S'han estudiat les característiques de la inducció de tumors de vies urinàries en rates Sprague-Dawley amb 2,2-dioxo-di-n-propilnitrosamina, un metabòlit intermediari en el procés d'activació de la di-n-propilnitrosamina per beta-oxidació, tot relacionant la incidència de lesions amb la dosi i la durada de l'exposició al carcinògen, el sexe de l'animal, i la localització. Per tal d'establir la utilitat del model experimental, s'ha comparat la morfologia dels tumors i les lesions preneoplàsiques induïdes amb una àmplia sèrie de tumors i lesions associades de vies urinàries en l'home. Igualment, s'ha comparat, per mitjà de tècniques immunohistoquímiques, l'expressió de marcadors estructurals i funcionals en els tumors i les lesions preneoplàsiques del model d'experimentació i en els de la sèrie humana revisada.La 2,2-dioxo-di-n-propilnitrosamina (DOPN) s'ha administrat per via subcutània a tres grups experimentals, cada un d'ells composta per 30 rates Sprague-Dawley (15 mascles i 15 femelles), a dosis setmanals corresponents a 1/5, 1/10 i 1/20 de la dosi letal mitjana (LD(50)=123 mg/Kg per als mascles, 107 mg/Kg per a les femelles). Un quart grup ha estat mantingut com a control, tractat amb CINa.S'han revisat tots els casos de neoplàsies de vies urinàries registrats a l'arxiu de Patologia Quirúrgica del Departament d'Anatomia Patològica de l'Hospital Clínic de la Facultat de Medicina de la Universitat de Barcelona, compresos en el periode 1976-1985. La sèrie de tumors de pelvis renal s'ha ampliat fins al 1968, amb un total de 20 tumors d'aquesta localització. S'han valorat separadamente els casos que presentaven diverses biòpsies al llarg del temps de l'estudi, estudiant les característiques de les lesions en relació amb l'evolució posterior.L'estudi immunohistoquímic s'ha realitzat amb la tècnica del complex avidina-biotina-peroxidasa (ABC), fent servir anticossos anti-TPA-B(1), EMA, CEA, i la lectina de l'Ulex Europaeus (UEA-I). L'adminlstració de DOPN a les rates Sprague-Dawley ha induït una elevada proporció de tumors de vies urinàries. La incidència de tumors ha estat superior amb les dosis més altes, en femelles més que en mascles, i en pelvis renal més que en bufeta urinària. En el gru~ experimental tractat amb les dosis més altes (1/5 LD(50)) s'han induït tumors de pelvis renal en el 100% de les femelles i en el 73% dels mascles. Dels 66 tumors induits en total en els tres grups, 65 han estat neoplàsies de cèl.lules transicionals, i l'altre un carcinoma escamós. Han predominat els papil.lomes i carcinomes de baix grau. El 27% dels tumors induïts han estat invasors. La diferenciació escamosa ha estat freqüent en tumors de tots els graus. La freqüència ha estat superior en els carcinomes invasors que en els tumors no invasors. Només s'ha identificat un carcinoma escamós pur sense presència de component transicional, La hiperplàsia ha estat l'alteració més freqüent de l'uroteli no tumoral. S'ha observat en el 94% dels animals amb tumor i en el 51% dels animals sense tumor dels grups experimentals, tant en pelvis renal com en bufeta urinària. Lesions displàsiques i carcinornes "in situ" s'han identificat només en sis animals, i en tots els casos s'associaven a carcinomas invasors de grau II i III.No s'ha observat reacció positiva valorable dels tumors ni de les lesions preneoplàsiques experimentals amb anticossos contra TP, EMA i CEA. la lectina de l 'Ulex Europaeus (UEA-I) ha marcat positivamente la majoria dels tumors experimentals, independentment del seu grau i de la presència o no d'invasió, però no ha marcat l'uroteli normal ni tampoc les cèl.lules endotelials ni els eritròcits.En la sèrie de 627 tumors humans de vies urinàries revisats, el 95,7% dels tumors eren localitzats a la bufeta urinària, el 2,2% a l'urèter i el 2,1% a la pelvis renal. Més del 50% dels tumors de pelvis renal han aparegut aïlladament, sense associar-se ni sincrònicament ni metacrònicament a tumors d'altres segments de la via urinària. El 98,7% dels tumors humans revisats han estat neoplàsies de cèl.lules transicionals, i el 1,3% restant carcinomas escamosos. Entre els tumors transicionals, el 7,4% eren papil.lomes, el 74% carcinomes papil.lars, i el 17,8% carcinomes no papil.lars. La diferenciació adenocarcinomatosa ha estat més freqüent que la diferenciació escamosa en els carcinomes transicionaIs humans. Totes dues s'associen sempre amb carcinomes invasors, preferentment d'alt grau, la hiperplàsia de I 'uroteli no tumoral s 'ha trobat associada a la majoria de tumors transicionaIs de baix grau. La majoria dels carcinomes de grau II han presentat displàsia urotelial associada. El carcinoma "in situ" és la lesió que s'ha associat amb més freqüència als carcinomes de grau III.Tant l'antígen polipeptídic tissular (TPA) com l'antígen de membrana epitelial (EMA) són positius en la majoria de tumors i lesions preneoplàsiques humanes, sense que permetin detectar diferents patrons de positivitat en relació amb les característiques del tumor ni amb l'evolució posterior de cada cas. La presència de CEA ha estat inconstant tant en els tumors com en l'uroteli no tumoral, per bé que s'ha detectat amb freqüència en els tumors d'alt grau. La presència de l'antígen H del sistema ABH dels grups sanguinis, detectat amb l'UEA-I, ha estat més marcada en els carcinomes papil.lars de grau l que amb els de grau II i III. Tots els carcinomes invasors no papil.lars han resultat positius. L'expressió d'aquest antígen tendeix a reduïr-se en l'uroteli normal associat a carcinomes invasors, però no en els casos de tumors no invasors que van desenvolupar posteriorment carcinoma invasor. En les hiperplàsies, la reacció ha estat sempre positiva, i ha estat generalment negativa en les lesions displàsiques.En conclusió, l'administració de DOPN a rates Sprague-Dawley constitueix un model experimental útil per a l'estudi de la carcinogènesi de les vies urinàries, i especialment de la pelvis renal, atès que és capaç d'induir tumors de pelvis renal en una elevada proporción d'animals; igual que succeeix en l'home, la majoria dels tumors de pelvis renal no s'associen amb altres tumors de vies urinàries, igual que en la sèrie humana, més del 98% dels tumors son derivats de l'epiteli transicional; es poden intuir tumors de tots els graus histològics, per bé que la proporció de tumors de baix grau és més alta que en l'home. Tant en aquest model experilnental com en la sèrie humana, la presència d'invasió es correlaciona amb el grau histològic del tumor.En els tumors experimentals, la lectina UEA-I detecta probablement estructures hidrocarbonades diferents dels antígens relacionats amb els grups sanguinis. De la mateixa manera, l'expressió d'estructures no relacionades amb els grups sanguinis explicaria la positivitat dels carcinomes no papil.lars humans per a aquest marcador. Tant en el model experimental com en la sèrie humana, les alteracions proliferatives de l'uroteIi no tumoral reflecteixen, en general, el grau histològic del tumor al qual s'associen. Probablement, aquestes lesions no tenen més valor pronòstic que el mateix grau del tumor, excepte en una petita proporció de carcinomes de baix grau amb alteracions displàsiques associades, i en els casos en que es detecten lesions displàsiques o carcinoma "in situ" aïllats. / Subcutaneous administration of 2,2-dioxo-di-n-propylnitrosamine (DOPN), an intermediate metabolite in the beta-oxidation pathway of di-n-propylnitrosamine, to three experimental groups of Sprague-Dawley rats, with weekly doses corresponding to 1/5, 1/10 and 1/20 LD(50) (LD(50)=123mg/Kg for males, 107 mg/Kg for females) induced a high rate of urinary tract tumours, with higher incidence with higher doses, in females, and in renal pelvis. 100% of females belonging to the highest dose group developed renal pelvic tumours. In all, 66 tumours were induced, 65 of which were or transitional cell type. Experimental tumours were compared with a series or 627 human urinary tract tumours. A higher rate of low grade tumours was found in the experimental series than in humans. Both in Experimental end human tumours, the presence of invasion correlated well with histological grade. Squamous differenciation was more frequent in experimental tumours. Conversely, adenocarcinomatous differentiation was more frequent than squamous differentiation in human tumours, being found only in one experimental case. Squamous differentiation correlated with invasion both in experimental and human tumours. Proliferative changes in non-tumoral urotheliurn usually reproduced the histological grade of tumours. Dysplasia and carcinoma "in situ" were seldom found in the experimental series, being always related to invasive carcinomes. Experimental tumours did not react with anti-ERA, TPA and CEA antibodies. UEA-I lectin reacted strongly in Experimental tumours, whatever their grade. UCA-l reaction decreased with grade rising in human papillary carcinomas, but was constantly found in non-papillary invasive carcinomas. It is concluded that subcutaneous administration or DOPN to Sprague-Dawley rats provides a useful experimental model for the study of urinary tract carcinogenesis, especially in respect to renal pelvis tumours.

El trasplante renal es la mejor opción disponible para el tratamiento de la enfermedad renal crónica avanzada, tanto en términos de supervivencia como de calidad de vida de los pacientes. La escasez de órganos disponibles para el procedimiento es la mayor limitación de este tipo de terapéutica y por tanto prolongar la vida útil de los injertos renales es la principal prioridad en el contexto del trasplante renal. Después del primer año de funcionamiento del trasplante, la disfunción crónica del injerto (DCI) constituye la principal causa de daño y perdida injerto renal. Esta tesis es un análisis de la correlación del estudio del proteoma urinario mediante espectrometría de masas con la severidad y subtipo histológico de la disfunción crónica del injerto. Los sujetos fueron agrupados según el resultado de la biopsia del injerto y el análisis proteómico mediante espectrometría de masas se realizó en una muestra obtenida antes de realizar la biopsia por indicación clínica. Se realizaron dos tipos de estrategias mediante espectrometría de masas: un primer abordaje, utilizando MALDI- TOF, previa extracción del muestra mediante cromatografía de fase reversa mostró diferencias en el perfil proteómico urinario entre sujetos sanos, pacientes trasplantados con buena función del injerto renal y pacientes con disfunción crónica del injerto. Un segundo estudio mediante LC-MS-MS cuantificó estas diferencias y además aportó información acerca de la secuencia de los péptidos diferenciales. Péptidos específicos derivados de uromodulina y bradiquinina son candidatos a biomarcadores de buen funcionamiento del injerto renal, ya que su presencia en la orina puede ser utilizada para discriminar entre pacientes trasplantados con disfunción del injerto renal y pacientes trasplantados con buena función del injerto. Los niveles elevados del ión 642.5 y niveles bajos del ión 638.0 derivado de uromodulina son característicos de la orina proveniente de pacientes con disfunción crónica del injerto y permiten detectar sus subtipos histológicos. Los iones de m/z 645.59 y m/z 642.61 estaban aumentados de forma significativa en pacientes con rechazo crónico activo mediado por anticuerpos respecto a pacientes con fibrosis intersticial y atrofia tubular aislada (4.4-2.7 fold change) y pacientes trasplantados con función estable del injerto (5.3-14.6 fold change) permitiendo cuantificar las diferencias entre estos dos subtipos de disfunción crónica del injerto ya demostradas en los análisis cualitativo con MALDI-TOF. Este trabajo es la primera prueba de concepto de la utilidad de la proteomica urinaria para detectar biomarcadores y el futuro diseño de una herramienta diagnóstica no invasiva en la disfunción crónica del injerto y en dos de sus subtipos histológicos: Fibrosis intersticial y atrofia tubular sin evidencias de otras lesiones y el Rechazo crónico activo mediado por anticuerpos. / Despite optimal immunosuppressive therapy, more than 50% of kidney transplants fail because of chronic allograft dysfunction. A noninvasive means to diagnose chronic allograft dysfunction may allow earlier interventions that could improve graft half-life. In this proof-of-concept study, we used mass spectrometry to analyze differences in the urinary polypeptide patterns of patients with chronic allograft dysfunction ( with pure interstitial fibrosis and tubular atrophy and with chronic active antibody-mediated rejection) and control subjects (stable recipients and healthy control subjects). Unsupervised hierarchical clustering showed good segregation of samples in groups corresponding mainly to the four biomedical conditions. Moreover, the composition of the proteome of the pure interstitial fibrosis and tubular atrophy group differed from that of the chronic active antibodymediated rejection group, and an independent validation set confirmed these results. Specific peptides derived from uromodulin and kininogen were found to be significantly more abundant in control than in CAD patients and correctly identified the two groups. These peptides are therefore potential biomarkers that might be used for the diagnosis of CAD. In addition, ions at m/z 645.59 and m/z 642.61 were able to differentiate between patients with different forms of CAD with specificities and sensitivities of 90% in a training set and, significantly, of 70% in an independent validation set of samples. Interestingly low expression of uromodulin at m/z 638.03 coupled with high expression of m/z 642.61 diagnosed CAD in virtually all cases. Multiple reaction monitoring experiments further validated the results, illustrating the power of our label-free quantitative LC-MS approach for obtaining quantitative profiles of urinary polypeptides in a rapid, comprehensive, and precise fashion and for biomarker discovery. In summary, this study establishes a pattern for two histologic lesions associated with distinct graft outcomes and constitutes a first step to designing a specific, noninvasive diagnostic tool for chronic allograft dysfunction.

A pesar de los importantes avances en el conocimiento de la patogenia de las infecciones del tracto urinario (ITU) que se han producido en los últimos años, persisten aún numerosas incógnitas por despejar. A modo de ejemplo cabe señalar que desconocemos gran parte de los mecanismos por los que algunos gérmenes consiguen acantonarse en la próstata, si existen o no factores de virulencia bacterianos y/o del huésped adicionales a los ya conocidos implicados en la aparición de infecciones urinarias recurrentes (ITURs), o el mecanismo por el que ciertas pacientes presentan cuadros de ITU más graves que otras. En relación al estudio de los factores de virulencia, la implicación de la producción de biopelícula por parte de cepas uropatógenas de Escherichia coli, el germen causal más frecuente de las ITUs, en su patogenia ha sido hasta el momento poco estudiada. Si se confirmara dicha implicación, particularmente en la patogenia de las prostatitis o de las ITURs, ello permitiría por ejemplo ajustar de forma individualizada la duración óptima de los tratamientos antibióticos en función de la producción o no de biopelícula.En relación al estudio de los factores dependientes del huésped el campo de estudio es aún mayor. A modo de ejemplo, varios estudios experimentales han evidenciado la importancia de la interleuquina 8 (IL-8) y de sus receptores (CXCR1 y CXCR2) en la patogenia de las ITU, aunque estas observaciones no han podido ser confirmados en humanos. Por otra parte, a pesar de existir numerosas evidencias científicas sobre la implicación de la proteína fijadora de manosa (MBL), otro componente de la inmunidad innata, en la mayor frecuencia y gravedad de ciertos procesos infecciosos, dicha asociación no ha sido evaluada en el caso de las ITU.El objetivo de la presente tesis ha sido analizar: 1. La expresión y la presencia de polimorfismos en el gen de los receptores de la IL-8 en mujeres con ITUR y la presencia de polimorfismos en el gen de la MBL en pacientes con pielonefritis aguda y shock séptico.2. La producción de biopelícula por cepas de UPEC en las diferentes formas de ITU, incluyendo las prostatitis agudas y las ITUR.Los resultados de la presente tesis ha permitido: 1. Conocer mejor la patogenia de la infección urinaria recurrente, tanto en lo que se refiere a los factores dependientes del huésped (disminución de la expresión de CXCR2 pero no de CXCR1 y ausencia de polimorfismos significativos en el gen CXCR1), como a la demostración de la implicación de la producción de biopelícula en el caso de las cistitis recurrentes. 2. Demostrar que aquellas pacientes con una pielonefritis aguda que presentan polimorfismos en el gen de la MBL, asociados a baja producción de MBL, tienen un riesgo mayor de desarrollar un shock séptico. 3. Que las cepas de UPEC aisladas de pacientes con prostatitis aguda producen con mayor frecuencia biopelícula. / The main objective of this doctoral thesis has been to increase the knowledge on the pathogenesis of urinary tract infections (ITUs), studying not only the microorganism, Escherichia coli, but also the host. Regarding the microorganism, the mechanisms by which some remain in the prostate or cause recurrent ITUs are not well understood. Several evidence point that host genetic factors may predispose to recurrent UTIs or to severe forms of UTIs. The objective of this doctoral thesis has been to analyze: 1. The expression of CXCR1 and CXCR2 and the existence of polymorphisms in the CXCR1 gene in women with recurrent UTIs and the presence of polymorphisms in the MBL2 gene in patients with acute pyelonephritis and septic shock. 2. The synthesis of biofilm by E. coli in the different clinical forms of UTIs including acute prostatitis and recurrent ITUs.This thesis has demonstrated that: 1. Women with recurrent UTIs have a lower expression of CXCR2 but not CXCR1 and that biofilm is involved in the pathogenesis of recurrent UTIs. 2. Women with acute pyelonephritis and polymorphisms in the MBL2 gene, related low MBL concentration, have an increased risk of septic shock. 3. E. coli strains involved in acute prostatitis produce biofilm more frequently.

Klebsiella spp., particularmente Klebsiella pneumoniae, es un importante agente causal de infecciones nosocomiales. Las principales infecciones producidas por K. pneumoniae son las neumonías y las infecciones del tracto urinario.En las bacterias gram-negativas el lipopolisacárido (LPS) constituye el antígeno superficial más importante y consta de tres regiones principales: el lípido A, el núcleo del lipopolisacárido, y el antígeno O. Los determinantes genéticos de la biosíntesis del antígeno O y del núcleo del LPS han sido ampliamente estudiados en las Enterobacteriaceae y en otras bacterias gram-negativas.Un total de ocho pautas abiertas de lectura completas (ORFs) eran necesarias para la producción del antígeno O5 del LPS de K. pneumoniae cepa KT769. Mediante el uso de mutantes O5- y la correspondiente cepa salvaje y los mutantes complementados con la agrupación génica wb[O5], hallamos que la presencia del antígeno O5 de K. pneumoniae es esencial para algunas de las características patogénicas de esta bacteria.En un segundo trabajo fue descrita la agrupación génica wb responsable de la biosíntesis del antígeno O12 de K. pneumoniae. Un total de ocho ORFs eran necesarias para la producción del antígeno O12 del LPS de K. pneumoniae cepa KT776. El análisis de la agrupación génica wb[O12] de K. pneumoniae mostró interesantes coincidencias con la agrupación génica wb[O4] de Serratia marcescens. Este hecho nos llevó a estudiar las complementaciones entre las agrupaciones génicas de ambas enterobacterias utilizando mutantes de S. marcescens N28b (O4) y K. pneumoniae KT776 (O12). Los genes wzm-wzt y los genes wbbA o wbbB no eran intercambiables entre ambas agrupaciones génicas, independientemente de los elevados niveles de similitud existentes. Sin embargo, la introducción de los tres genes de una misma agrupación (wzm-wzt-wbbA o wzm-wzt-wbbB) en mutantes incapaces de producir el antígeno O permitió la producción del antígeno O específico de esa agrupación. La proteína WbbL de K. pneumoniae O12 realiza la misma función que la WbbL de S. marcescens O4 tanto en S. marcescens O4 como E. coli K-12.En nuestro último trabajo caracterizamos completamente la agrupación génica waa, implicada en la biosíntesis del núcleo del LPS de la cepa 52145 de K. pneumoniae. Esta agrupación génica presenta tres ORFs diferentes en K. pneumoniae 52145 en comparación con la agrupación waa de K. pneumoniae C3, que había sido descrita previamente. La caracterización genética de la agrupación mostró que las diferencias genéticas en la cepa 52145 implican la existencia de diferencias a nivel de la estructura química del núcleo del LPS de esta cepa.

En España se diagnostican cada año unos 12.000 nuevos casos de carcinoma urotelial (CU). Más concretamente, en Cataluña este tumor representa entre un 9,9 y un 11,7% del total de tumores malignos, dando lugar a una mortalidad cáncer específica del 5,2% en el sexo masculino. Aunque en la mayoría de casos la enfermedad se acaba detectando en su fase más inicial, la alta frecuencia de recidivas y la posibilidad de progresión y diseminación debido a la agresividad de algunas formas limitarán la supervivencia del paciente.El método estándar para la detección y seguimiento del CU se basa en la combinación de la citología urinaria y la cistoscopia. Sin embargo, la primera de estas técnicas presenta baja sensibilidad en la detección de tumores de estadio inical y bajo grado, mientras que la segunda es una técnica invasiva que además no es lo suficientemente sensible para detectar todas las lesiones de crecimiento plano.Por otro lado, las técnicas histológicas convencionales para el diagnóstico de la diseminación linfática del CU no son lo suficientemente sensibles ya que alrededor del 50% de pacientes sometidos a cirugía radical con linfadenectomía N0, fallecen antes de los 5 años post-cirugía. Estos datos sugieren que existe una diseminación tumoral antes de la cirugía que no es detectada mediante estas técnicas histológicas.Debido a la elevada prevalencia y gravedad de la enfermedad, a la invasividad de las pautas utilizadas en su diagnóstico y a la falta de métodos de estadiaje refinados, el desarrollo de nuevos sistemas diagnósticos que permitan una detección temprana tanto del CU inicial como de sus recidivas y de su diseminación es esencial para mejorar la calidad de vida y el pronóstico de los pacientes con esta enfermedad.En el presente trabajo se ha evaluado la utilidad de la técnica "fluorescence in situ hibridization" (FISH) en el diagnóstico no invasivo del Cu de bajo estadio, en el diagnóstico no invasivo del CU localizado en el tracto urnario superior (TUS) y en el pronóstico de pacientes con CU de alto riesgo de recurrencia y progresión, tratados mediante inmunoterapia con el bacilo de Calmette Guérin (BCG). Por otro lado se ha intentado detectar la presencia de micrometástasis linfáticas así como de diseminación sanguínea del CU, mediante marcadores moleculares en pacientes sometidos a cistectomía y linfadenectomía radical.Los resultados obtenidos indican que la técnica FISH basada en los cromosomas 3, 7, 9 y 17 presenta mayor sensibilidad que la citología urinaria, y una similar especificidad equivalente en la detección del CU no músculo-infiltrante, así como en la detección del CU localizado en el TUS. La naturaleza no invasiva de este ensayo así como su elevada sensibilidad y especificidad podrían contribuir a mejorar el actual diagnóstico/seguimiento del CU en estas localizaciones. Otro resultado interesante fue que los pacientes con un resultado positivo de FISH tras la terapia BCG tienen mayor probabilidad de presentar una recurrencia del tumor. Así, la técnica FISH parece ser útil en el seguimiento de los pacientes con un tumor no músculo-infiltrante de alto riesgo de recurrencia y progresión sometidos a terapia BCG. Finalmente, se observó que la utilización de marcadores moleculares permite mejorar la sensibilidad del análisis histopatológico en la detección de la diseminación linfática tumoral y que la linfadenectomía juega un importante papel curativo eliminando la enfermedad microdiseminada. Sin embargo, el análisis de la expresión génica en muestras de sangre periférica no es adecuado para seleccionar a aquellos pacientes que desarrollarán metástasis detectables clínicamente, aunque sí permite distinguir entre pacientes con CU de controles sanos. / Cystoscopy and cytology are the standard methods to detect and monitor urothelial carcinoma (UC). Cystoscopy is an invasive technique (especially to visualize the upper urinary tract or UUT) that has a high sensitivity, except in flat malignancies. Cytology has the advantage of being non-invasive with a high specificity, but it lacks sensitivity and produces high rates of suspicious cases, especially for low-stage and low-grade tumors. Another weak point in the clinical management of UC is the fact that current methodologies to detect disseminated UC lack sensitivity.The aims of this study were: (1) to evaluate the performance of a multiprobe FISH (fluorescence in situ hybridization) assay for non-invasive detection of superficial UC in the bladder, in comparison to urinary cytology, (2) to assess the clinical utility of FISH as a non-invasive method for diagnosing and monitoring UC in UUT, (3) to evaluate the use of FISH for determining the response of patients with high-risk superficial bladder tumour (HRSBT) to bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy, (4) to identify and test potential mRNA markers of UC dissemination in lymph nodes, and to compare the performance of selected markers with patients' clinical outcome, and (5) to test the efficiency of such mRNA markers in detecting and monitoring UC haematogenous dissemination.According to our results, FISH assay for chromosomes 3, 7, 9, and 17 has higher sensitivity than cytology and a similar specificity in the detection of superficial UC and UC at UUT, which could be useful for reducing some cystoscopies in the follow-up of these patients. Moreover, a high percentage of positive pre-BCG FISH results were obtained, suggesting the need for adjuvant therapy in patients with HRSBT after the transurethral resection. In addition, patients with a positive post-BCG FISH result were more likely to relapse after therapy. Thus, FISH appears to be useful for the surveillance of patients with HRSBT following BCG therapy.Finally, using molecular markers it was possible to improve the sensitivity of LN histologic analysis. Also this methodology allowed distinguishing between UC patients and controls. However, despite its high sensitivity, it was not possible to monitor UC haematogenous dissemination.

Urinary tract infection (UTIs) is an extremely common disease. Proteus mirabilis is a common cause of UTI in individuals with functional or structural abnormalities or with long-term catheterization, it forms bladder and kidney stones as a consequence of urease-mediated urea hydrolysis. Known virulence factors, besides urease, are flagella, fimbriae, outer membrane proteins, hemolysins, amino acid deaminase, protease, capsule and lipopolysaccharide (LPS). Study of LPS core is particularly relevant for several reasons: it is a conserved region, although it is increasingly clear that there is some variability at the genus or groups of similar genera, its chemical structure modulates the endotoxic activity of lipid A, alteration of the LPS core, which generates less virulent bacteria, encourages the search of substances that interfere with the biosynthesis of this region, and conserved regions of the core LPS could be useful as antigens in preventing diseases caused by pathogens that contain these conserved regions. The specific aims of this project have been to identify and functionally characterize genes involved in core LPS biosynthesis in P. mirabilis, to elucidate the mechanism of incorporation of galactosamine (GalN) to the core LPS, to identify genes coding for phosphoethanolamine (PEtN) modifications, and to characterize and to study the biological effects of the gene encoding the PEtN transferase involved in the modification of the second heptose residue (L,D-HepII). We found that P. mirabilis has most of the genes for the biosynthesis of LPS core grouped in the waa cluster in the chromosome. Despite this, additional genes required for core LPS biosynthesis are found outside the waa cluster. The pentasaccharide of the inner core, shared by all Enterobacteriaceae, is biosynthesized in P. mirabilis, by the sequential activity of a bifunctional transferase (WaaA) and three heptosyltransferases (WaaC, WaaF, and WaaQ). These enzymes are transcribed from genes located inside the waa cluster, and are conserved in P. mirabilis strains analyzed; for more, they show a high identity and similarity level to homologues proteins of Escherichia coli, Klebsiella penumoniae and Serratia marcescens. The waaL gene, coding for the O-antigen polymerase ligase, is found adjacent to the classic waa cluster. Downstream this gene, four genes encoding enzymes belonging to the 4 (walM, walN, and WalR), and 9 (walO) glycosyltransferase family were found. Even if members of these families were related to LPS core biosynthesis in several Gram-negative bacteria, in P. mirabilis they do not appear to be involved in the biosynthesis of the reported core LPS structures. The presence of the disaccharide hexosamine (HexN)-1,4-galacturonic acid (GalA) is a feature of P. mirabilis LPS outer core. Depending on the nature of the HexN outer core residue, two different homologues for N-acetyl-hexosamine transferases are present in the waa cluster: wabH or wabP. Altought the incorporation of glucosamine into LPS core requires an acetylglucosaminyltransferase (WabH) and a deacetilase (WabN), the incorporation of GalN requires three enzymes: an acetylgalactosaminyltransferase (WabP), a deacetilase (WabN) and an epimerase (gne). An amplification test with specific primers for this two different homologues can be used to predict the HexN nature in P. mirabilis LPS cores. The strain-specific genes wamB and wamC code for a galactosyltransferase and a heptosyltransferase respectively in strain R110 of P. mirabilis. The enzyme encoded by gene wamD is a N-acetylglucosaminyltransferase, and it is found in strain 51/57 of P. mirabilis. WamA, coded by wamA gene in the waa cluster of strains R110, 50/57, TG83 and HI4320, is a heptosyltransferase responsible for the incorporation of a quarter residue of heptose (Hep), in DD configuration, to the GalA II of the outer core. In P. mirabilis strain 51/57, a gene coding a protein of the Mig-14 family was identified inside the waa cluster, this localization appears to be an exception in the Enterobacteriaceae family. Inspection of the whole genome of P. mirabilis HI4320 did not allow the identification of a mig-14 similar gene. There are three putative PEtN transferases in the genome of P. mirabilis: PMI3040, PMI3576, and PMI3104. The gene identified as eptC (PMI3104) transfers the moiety of PEtN to the O-6 position of L,D-Hep II (HepII6PEtN). The absence of the positive charge due to PEtN residue doesn't affect the bacterial growth kinetics in lab conditions in rich or defined media, but causes a moderate destabilization of the outer-membrane. Despite the lack of the PEtN residue on the Hep II in P. mirabilis LPS core, has no statistically effects during urinary tract infection assays in mouse model, the absence of this modification causes an increase sensitivity to complement in non-immune human sera. / P. mirabilis no es una causa frecuente de infecciones urinarias en el huésped normal, más bien infecta el tracto urinario con alteraciones funcionales o anatómicas, o instrumentación crónica como el cateterismo. P. mirabilis está a menudo asociado con cálculos urinarios e incrustaciones de los catéteres y es, particularmente importante, en pacientes con cateterización prolongada. Las infecciones del tracto urinario asociadas a cateterización son mundialmente reconocidas como la causa más común de infección asociada a tratamientos en ambiente hospitalario. El LPS es un factor de virulencia importante en bacterias Gram negativas patógenas. También conocido como endotoxina, es una molécula glicolipídica que constituye la estructura mayoritaria de la cara externa de la membrana externa (OM). En Proteus mirabilis la mayoría de los genes responsables de la biosíntesis de núcleo de LPS están localizados en el cromosoma, en el agrupamiento génico waa. A pesar de esto, algunos genes adicionales, necesarios para la biosíntesis del núcleo de LPS, se encuentran ubicados fuera del agrupamiento génico waa. El pentasacárido del núcleo interno, común a todas las Enterobacteriáceae, se biosintetiza en P. mirabilis, por la actividad secuencial de una transferasa bifunciona (WaaA) y tres heptosiltransferasas (WaaC, WaaF, y WaaQ). La presencia del disacárido HexN‐1,4‐GalA es característica del núcleo externo de LPS en P. mirabilis. Dependiendo de la naturaleza del residuo de HexN, se encuentran, en el agrupamiento génico waa, dos HexNAc transferasas diferentes: wabH o wabP. El gen eptC (PMI3104) codifica para la enzima que transfiere el residuo de fosfoetanolamina a la posición O-6 de la L,D-Hep II (HepII6PEtN), en el núcleo de LPS de P. mirabilis. La ausencia de la carga positiva del residuo de fosfoetanolamina no afecta a la cinética de crecimiento de las bacterias en condiciones standard de laboratorio sea en medios ricos o definidos. La ausencia del residuo fosfoetanolamina provoca una desestabilización moderada de la membrana externa que se traduce en una disminución de la MIC para SDS.