Archazolid is a novel and highly efficient inhibitor of the V-ATPase, a ubiquitous membrane energizing protein complex consisting of a cytosolic ATP-hydrolyzing V1 domain and a VO domain which mediates proton translocation via a membrane embedded ring of c subunits. The intention of the present thesis was to characterize the archazolid binding site within the V-ATPase on the molecular level. Initial labeling experiments with 14C-derivatives of archazolid and the Manduca sexta V-ATPase clearly identified the c subunit as binding partner for the inhibitor. Concurrently performed site-directed mutagenesis studies in Saccharomyces cerevisiae as well as continuous wave electron paramagnetic resonance spectroscopy, revealed that the amino acids tyrosine 142 and leucine 144, located within the fourth transmembrane helix of subunit c, contribute to archazolid binding. Strikingly, mutation of these amino acids to either asparagine or isoleucine resulted in a V-ATPase approximately 10-fold more sensitive to the inhibitor, indicating increased inhibitor-target interaction in both cases. In addition, inhibition assays with different derivatives of archazolid suggested close proximity of the C-15 of archazolid and tyrosine 142 of subunit c. Competition assays with NCD-4, a covalently binding inhibitor which specifically targets a highly conserved glutamate within subunit c that is essential for proton translocation, revealed that the archazolid binding site also comprises this amino acid. Since the three amino acids tyrosine 142, leucine 144 and glutamate 137 (positions according to the S. cerevisiae c subunit) form a triangle within the central part of subunit c, the archazolid binding site most likely resides within a single c subunit and the inhibitor probably directly prevents proton translocation by the c ring. A spin labeled derivative of archazolid was used to enlighten the stoichiometry of c subunits within the VO ring. The measurements, performed via double electron electron resonance spectroscopy on spin labeled archazolid bound to the M. sexta V-ATPase, revealed a clear distance distribution that suggested, based on the supposed binding site of archazolid, a number between 9 and 11 subunits in the ring. This number is in line with a previously suggested decameric arrangement of the M. sexta ring and excludes a hexameric structure which is frequently assumed to be valid for V-ATPases.

V-ATPasen sind eukaryotische Protonenpumpen, die viele sekundär aktive Transporte energetisieren und eine Reihe von intrazellulären Kompartimenten ansäuern. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde die Interaktion der V-ATPase aus Manduca sexta mit dem Aktin-Zytoskelett untersucht. Nachdem die Co-Lokalisation der V-ATPase mit F-Aktin in den apikalen Membranen der Gobletzellen immunzytochemisch festgestellt worden war, wurde auch die direkte Wechselwirkung zwischen der V-ATPase und den Aktinfilamenten durch Co-Pelletierungsstudien nachgewiesen. Mit Hilfe von Overlayblots wurde gezeigt, dass sowohl die Untereinheit B als auch Untereinheit C die Bindung an Aktin vermitteln. Co-Pelletierung der Aktinfilamente mit rekombinanter Untereinheit C wiesen eine direkte Interaktion zwischen beiden Proteinen nach. Mit rekombinanter Untereinheit C rekonstituierter V1-Komplex hatte eine deutlich höhere Affinität zu Aktinfilamenten als C-freier V1-Komplex. In Overlayblots wurde nachgewiesen, dass die Untereinheit C beide Formen (F- und G-) des Aktins bindet. Die Interaktion mit G-Aktin wurde mit NBD-markiertem Aktin quantifiziert, wobei sich Dissoziationskonstanten von 50-60 nM ergaben; eine Bevorzugung von ATP-Aktin gegenüber ADP-Aktin oder umgekehrt konnte nicht festgestellt werden. Die Untereinheit C beeinflusste die Dynamik des Aktin-Zytoskeletts dadurch, dass sie Aktinfilamente unabhängig vom pH stabilisierte und einen positiven Einfluss auf die Vernetzung von Aktinfilamenten hatte. Die auch im Fluoreszenzmikroskop nachgewiesene Fähigkeit zur Bündelung kann sowohl durch die zwei Aktinbindungsstellen in der Untereinheit C als auch durch ihre Di- und Oligomerisierung unter oxidierenden Bedingungen ermöglicht werden. Mit Hilfe von radioaktivem ATP wurde gezeigt, dass die Untereinheit C durch die Proteinkinase A phosphoryliert werden kann. Diesem Phänomen könnte eine große Bedeutung für die Regulation der Eigenschaften der Untereinheit C zukommen.

Cell death is a fundamental aspect of development and homeostasis; its dysregulation is commonly associated with disease. Historically, apoptosis has been the most heavily studied type of cell death, but there are many other non-apoptotic forms of cell death. The Drosophila ovary provides a powerful in vivo model to study non-apoptotic cell death. Each egg chamber in the ovary contains 15 nurse cells that support an oocyte throughout development, and at the end of oogenesis the nurse cells are surrounded by stretch follicle cells and undergo non-apoptotic cell death. The work in this dissertation investigated the role of stretch follicle cells in nurse cell death. Genetic ablation of the stretch follicle cells revealed that they are required for multiple nurse cell death events including the transport of cytoplasm to the oocyte and DNA fragmentation. We found that phagocytic machinery is required in the stretch follicle cells for the acidification and elimination of nurse cells, suggesting nurse cells die by phagoptosis. Furthermore, live imaging and a transgenic engulfment detector demonstrated that nurse cells are not engulfed piece-wise despite the requirement of phagocytosis machinery, but are instead surrounded and acidified extracellularly. To determine the mechanism driving nurse cell acidification, we performed a targeted RNAi screen against lysosome-associated genes. Using tissue-specific RNAi, we demonstrated that the V-ATPase proton pump is required in the stretch follicle cells for nurse cell acidification. GFP fusion proteins and antibody staining revealed that V-ATPases become enriched and localize to the stretch follicle cell plasma membranes to acidify the nurse cells that they surround. Following acidification, the stretch follicle cells were found to release cathepsins, lysosomal proteases, to break down and degrade the nurse cell. To uncover novel pro-death proteins that mediate signaling between the stretch follicle cells and nurse cells, we utilized proximity-dependent protein labeling and identified proteins enriched in the stretch follicle cells. Altogether this work uncovers a new role for lysosomal machinery acting at the plasma membrane of stretch follicle cells to drive nurse cell death, and identifies pro-death proteins in the stretch follicle cells that promote nurse cell death.

Der (Pro)Renin Rezeptor (PRR) ist ein hoch konservierter Transmembranrezeptor, der ursprünglich beschrieben wurde Renin und Prorenin zu binden. Durch Bindung an Renin und Prorenin beeinflusst der PRR das Renin-Angiotensin-Systems und induziert eine MAP-Kinase-Signaltransduktion. Teile des PRR sind assoziiert mit der vakuolären H+-ATPase (vATPase), welche wichtig für die Azidifizierung zellulärer Organellen ist. Kürzlich wurde eine neue Funktion des PRR für den WNT/β-catenin Signalweg beschrieben. Hier dient der PRR als Verbindungsglied zwischen den WNT Rezeptoren und der vATPase. Die Mechanismen der Funktionen des PRR sind noch nicht verstanden, aber es wird angenommen, dass der PRR in die Regulation verschiedenster zellulärer Mechanismen involviert ist. Es gibt bis jetzt keine biochemische und strukturelle Charakterisierung des PRR. In der vorliegenden Arbeit wurden strukturelle Studien mit verschiedenen Konstrukten des extrazellulären Teils des PRR durchgeführt. Alle PRR Konstrukte (hsPRR (170-303), hsPRR (101-257) und hsPRR (166-257)) zeigten eine alpha-helikale Faltung und konnten nicht an Renin oder Prorenin binden. Der hsPRR (101-257) liegt in einem Konzentrations- und pH-abhängigen Monomer-/Oligomerequilibrium vor, während der hsPRR (166-257) als Monomer/Dimerequilibrium vorkommt. Diese Daten bilden die Grundlage für weitere strukturelle und funktionelle Untersuchungen. Konditionelle KO Mäuse sind eine exzellente Methode, um die physiologische Rolle des PRR in vivo zu untersuchen. Eines der wichtigsten Proteine des Wnt/β-catenin Signaltransduktionsweges, β-catenin, ist fundamental für die T-Zell Entwicklung. Aus diesem Grund wurde untersucht, ob die Deletion des PRR in T-Zellen ebenfalls zu einem Verlust von T-Zellen und zu einer Entwicklungsstörung führt. Die Ergebnisse zeigen, dass der PRR wichtig für eine vollständige T-Zellentwicklung ist und unterstützen die Hypothese, dass der PRR eine Rolle für Wnt/β-catenin Singaltransduktion in T-Zellen spielt. / The (pro)renin receptor (PRR) is an evolutionary conserved transmembrane receptor that was first discovered to bind renin and prorenin. Upon binding, PRR was shown to influence the activity of the renin-angiotensin-system (RAS) and to induce MAP kinase signalling. It was previously shown that a truncated, transmembrane part of PRR was associated to vacuolar H+-ATPase (vATPase), a proton pump which is important for acidification. Recently, a new function of PRR in the WNT/β-catenin signalling pathway was described. Here, the PRR was shown to be an adaptor between WNT receptors and the vATPase. The precise mechanisms by which PRR functions, are still elucidative but the PRR is supposed to regulate various cellular processes. Currently, no biochemical characterization or structural analysis is available for PRR. In order to gain understanding of the function of the PRR, structural studies were performed with several truncated proteins of the extracellular part of the PRR. All PRR proteins (hsPRR170-303, hsPRR 101-257 or hsPRR 166-257) showed an overall alpha helical folding and did not bind renin or prorenin. The oligomeric assembly of the proteins was investigated. The hsPRR (101-257) was shown to be in a concentration and pH dependent monomer/oligomer equilibrium, whereas hsPRR (166-257) is only present in a monomer/dimer equililibrium. These data are the basics for further structural and functional studies. Additionally, conditional KO animals are an excellent tool to investigate the physiological role of the PRR in vivo. As the major mediator of the Wnt/β-catenin signaling pathway, β-catenin, is crucial for T cell maturation, a conditionel deletion of PRR in T cells was analyzed. PRR deletion resulted in a loss of mature T cells. Moreover, a defect in T cell maturation in the thymus was determined. Our data showed that PRR is critical for proper T cell development and support the hypothesis that PRR contributes to Wnt/β-catenin signaling in T cells.

La v-ATPase est une pompe à protons. Elle permet l’acidification d’organelles, ce qui est indispensable à de nombreux processus cellulaires. Cette enzyme est composée de 14 sous-unités différentes, organisées en deux domaines, le domaine catalytique V1 et le domaine membranaire V0. La sous-unité a du domaine V0 est essentielle au transport des protons. Il en existe 4 isoformes (a1 à a4) et des variants d’épissage (a1-I à a1-IV pour a1) permettant à la v-ATPase d’être adressée vers différents compartiments et donc d’être impliquée dans différents processus. Deux projets visant à étudier cette sous-unité ont été réalisés.En plus de son rôle dans le transport des protons, il a été montré que le domaine V0 de la v-ATPase est impliqué dans des évènements de trafic membranaire, tel que l’exocytose de vésicules de sécrétion. Ce rôle semble nécessiter des interactions avec les protéines SNAREs. J’ai montré, pendant la première partie de ma thèse, que les sous-unités flag-a1-I et flag-a1-IV sont toutes deux adressées aux granules de sécrétion de cellules neurosécrétrices et interagissent avec les protéines SNAREs VAMP2 et syntaxine-1. De façon intéressante la syntaxine-1 semble interagir préférentiellement avec la sous-unité a1-I qui dans les neurones est l’isoforme adressée aux terminaisons nerveuses. Les sous-unités a1-IV ne diffèrent d’a1-I que par l’ajout de 7 acides aminés dans sa moitié N-terminale. Le domaine d’interaction de la sous-unité a avec la syntaxine-1 semble donc être localisé dans cette région.Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai mis en évidence et étudié l’expression de la sous-unité rénale a4 dans des gliomes humains. Ces tumeurs sont les tumeurs cérébrales les plus fréquentes et sont en général associées à un mauvais pronostic. L’OMS distingue, en fonction de paramètres histologiques, les astrocytomes (de grade I à IV), les oligodendrogliomes et les gliomes mixtes (chacun de grade II ou III). Cette classification est controversée, notamment à cause de son manque de reproductibilité, et la prise en compte de marqueurs moléculaires semble s’imposer comme une solution pour la renforcer.J’ai quantifié par RT-PCR quantitative l’expression du gène ATP6V0A4 (codant la sous-unité a4) dans 188 prélèvements de gliomes humains. Nous avons ainsi montré que l’expression de la sous-unité a4 peut être utilisée comme marqueur diagnostique des oligodendrogliomes anaplasiques (35 % l’expriment). Dans un prélèvement, la présence de la codélétion 1p/19q et l’expression de a4, tout deux marqueurs indépendants des oligodendrogliomes, permettra le renforcement du diagnostique oligodendrogliome anaplasique. De plus a4 est fréquemment exprimée par les astrocytomes pilocytiques (70%), où elle est associée à la duplication en tandem de la région chromosomique 7q34 située à proximité directe du gène ATP6V0A4. Enfin une observation prometteuse est que l’expression de a4 pourrait être un marqueur de mauvais pronostic pour les patients atteints d’oligodendrogliome anaplasique ne présentant pas la co-délétion 1p/19q, observation qui devra être confirmée sur une plus grande cohorte de patients. / Vacuolar type H+-ATPase is a proton pump, which acidifies numerous organelles, crucial for many cellular processes. This enzyme is composed of 14 different subunits organized in two domains, a catalytic V1 domain and a V0 membrane domain. The a-subunit of V0 is essential for proton transport. There are 4 isoforms of a (a1 to a4) and splicing variants (a1-I to a1-IV for the a1 subunit). v-ATPases containing different a-subunit isoforms are localized in different compartments allowing v-ATPase to participate in different processes. The a-subunits were studied in this work in two distinct projects.Besides its role in proton pumping, V0 domain of v-ATPase is implicated in organelles trafficking events, like vesicles exocytosis. This role seems to require interactions of V0 with SNARE proteins. During my thesis work, I showed that flag-a1-I and flag-a1-IV are both targeted to secretion granules in PC12 neurosecretory cells. These subunits interact with the SNARE proteins VAMP2 and syntaxin-1. Interestingly, syntaxin-1 seems to preferentially interact with the a1-I subunit, isoform which in neurons is sorted to nerve terminals. The only difference between a1-I and a1-IV subunits is the addition of 7 amino acids in the N-terminal half of a1-IV. So syntaxin-1 probably interacts with a1-I at this location. In a second project, I studied the expression of the renal a4-subunit in human gliomas. These tumors are the most frequent brain tumors and are generally associated with a poor prognosis. Based on histological parameters,WHO distinguishes, astrocytomas (grade I to IV), oligodendrogliomas and oligoastrogliomas (each of grade II or III). This classification suffers of a lack of reproducibility, which could be overcome by the identification of specific molecular markers.In the present work, by real time quantitative PCR, ATP6V0A4 gene (encoding the renal a4) expression was quantified in 188 human glioma biopsies. We established a4 expression as a new marker of grade III oligodendrogliomas (35 % express it), independent of the 1p/19q codeletion, an established marker of oligodendrogliomas. Moreover, a4 is expressed in 70% of pilocytic astrocytomas, in which it is associated with the tandem duplication of 7q34, localized at direct proximity of the ATP6V0A4 gene. Of promising interest is the observation that a4 expression could be considered as a bad prognostic marker for patients with 1p/19q non-deleted oligodendrogliomas, an observation that should be confirmed on larger cohorts of patients.

The diverse outcomes of ubiquitination primarily relate to the flexibility of ubiquitin in forming homo- or heterotypic chains on each of its seven lysine residues which in turn stimulate distinct downstream signaling pathways. These ubiquitin signals must be selectively initiated on the substrate protein and subsequently decoded to facilitate the desired cellular function. These initiation and decoding steps often involve additional post-translational modifications and ubiquitin receptor proteins, but the enzymes and ubiquitin chains involved for many ubiquitinated substrates are not clear. Here, I have explored the initiation and decoding of ubiquitin signals, focusing on lysine-11 (K11) linked polyubiquitin chains and their role in protein degradation. I established in vitro assays to understand how K11-chains are decoded and whether these chains act as a signal for proteasome-mediated degradation. Pure homotypic K11-chains did not bind the proteasome or its associated ubiquitin binding proteins, but did bind to the mitophagy ubiquitin receptors, MyosinVI and TAX1BP1. Heterotypic K11/K48 linkages not only bound the proteasome but also stimulated degradation of the cell cycle substrate, cyclin B1. To further explore the functions of K11-chains I focused on the hypoxia inducible transcription factor (HIF) pathway, as K11-ubiquitination had been implicated in proteasome-independent degradation of the transcription factor. I established an in vitro assay to initiate HIF ubiquitination, via prolyl hydroxylation, and determine the type of ubiquitin chains involved. Recombinant HIF isoforms were rapidly hydroxylated when incubated with cell extracts. Moreover, the levels of iron and small molecule metabolites within the lysates regulated HIF hydroxylation. However, this hydroxylation was insufficient to reproducibly promote HIF ubiquitination or determine the ubiquitin chains involved. While the nature of the polyubiquitin chains formed in the HIF pathway remain elusive, my studies identify distinct roles for homotypic and heterotypic K11-polyubiquitination in proteasome-mediated degradation.

Chemoresistance is one of the main causes of failure of anticancer chemotherapy. Vacuolar-type ATPase (V-ATPase) is an ATP-dependent proton pump involved in the regulation of the pH in cells, cell organelles and the intracellular space. A significant acidification of the extracellular space and intracellular compartments occurs in connection with the metabolism of tumour cells (glucose metabolism, hypoxia, insufficient blood perfusion of the cancer tissue). Basic drugs are transferred into acidic organelles based on the pH gradient, where they are then protonated and accumulated. This mechanism is called lysosomal sequestration and is one of the mechanisms how tumour cells resist to applied drugs, which then do not reach their target site in cancer cell. An increased expression of V-ATPases has been described in relation to chemoresistance and the progression of tumours. This dissertation is focused on observing the membrane subunit V0d from the complex of V-ATPase and the changes in resistance to ellipticine caused by the silencing of this subunit's gene in human neuroblastoma cell lines UKF-NB-4 (sensitive) and UKF-NB-4ELLI (resistant to ellipticine). The expression of the V0d protein was first examined on mRNA level using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). The silencing of selected...

Struktur, Funktion und Regulation der Plasmamembran V-ATPase von Manduca sexta. Die V-ATPase im larvalen Mitteldarm des Tabakschwärmers Manduca sexta energetisiert die gesamten sekundär aktiven Transportprozesse in diesem Epithel. Sie ist einer der best untersuchten Vertreter dieser Klasse von Ionentransport-ATPasen und hat sich als ideales Objekt für die Untersuchung von Struktur, Funktion und Regulation dieser Proteinfamilie erwiesen. In der vorliegenden Dissertation wurde die Struktur des V1Vo Holoenzyms, des V1 Komplexes und des Vo Komplexes, die Regulation der V-ATPase-Aktivität und die Hemmung der V-ATPase durch Makrolide untersucht. Mit der Modifikation von bestehenden und der Etablierung von neuen Protokollen gelang es das V1Vo Holoenzym, den V1 Komplex und den Vo Komplex in Milligramm-Mengen zu reinigen und damit die Vorraussetzung für neue Erkenntnisse über die Struktur der V-ATPase zu schaffen. Durch N-terminale Sequenzierung, Immunfärbung und/oder MALDI-MS konnten neben den bereits bei M. sexta bekannten Untereinheiten A, B, E, F, G, c und d auch die restlichen Untereinheiten C, D, H, a und e identifiziert werden. Das als Kontamination der V-ATPase häufig auftauchende Protein B´ wurde als ein mitochondriales Hsp60 identifiziert. Bei dem sowohl im Holoenzym als auch im Vo Komplex vorhandenen 26 kDa großen Protein handelt es sich sehr wahrscheinlich um ein Dimer der Untereinheit c und nicht, wie bislang vermutet um deren Isoform c´´. Für die im V1 Komplex nur substöchiometrisch vorhandene Untereinheit C konnte gezeigt werden, dass sie im Gegensatz zur Situation beim V1Vo Holoenzym nur sehr schwach gebunden ist. Sie lässt sich schon unter relativ milden Bedingungen (0,01% C12E10) vom V1 Komplex abtrennen, reassoziiert aber andererseits auch sehr leicht wieder an den V1 Komplex, wie mit einer rekombinanten Untereinheit gezeigt werden konnte. Durch die Behandlung des V1 Komplexes mit chaotropen Ionen ergaben sich Hinweise, die eher auf die Untereinheit D als auf die Untereinheit E als Homolog der V-ATPasen zur g -Untereinheit der F-ATPasen schließen lassen. Durch die Erhöhung der Ionenstärke während eines Reinigungsschrittes gelang es erstmals, die Untereinheit a bei einer Insekten V-ATPase darzustellen. Dies gelang sowohl für das V1Vo Holoenzym als auch für den Vo Komplex und war besonders wichtig, da die Untereinheit als der Favorit für die Bindung der V-ATPase spezifischen inhibitorischen Plecomakrolide angesehen wurde. Wie sich allerdings herausstellte, ist die Untereinheit c des Vo Komplexes die einzige Untereinheit die durch das semisynthetische Concanamycin-Derivat, 9-O-[p-(Trifluoroethyldiazirinyl)-benzoyl]-21,23-dideoxy-23-epi-[125I]Iodo-concanolid A (J-Concanolid A) spezifisch markiert wird. Durch MALDI-MS konnten einige Bereiche der Untereinheit c bestimmt werden, die potentiell mit der Sonde interagieren. Diese Abschnitte befinden sich alle auf der luminalen Seite der Membran. Beim Testen einer Reihe neuer Makrolide zeigte sich erstaunlicherweise, dass Salicylihalamid, Apikularen und Archazolid ähnlich wie Concanamycin A, Bafilomycin A1 und B1, mit einem IC50 von ca. 20 nM die V-ATPase schon bei sehr niedrigen Konzentrationen hemmen. Das ebenfalls getestete Cruentaren lag mit einem IC50 von 60 µM hingegen deutlich höher. Neben Concanamycin und den Bafilomycinen ist auch Archazolid in der Lage, die Markierung durch J-Concanolid A zu unterbinden, was auf eine gemeinsame Bindestelle dieser drei Makrolide hinweist. Die Untersuchung der Enzymaktivität der V-ATPase zeigte zum einen eine deutliche Endprodukthemmung durch das entstehende ADP und zum anderen dass Mg2+ nicht durch Ca2+ zu ersetzten ist, da Ca2+-ATP im Gegensatz zu Mg2+-ATP keinen Protonentransport unterstützt. Für den Mechanismus der Dissoziation des V1Vo Holoenzyms in seinen V1 und Vo Komplex scheinen Nukleotide von entscheidender Bedeutung zu sein. Während das V1Vo Holoenzym praktisch nukleotidfrei ist, sind im abdissoziierten V1 Komplex ein bis zwei Moleküle ADP enthalten. Die Bindung von ADP oder AMP-PNP an das Holoenzym bewirkt keine Dissoziation der V-ATPase. Allerdings genügt bereits die Hydrolyse von nur einem Molekül Mg2+-ATP pro Enzym, um eine Dissoziation zu induzieren. Aus diesem Befund kann geschlossen werden, dass die V-ATPase während der Hydrolyse einen Konformationszustand durchläuft, in dem sie instabil ist und zur Dissoziation neigt.

Topologie und Regulation der Manduca sexta V-ATPase Die V-ATPase im Mitteldarm der Tabakschwärmerraupen von Manduca sexta besteht aus zwölf Untereinheiten, von denen vier den membranständigen Vo- und acht den cytosolischen V1-Komplex bilden. Das Enzym energetisiert unter ATP-Verbrauch eine Protonentranslokation über die Gobletzellapikalmembran, wobei eine Potentialdifferenz von etwa 250 mV aufgebaut wird. Durch diese Spannung wird ein elektrogener K+/2H+-Antiport getrieben und indirekt ein K+/Aminosäure-Symport, wodurch die Nährstoffversorgung der Raupen gesichert wird. Da die V-ATPase sehr viel ATP verbraucht, erscheint es ökonomisch, diese in Hungerperioden durch die Dissoziation des Enzyms in den cytosolische V1- und den Vo-Komplex, abzuschalten. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob auch die Biosynthese der V-ATPase Untereinheiten in Hungerperioden reduziert wird und was eventuellen Änderungen von Transkriptionsraten zugrunde liegt. Mit Ausnahme der Untereinheit D waren die Transkriptmengen aller V-ATPase Untereinheiten in Hungerperioden erniedrigt. Am stärksten betraf dies die Untereinheit G, was auch für den Anstieg der Transkriptmengen nach erneuter Futterzufuhr galt. Da Hungerperioden auch in der Entwicklung von Raupen während der Häutungen vorkommen, wurde exemplarisch die Biosynthese von drei, die verschiedenen Bereiche der V-ATPase (V1-Kopf: Untereinheit B, V1-Stiel: Untereinheit G, Vo-Komplex: Untereinheit d) repräsentierenden Untereinheiten, untersucht. In allen drei Fällen konnte eine Reduktion der Transkriptmengen in der Mitte der Häutungsphase festgestellt werden, welche zu ihrem Ende hin wieder aufgehoben wurde. Der Abfall und Anstieg der mRNA-Mengen korrelierte mit den Titern der beiden Häutungshormone der Insekten: negativ mit dem Titer des Ecdysons und positiv mit dem des Juvenilhormons. Die Injektion von 20-Hydroxyecdyson in fressende Raupen hatte die Reduktion der Transkriptmengen zur Folge, während Juvenilhormon III fast keinen Einfluss ausübte. Darüberhinaus war zu beobachten, dass sich nach Injektion von 20-Hydroxyecdyson die V1-Komplexe von den apikalen Gobletzellmembranen ablösten. Um auch den Einfluss der Häutungshormone auf die Promotoraktivität zu untersuchen, und dadurch auf Unterschiede in der RNA-Stabilität zu schließen, wurden ca. 1 kb lange 5`-Bereiche stromaufwärts vom Startcodon der drei verwendeten Gene mvB, mvG und mvd in Reportergenassays getestet. Hierbei wurde als Reportergen eine Luciferase verwendet, die unter der Kontrolle der jeweiligen 5`-Region der V-ATPase Untereinheit stand. Nach Transfektion von Sf21-Zellen konnte wie auch in den vorangegangenen Experimenten gezeigt werden, dass 20-Hydroxyecdyson die Promotoraktivität aller drei V-ATPase-Gene nach einem kurzzeitigen Anstieg bei den Genen mvB und mvG über einen längeren Zeitraum negativ beeinflusst und nach 48 h zu einer Reduktion auf 30-50% gegenüber der Kontrolle führt.Im Gegensatz dazu führte die Anwesenheit von Juvenilhormon III zur Aktivitätssteigerung von mvG um den Faktor 3, während die Aktivität der anderen 5`-Bereiche nicht signifikant verändert wurde.Zusammen mit den Daten der Transkriptmengen unter Juvenilhormon III Einfluss könnte dies der erste Hinweis auf eine reduzierte Stabilität der mRNA der Untereinheit G sein. Des Weiteren wurde in der vorliegenden Arbeit die Nukleotidsequenz der bei der Insekten V-ATPase lange Zeit nicht nachweisbaren Untereinheit a des Vo-Komplexes aufgeklärt. Neben einer ubiquitär vorkommenden Isoform konnte auch eine Teilsequenz einer Malpighigefäß spezifischen Isoform nachgewiesen werden. Antikörper gegen den in dieser Arbeit exprimierten cytoplasmatischen N-Terminus wurden eingesetzt, um die Untereinheit in der Immunhistochemie sowie in den gebildeten Komplexen der Vernetzungsexperimente nachzuweisen. Die durch Kupfer(II)-chlorid induzierte Vernetzung von Cysteinresten der Untereinheiten des V1Vo-Holoenzyms führte zu der Identifizierung von drei Banden, wobei diese wahrscheinlich aus verschiedenen Subkomplexen der Untereinheiten a, A, B, C, E und G aufgebaut waren. Durch diese Ergebnisse und den Daten aus dem Verdau des V1Vo-Holoenzyms mit Trypsin konnte ein neues Modell der V-ATPase erstellt werden, dass sich erheblich von den bisherigen Modellen unterscheidet, insbesondere in der Lokalisation der Untereinheiten des Stators.

Saccharomyces cerevisiae teve seu seqüenciamento genômico finalizado em 1996, sendo composto de cerca de 6600 ORF\'s ( \"open reading frames\", quadros abertos de leitura) das quais aproximadamente 20% estão anotadas como não caracterizadas e de função molecular desconhecida. Com o objetivo de caracterizar algumas dessas ORF\'s relacionadas aos processos antioxidantes, escolhemos a proteína Yjl077cp. Através de nossos experimentos foi possível relacionar a proteína Yjl077cp com a resposta antioxidante, pois a linhagem mutante para o gene YJL077C apresentou letalidade quando exposta por 24 horas a uma concentração de 3mM de peróxido de hidrogênio (H2O2) . Testes de tolerância ao cobre, demonstraram que esse metal na concentração de 10mM, adicionado diretamente ao meio de cultura YPD, após um período de 4 horas de incubação afeta a cinética de crescimento, e após 24 horas de incubação, essa concentração é letal para a linhagem mutante. Observamos que a adição de CuSO4, causa modificação de pH do meio de cultura YPD, foram realizados experimentos para que verificássemos o efeito da acidificação do meio de cultura na viabilidade de Δics3, através de experimentos de tolerância em meio YPD ácido (pH 4.0) e com pH corrigido com adição de CuSO4. De acordo com os resultados obtidos, o efeito da letalidade de 10 mM de CuSO4 observado sem correção de pH, não ocorre quando em meio de cultura com o pH corrigido (pH6.0), demonstrando que, a letalidade da linhagem Δics3 é causada pelo acréscimo do metal e a mudança de pH (ácido, pH4.0). Testes de ICP-AES detectaram uma maior absorção intracelular de cobre na linhagem mutante Δics3, em condições de pH 4.0, quando comparada a absorção desse mesmo metal em condições de pH 6.0, demonstrando que grandes quantidades de cobre, estão sendo incorporadas para o meio intracelular, devido a acidificação do meio, sugerindo o envolvimento de Δics3, às ações das VATP-ases. Em conjunto esses resultados demonstram que o gene ICS3 é importante para a manutenção da viabilidade celular de S. cerevisiae crescida em meio de cultura com pH ácido e em condições de altas concentrações de CuSO4. O objetivo do presente trabalho foi entender a relação de ICS3 na resposta antioxidante e sensibilidade ao cobre através de experimentos de tolerância e em meio YPD ácido (pH 4.5) e com pH corrigido após adição de CuSO4. / Saccharomyces cerevisiae had its genome sequencing completed in 1996, consisting of about 6600 ORF\'s (\"open reading frames\" open reading frames) of which approximately 20% are annotated as uncharacterized and unknown molecular function. In order to characterize some of these ORF\'s related to antioxidants processes, we chose Yjl077cp protein . Through our experiments it was possible to relate the Yjl077cp protein with the antioxidant response, because the mutant strain to YJL077C gene showed lethality when exposed for 24 hours at a concentration of 3 mM hydrogen peroxide (H2O2). Copper tolerance tests demonstrated that this metal at concentration 10mM added directly to the medium YPD culture after a 4-hour period of incubation affects the growth kinetics, and after 24 hours of incubation, these concentration is lethal to mutant strain. We found that the addition of CuSO4, causes pH modification in the YPD culture medium, experiments were conducted to we check the effect of acidification of the culture medium on the viability of Δics3 through experiments of acid tolerance in YPD medium (pH 4.0) and pH adjusted with addition of CuSO4. According to the results, the effect of mortality of 10 mM CuSO4 observed without pH correction, does not occur when the culture medium with the Ph adjusted (pH6.0), demonstrating that the lethality of the strain Δics3 is caused by adding the metal and the change of pH (acid, pH4.0). ICP-OES tests detected greater intracellular uptake of copper in the mutant strain l1ics3 under conditions of pH 4.0 when compared to absorption of the same metal under conditions of pH 6.0, demonstrating that large amounts of copper, are being incorporated into the intracellular medium due to acidification of the medium, suggesting the involvement of Δics3 to the actions of the VATP-ases. Together, these results demonstrate that ICS3 gene is important for maintaining cell viability of S. cerevisiae grown in culture medium at acidic pH, and under conditions of high concentrations of CuSO4. The objective of this study was to understand the relationship ICS3 in antioxidant response and sensitivity to copper through experiments tolerance and YPD medium acid (pH 4.5) and fixed pH after addition of CuSO4.