Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais da Universidade do Extremo Sul Catarinense-UNESC, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Ambientais. / According to the informal knowledge, Calea uniflora Less. is widely used in southern Santa Catarina (Brazil), however there is no ethnobotanical study of this plant, as there is no literature on the characterization of soil development of this plant. Its chemical composition is not well defined and there are no studies to prove the safety of using it orally. For these reasons, this study aims to determine the knowledge that the population holds over C. uniflora, popularly known as arnica-da-praia, in the city of Balneário Rincão (SC). In addition, we intend to evaluate nutritional characteristics of the soil of plant development, check content of phenolic compounds in the inflorescence the hydroalcoholic C. uniflora extracts, as well as the presence of acute toxicity in rats. For this, interviews were conducted by applying a semi-structured form, being interviewed residents in the city of Balneário Rincão (SC), totaling 372 people. Soil testing was conducted by the Agricultural Research and Rural Extension of Santa Catarina, characterizing the content of macro and micronutrients the soil. The assay of phenolic compounds was carried out using the Folin Ciocalteu methodologies and aluminum chloride. Acute toxicological potential was realized as Resolution No. 90, of March 16, 2004 the National Health Surveillance Agency. The results showed that 94.1% of respondents know C. uniflora and that 74.3% of these make its use as a medicinal plant, thus concluding that the species C. uniflora is widely known and used in the city of Balneário Rincão. The most popular indications cited were: healing, muscle pain and bruises. The predominant mode of preparation was a macerating and the modes of administration were cited as being more topical and oral. It was found that people have great confidence in the use of this plant, as 98% reported that it is non-toxic. The transmission of knowledge among relatives was of 84.6%, demonstrating the traditional use of the plant. The soil which develops C. uniflora quarry in the neighborhood, some characteristics of a soil poor in macronutrient, with high concentrations of micronutrients. The assay demonstrated phenolic compounds C. uniflora hydroalcoholic extract is rich in polyphenols, and approximately 4.6 g to 15.8 g flavonoid and polyphenol for 100g of extract. Acute toxicological study showed no toxic effect of the extract treated rats at doses of 100, 250, 500 and 1000 mg / kg orally. As there were no deaths during the study, the LD 50 for the hydroalcoholic extract of the inflorescence of C. uniflora is greater than 1000 mg / kg. As conclusions, we can suggest that the plant is widely used in Balneário Rincão city, grows in poor soil on macronutrients, has a high concentration of phenolic compounds and appears to have low toxicity in acute treatment. / De acordo com o conhecimento informal, Calea uniflora Less. é amplamente utilizada na região sul de Santa Catarina (Brasil); no entanto, não há estudo etnobotânico específicos desta planta, como também não há em literatura a caracterização do solo onde se desenvolve. Sua composição química ainda não é bem definida e não há estudos que comprovem a segurança de utilização da planta por via oral. Por estes motivos, este trabalho teve por objetivo, determinar o conhecimento que a população detém sobre C. uniflora, popularmente conhecida como arnica-da-praia, no Município de Balneário Rincão (SC). Pretendeu-se ainda avaliar as características nutricionais do solo de desenvolvimento da planta, verificar teor de compostos fenólicos no extrato hidroalcoólico das partes aérea de C. uniflora, bem como a toxicidade aguda em ratos Wistar. Foram realizadas entrevistas semiestruturada com 372 pessoas com aplicação de formulário, sendo entrevistados residentes do Município de Balneário Rincão (SC), totalizando 372 pessoas, sendo este o N representativo da amostra total. A análise do solo foi realizada pela Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina (EPAGRI), caracterizando o teor de macro e micronutrientes do solo. O doseamento de compostos fenólicos foi realizado utilizando-se as metodologias do Folin Ciocalteu e cloreto de alumínio. O potencial toxicológico agudo foi realizado conforme a resolução nº 90, de 16 de março de 2004 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Os resultados mostraram que 94,1% dos entrevistados conhecem C. uniflora e que destes 74,3% fazem uso como planta medicinal, evidenciando assim que C. uniflora é amplamente conhecida e utilizada no Município de Balneário Rincão. As indicações populares mais citadas foram: cicatrização, dor muscular, e hematomas. O modo de preparo predominante foi a maceração e as vias de administração mais citadas foram a tópica e oral. Verificou-se que a população tem grande credibilidade no uso desta planta, pois 98% relataram que ela não é tóxica. A transmissão de conhecimento entre familiares foi de 84,6%. O solo onde se desenvolve C. uniflora, no bairro Pedreira, apresentou características de um solo pobre em macronutrientes e concentrações altas dos micronutrientes zinco, cobre, manganês e ferro. O doseamento de compostos fenólicos demonstrou que o extrato hidrooalcoólico de C. unifloraé rico em polifenois, tendo aproximadamente 4,6 g de flavonoide e 15,8 g de polifenois totais a cada 100g de extrato. O estudo toxicológico agudo não mostrou efeito tóxico do extrato em ratos tratados nas doses de 100, 250, 500 e 1000 mg/Kg por via oral. Como não houve óbito durante o estudo, a DL50 para o extrato hidroalcoólico das partes aérea de C. uniflora é superior a 1000 mg/Kg. Portanto, pode-se sugerir que a planta é vastamente utilizada no município do Balneário Rincão, cresce em solos pobres em macronutrientes, apresenta teor elevado de compostos fenólicos e possui baixa toxicidade em tratamento agudo.

As plantas, por serem organismos sésseis, enfrentam persistentemente perturbações ambientais adversas denominadas estresses abióticos, sendo as mais importantes, a seca, a salinidade do solo, as temperaturas extremas e a presença de metais pesados. Em resposta, as plantas desenvolveram mecanismos de tolerância, resistência e prevenção para minimizar a influência do estresse, utilizando estratégias de curto prazo para readaptar rápida e eficientemente seu metabolismo. Neste sentido, os pequenos RNAs não codificantes (sncRNAs) são fortes candidatos para realizar este tipo de regulação. Através do sequenciamento de nova geração revelou-se o papel dos sncRNAs na regulação da expressão gênica em nível transcricional e póstranscricional. Dentre os sncRNAs, os microRNAs (miRNAs) são os mais conhecidos e os fragmentos derivados dos RNAs transportadores (tRFs) são os mais novos e com maiores perspectivas de descobertas futuras. Os miRNAs desempenham papéis regulatórios essenciais tanto no crescimento das plantas quanto no desenvolvimento e resposta ao estresse, enquanto os tRFs, em sua maioria, têm sido associados a respostas de estresse. Eugenia uniflora L., “pitanga” ou a cereja brasileira é uma árvore frutífera nativa da América do Sul que pertence à família Myrtaceae. Ela cresce em diferentes ambientes; florestas, restingas e ambientes áridos e semi-áridos no nordeste brasileiro, sendo uma espécie versátil em termos de adaptabilidade e que desempenha um papel fundamental na manutenção da vegetação costeira arbustiva. Além disso, é muito conhecida por suas propriedades medicinais que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes nas folhas e frutos. E. uniflora representa uma fonte fascinante da biodiversidade do germoplasma e tem um grande potencial como fonte de genes para o melhoramento genético. Portanto, a compreensão dos mecanismos que conferem tolerância ao estresse nesta planta é de particular importância. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho é a identificação de sncRNAs (miRNAs e tRFs) por ferramentas de bioinformática e análise do padrão de expressão destes sob condições de estresse abiótico (seca e salinidade), bem como avaliação dos genes envolvidos nesta resposta. No capítulo 1, bibliotecas de DNA, pequenos RNAs (sRNAs) e RNAseq de folhas foram usadas para identificar pre-miRNAs, miRNAs maduros e potenciais alvos destes miRNAs, respectivamente. A montagem de novo do genoma permitiu identificar 38 miRNAs conservados e 28 novos miRNAs. Após a avaliação da expressão destes, 11 conservados, entre eles miR156 e miR170, mostraram variação significativa nas condições de restinga e de estresse induzido por PEG. A maioria deles foram previamente descritos em processos de estresse em outras espécies. 14 novos miRNAs foram avaliados em diferentes tecidos de pitanga mostrando variação significativa no padrão de expressão. Os alvos destes últimos miRNAs foram preditos e validados por RTqPCR. Eles correspondem a genes de fatores de transcrição e outros genes como transferases ou ATPases e demonstraram o padrão esperado oposto à expressão dos miRNAs. No capítulo 2, as mesmas bibliotecas foram usadas para identificar tRFs conservados na família das Myrtaceae. Para isso, os tRNAs de Eucalyptus grandis e E. uniflora foram anotados e os tRNAs comuns foram utilizados para o ancoramento dos sRNAs. 479 tRFs foram identificados em pitanga, na maioria com 18 nucleotídeos (nt). Um conjunto de 11 tRFs conservados em ambas espécies, assim como seus alvos, foram avaliados em condições de estresse salino e seca demonstrando diferenças significativas dependendo do tipo de estresse. Os alvos identificados correspondem a genes previamente descritos como envolvidos em estresse salino e seca para outras espécies. O presente trabalho apresenta fortes evidências do envolvimento dos miRNAs em processos de desenvolvimento e estresse, assim como dos tRFs na resposta à seca e estresse salino presente em E. uniflora. Além disso, os dados produzidos poderão ser utilizados em estudos funcionais mais aprofundados que servirão para melhor compreensão dos mecanismos de tolerância presentes nesta importante planta. / Plants being sessile organisms, persistently face adverse environmental perturbations termed as abiotic stresses, most important being drought, soil salinity, extreme temperatures, and heavy metals. They developed several strategies such as tolerance, resistance, and avoidance to minimize stress influence, thus require short-term strategies to quickly and efficiently readapt their metabolism. In this sense, small non coding RNAs are strong candidates to do this kind of fine tune regulation. Next generation sequencing technologies have revealed the key role of these sncRNAs in the transcriptional and posttranscriptional gene-expression regulation. Among the myriad of new sncRNAs, miRNAs are the most known ones and the fragments derived from tRNAs (tRFs) are the newest but with high perspective ones. The miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. In the case of tRFs, they are mainly involved in stress response. Eugenia uniflora L., ‘pitanga’ or Brazilian cherry is a fruit tree native to South America that belongs to Myrtaceae family. It grows in several different harsh environments, including forests, restingas, near the beach, and arid and semiarid environments in the Brazilian northeast. This species is very versatile in terms of adaptability and plays a fundamental role in the maintenance of the shrubby coastal vegetation. However, this species is best-known because its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites with known biological activities present in their leaves and fruits. E. uniflora is a fascinating reservoir of germplasm biodiversity and has great potential as a source of genes for plant breeding. Therefore, understanding the mechanisms conferring stress tolerance will be very useful. In this sense, the objective of this work is to identify sncRNAs (miRNAs and tRFs) by bioinformatic tools and to analyze their expression pattern under stress conditions as well as the genes involved in that response. In chapter 1, DNA, small RNA (sRNA) and RNAseq libraries from leaves were used to identify pre-miRNAs, mature miRNAs and potential targets of these miRNAs, respectively. De novo assembly of the genome identified 38 conserved miRNAs and 28 novel miRNAs. After evaluating their expression pattern, 11 11 conserved miRNAs, including miR156 and miR170, showed significant variation in the natural (restinga habitat) and PEG induced stress. Most of them were previously reported in stress processes. 14 novel miRNAs were evaluated in different tissues of pitanga showing significant variation in the expression pattern. The targets of the last miRNAs were predicted and validated by RT-qPCR. They were transcription factor genes and other genes such as transferases or ATPases and showed the expected opposite pattern to miRNA expression. In Chapter 2, the same libraries were used to identify conserved tRFs in the Myrtaceae family. To do this, the tRNAs of Eucalyptus grandis and E. uniflora were annotated and sRNAs mapped into them. 479 tRFs were identified in pitanga with predominance of those with 18 nucleotide length. 11 conserved tRFs in both species, as well as their targets, were evaluated under saline and drought stress conditions showing significant differences depending on the stress type. The targets were genes previously involved in saline and drought stress for other species. The present work shows strong evidences of the involvement of the miRNAs in the development and stress, as well as the tRFs in the tolerance to drought and saline stress of E. uniflora. In addition, the data could be used in more detailed functional studies that will serve to corroborate and better understand the mechanism of tolerance present in this important plant.

Pitanga (Eugenia uniflora L.) é uma árvore arbustiva com frutas semelhantes à cereja, que cresce em diferentes tipos de vegetação e ecossistemas como consequência da sua alta capacidade de adaptação a diferentes condições de solo e clima. Esta espécie é de particular interesse econômico devido às suas propriedades medicinais, que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes em suas folhas e frutos. Entre os metabólitos, os terpenóides são os mais abundantes dos óleos essenciais que são encontrados nas folhas. A diversidade de terpenos observada em Myrtaceae é determinada pela atividade de diferentes membros das famílias das terpeno sintases e oxidosqualeno ciclases. Por outro lado, os miRNAs são pequenos RNAs endógenos que desempenham papéis regulatórios essenciais no crescimento das plantas, desenvolvimento e resposta ao estresse. Por esta razão, estudos extensivos de miRNAs foram realizados em plantas modelos e outras plantas de importância econômica nos últimos anos. Portanto, o objetivo deste estudo é gerar recursos genômicos para E. uniflora utilizando sequenciamento de nova geração e ferramentas de bioinformática para a identificação de miRNAs conservados e novos, bem como os genes envolvidos na sínteses dos terpenóides. No capítulo 3, bibliotecas de pequenos RNA e RNA-seq foram construídas a partir de folhas de pitanga para identificar miRNAs maduros e pre-miRNAs, respectivamente. De 14.489.131 leituras limpas de pequenos RNA, foram obtidos 1.852.722 sequências de miRNAs maduros que representam 45 famílias conservadas e que foram identificadas em outras espécies de plantas. Análises posteriores, usando contigs montados a partir do RNA-seq, permitiu a predição das estruturas secundárias de 42 pre-miRNAs: 25 conservados e 17 novos. Alvos potenciais foram previstos para os miRNAs maduros mais abundantes nos pre-miRNAs, identificados com base na homologia de sequências. Além disso, a expressão de 27 pre-miRNAs foi validada utilizando ensaios de RT-PCR em diferentes indivíduos de pitanga. Este estudo é o primeiro de identificação em grande escala de miRNAs e seus alvos potenciais de uma espécie da família Myrtaceae, e proporciona mais informação sobre a conservação evolutiva dos vias regulatórias dos miRNAs em plantas com destaques para os miRNAs específicos da pitanga. No capítulo 4, a biblioteca de RNA-seq sequenciada anteriormente foi utilizada para identificar os genes potencialmente envolvidos na via da biossíntese dos terpenos e diversidade dos terpenóides a partir da montagem de novo e a anotação do transcriptoma de E. uniflora. No total, foram identificados 72.742 unigenes com um comprimento médio de 1.048 pb. Destes, 43.631 e 36.289 unigenes foram anotadas com as bases de dados das proteínas não redundantes do NCBI e Swiss-Prot, respectivamente. A ontologia gênica categorizou as sequências em 53 grupos funcionais. A análise das vias metabólicas com KEGG revelou 8.625 unigenes designados a 141 vias metabólicas e 40 unigenes preditos como associados com a biossíntese de terpenóides. Por outro lado, foram identificados quatro genes putativos de terpeno sintases (TPS), de comprimento completo, envolvidos na biossíntese de monoterpenos e sesquiterpenos, e três genes putativos de oxidosqualeno ciclases (OSC), de comprimente completo, envolvidos na biossíntese de triterpenos. Além disso, a expressão destes genes foi validada em diferentes tecidos de E. uniflora. A futura caracterização bioquímica dos diferentes TPS e OSC descritos aqui determinará especificamente o tipo de terpenóide sintetizado em condições ambientais específicas. Os dados produzidos neste estudo servirão como referência para estudos genéticos sobre os mecanismos moleculares que são responsáveis pela composição química dos óleos essenciais em E. uniflora e os aspectos fisiológicos da capacidade de adaptação desta espécie a diferentes habitats. / Pitanga (Eugenia uniflora L.) is a shrubby tree with edible cherry-like fruits that grows in different vegetation types and ecosystems as a consequence of its high adaptability to different soils and climate conditions. This species is of particular interest due to its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites present in their leaves and fruits with potential pharmacological benefits. Among these metabolites, the terpenoids are the most abundant in the essential oils found in the leaves. The terpene diversity observed in Myrtaceae is determined by the activity of different members of the terpene synthase and oxidosqualene cyclase families. Furthermore, miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. For this reason, extensive studies of miRNAs have been performed in model plants and other plants of economic importance in the last years. Therefore, the aim of this study is to generate genomic resources for E. uniflora using next generation sequencing and bioinformatics tools to identify conserved and new miRNAs, and to identify the genes involved in the synthesis of terpenoids. In chapter 3, small RNA and RNA-seq libraries were constructed from leaves to identify mature miRNAs and pre-miRNAs, respectively. From 14.489.131 small RNA clean reads we obtained 1.852.722 mature miRNA sequences, representing 45 conserved families that have been identified in other plant species. Further analysis using assembled contigs from RNA-seq allowed the prediction of secondary structures of 42 pre-miRNAs: 25 conserved and 17 novel. Potential targets were predicted for the most abundant mature miRNAs, which were identified in pre-miRNAs based on sequence homology. In addition, the expression of 27 identified pre-miRNAs was validated using RTPCR assays in different individuals of pitanga. In chapter 4, the previously sequenced RNA-seq library was de novo assembled followed by annotation of the E. uniflora transcriptome and used to identify the genes potentially involved in the terpene biosynthesis pathway and terpenoid diversity. In total, we identified 72.742 unigenes with a mean length of 1.048 bp. Of these, 43.631 and 36.289 unigenes were annotated with the NCBI non-redundant protein and Swiss-Prot databases, respectively. The gene ontology categorized the sequences into 53 functional groups. A metabolic pathway analysis with KEGG revealed 8.625 unigenes assigned to 141 metabolic pathways and 40 unigenes predicted to be associated with the biosynthesis of terpenoids. Furthermore, we identified four putative full-length terpene synthase (TPS) genes involved in sesquiterpenes and monoterpenes biosynthesis, and three putative full-length oxidosqualene cyclase (OSC) genes involved in the triterpenes biosynthesis. In addition, expression of these genes was validated in different E. uniflora tissues. Future biochemical characterization of the different TPS and OSC described here will determine the type of terpenoid specifically synthesized in specific environmental conditions. The data produced in this study will serve as a reference for genetic studies about the molecular mechanisms behind the chemical composition of the essential oils in E. uniflora and about the physiologic aspects of the capacity of adaptation of this specie to different habitats.

Pitanga (Eugenia uniflora L.) é uma árvore arbustiva com frutas semelhantes à cereja, que cresce em diferentes tipos de vegetação e ecossistemas como consequência da sua alta capacidade de adaptação a diferentes condições de solo e clima. Esta espécie é de particular interesse econômico devido às suas propriedades medicinais, que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes em suas folhas e frutos. Entre os metabólitos, os terpenóides são os mais abundantes dos óleos essenciais que são encontrados nas folhas. A diversidade de terpenos observada em Myrtaceae é determinada pela atividade de diferentes membros das famílias das terpeno sintases e oxidosqualeno ciclases. Por outro lado, os miRNAs são pequenos RNAs endógenos que desempenham papéis regulatórios essenciais no crescimento das plantas, desenvolvimento e resposta ao estresse. Por esta razão, estudos extensivos de miRNAs foram realizados em plantas modelos e outras plantas de importância econômica nos últimos anos. Portanto, o objetivo deste estudo é gerar recursos genômicos para E. uniflora utilizando sequenciamento de nova geração e ferramentas de bioinformática para a identificação de miRNAs conservados e novos, bem como os genes envolvidos na sínteses dos terpenóides. No capítulo 3, bibliotecas de pequenos RNA e RNA-seq foram construídas a partir de folhas de pitanga para identificar miRNAs maduros e pre-miRNAs, respectivamente. De 14.489.131 leituras limpas de pequenos RNA, foram obtidos 1.852.722 sequências de miRNAs maduros que representam 45 famílias conservadas e que foram identificadas em outras espécies de plantas. Análises posteriores, usando contigs montados a partir do RNA-seq, permitiu a predição das estruturas secundárias de 42 pre-miRNAs: 25 conservados e 17 novos. Alvos potenciais foram previstos para os miRNAs maduros mais abundantes nos pre-miRNAs, identificados com base na homologia de sequências. Além disso, a expressão de 27 pre-miRNAs foi validada utilizando ensaios de RT-PCR em diferentes indivíduos de pitanga. Este estudo é o primeiro de identificação em grande escala de miRNAs e seus alvos potenciais de uma espécie da família Myrtaceae, e proporciona mais informação sobre a conservação evolutiva dos vias regulatórias dos miRNAs em plantas com destaques para os miRNAs específicos da pitanga. No capítulo 4, a biblioteca de RNA-seq sequenciada anteriormente foi utilizada para identificar os genes potencialmente envolvidos na via da biossíntese dos terpenos e diversidade dos terpenóides a partir da montagem de novo e a anotação do transcriptoma de E. uniflora. No total, foram identificados 72.742 unigenes com um comprimento médio de 1.048 pb. Destes, 43.631 e 36.289 unigenes foram anotadas com as bases de dados das proteínas não redundantes do NCBI e Swiss-Prot, respectivamente. A ontologia gênica categorizou as sequências em 53 grupos funcionais. A análise das vias metabólicas com KEGG revelou 8.625 unigenes designados a 141 vias metabólicas e 40 unigenes preditos como associados com a biossíntese de terpenóides. Por outro lado, foram identificados quatro genes putativos de terpeno sintases (TPS), de comprimento completo, envolvidos na biossíntese de monoterpenos e sesquiterpenos, e três genes putativos de oxidosqualeno ciclases (OSC), de comprimente completo, envolvidos na biossíntese de triterpenos. Além disso, a expressão destes genes foi validada em diferentes tecidos de E. uniflora. A futura caracterização bioquímica dos diferentes TPS e OSC descritos aqui determinará especificamente o tipo de terpenóide sintetizado em condições ambientais específicas. Os dados produzidos neste estudo servirão como referência para estudos genéticos sobre os mecanismos moleculares que são responsáveis pela composição química dos óleos essenciais em E. uniflora e os aspectos fisiológicos da capacidade de adaptação desta espécie a diferentes habitats. / Pitanga (Eugenia uniflora L.) is a shrubby tree with edible cherry-like fruits that grows in different vegetation types and ecosystems as a consequence of its high adaptability to different soils and climate conditions. This species is of particular interest due to its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites present in their leaves and fruits with potential pharmacological benefits. Among these metabolites, the terpenoids are the most abundant in the essential oils found in the leaves. The terpene diversity observed in Myrtaceae is determined by the activity of different members of the terpene synthase and oxidosqualene cyclase families. Furthermore, miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. For this reason, extensive studies of miRNAs have been performed in model plants and other plants of economic importance in the last years. Therefore, the aim of this study is to generate genomic resources for E. uniflora using next generation sequencing and bioinformatics tools to identify conserved and new miRNAs, and to identify the genes involved in the synthesis of terpenoids. In chapter 3, small RNA and RNA-seq libraries were constructed from leaves to identify mature miRNAs and pre-miRNAs, respectively. From 14.489.131 small RNA clean reads we obtained 1.852.722 mature miRNA sequences, representing 45 conserved families that have been identified in other plant species. Further analysis using assembled contigs from RNA-seq allowed the prediction of secondary structures of 42 pre-miRNAs: 25 conserved and 17 novel. Potential targets were predicted for the most abundant mature miRNAs, which were identified in pre-miRNAs based on sequence homology. In addition, the expression of 27 identified pre-miRNAs was validated using RTPCR assays in different individuals of pitanga. In chapter 4, the previously sequenced RNA-seq library was de novo assembled followed by annotation of the E. uniflora transcriptome and used to identify the genes potentially involved in the terpene biosynthesis pathway and terpenoid diversity. In total, we identified 72.742 unigenes with a mean length of 1.048 bp. Of these, 43.631 and 36.289 unigenes were annotated with the NCBI non-redundant protein and Swiss-Prot databases, respectively. The gene ontology categorized the sequences into 53 functional groups. A metabolic pathway analysis with KEGG revealed 8.625 unigenes assigned to 141 metabolic pathways and 40 unigenes predicted to be associated with the biosynthesis of terpenoids. Furthermore, we identified four putative full-length terpene synthase (TPS) genes involved in sesquiterpenes and monoterpenes biosynthesis, and three putative full-length oxidosqualene cyclase (OSC) genes involved in the triterpenes biosynthesis. In addition, expression of these genes was validated in different E. uniflora tissues. Future biochemical characterization of the different TPS and OSC described here will determine the type of terpenoid specifically synthesized in specific environmental conditions. The data produced in this study will serve as a reference for genetic studies about the molecular mechanisms behind the chemical composition of the essential oils in E. uniflora and about the physiologic aspects of the capacity of adaptation of this specie to different habitats.

As plantas, por serem organismos sésseis, enfrentam persistentemente perturbações ambientais adversas denominadas estresses abióticos, sendo as mais importantes, a seca, a salinidade do solo, as temperaturas extremas e a presença de metais pesados. Em resposta, as plantas desenvolveram mecanismos de tolerância, resistência e prevenção para minimizar a influência do estresse, utilizando estratégias de curto prazo para readaptar rápida e eficientemente seu metabolismo. Neste sentido, os pequenos RNAs não codificantes (sncRNAs) são fortes candidatos para realizar este tipo de regulação. Através do sequenciamento de nova geração revelou-se o papel dos sncRNAs na regulação da expressão gênica em nível transcricional e póstranscricional. Dentre os sncRNAs, os microRNAs (miRNAs) são os mais conhecidos e os fragmentos derivados dos RNAs transportadores (tRFs) são os mais novos e com maiores perspectivas de descobertas futuras. Os miRNAs desempenham papéis regulatórios essenciais tanto no crescimento das plantas quanto no desenvolvimento e resposta ao estresse, enquanto os tRFs, em sua maioria, têm sido associados a respostas de estresse. Eugenia uniflora L., “pitanga” ou a cereja brasileira é uma árvore frutífera nativa da América do Sul que pertence à família Myrtaceae. Ela cresce em diferentes ambientes; florestas, restingas e ambientes áridos e semi-áridos no nordeste brasileiro, sendo uma espécie versátil em termos de adaptabilidade e que desempenha um papel fundamental na manutenção da vegetação costeira arbustiva. Além disso, é muito conhecida por suas propriedades medicinais que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes nas folhas e frutos. E. uniflora representa uma fonte fascinante da biodiversidade do germoplasma e tem um grande potencial como fonte de genes para o melhoramento genético. Portanto, a compreensão dos mecanismos que conferem tolerância ao estresse nesta planta é de particular importância. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho é a identificação de sncRNAs (miRNAs e tRFs) por ferramentas de bioinformática e análise do padrão de expressão destes sob condições de estresse abiótico (seca e salinidade), bem como avaliação dos genes envolvidos nesta resposta. No capítulo 1, bibliotecas de DNA, pequenos RNAs (sRNAs) e RNAseq de folhas foram usadas para identificar pre-miRNAs, miRNAs maduros e potenciais alvos destes miRNAs, respectivamente. A montagem de novo do genoma permitiu identificar 38 miRNAs conservados e 28 novos miRNAs. Após a avaliação da expressão destes, 11 conservados, entre eles miR156 e miR170, mostraram variação significativa nas condições de restinga e de estresse induzido por PEG. A maioria deles foram previamente descritos em processos de estresse em outras espécies. 14 novos miRNAs foram avaliados em diferentes tecidos de pitanga mostrando variação significativa no padrão de expressão. Os alvos destes últimos miRNAs foram preditos e validados por RTqPCR. Eles correspondem a genes de fatores de transcrição e outros genes como transferases ou ATPases e demonstraram o padrão esperado oposto à expressão dos miRNAs. No capítulo 2, as mesmas bibliotecas foram usadas para identificar tRFs conservados na família das Myrtaceae. Para isso, os tRNAs de Eucalyptus grandis e E. uniflora foram anotados e os tRNAs comuns foram utilizados para o ancoramento dos sRNAs. 479 tRFs foram identificados em pitanga, na maioria com 18 nucleotídeos (nt). Um conjunto de 11 tRFs conservados em ambas espécies, assim como seus alvos, foram avaliados em condições de estresse salino e seca demonstrando diferenças significativas dependendo do tipo de estresse. Os alvos identificados correspondem a genes previamente descritos como envolvidos em estresse salino e seca para outras espécies. O presente trabalho apresenta fortes evidências do envolvimento dos miRNAs em processos de desenvolvimento e estresse, assim como dos tRFs na resposta à seca e estresse salino presente em E. uniflora. Além disso, os dados produzidos poderão ser utilizados em estudos funcionais mais aprofundados que servirão para melhor compreensão dos mecanismos de tolerância presentes nesta importante planta. / Plants being sessile organisms, persistently face adverse environmental perturbations termed as abiotic stresses, most important being drought, soil salinity, extreme temperatures, and heavy metals. They developed several strategies such as tolerance, resistance, and avoidance to minimize stress influence, thus require short-term strategies to quickly and efficiently readapt their metabolism. In this sense, small non coding RNAs are strong candidates to do this kind of fine tune regulation. Next generation sequencing technologies have revealed the key role of these sncRNAs in the transcriptional and posttranscriptional gene-expression regulation. Among the myriad of new sncRNAs, miRNAs are the most known ones and the fragments derived from tRNAs (tRFs) are the newest but with high perspective ones. The miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. In the case of tRFs, they are mainly involved in stress response. Eugenia uniflora L., ‘pitanga’ or Brazilian cherry is a fruit tree native to South America that belongs to Myrtaceae family. It grows in several different harsh environments, including forests, restingas, near the beach, and arid and semiarid environments in the Brazilian northeast. This species is very versatile in terms of adaptability and plays a fundamental role in the maintenance of the shrubby coastal vegetation. However, this species is best-known because its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites with known biological activities present in their leaves and fruits. E. uniflora is a fascinating reservoir of germplasm biodiversity and has great potential as a source of genes for plant breeding. Therefore, understanding the mechanisms conferring stress tolerance will be very useful. In this sense, the objective of this work is to identify sncRNAs (miRNAs and tRFs) by bioinformatic tools and to analyze their expression pattern under stress conditions as well as the genes involved in that response. In chapter 1, DNA, small RNA (sRNA) and RNAseq libraries from leaves were used to identify pre-miRNAs, mature miRNAs and potential targets of these miRNAs, respectively. De novo assembly of the genome identified 38 conserved miRNAs and 28 novel miRNAs. After evaluating their expression pattern, 11 11 conserved miRNAs, including miR156 and miR170, showed significant variation in the natural (restinga habitat) and PEG induced stress. Most of them were previously reported in stress processes. 14 novel miRNAs were evaluated in different tissues of pitanga showing significant variation in the expression pattern. The targets of the last miRNAs were predicted and validated by RT-qPCR. They were transcription factor genes and other genes such as transferases or ATPases and showed the expected opposite pattern to miRNA expression. In Chapter 2, the same libraries were used to identify conserved tRFs in the Myrtaceae family. To do this, the tRNAs of Eucalyptus grandis and E. uniflora were annotated and sRNAs mapped into them. 479 tRFs were identified in pitanga with predominance of those with 18 nucleotide length. 11 conserved tRFs in both species, as well as their targets, were evaluated under saline and drought stress conditions showing significant differences depending on the stress type. The targets were genes previously involved in saline and drought stress for other species. The present work shows strong evidences of the involvement of the miRNAs in the development and stress, as well as the tRFs in the tolerance to drought and saline stress of E. uniflora. In addition, the data could be used in more detailed functional studies that will serve to corroborate and better understand the mechanism of tolerance present in this important plant.

Orientador: Fernando Antonio Cabral / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-08T22:16:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LopesFilho_Genival_M.pdf: 416602 bytes, checksum: 4ccc5298df0fb2a67696261d6015fda9 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Pitanga (Eugenia uniflora) é uma fruta nativa do Brasil e amplamente distribuída nos países da América do Sul. Atualmente, seu uso é para a obtenção de polpas e sucos, mas quando se fala do seu potencial antioxidante e propriedades farmacológicas, a pitanga ainda é pouco estudada. Os carotenóides por sua vez, são amplamente conhecidos pelo seu poder corante, valor nutricional, atividade antioxidante e proteção contra algumas doenças. No presente trabalho, foram obtidos extratos a partir dos frutos liofilizados da pitanga usando o dióxido de carbono supercrítico como solvente de extração, nas condições de 40°C e 60°C e nas pressões de 100, 150, 200, 250, 300, 350 e 400 bar. Os ensaios foram realizados em duplicata. Os extratos foram saponificados com KOH metanólico e a análise dos carotenóides foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos. O maior rendimento global em extrato foi de 1,03% na condição de 60°C e 350 bar. Quanto à composição de carotenóides, os extratos apresentaram uma composição complexa sendo b-criptoxantina, licopeno e rubixantina os carotenóides majoritários. A condição de maior concentração de carotenóides totais nos extratos foi a 60°C e 250 bar perfazendo 5474ìg/g, sendo licopeno, rubixantina e cis-licopeno os carotenóides majoritários nesta condição, representando, respectivamente, 49, 22 e 17% do total. Contudo, a melhor condição operacional para extração de rubixantina foi a 40°C e 300 bar (1485 ìg/g). A variação das condições operacionais de temperatura e pressão indicou que o dióxido de carbono supercrítico é seletivo no fracionamento dos diferentes carotenóides, sendo que na isoterma de 60°C não foi detectada a presença de b- criptoxantina nos extratos quando a pressão variou de 200 a 300 bar. Notou-se que para pressões acima de 250 bar, nas duas isotermas, não houve influência das condições operacionais de extração nas concentrações de a e b-caroteno nos extratos / Abstract: Pitanga (Eugenia uniflora) is a fruit native from Brazil and widely distributed in South America. Nowadays, it is used for obtaining pulps and juices, in spite of this, there are few studies analyzing its antioxidant activity and pharmacological properties. On the other hand, the carotenoids, are widely known for their coloring power, nutritional role, antioxidant activity and protection against some diseases. In the present work, extracts of freeze-dried powder of fruits of pitanga were obtained by supercritical carbon dioxide extraction. The operational conditions were as follows: pressures of 100, 150, 200, 250, 300, 350 and 400 bar and temperatures of 40 and 60°C. The assays were conducted in duplicate. The extracts were saponified with 10% methanolic KOH and the carotenoid analysis was carried out by high performance liquid chromatography (HPLC) with diode array detector. The larger global yield was achieved at 60°C and 350 bar (1,03%). All extracts showed a complex carotenoid composition with b-cryptoxanthin, lycopene and rubixanthin as the major carotenoids. The condition of higher carotenoid content in the extract was 60°C and 250 bar, reaching 5474 ìg/g, being lycopene, rubixanthin and cislycopene the major carotenoids, representing, respectively, 49, 22, and 17% of the total amount. However, the best operational condition for rubixantin extraction was at 40°C and 300 bar (1485 ìg/g). The variation of pressure and temperature showed that supercritical carbon dioxide is selective for carotenoids extraction, as was confirmed at 60°C and pressures among 200 and 300 bar. In this condition any b-cryptoxanthin in the supercritical extracts was detected. For pressures above 250 bar, there was no influence of pressure and temperature on the concentration of a and b-carotene in pitanga extracts / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-11-26T10:58:22Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ariadne Gomes Carvalho - 2013.pdf: 15859092 bytes, checksum: 49e244032bbe4e6e46e0c3264cf9c86b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-11-26T12:34:24Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ariadne Gomes Carvalho - 2013.pdf: 15859092 bytes, checksum: 49e244032bbe4e6e46e0c3264cf9c86b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-26T12:34:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ariadne Gomes Carvalho - 2013.pdf: 15859092 bytes, checksum: 49e244032bbe4e6e46e0c3264cf9c86b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-07-19 / Eugenia uniflora L., known as pitangueira, is widely distrubuted in Brazil; its leaves are used in popular medicine as a treatment for diarrhea, fever, inflamation, hyperglycemia and hypertension. The pharmacological activities are due mainly to the phenolic compounds present in its leaves; therefore the aim of this work was to isolate these compounds. Powdered air-dried leaves were homogenized in 50% aqueous acetone. The filtrate was concentrated and extracted with ethyl acetate, yielding AcOEt fraction. The aqueous layer was lyophilized and after that dissolved in methanol to separate the soluble and the insoluble methanolic fractions. The ethyl acetate and methanol soluble fractions were subjected to repeated column chromatography over Diaion HP-20 and Sephadex LH-20. Isolated compounds were analyzed by NMR H1, C13, COSY, HSQC and HMBC (with variable temperature) and mass spectroscopy. The applied technique of temperature variation spectroscopy has proved to be extremely promising for identification of macrocyclic compounds, providing accurate data for not only elucidation but correction of previously described assignments. Two galloyl esters: 2,3-di-O-galloyl-β-D-glucose (26 mg), 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose (92 mg) and two monomeric ellagitannins: 3-O-galloyl-4,6-HHDP-β-D-glucose (540 mg) and2-Ogalloyl- 4,6-HHDP-β-D-glucose (20 mg) were obtained. The methanol soluble fraction furnished three dimeric ellagitannins: oenothein B (770 mg), eugeniflorinD2 (260 mg) and camptothin A (56 mg). In addition to hydrolysable tannins, four flavonoids were also isolated and identified: quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (114 mg), kaempferol-3-O- α-L-rhamnopyranoside (80 mg), myricetin-3-O-α-L-rhamno-pyranoside(32 mg) and myricetin-3-O-(2"-O-galloyl)-α-L-rhamnopyranoside (97 mg).For the first time in this specie the following compounds were found 2,3-di-O-galloyl-β-D-glucose, 1,2,3,4,6- penta-O-galloyl-β-D-glucose, 3-O-galloyl-4,6-HHDP-β-D-glucose, 2-O-galloyl-4,6- HHDP-β-D-glucose, camptothin A, kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside, and myricetin-3-O-(2"-O-galloyl)-α-L-rhamnopyranoside. The methodology applied in this work allowed the isolation and identification of eleven phenolic compounds, in the near future they will be tested in several biological assays. / Eugenia uniflora L., conhecida como pitangueira, é uma espécie amplamente distribuída no Brasil, onde suas folhas são usadas na medicina popular no tratamento de diarréia, febre, inflamação, hiperglicemia e hipertensão. Comprovou-se que muitas das suas atividades farmacológicas se devem aos compostos fenólicos presentes em suas folhas. A fim de isolar e identificar as substâncias fenólicas desta espécie realizou-se extração de suas folhas secas e moídas com uma mistura de acetona e água (1:1).Após a extração a acetona foi removida em rotaevaporador e o extrato aquoso foi particionado com acetato de etila. A fase aquosa foi liofilizada e parcialmente solubilizada em metanol. As frações acetato de etila e solúvel em metanol foram submetidas à cromatografia em coluna com Diaion HP-20 e Sephadex LH-20 como adsorventes. As substâncias isoladas foram caracterizadas por espectroscopia de RMN de 1H e 13C (uni e bidimensional, com variação de temperatura) e massas.A técnica utilizada de espectroscopia com variação de temperatura mostrou-se extremamente promissora para identificação de compostos macrocíclicos, fornecendo dados precisos para elucidação e correção de assinalamentos já previamente descritos.Foram identificados dois ésteres galoílicos: 2,3-di-O-galoil-β-D-glicose (26 mg) e 1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glicose (92 mg), dois elagitaninos monoméricos: 3- O-galoil-4,6-HHDF-β-D-glicose (540 mg) e 2-O-galoil-4,6-HHDF-β-D-glicose (20 mg) e três elagitaninos diméricos: oenoteína B (770 mg), eugeniflorina D2 (260 mg) e camptotina A (56 mg). Além dos taninos hidrolisáveis também foram isolados e identificados quatro flavonóides: quercetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo (114 mg), canferol-3-O-α-L-ramnopiranosídeo (80 mg), miricetina-3-O-α-L-ramnopiranosídeo (32 mg) e miricetina-3-O-(2"-O-galoil)-α-L-ramnopiranosídeo (97 mg). Pela primeira vez foram encontrados nesta espécie os compostos 2,3-di-O-galoil-β-D-glicose, 1,2,3,4,6- penta-O-galoil-β-D-glicose, 3-O-galoil-4,6-HHDF-β-D-glicose, 2-O-galoil-4,6-HHDF-β-Dglicose, camptotina A,canferol-3-O-α-L-ramnopiranosídeo e a miricetina-3-O-(2"-Ogaloil)- α-L-ramnopiranosídeo. Através da metodologia utilizada foi possível isolar e identificar onze compostos polifenólicos, que serão posteriormente testados em diversos ensaios biológicos.

Orientadores: Fernando Antonio Cabral, Alessandra Lopes de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-12T07:32:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peixoto_CamilaArantes_D.pdf: 1203931 bytes, checksum: c453369b0ad4f9252d730ea40671e0ad (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Averiguado que não existe na literatura a caracterização de extratos obtidos por fluido supercrítico das folhas de Eugenia uniflora L. (pitangueira), este trabalho visou à obtenção destes extratos variando as condições de extração supercrítica no que se refere à temperatura e pressão de 30, 40, 50 e 60 °C e 100, 150, 200, 250 e 300 bar. Verificou-se que as condições ótimas de rendimento para o processo foram as de 40 ºC e 300 bar e a 60 ºC, nas pressões de 250 e 300 bar, que corresponderam aos rendimentos: 3,68, 3,54 e 3,96 %, respectivamente. Os extratos das folhas obtidos por extração supercrítica, por hidrodestilação e por microextração em fase sólida foram caracterizados. Os compostos majoritários encontrados no extrato obtido por hidrodestilação foram curzereno (34,76 %), germacreno B (11,84 %) e C15H20O2 (9,56 %). Os compostos: ß-elemeno, ß-cariofileno e ?-elemeno estão presentes tanto no óleo essencial das folhas como também no extrato obtido por microextração em fase sólida. O composto majoritário presente nos extratos supercríticos foi o C15H20O2 seguido de curzereno e germacreno B. Pelo método de DPPH (1,1-difenil-2-pirilhidrazina) o extrato obtido com álcool hidratado é o que apresenta maior atividade antioxidante, visto o maior conteúdo de fenóis totais, dentre todos os extratos obtidos das folhas de E. uniflora. O valor da atividade antioxidante expressa em CI50 para o extrato etanólico das folhas de pitangueira foi 16,95 µg/mL. A modelagem termodinâmica clássica foi empregada para estimar a solubilidade dos componentes majoritários do extrato / Abstract: Examined in the literature that there is not the characterization of extracts obtained by supercritical fluid from the leaves of Eugenia uniflora L. (Surinam cherry), this work aimed to obtain these extracts varying conditions of supercritical extraction as regards temperature and pressure of 30, 40, 50 and 60 °C an d 100, 150, 200, 250 and 300 bar. It was found that the optimum operational conditions for the process were 40 ºC and 300 bar and 60 ° C, at pressures of 250 and 300 bar, which corresponded to yield of: 3,68; 3,54 and 3,96 %, respectively. The extracts of the leaves obtained by supercritical extraction, by hydrodistillation and by solid phase microextraction were characterized. The majority compounds found in the extract obtained by hydrodistillation were curzerene (34,76 %), germacrene B (11,84 %) and C15H20O2 (9,56 %). The compounds: ß-elemene, ß- caryophyllene and ?-elemene are presented in the essential oil of the leaves as well in the extract obtained by solid phase microextraction. The major compound presented in supercritical extracts was C15H20O2 followed by curzerene and germacrene B. By the DPPH antioxidant activity method, the extract obtained with hydrated alcohol presented the higher antioxidant activity, because the higher concentration of total phenols among all the extracts obtained of the leaves of E. uniflora. The value of antioxidant activity expressed in IC50 for the hydrated alcohol extract of the leaves of E. uniflora was 16,95 g/mL. The classical thermodynamic modeling was used to estimate the solubility of major components of the extract / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos

Orientadores: Fernando Antonio Cabral, Losiane Cristina Paviani / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-23T09:13:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Diniz_TabataTayaraGarmus_M.pdf: 2219524 bytes, checksum: d534ef54252dcca6946c4b832f819e43 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Esse trabalho objetivou, através da combinação de processos de extração, a obtenção de extratos naturais a partir de folhas de pitanga (Eugenia uniflora L.) e de folhas de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.). Os extratos foram obtidos por extração sequencial em leito fixo a 60 ºC e 400 bar, primeiro por extração com dióxido de carbono supercrítico (scCO2), seguido por extração com etanol em uma segunda etapa e por último, extração com água (terceira etapa). Curvas de extração (rendimento de extrato em função da massa de solvente) foram obtidas no intuito de se avaliar o desempenho da extração quanto ao rendimento em função do tipo de solvente. Todos os extratos foram avaliados quanto ao teor de fenóis e flavonoides totais e a fração volátil obtida na primeira etapa com scCO2 foi avaliada quanto ao seu perfil químico por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC-EM). Para efeito de comparação, mais dois tipos de extratos etanólicos e aquosos foram obtidos: 1) Extratos em etapa única a partir das folhas, com etanol e com água em leito fixo a 60 °C e 400 bar sem prévia extração com scCO2 e 2) Extratos convencionais utilizando um sistema a baixa pressão e 60 ºC. A análise dos resultados mostrou que o caráter do solvente empregado influenciou significativamente no processo de obtenção dos extratos, pois o rendimento apresentou tendência de aumento com o aumento da polaridade do solvente, sendo os extratos aquosos os de maior rendimento, seguidos dos etanólicos e por último os supercríticos. O estudo apontou o processo de extração sequencial (em três etapas) como o mais eficaz em termos de rendimento global de extração e de fenóis e flavonoides totais para Eugenia uniflora. O extrato obtido com etanol (60 ºC e 400 bar) após extração supercrítica e o extrato obtido com scCO2 apresentaram as maiores concentrações de fenóis e flavonoides totais, respectivamente, dentre todos os extratos obtidos das folhas de E. uniflora L. Na matriz Lippia sidoides Cham., o processo de extração etanólica a 60 ºC e 400 bar em etapa única permitiu obter extratos mais concentrados em fenóis e flavonóis e o melhor rendimento de flavonoides totais. Os resultados para o rendimento de compostos fenólicos do alecrim-pimenta aponta a extração sequencial como a mais eficiente. A influência da extração supercrítica prévia foi diferente dependendo da matriz vegetal estudada. O scCO2 como primeiro solvente de extração permitiu obter extratos etanólicos e aquosos mais concentrados em compostos fenólicos para pitanga / Abstract: The objective of this study was to obtain natural extracts from leaves of pitanga (Eugenia uniflora L.) and pepper-rosmarin (Lippia sidoides Cham.) with the combination of different sequential extraction techniques. The extracts were obtained by sequential extraction in fixed bed (60 °C and 400 bar), first by extraction with supercritical carbon dioxide (scCO2), followed by extraction with ethanol in a second step and finally extracted with water in a third step. Extraction curves (yield of extracts by the mass of solvent) were obtained in order to evaluate the performance of the extraction yield due to the type of solvent. All extracts were evaluated for their content of total phenols and flavonoids and the more volatile fraction obtained in the first step with scCO2 was evaluated for its chemical profile by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). For comparison, two types of ethanol and aqueous extracts were obtained: 1) single-step extracts from the leaves with ethanol and water in the fixed bed at 60 °C and 400 bar without prior extraction with scCO2 and 2) extracts using a conventional low pressure system and 60 °C. The results showed that the nature of the solvent employed strongly influenced the process of obtaining extracts, as the yield showed a tendency to increase with increasing polarity of the solvent. The aqueous extracts showed the highest yield, followed by ethanol and finally the supercritical The study pointed out the process of sequential extraction (three-step) as the most effective in terms of global extraction yield and total phenols and flavonoids for Eugenia uniflora. The extract obtained with ethanol (60 °C and 400 bar) after supercritical extraction and the extract obtained with scCO2 were those with the highest concentrations of total phenols and flavonoids, respectively, among all the extracts obtained from the leaves of E. uniflora L. At Lippia sidoides Cham. matrix, the process of single-step ethanolic extraction at 60 °C and 400 bar obtained more concentrated yields in phenols and flavonols and the best yield of total flavonoids. The results for the yield of phenolic compounds from pepper-rosmarin indicate the sequential extraction as the most efficient process. The influence of prior supercritical extraction was different according to plant matrix studied. The scCO2 as the first extraction step yielded ethanolic and aqueous extracts more concentrated in phenolic compounds for E. uniflora / Mestrado / Engenharia de Alimentos / Mestra em Engenharia de Alimentos

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais da Universidade do Extremo Sul Catarinense-UNESC, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Ambientais. / The medicinal plants always were utilized by population, in the past they were the main therapeutic resource for treatment diseases. Among these therapeutic resources find the medicinal plant Calea uniflora Less., native by region south find also south central of Brazil, Argentina, Uruguay and Paraguay. This plant is utilized populary to process inflammatory and hematomas. From these informations and due the few studies with C. uniflora, emerged the interest of investigate possible compounds chemical, cytotoxic effects, antinociceptive effects, and anti-inflammatory. To the phytochemistry evaluation were analyzed the crude extract of plant by HPLC. To the evaluation about activity cytotoxic, were utilized the MTT test, in vitro, in order to verify as extract and fractions de C. uniflora cause possible effects cytotoxic. To evaluation of antinociceptive activity and anti-inflammatory were utilized models in vivo. This animals models were based in chemical stimuli (writhing induced by acetic acid and formalin test) and thermal stimuli (hot plate), while the motor incoordination was analized by rota rod. To evaluate activity anti-inflammatory was used the model paw edema induced by carrageenan. After the performing the tests, verified in the analyses phytochemistry the presence the flavonoid and alkaloid. In the test cytotoxic in vitro, the crude extract and fractions of ethyl acetate and butanol produce IC50 greater that 58 μg/ml to lineage HaCaT and 48 μg/ml to lineage B-16, thus this values not present a cytotoxic effects. However fraction dichloromethane produced IC50 18 μg/ml, showed significant inhibition when compared to controls vincristine and doxorubicin. In relation of antinociceptive activity, the models presented results significant that correspond to chemical and thermal stimuli in the doses of 100 and 300 mg/kg of the crude extract, when compared with the control groups. The rota rod model showed satisfactory results, since the extract did not cause motor incoordination and sedation. According this results, can be related the flavonoids and alkaloids with pharmacological activities reported by agents of “pastoral da saúde” with the antinociceptive and cytotoxic activities. However further studies are needed to determine the action of the activities described and relate to the chemical compounds present in the plant. / As plantas medicinais sempre foram utilizadas, sendo no passado o principal recurso terapêutico conhecido para o tratamento de enfermidades pela população. Dentre elas encontra-se Calea uniflora Less., planta medicinal nativa da região sul do Brasil encontrada também no centro-sul do Brasil, Argentina, Uruguai e Paraguai. Esta planta é utilizada popularmente para processos inflamatórios e hematomas. A partir destas informações e devido aos poucos estudos com a C. uniflora, surgiu o interesse em investigar os possíveis constituintes químicos, efeitos citotóxicos, efeitos antinociceptivo e anti-inflamatório desta espécie, para a avaliação fitoquímica foram analisados os extratos brutos da planta, através de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Para a atividade citotóxica, foi utilizado o teste de MTT, in vitro, a fim de verificar se o extrato e as frações de C. uniflora apresentaram efeitos citotóxicos. Para a avaliação das atividades antinociceptiva e anti-inflamatória foram utilizados modelos in vivo. Os modelos animais antinociceptivos empregados foram baseados em estímulos químicos (modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético, teste da formalina) e estímulos térmicos (placa quente), enquanto a possível incoordenação motora foi analisada pelo teste rota rod, e para a avaliação anti-inflamatória utilizou-se o modelo de edema de pata induzido por carragenina. Após a realização dos testes, verificamos, na análise fitoquímica, à presença de flavonoides e alcaloides. Na atividade citotóxica in vitro, os extratos brutos e as frações de acetato de etila e butanol apresentaram uma IC50 maior que 58 μg/ml para linhagem HaCaT e 48 μg/ml para a linhagem B-16, sendo assim esses valores não apresentaram um efeito citotóxico. Entretanto a fração do diclorometano apresentou uma IC50 de 18 μg/ml, mostrando inibição significativa quando comparada aos controles vincristina e doxorrubicina. Em relação à atividade antinociceptiva observou-se resultados significativos nos modelos que correspondem a estímulos químicos e térmicos nas doses de 100 e 300 mg/kg do extrato bruto, quando comparados aos grupos controles. No modelo rota rod os resultados foram satisfatórios, pois o extrato não causou incoordenação motora e sedação nas doses avaliadas. Entretanto, pode-se relacionar com os flavonoides e alcaloides com as atividades farmacológicas relatadas popularmente e com as atividades citotóxicas e antinociceptiva. Entretanto são necessários novos estudos para determinação do mecanismo de ação das atividades descritas bem como relacionar com os compostos químicos presentes na planta.