell survival upon proteotoxic stress.Our study defines NEDD8 as a new effector in the proteostasis network, identifies a new cytoprotective nuclear inclusion and shows that atypical NEDDylation is essential for the cellular response to stress.

Ce travail décrit un criblage systématique du système ubiquitine-protéasome (UPS) basé sur une organisation en cascade. Nous avons évalué l’effet de l’inhibition par ARN interférent de composants individuels d’UPS sur la viabilité de cellules cancéreuses de la prostate, avec un accent particulier sur les cellules TMPRSS:ERG-positive (VCaP), comme un modèle de phénotype prévalent du cancer. Sept gènes ont été identifiés comme étant particulièrement importants pour le fonctionnement des cellules cancéreuses de la prostate. Parmi eux, le gène-candidat le plus prometteur était UBE2U. Cette thèse met en évidence l’implication d’UBE2U dans la carcinogénèse de la prostate et décrit les premières caractérisations d’UBE2U comme une cible thérapeutique potentielle.La prévalence des composants de la voie CRL/NEDD8 parmi les hits (4 sur 7) suggère que la neddylation est importante dans la biologie des cellules cancéreuses de la prostate. Deux de ces gènes, CUL2 et RBX1, n’ont des effets spécifiques que dans des cellules TMPRSS2:ERG-positives, et, donc, sont potentiellement ERG-dépendantes. Nous avons également révélé un rôle crucial du facteur d’échange de CRL (CAND1), en particulier lorsque la neddylation est compromise. L’inhibition de CAND1 induit l’apoptose dans des cellules VCaP, qui est renforcé par l’inhibiteur spécifique de la neddylation MLN4924. CAND1 est donc une nouvelle cible thérapeutique potentielle. Par ailleurs, nous avons démontré que l’inhibition de la voie CRL/NEDD8 dans les cellules cancéreuses de prostate a des conséquences qui dépendent fortement du contexte cellulaire. L’inhibiteur MLN4924 induit l’apoptose dans toutes les lignées cellulaires testées, bien que les cellules TMPRSS2:ERG-positives se soient révélées significativement plus résistantes. Nous avons démontré que la résistance accrue des cellules VCaP reflète la plasticité des cellules cancéreuses régulée par un réseau d’interactions ERG:NF-kB:c-Myc:Wnt/β-cat:AR. L’inhibition partielle de la neddylation enclenche une reprogrammation transcriptionnelle de cellules VCaP, amenant à la quiescence des cellules et à l’inhibition de l’apoptose dépendant de la prolifération. Cet effet est le résultat de la réactivation du programme AR. Nous avons conclus que la voie CRL/NEDD8 régule le réseau transcriptionnel qui contrôle la plasticité des cellules cancéreuses. Ces résultats peuvent aider à trouver des traitements plus efficaces de cancers TMPRSS2:ERG-positifs.Finalement, nous avons observé que l’inhibition de la neddylation modifie les propriétés de la membrane et la morphologie des cellules VCaP. Cet effet est accompagné par des changements du taux et de la localisation de plusieurs protéines associées à la membrane, y compris l’occludine, la N-cadherine, la paxilline and FAK. Nous en avons conclus que la voie CRL/NEDD8 pourrait être impliquée dans le tri/trafic des protéines membranaires. Cette partie du projet nécessite de plus amples études, étant donné que la compréhension des mécanismes sous-jacents est importante et peut mettre à jour un nouveau rôle de la voie CRL/NEDD8 dans la régulation des fonctions cellulaires.Conclusion générales :1. Nous avons caractérisé l’implication de tous les composants E1-E2 d’UPS dans la régulation de la viabilité des cellules cancéreuses de prostate (avec cinq différentes lignées cellulaires).2. Nos travaux ont mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement du cancer, telles qu’UBE2U et CAND1.3. Nous avons démontré le rôle de la voie CRL/NEDD8 dans la régulation de la plasticité et de la morphologie des cellules cancéreuses. / In this work we describe a systematic approach for screening of ubiquitin-proteasome system (UPS) based on cascade organization. We have evaluated the effect of RNAi knockdown of individual UPS components on viability of PCa cells with major focus on TMPRSS:ERG-positive cell line, VCaP, as a model of prevalent phenotype of prostate cancer. Seven genes have been identified to be particularly important for the functioning of PCa cells. Among them, UBE2U was the strongest hit. This thesis provides the first evidence for UBE2U involvement in prostate carcinogenesis and describes initial characterization of UBE2U as a potential drug-target.The prevalence of the components of CRL/NEDD8 pathway in the hits (four out of seven) suggested the importance of neddylation for PCa biology. Two of these hits, CUL2 and RBX1, being specific to TMPRSS2:ERG-positive cells, are potentially ERG-dependent. We have also revealed the crucial role of CRL-exchange factor CAND1, in particular, when the neddylation is compromised. Knockdown of CAND1 induces apoptosis in VCaP cells that is further potentiated by neddylation-specific inhibitor MLN4924. CAND1 is, therefore, a novel potential drug target. Furthermore, we have demonstrated that the inhibition of CRL/NEDD8 pathway in prostate cancer cells has a complex outcome that strongly depends on cellular context. MLN4924 inhibitor induced apoptosis in all tested cell lines, though TMPRSS2:ERG positive cells were significantly more resistant. We have demonstrated that the increased resistance of VCaP cells reflects the plasticity of cancer cells ensured by sophisticated interaction network ERG:NF-kB:c-Myc:Wnt/β-cat:AR. We found that partial inhibition of neddylation triggered transcriptional reprogramming of VCaP cells leading to cell quiescence and inhibition of proliferation-dependent apoptosis. This was a result of re-activation of AR program and induction of differentiation-like state. We conclude that CRL/NEDD8 pathway regulates cancer transcriptional network that underlies cancer cells plasticity. This knowledge would help to find better treatments for TMPRSS2:ERG-positive cancers.Finally, we observed that neddylation inhibition changed membrane properties and morphology of VCaP cells. This was accompanied by dose-dependent changes in the level and the localization of several membrane-associated proteins, including occludin, N-cadherin, paxillin and FAK. We thus conclude that CRL/NEDD8 pathway might be involved in sorting/trafficking of membrane proteins. This part of the work requires further investigation, as understanding of the underlying mechanisms is of general importance and may uncover a new role of CRL/NEDD8 pathway in regulation of cellular functions.General conclusions:1. We have obtained a comprehensive dataset on the involvement of all human E1-E2 UPS components in the regulation of viability of PCa cells, represented by five different cell lines.2. Our work has revealed new potential drug targets for PCa treatment: UBE2U and CAND1.3. We have demonstrated the role of CRL/NEDD8 pathway in the regulation of cancer cell plasticity and morphology.

L'ARN interférence est un mécanisme moléculaire conservé chez les Eucaryotes dont les principaux acteurs sont les protéines ARGONAUTE (AGO). Chez les plantes, AGO1 est une protéine essentielle à la croissance et la défense antivirale. Elle utilise des petits ARNs comme sondes pour reconnaître et réguler des ARN messagers. Les virus ont développé des suppresseurs de l'ARN interférence pour surmonter cette défense. L'un d'entre eux, P0 du virus de la mosaïque jaune du navet, est comme une protéine F-box qui détourne le complexe SCF, une ubiquitine ligase E3, et conduit AGO1 vers la protéolyse ubiquitine-dépendante. Cette dégradation utilise la vacuole au lieu du protéasome 26S, généralement associé à la dégradation ubiquitine-dépendante. Ce mécanisme de protéolyse n'est pas compris et est aussi apparent quand AGO1 est déstabilisé de manière endogène, suggérant que P0 utilise une voie déjà existante. Une protéine F-box d'Arabidopsis, FBW2, a été décrite comme impactant l'homéostasie d'AGO1 indépendamment du protéasome. Mon projet de thèse visait à caractériser l'activité F-box de FBW2 et à comprendre la relation entre AGO1 et FBW2 ainsi que ses conséquences sur l'ARN interférence. Les résultats obtenus dans ce manuscrit montrent que le complexe SCFFBW2 interagit avec AGO1 et déclenche sa dégradation via un processus indépendant de l'autophagie ou du protéasome, tout en n'affectant que faiblement l'ARN interférence. FBW2 ciblerait en fait un sous-ensemble de protéines AGO1 qui semble ne pas contenir de petits ARNs. Cette régulation jouerait un rôle de surveillance pour prévenir une activité délétère d'AGO1 en absence de petits ARNs. / RNA silencing is a conserved molecular mechanism in eukaryotes, of which the main effectors are the ARGONAUTE (AGO) proteins. In plants, AGO1 is a protein that is essential for growth and antiviral defence. It uses small RNAs as probe to recognize and regulate messenger RNAs. Viruses have developed suppressors of RNA silencing to overcome this defence. One of these, P0 from the Turnip Yellows Virus, acts as an F-box protein to hijack the SCF complex, an E3 ubiquitin ligase, and guide AGO1 to the ubiquitin-dependent proteolysis. This degradation uses the vacuole instead of the 26S proteasome, generally associated with ubiquitin-dependant proteolysis. This proteolysis mechanism is not understood and is also apparent when AGO1 is endogenously destabilized, suggesting that P0 uses an already existing pathway. An Arabidopsis F-box protein, FBW2, has been shown to impact AGO1 homeostasis independently from the proteasome. My PhD project aimed at characterizing FBW2 F-box activity and understanding the relationship between AGO1 and FBW2, as well as its consequences on the RNA silencing. The results obtained in this manuscript show that the SCFFBW2 interacts with AGO1 and triggers its degradation through an autophagy- and proteasome- independent process, while only weakly affecting the RNA silencing. FBW2 would actually target a subset of AGO1 proteins, which appears not to contain small RNAs. This regulation would play a surveillance role in order to prevent a deleterious activity of AGO1 in absence of small RNAs.

L'histone déacétylase HDAC6 est une enzyme multifonctionnelle possédant deux domaines déacétylases en tandem et un domaine fixant l'ubiquitine. Localisée exclusivement dans le cytoplasme, cette protéine peut déacétyler les microtubules acétylés et participer à la prise en charge des protéines ubiquitinées lors de la formation d'agrésomes. Elle possède également une activité sur d'autres substrats comme les histones ou HSP90, et elle contribue à divers processus cellulaires. Le travail présenté dans cette thèse décrit un rôle supplémentaire de cette déacétylase dans la réponse après un stress. Il vise à comprendre comment HDAC6 participe dans les mécanismes d'activation des gènes HSPs, et dans les processus de récupération cellulaire à la suite d'un choc thermique. La découverte d'un nouveau domaine nommé SE14 chez la protéine HDAC6 humaine, présente un dispositif supplémentaire de régulation nucléocytoplasmique pour cette protéine. Ce domaine permet la rétention dans le cytoplasme de cette protéine en renforçant le mécanisme d'export nucléaire. A coté de ce contrôle, le fonctionnement des deux domaines déacétylases est analysé. Des expériences in vitro et in vivo confirment l'importance de l'arrangement spatial des deux domaines dans la réaction de déacétylation. Finalement, ce travail montre que la protéine HDAC6 intervient lors de la différenciation ostéoclastique. Par son activité catalytique sur les microtubules acétylés et grâce à son interaction avec l'effecteur mDIA2, cette déacétylase est impliquée dans la maturation des ostéoclastes.

La dérégulation des facteurs NF-κB, impliqués dans la survie cellulaire et l'inflammation, peut entraîner des pathologies inflammatoires chroniques et des cancers. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse était d'identifier des régulateurs négatifs des voies NF-κB conservées au cours de l'évolution, Toll et Imd, chez la drosophile. De nombreux éléments de ces voies sont régulés par ubiquitination. Les « Ubiquitine Specific Proteases » (USPs) constituent ainsi un nouveau champ d'investigation pour rechercher des régulateurs de ces voies. J'ai réalisé le crible d'une collection d'ARN interférents permettant l'inactivation des 21 USPs de drosophile en cellules S2. Ce crible a mis en évidence trois régulateurs négatifs de la voie Imd, dont un montre également une activité sur la voie Toll. Parmi ces candidats, dUSP36, un homologue de la protéine humaine USP36, avait été préalablement sélectionné par un crible génétique au laboratoire. Des études de l'équipe auxquelles j'ai contribué, montrent son rôle in vivo dans la régulation négative de la protéine adaptatrice Imd via son activité catalytique. Afin de caractériser la fonction des deux autres USPs, j'ai mené des expériences de transgénèse chez la drosophile qui prouvent que ces deux USPs répriment la voie Imd en cas d'infection et qu'elles sont requises pour maintenir l'état inactif de la voie Imd en l'absence d'infection. J'ai également entrepris de caractériser l'activité catalytique des deux USPs in vitro. L'originalité de mon travail a consisté à limiter le crible à une famille de gènes, ce qui a permis de détecter de nouveaux régulateurs qui n'avaient pas été mis en évidence dans des cribles antérieurs.

Les maladies neurodégénératives telles que les maladies de Huntington, de Parkinson et d'Alzheimer ont la caractéristique commune de présenter des agrégats de protéines spécifiques dans les neurones des patients atteints par ces pathologies. Le mécanisme par lequel ces structures se forment est encore inconnu. L'objectif de ce travail a consisté en l'étude du mécanisme d'agrégation des protéines à expansion de polyglutamine. Nous avons découvert que l'environnement cellulaire joue un rôle critique dans la capacité à s'agréger des protéines à expansion de polyglutamine (Rousseau et al., 2004). Ce travail suggère l'existence de modulateurs de l'agrégation des protéines à expansion de polyglutamine. En cherchant des modulateurs d'agrégation nous avons découvert que les sous unités chaperons du protéasome 19S, Rpt6 et Rpt4, augmentent l'agrégation de la protéine Huntingtine dans les cellules, alors que la réduction du niveau de Rpt6 par ARN interférence diminue la quantité de Huntingtine agrégée. Si la Huntingtine mutante est adressée au protéasome de manière ubiquitine indépendante, elle est très facilement dégradée. L'agrégation des protéines Huntingtine mutante n'est pas la conséquence d'une inhibition de l'activité protéolytique du protéasome mais fait suite à un découplage entre l'activité de dépliement médiée par le protéasome 19S et l'activité protéolytique du protéasome 20S. Ces travaux révèlent le rôle clef de l'environnement cellulaire et particulièrement du protéasome 19S dans le mécanisme d'agrégation des protéines à expansion de polyglutamine.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal