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Thesis (M.S.)--University of Wisconsin -- La Crosse, 1976. / Includes bibliographical references (leaves 28-30).

O conhecimento sobre a história evolutiva de uma espécie é essencial para obter insights sobre processos que contribuíram para os padrões atuais de distribuição e diversidade dessa espécie. Entender a evolução de uma espécie envolve a compreensão de sua história demográfica, estruturação populacional e também os mecanismos envolvidos na adaptação local. Neste contexto, os avanços em genômica e tecnologia de sequenciamento de DNA estão revolucionando o entendimento da história evolutiva das espécies, pois possibilitam o desenvolvimento de plataformas de genotipagem de alto rendimento, facilitando o uso de análises multilocus para identificar as regiões genômicas responsáveis pela adaptação local e trazendo uma visão detalhada sobre a história demográfica e a estrutura de populações. Além disso, estes dados permitem a identificação de loci responsáveis ou associados com adaptações locais e compreender as estratégias de adaptação que possibilitam algumas plantas sobreviverem em diferentes condições ambientais. Eugenia uniflora L. é uma espécie pertencente à família Myrtaceae e que apresenta uma ampla distribuição ao longo dos domínios da Floresta Atlântica (DFA). Popularmente conhecida como pitanga ou cereja-brasileira, E. uniflora é bastante versátil e cresce em vários habitats diferentes, ocorrendo como um arbusto ou árvore pequena em ambientes arenosos de restinga na planície costeira, próximo ao oceano e também no sul do Brasil apresenta-se como árvore, em ambientes de mata ciliar. Essas características, aliadas ao fato de que esta espécie seja uma das espécies-chave presentes em diferentes regiões fitogeográficas que integram a DFA, fazem com que ela seja um excelente modelo para estudos de variação adaptativa. Dessa forma, a presente dissertação teve como objetivo o estudo da variação genética adaptativa em populações naturais de E. uniflora. Para isso, foram selecionados 30 genes candidatos envolvidos em diferentes vias de sinalização com as respostas ao estresse abiótico, através da análise do transcriptoma da folha de E. uniflora. As sequências desses genes foram amplificadas por PCR em 96 indivíduos provenientes de populações de ambientes contrastantes. Os fragmentos amplificados foram submetidos ao sequenciamento usando plataforma de Sequenciamento de Nova Geração para a identificação e genotipagem de marcadores SNPs (Single Nucleotide Polimorphism). Após a análise do sequenciamento, um total de 381 SNPs, distribuídos em 16 genes foram identificados e genotipados em 84 indivíduos. A análise de FST outlier revelou dois loci sob seleção positiva, um no gene que codifica uma dehidrina e outro no gene que codifica uma Lea14-A, genes estes previamente reportados estarem envolvidos com estresse de resposta à seca em plantas. / The knowledge about the evolutionary history of a species is essential to gain insight into processes that contributed to the current patterns of distribution and diversity of this species. It involves the understanding of demographic history, population structure and also the mechanisms involved in local adaptation. In this context, advances in genomics and DNA sequencing technology are revolutionizing the understanding of the evolutionary history of the species, as they allow the development of high-throughput genotyping platforms, facilitating the use of multilocus analysis to identify genomic regions responsible for local adaptation. It also gives detailed insight into the demographic history and population structure. Furthermore, these data allow the identification of loci responsible for or associated with local adaptations and comprises adaptation strategies that enable some plants to survive in different environmental conditions. Eugenia uniflora L. is a species belonging to Myrtaceae family, wide distributed over the Atlantic Forest Domain (AFD). Popularly known as Pitanga or Brazilian-cherry, it is quite versatile and grows in distinct habitats, occurring as a shrub or small tree in sandy environments (Restinga) on the coastal plain near the ocean and as a tree in southern Brazil (riparian forest). These characteristics, combined with the fact that this species is one of the key species present in different phytogeographic regions of the AFD, make this species an excellent model for studies of adaptation. Thus, the present work aims to study the adaptive genetic variation in natural populations of E. uniflora. For this, we selected 30 candidate genes involved in different signaling pathways with the responses to abiotic stress by transcriptome analysis of E. uniflora. The sequences of these genes were amplified by PCR in 96 individuals from populations of different environments. The amplified fragments were subjected to sequencing using Next Generation Sequencing platform for the identification and genotyping of SNP markers (Single Nucleotide Polymorphism). After sequencing analysis, a total of 381 SNPs spread on 16 genes were identified and genotyped in 84 individuals. The FST outlier analysis revealed two loci under positive selection, one present in a gene encoding a dehydrin and another in a gene encoding a Lea14-A. These two genes were previously reported to be involved in drought stress response in plants.

O conhecimento sobre a história evolutiva de uma espécie é essencial para obter insights sobre processos que contribuíram para os padrões atuais de distribuição e diversidade dessa espécie. Entender a evolução de uma espécie envolve a compreensão de sua história demográfica, estruturação populacional e também os mecanismos envolvidos na adaptação local. Neste contexto, os avanços em genômica e tecnologia de sequenciamento de DNA estão revolucionando o entendimento da história evolutiva das espécies, pois possibilitam o desenvolvimento de plataformas de genotipagem de alto rendimento, facilitando o uso de análises multilocus para identificar as regiões genômicas responsáveis pela adaptação local e trazendo uma visão detalhada sobre a história demográfica e a estrutura de populações. Além disso, estes dados permitem a identificação de loci responsáveis ou associados com adaptações locais e compreender as estratégias de adaptação que possibilitam algumas plantas sobreviverem em diferentes condições ambientais. Eugenia uniflora L. é uma espécie pertencente à família Myrtaceae e que apresenta uma ampla distribuição ao longo dos domínios da Floresta Atlântica (DFA). Popularmente conhecida como pitanga ou cereja-brasileira, E. uniflora é bastante versátil e cresce em vários habitats diferentes, ocorrendo como um arbusto ou árvore pequena em ambientes arenosos de restinga na planície costeira, próximo ao oceano e também no sul do Brasil apresenta-se como árvore, em ambientes de mata ciliar. Essas características, aliadas ao fato de que esta espécie seja uma das espécies-chave presentes em diferentes regiões fitogeográficas que integram a DFA, fazem com que ela seja um excelente modelo para estudos de variação adaptativa. Dessa forma, a presente dissertação teve como objetivo o estudo da variação genética adaptativa em populações naturais de E. uniflora. Para isso, foram selecionados 30 genes candidatos envolvidos em diferentes vias de sinalização com as respostas ao estresse abiótico, através da análise do transcriptoma da folha de E. uniflora. As sequências desses genes foram amplificadas por PCR em 96 indivíduos provenientes de populações de ambientes contrastantes. Os fragmentos amplificados foram submetidos ao sequenciamento usando plataforma de Sequenciamento de Nova Geração para a identificação e genotipagem de marcadores SNPs (Single Nucleotide Polimorphism). Após a análise do sequenciamento, um total de 381 SNPs, distribuídos em 16 genes foram identificados e genotipados em 84 indivíduos. A análise de FST outlier revelou dois loci sob seleção positiva, um no gene que codifica uma dehidrina e outro no gene que codifica uma Lea14-A, genes estes previamente reportados estarem envolvidos com estresse de resposta à seca em plantas. / The knowledge about the evolutionary history of a species is essential to gain insight into processes that contributed to the current patterns of distribution and diversity of this species. It involves the understanding of demographic history, population structure and also the mechanisms involved in local adaptation. In this context, advances in genomics and DNA sequencing technology are revolutionizing the understanding of the evolutionary history of the species, as they allow the development of high-throughput genotyping platforms, facilitating the use of multilocus analysis to identify genomic regions responsible for local adaptation. It also gives detailed insight into the demographic history and population structure. Furthermore, these data allow the identification of loci responsible for or associated with local adaptations and comprises adaptation strategies that enable some plants to survive in different environmental conditions. Eugenia uniflora L. is a species belonging to Myrtaceae family, wide distributed over the Atlantic Forest Domain (AFD). Popularly known as Pitanga or Brazilian-cherry, it is quite versatile and grows in distinct habitats, occurring as a shrub or small tree in sandy environments (Restinga) on the coastal plain near the ocean and as a tree in southern Brazil (riparian forest). These characteristics, combined with the fact that this species is one of the key species present in different phytogeographic regions of the AFD, make this species an excellent model for studies of adaptation. Thus, the present work aims to study the adaptive genetic variation in natural populations of E. uniflora. For this, we selected 30 candidate genes involved in different signaling pathways with the responses to abiotic stress by transcriptome analysis of E. uniflora. The sequences of these genes were amplified by PCR in 96 individuals from populations of different environments. The amplified fragments were subjected to sequencing using Next Generation Sequencing platform for the identification and genotyping of SNP markers (Single Nucleotide Polymorphism). After sequencing analysis, a total of 381 SNPs spread on 16 genes were identified and genotyped in 84 individuals. The FST outlier analysis revealed two loci under positive selection, one present in a gene encoding a dehydrin and another in a gene encoding a Lea14-A. These two genes were previously reported to be involved in drought stress response in plants.

O conhecimento sobre a história evolutiva de uma espécie é essencial para obter insights sobre processos que contribuíram para os padrões atuais de distribuição e diversidade dessa espécie. Entender a evolução de uma espécie envolve a compreensão de sua história demográfica, estruturação populacional e também os mecanismos envolvidos na adaptação local. Neste contexto, os avanços em genômica e tecnologia de sequenciamento de DNA estão revolucionando o entendimento da história evolutiva das espécies, pois possibilitam o desenvolvimento de plataformas de genotipagem de alto rendimento, facilitando o uso de análises multilocus para identificar as regiões genômicas responsáveis pela adaptação local e trazendo uma visão detalhada sobre a história demográfica e a estrutura de populações. Além disso, estes dados permitem a identificação de loci responsáveis ou associados com adaptações locais e compreender as estratégias de adaptação que possibilitam algumas plantas sobreviverem em diferentes condições ambientais. Eugenia uniflora L. é uma espécie pertencente à família Myrtaceae e que apresenta uma ampla distribuição ao longo dos domínios da Floresta Atlântica (DFA). Popularmente conhecida como pitanga ou cereja-brasileira, E. uniflora é bastante versátil e cresce em vários habitats diferentes, ocorrendo como um arbusto ou árvore pequena em ambientes arenosos de restinga na planície costeira, próximo ao oceano e também no sul do Brasil apresenta-se como árvore, em ambientes de mata ciliar. Essas características, aliadas ao fato de que esta espécie seja uma das espécies-chave presentes em diferentes regiões fitogeográficas que integram a DFA, fazem com que ela seja um excelente modelo para estudos de variação adaptativa. Dessa forma, a presente dissertação teve como objetivo o estudo da variação genética adaptativa em populações naturais de E. uniflora. Para isso, foram selecionados 30 genes candidatos envolvidos em diferentes vias de sinalização com as respostas ao estresse abiótico, através da análise do transcriptoma da folha de E. uniflora. As sequências desses genes foram amplificadas por PCR em 96 indivíduos provenientes de populações de ambientes contrastantes. Os fragmentos amplificados foram submetidos ao sequenciamento usando plataforma de Sequenciamento de Nova Geração para a identificação e genotipagem de marcadores SNPs (Single Nucleotide Polimorphism). Após a análise do sequenciamento, um total de 381 SNPs, distribuídos em 16 genes foram identificados e genotipados em 84 indivíduos. A análise de FST outlier revelou dois loci sob seleção positiva, um no gene que codifica uma dehidrina e outro no gene que codifica uma Lea14-A, genes estes previamente reportados estarem envolvidos com estresse de resposta à seca em plantas. / The knowledge about the evolutionary history of a species is essential to gain insight into processes that contributed to the current patterns of distribution and diversity of this species. It involves the understanding of demographic history, population structure and also the mechanisms involved in local adaptation. In this context, advances in genomics and DNA sequencing technology are revolutionizing the understanding of the evolutionary history of the species, as they allow the development of high-throughput genotyping platforms, facilitating the use of multilocus analysis to identify genomic regions responsible for local adaptation. It also gives detailed insight into the demographic history and population structure. Furthermore, these data allow the identification of loci responsible for or associated with local adaptations and comprises adaptation strategies that enable some plants to survive in different environmental conditions. Eugenia uniflora L. is a species belonging to Myrtaceae family, wide distributed over the Atlantic Forest Domain (AFD). Popularly known as Pitanga or Brazilian-cherry, it is quite versatile and grows in distinct habitats, occurring as a shrub or small tree in sandy environments (Restinga) on the coastal plain near the ocean and as a tree in southern Brazil (riparian forest). These characteristics, combined with the fact that this species is one of the key species present in different phytogeographic regions of the AFD, make this species an excellent model for studies of adaptation. Thus, the present work aims to study the adaptive genetic variation in natural populations of E. uniflora. For this, we selected 30 candidate genes involved in different signaling pathways with the responses to abiotic stress by transcriptome analysis of E. uniflora. The sequences of these genes were amplified by PCR in 96 individuals from populations of different environments. The amplified fragments were subjected to sequencing using Next Generation Sequencing platform for the identification and genotyping of SNP markers (Single Nucleotide Polymorphism). After sequencing analysis, a total of 381 SNPs spread on 16 genes were identified and genotyped in 84 individuals. The FST outlier analysis revealed two loci under positive selection, one present in a gene encoding a dehydrin and another in a gene encoding a Lea14-A. These two genes were previously reported to be involved in drought stress response in plants.

A pitangueira (Eugenia uniflora) é uma importante espécie frutífera representante do gênero Eugenia, família Myrtaceae, possui potencial ornamental e fitoterápico, podendo ser incluída em projetos de revegetação de áreas degradadas. No Brasil a maioria dos pomares dessa espécie são formados por mudas do tipo péfranco, o que torna os plantios com baixa uniformidade genética. Métodos de propagação vegetativa como o cultivo in vitro e a miniestaquia são alternativas viáveis para propagação de diversas espécies frutíferas, podendo ser utilizado também com as espécies nativas proporcionando a formação de pomares com populações de plantas homogêneas, além de acelerar o processo de propagação. No entanto, um dos maiores entraves na propagação vegetativa da pitangueira está na dificuldade de obter tecidos livres de contaminações provocadas por fungos e bactérias e, ainda, por oxidações causadas pela liberação de compostos fenólicos no ponto de incisão. Neste contexto, conduziu-se dois estudos visando a multiplicação da pitangueira, no Departamento de Horticultura e Silvicultura da Faculdade de Agronomia da UFRGS, no período de 2008 a 2010. O estudo 1 concentrou-se em métodos de assepsia e tratamento de plantas matrizes, meios de cultivo e concentrações de reguladores de crescimento. No estudo 2 testou-se a estaquia com material herbáceo de pitangueira. Os resultados obtidos indicam a possibilidade do cultivo in vitro de pitangueira, quando tratados os explantes com solução bactericida e estabelecendo-os em meio WPM com 0,2mg.L-1 de BAP para a fase de multiplicação e 0,1mg.L-1 de ANA para a fase de enraizamento. No entanto, ainda há necessidade de melhoria nos percentuais de enraizamento e brotação dos explantes, bem como na redução de explantes oxidados e contaminados. A miniestaquia foi eficiente para produzir mudas, especialmente, quando utilizadas estacas oriundas de plantas jovens na ausência de auxinas exógenas. Contudo, ainda há a necessidade de aprimorar a técnica visando a multiplicação a partir de estacas coletadas de planta adulta de genótipos promissores. / The surinam cherry (Eugenia uniflora) is an important fruit species, representative of the genus Eugenia, Family Myrtaceae, wich has ornamental and herbal potential and could be included in projects in degraded disturbed areas. In Brazil, most of this species orchards are formed by planting ungrafted plants, which gives low genetic uniformity to the plantations. Vegetative propagation methods, such as micropropagation and minicutting, are viable alternatives for the propagation of several fruit species and can also be used with the native species, allowing the formation of orchards with homogeneous populations and accelerating the propagation process. However, one of the biggest obstacles in surinam cherry propagation is the difficulty of obtaining free from funghi and bacteria contamination tissue and also by oxidation due to the phenolic compounds liberation at the incision point. In this context, two surinam cherry multiplication studies were carried out, both at the Departamento de Horticultura e Silvicultura, Faculdade de Agronomia, UFRGS, for the period 2008 to 2010. Study 1 focused on sterilization methods and mother plants treatment, culture medium and growth regulators concentrations. In study 2 minicuttings of surinam cherry were tested. The results indicate the possibility of in vitro cultivation of surinam cherry when the explants were treated with antibacterial solution and established in culture medium with 0.2 mg.L-1 BAP for multiplication and 0.1 mg.L-1 NAA for rooting. However, there is still a need for improvement of rooting and sprouting percentage of the explants, and the reduction of oxidized and contaminated explants. The minicutting was efficient to produce seedlings, especially when obtained from young plants with not exogenous auxin. Although, the necessity to improve the technique continues, aiming to multiply starting from adult plant collected cuttings from promising genotypes.

A pitangueira (Eugenia uniflora) é uma importante espécie frutífera representante do gênero Eugenia, família Myrtaceae, possui potencial ornamental e fitoterápico, podendo ser incluída em projetos de revegetação de áreas degradadas. No Brasil a maioria dos pomares dessa espécie são formados por mudas do tipo péfranco, o que torna os plantios com baixa uniformidade genética. Métodos de propagação vegetativa como o cultivo in vitro e a miniestaquia são alternativas viáveis para propagação de diversas espécies frutíferas, podendo ser utilizado também com as espécies nativas proporcionando a formação de pomares com populações de plantas homogêneas, além de acelerar o processo de propagação. No entanto, um dos maiores entraves na propagação vegetativa da pitangueira está na dificuldade de obter tecidos livres de contaminações provocadas por fungos e bactérias e, ainda, por oxidações causadas pela liberação de compostos fenólicos no ponto de incisão. Neste contexto, conduziu-se dois estudos visando a multiplicação da pitangueira, no Departamento de Horticultura e Silvicultura da Faculdade de Agronomia da UFRGS, no período de 2008 a 2010. O estudo 1 concentrou-se em métodos de assepsia e tratamento de plantas matrizes, meios de cultivo e concentrações de reguladores de crescimento. No estudo 2 testou-se a estaquia com material herbáceo de pitangueira. Os resultados obtidos indicam a possibilidade do cultivo in vitro de pitangueira, quando tratados os explantes com solução bactericida e estabelecendo-os em meio WPM com 0,2mg.L-1 de BAP para a fase de multiplicação e 0,1mg.L-1 de ANA para a fase de enraizamento. No entanto, ainda há necessidade de melhoria nos percentuais de enraizamento e brotação dos explantes, bem como na redução de explantes oxidados e contaminados. A miniestaquia foi eficiente para produzir mudas, especialmente, quando utilizadas estacas oriundas de plantas jovens na ausência de auxinas exógenas. Contudo, ainda há a necessidade de aprimorar a técnica visando a multiplicação a partir de estacas coletadas de planta adulta de genótipos promissores. / The surinam cherry (Eugenia uniflora) is an important fruit species, representative of the genus Eugenia, Family Myrtaceae, wich has ornamental and herbal potential and could be included in projects in degraded disturbed areas. In Brazil, most of this species orchards are formed by planting ungrafted plants, which gives low genetic uniformity to the plantations. Vegetative propagation methods, such as micropropagation and minicutting, are viable alternatives for the propagation of several fruit species and can also be used with the native species, allowing the formation of orchards with homogeneous populations and accelerating the propagation process. However, one of the biggest obstacles in surinam cherry propagation is the difficulty of obtaining free from funghi and bacteria contamination tissue and also by oxidation due to the phenolic compounds liberation at the incision point. In this context, two surinam cherry multiplication studies were carried out, both at the Departamento de Horticultura e Silvicultura, Faculdade de Agronomia, UFRGS, for the period 2008 to 2010. Study 1 focused on sterilization methods and mother plants treatment, culture medium and growth regulators concentrations. In study 2 minicuttings of surinam cherry were tested. The results indicate the possibility of in vitro cultivation of surinam cherry when the explants were treated with antibacterial solution and established in culture medium with 0.2 mg.L-1 BAP for multiplication and 0.1 mg.L-1 NAA for rooting. However, there is still a need for improvement of rooting and sprouting percentage of the explants, and the reduction of oxidized and contaminated explants. The minicutting was efficient to produce seedlings, especially when obtained from young plants with not exogenous auxin. Although, the necessity to improve the technique continues, aiming to multiply starting from adult plant collected cuttings from promising genotypes.

Pitanga (Eugenia uniflora L.) é uma árvore arbustiva com frutas semelhantes à cereja, que cresce em diferentes tipos de vegetação e ecossistemas como consequência da sua alta capacidade de adaptação a diferentes condições de solo e clima. Esta espécie é de particular interesse econômico devido às suas propriedades medicinais, que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes em suas folhas e frutos. Entre os metabólitos, os terpenóides são os mais abundantes dos óleos essenciais que são encontrados nas folhas. A diversidade de terpenos observada em Myrtaceae é determinada pela atividade de diferentes membros das famílias das terpeno sintases e oxidosqualeno ciclases. Por outro lado, os miRNAs são pequenos RNAs endógenos que desempenham papéis regulatórios essenciais no crescimento das plantas, desenvolvimento e resposta ao estresse. Por esta razão, estudos extensivos de miRNAs foram realizados em plantas modelos e outras plantas de importância econômica nos últimos anos. Portanto, o objetivo deste estudo é gerar recursos genômicos para E. uniflora utilizando sequenciamento de nova geração e ferramentas de bioinformática para a identificação de miRNAs conservados e novos, bem como os genes envolvidos na sínteses dos terpenóides. No capítulo 3, bibliotecas de pequenos RNA e RNA-seq foram construídas a partir de folhas de pitanga para identificar miRNAs maduros e pre-miRNAs, respectivamente. De 14.489.131 leituras limpas de pequenos RNA, foram obtidos 1.852.722 sequências de miRNAs maduros que representam 45 famílias conservadas e que foram identificadas em outras espécies de plantas. Análises posteriores, usando contigs montados a partir do RNA-seq, permitiu a predição das estruturas secundárias de 42 pre-miRNAs: 25 conservados e 17 novos. Alvos potenciais foram previstos para os miRNAs maduros mais abundantes nos pre-miRNAs, identificados com base na homologia de sequências. Além disso, a expressão de 27 pre-miRNAs foi validada utilizando ensaios de RT-PCR em diferentes indivíduos de pitanga. Este estudo é o primeiro de identificação em grande escala de miRNAs e seus alvos potenciais de uma espécie da família Myrtaceae, e proporciona mais informação sobre a conservação evolutiva dos vias regulatórias dos miRNAs em plantas com destaques para os miRNAs específicos da pitanga. No capítulo 4, a biblioteca de RNA-seq sequenciada anteriormente foi utilizada para identificar os genes potencialmente envolvidos na via da biossíntese dos terpenos e diversidade dos terpenóides a partir da montagem de novo e a anotação do transcriptoma de E. uniflora. No total, foram identificados 72.742 unigenes com um comprimento médio de 1.048 pb. Destes, 43.631 e 36.289 unigenes foram anotadas com as bases de dados das proteínas não redundantes do NCBI e Swiss-Prot, respectivamente. A ontologia gênica categorizou as sequências em 53 grupos funcionais. A análise das vias metabólicas com KEGG revelou 8.625 unigenes designados a 141 vias metabólicas e 40 unigenes preditos como associados com a biossíntese de terpenóides. Por outro lado, foram identificados quatro genes putativos de terpeno sintases (TPS), de comprimento completo, envolvidos na biossíntese de monoterpenos e sesquiterpenos, e três genes putativos de oxidosqualeno ciclases (OSC), de comprimente completo, envolvidos na biossíntese de triterpenos. Além disso, a expressão destes genes foi validada em diferentes tecidos de E. uniflora. A futura caracterização bioquímica dos diferentes TPS e OSC descritos aqui determinará especificamente o tipo de terpenóide sintetizado em condições ambientais específicas. Os dados produzidos neste estudo servirão como referência para estudos genéticos sobre os mecanismos moleculares que são responsáveis pela composição química dos óleos essenciais em E. uniflora e os aspectos fisiológicos da capacidade de adaptação desta espécie a diferentes habitats. / Pitanga (Eugenia uniflora L.) is a shrubby tree with edible cherry-like fruits that grows in different vegetation types and ecosystems as a consequence of its high adaptability to different soils and climate conditions. This species is of particular interest due to its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites present in their leaves and fruits with potential pharmacological benefits. Among these metabolites, the terpenoids are the most abundant in the essential oils found in the leaves. The terpene diversity observed in Myrtaceae is determined by the activity of different members of the terpene synthase and oxidosqualene cyclase families. Furthermore, miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. For this reason, extensive studies of miRNAs have been performed in model plants and other plants of economic importance in the last years. Therefore, the aim of this study is to generate genomic resources for E. uniflora using next generation sequencing and bioinformatics tools to identify conserved and new miRNAs, and to identify the genes involved in the synthesis of terpenoids. In chapter 3, small RNA and RNA-seq libraries were constructed from leaves to identify mature miRNAs and pre-miRNAs, respectively. From 14.489.131 small RNA clean reads we obtained 1.852.722 mature miRNA sequences, representing 45 conserved families that have been identified in other plant species. Further analysis using assembled contigs from RNA-seq allowed the prediction of secondary structures of 42 pre-miRNAs: 25 conserved and 17 novel. Potential targets were predicted for the most abundant mature miRNAs, which were identified in pre-miRNAs based on sequence homology. In addition, the expression of 27 identified pre-miRNAs was validated using RTPCR assays in different individuals of pitanga. In chapter 4, the previously sequenced RNA-seq library was de novo assembled followed by annotation of the E. uniflora transcriptome and used to identify the genes potentially involved in the terpene biosynthesis pathway and terpenoid diversity. In total, we identified 72.742 unigenes with a mean length of 1.048 bp. Of these, 43.631 and 36.289 unigenes were annotated with the NCBI non-redundant protein and Swiss-Prot databases, respectively. The gene ontology categorized the sequences into 53 functional groups. A metabolic pathway analysis with KEGG revealed 8.625 unigenes assigned to 141 metabolic pathways and 40 unigenes predicted to be associated with the biosynthesis of terpenoids. Furthermore, we identified four putative full-length terpene synthase (TPS) genes involved in sesquiterpenes and monoterpenes biosynthesis, and three putative full-length oxidosqualene cyclase (OSC) genes involved in the triterpenes biosynthesis. In addition, expression of these genes was validated in different E. uniflora tissues. Future biochemical characterization of the different TPS and OSC described here will determine the type of terpenoid specifically synthesized in specific environmental conditions. The data produced in this study will serve as a reference for genetic studies about the molecular mechanisms behind the chemical composition of the essential oils in E. uniflora and about the physiologic aspects of the capacity of adaptation of this specie to different habitats.

As plantas, por serem organismos sésseis, enfrentam persistentemente perturbações ambientais adversas denominadas estresses abióticos, sendo as mais importantes, a seca, a salinidade do solo, as temperaturas extremas e a presença de metais pesados. Em resposta, as plantas desenvolveram mecanismos de tolerância, resistência e prevenção para minimizar a influência do estresse, utilizando estratégias de curto prazo para readaptar rápida e eficientemente seu metabolismo. Neste sentido, os pequenos RNAs não codificantes (sncRNAs) são fortes candidatos para realizar este tipo de regulação. Através do sequenciamento de nova geração revelou-se o papel dos sncRNAs na regulação da expressão gênica em nível transcricional e póstranscricional. Dentre os sncRNAs, os microRNAs (miRNAs) são os mais conhecidos e os fragmentos derivados dos RNAs transportadores (tRFs) são os mais novos e com maiores perspectivas de descobertas futuras. Os miRNAs desempenham papéis regulatórios essenciais tanto no crescimento das plantas quanto no desenvolvimento e resposta ao estresse, enquanto os tRFs, em sua maioria, têm sido associados a respostas de estresse. Eugenia uniflora L., “pitanga” ou a cereja brasileira é uma árvore frutífera nativa da América do Sul que pertence à família Myrtaceae. Ela cresce em diferentes ambientes; florestas, restingas e ambientes áridos e semi-áridos no nordeste brasileiro, sendo uma espécie versátil em termos de adaptabilidade e que desempenha um papel fundamental na manutenção da vegetação costeira arbustiva. Além disso, é muito conhecida por suas propriedades medicinais que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes nas folhas e frutos. E. uniflora representa uma fonte fascinante da biodiversidade do germoplasma e tem um grande potencial como fonte de genes para o melhoramento genético. Portanto, a compreensão dos mecanismos que conferem tolerância ao estresse nesta planta é de particular importância. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho é a identificação de sncRNAs (miRNAs e tRFs) por ferramentas de bioinformática e análise do padrão de expressão destes sob condições de estresse abiótico (seca e salinidade), bem como avaliação dos genes envolvidos nesta resposta. No capítulo 1, bibliotecas de DNA, pequenos RNAs (sRNAs) e RNAseq de folhas foram usadas para identificar pre-miRNAs, miRNAs maduros e potenciais alvos destes miRNAs, respectivamente. A montagem de novo do genoma permitiu identificar 38 miRNAs conservados e 28 novos miRNAs. Após a avaliação da expressão destes, 11 conservados, entre eles miR156 e miR170, mostraram variação significativa nas condições de restinga e de estresse induzido por PEG. A maioria deles foram previamente descritos em processos de estresse em outras espécies. 14 novos miRNAs foram avaliados em diferentes tecidos de pitanga mostrando variação significativa no padrão de expressão. Os alvos destes últimos miRNAs foram preditos e validados por RTqPCR. Eles correspondem a genes de fatores de transcrição e outros genes como transferases ou ATPases e demonstraram o padrão esperado oposto à expressão dos miRNAs. No capítulo 2, as mesmas bibliotecas foram usadas para identificar tRFs conservados na família das Myrtaceae. Para isso, os tRNAs de Eucalyptus grandis e E. uniflora foram anotados e os tRNAs comuns foram utilizados para o ancoramento dos sRNAs. 479 tRFs foram identificados em pitanga, na maioria com 18 nucleotídeos (nt). Um conjunto de 11 tRFs conservados em ambas espécies, assim como seus alvos, foram avaliados em condições de estresse salino e seca demonstrando diferenças significativas dependendo do tipo de estresse. Os alvos identificados correspondem a genes previamente descritos como envolvidos em estresse salino e seca para outras espécies. O presente trabalho apresenta fortes evidências do envolvimento dos miRNAs em processos de desenvolvimento e estresse, assim como dos tRFs na resposta à seca e estresse salino presente em E. uniflora. Além disso, os dados produzidos poderão ser utilizados em estudos funcionais mais aprofundados que servirão para melhor compreensão dos mecanismos de tolerância presentes nesta importante planta. / Plants being sessile organisms, persistently face adverse environmental perturbations termed as abiotic stresses, most important being drought, soil salinity, extreme temperatures, and heavy metals. They developed several strategies such as tolerance, resistance, and avoidance to minimize stress influence, thus require short-term strategies to quickly and efficiently readapt their metabolism. In this sense, small non coding RNAs are strong candidates to do this kind of fine tune regulation. Next generation sequencing technologies have revealed the key role of these sncRNAs in the transcriptional and posttranscriptional gene-expression regulation. Among the myriad of new sncRNAs, miRNAs are the most known ones and the fragments derived from tRNAs (tRFs) are the newest but with high perspective ones. The miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. In the case of tRFs, they are mainly involved in stress response. Eugenia uniflora L., ‘pitanga’ or Brazilian cherry is a fruit tree native to South America that belongs to Myrtaceae family. It grows in several different harsh environments, including forests, restingas, near the beach, and arid and semiarid environments in the Brazilian northeast. This species is very versatile in terms of adaptability and plays a fundamental role in the maintenance of the shrubby coastal vegetation. However, this species is best-known because its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites with known biological activities present in their leaves and fruits. E. uniflora is a fascinating reservoir of germplasm biodiversity and has great potential as a source of genes for plant breeding. Therefore, understanding the mechanisms conferring stress tolerance will be very useful. In this sense, the objective of this work is to identify sncRNAs (miRNAs and tRFs) by bioinformatic tools and to analyze their expression pattern under stress conditions as well as the genes involved in that response. In chapter 1, DNA, small RNA (sRNA) and RNAseq libraries from leaves were used to identify pre-miRNAs, mature miRNAs and potential targets of these miRNAs, respectively. De novo assembly of the genome identified 38 conserved miRNAs and 28 novel miRNAs. After evaluating their expression pattern, 11 11 conserved miRNAs, including miR156 and miR170, showed significant variation in the natural (restinga habitat) and PEG induced stress. Most of them were previously reported in stress processes. 14 novel miRNAs were evaluated in different tissues of pitanga showing significant variation in the expression pattern. The targets of the last miRNAs were predicted and validated by RT-qPCR. They were transcription factor genes and other genes such as transferases or ATPases and showed the expected opposite pattern to miRNA expression. In Chapter 2, the same libraries were used to identify conserved tRFs in the Myrtaceae family. To do this, the tRNAs of Eucalyptus grandis and E. uniflora were annotated and sRNAs mapped into them. 479 tRFs were identified in pitanga with predominance of those with 18 nucleotide length. 11 conserved tRFs in both species, as well as their targets, were evaluated under saline and drought stress conditions showing significant differences depending on the stress type. The targets were genes previously involved in saline and drought stress for other species. The present work shows strong evidences of the involvement of the miRNAs in the development and stress, as well as the tRFs in the tolerance to drought and saline stress of E. uniflora. In addition, the data could be used in more detailed functional studies that will serve to corroborate and better understand the mechanism of tolerance present in this important plant.

A pitangueira (Eugenia uniflora) é uma importante espécie frutífera representante do gênero Eugenia, família Myrtaceae, possui potencial ornamental e fitoterápico, podendo ser incluída em projetos de revegetação de áreas degradadas. No Brasil a maioria dos pomares dessa espécie são formados por mudas do tipo péfranco, o que torna os plantios com baixa uniformidade genética. Métodos de propagação vegetativa como o cultivo in vitro e a miniestaquia são alternativas viáveis para propagação de diversas espécies frutíferas, podendo ser utilizado também com as espécies nativas proporcionando a formação de pomares com populações de plantas homogêneas, além de acelerar o processo de propagação. No entanto, um dos maiores entraves na propagação vegetativa da pitangueira está na dificuldade de obter tecidos livres de contaminações provocadas por fungos e bactérias e, ainda, por oxidações causadas pela liberação de compostos fenólicos no ponto de incisão. Neste contexto, conduziu-se dois estudos visando a multiplicação da pitangueira, no Departamento de Horticultura e Silvicultura da Faculdade de Agronomia da UFRGS, no período de 2008 a 2010. O estudo 1 concentrou-se em métodos de assepsia e tratamento de plantas matrizes, meios de cultivo e concentrações de reguladores de crescimento. No estudo 2 testou-se a estaquia com material herbáceo de pitangueira. Os resultados obtidos indicam a possibilidade do cultivo in vitro de pitangueira, quando tratados os explantes com solução bactericida e estabelecendo-os em meio WPM com 0,2mg.L-1 de BAP para a fase de multiplicação e 0,1mg.L-1 de ANA para a fase de enraizamento. No entanto, ainda há necessidade de melhoria nos percentuais de enraizamento e brotação dos explantes, bem como na redução de explantes oxidados e contaminados. A miniestaquia foi eficiente para produzir mudas, especialmente, quando utilizadas estacas oriundas de plantas jovens na ausência de auxinas exógenas. Contudo, ainda há a necessidade de aprimorar a técnica visando a multiplicação a partir de estacas coletadas de planta adulta de genótipos promissores. / The surinam cherry (Eugenia uniflora) is an important fruit species, representative of the genus Eugenia, Family Myrtaceae, wich has ornamental and herbal potential and could be included in projects in degraded disturbed areas. In Brazil, most of this species orchards are formed by planting ungrafted plants, which gives low genetic uniformity to the plantations. Vegetative propagation methods, such as micropropagation and minicutting, are viable alternatives for the propagation of several fruit species and can also be used with the native species, allowing the formation of orchards with homogeneous populations and accelerating the propagation process. However, one of the biggest obstacles in surinam cherry propagation is the difficulty of obtaining free from funghi and bacteria contamination tissue and also by oxidation due to the phenolic compounds liberation at the incision point. In this context, two surinam cherry multiplication studies were carried out, both at the Departamento de Horticultura e Silvicultura, Faculdade de Agronomia, UFRGS, for the period 2008 to 2010. Study 1 focused on sterilization methods and mother plants treatment, culture medium and growth regulators concentrations. In study 2 minicuttings of surinam cherry were tested. The results indicate the possibility of in vitro cultivation of surinam cherry when the explants were treated with antibacterial solution and established in culture medium with 0.2 mg.L-1 BAP for multiplication and 0.1 mg.L-1 NAA for rooting. However, there is still a need for improvement of rooting and sprouting percentage of the explants, and the reduction of oxidized and contaminated explants. The minicutting was efficient to produce seedlings, especially when obtained from young plants with not exogenous auxin. Although, the necessity to improve the technique continues, aiming to multiply starting from adult plant collected cuttings from promising genotypes.