Plus de 40 ans après la découverte de la technologie des hybridomes, une soixantaine d’anticorps monoclonaux thérapeutiques IgG ou assimilés sont aujourd’hui commercialisés. Leur succès découle de leur humanisation, en particulier celle de la portion Fc qui dérive de différents variants humains naturels, isotypes et allotypes. Depuis quelques années, apparaissent sur le marché de nombreux anticorps comportant des portions Fc artificiellement modifiées dans le but de moduler diverses propriétés pharmacologiques (propriétés cytolytiques, demi-vie, stabilité, etc.), dont certaines ont été particulièrement étudiées suite aux travaux de notre équipe. Les variants Fc sont protégés par des technologies brevetées dont on connaît mal l’étendue, qui ne font pas nécessairement l’objet de publications scientifiques, et dont la raison d’être reste méconnue des chercheurs et plus encore des professionnels de santé. Nous avons donc entrepris de réaliser une cartographie et une analyse fine des brevets traitant des modifications dans la portion Fc des IgG. Cette analyse a été menée de front avec une étude bibliographique détaillée, car les données scientifiques décrites dans les brevets sont toujours à considérer avec prudence, les demandes de brevets n’étant pas revues par des pairs. Nous avons eu l’occasion d’ailleurs d’épingler certaines dérives, comme celle de considérer qu’il pourrait y avoir plus de 4 sous-classes d’IgG dans l’espèce humaine (jusqu’à 19 dans certaines revendications…). / More than 40 years after the discovery of the hybridoma technology, around sixty therapeutic monoclonal antibodies based on IgG or assimilated are marketed today. Their success comes from their humanization, especially of the Fc portion derived from various natural human variants, isotypes and allotypes. For some years, many antibodies artificially modified in their Fc portions have emerged, in order to alter various pharmacological properties (cytolitic properties, half-life, stability, etc.), some of them having been particularly studied following the works of our team. Fc variants are covered by patented technologies of which little is known about the extent, which are not necessarily the subject of scientific publications, and whose purpose remains unknown for researchers and even more for health professionals. We therefore undertook to realize a landscape and a detailed analysis of patents dealing with modifications in the Fc portion of IgG. This analysis has been conducted in front with a detailed literature survey, since the scientific data described in patents must be treated with caution, as patent application are not peer reviewed. We actually point certain abuses, such as to consider that there might be more than four human IgG subclasses (up to 19 in some claims…).

Résumé confidentiel / Confidential abstract

De façon physiologique, la voie alterne (VA) du complément est activée en permanence. Elle doit donc être finement régulée à tous les niveaux de la cascade afin de ne pas être délétère pour l'hôte. Chez l'homme, deux pathologies rénales sont associées à une activation non contrôlée de la VA du complément: le syndrome hémolytique et urémique atypique et la glomérulopathie à dépôts de C3 (GP-C3). Pathologie du sujet jeune essentiellement, la GP-C3 regroupe deux entités, la maladie des dépôts denses (GN-DD) et la glomérulonéphrite à dépôts de C3 (GN-C3), d'expressions clinique et histologique hétérogènes et toutes les deux de pronostic rénal réservé en l’absence de traitement efficace disponible (médiane de survie rénale de l’ordre de 8 à 10 ans). Les anomalies de la VA du complément mises en évidence dans la GP-C3 sont essentiellement acquises en rapport avec la présence d'auto anticorps (Ac) dirigés contre la C3 convertase alterne, le C3NeF, ou contre le FH, une protéine régulatrice essentielle de la VA. Dans 15 à 20% des cas seulement, les anomalies sont génétiques en rapport avec des mutations du FH, du FI. Les approches in silico de modélisation moléculaire des protéines mutées apportent des éléments de réponse quant à la responsabilité potentielle d'une mutation dans l’activation non contrôlée de la VA, néanmoins, l'étude des conséquences fonctionnelles est indispensable pour relier l'anomalie à la survenue de la pathologie rénale mais aussi pour comprendre les mécanismes précis impliqués dans le déterminisme des lésions rénales, de GN-DD ou de GN-C3. J'ai dans un premier temps étudié les conséquences fonctionnelles de la première mutation de C3 identifiée dans une forme familiale de GN-C3. In silico, cette mutation I734T est située au niveau d'un site impliqué dans la liaison de C3 avec deux protéines régulatrices, le FH et CR1 et à proximité du site d’interaction avec le FB. In vitro, j'ai pu confirmer que la mutation était responsable d'une activation de la VA au niveau tissulaire en rapport avec un défaut induit de régulation par le FH mais surtout CR1, une protéine régulatrice membranaire, identifié pour la première fois comme acteur dans la physiopathologie de la GP-C3. Par ailleurs, en raison de l'expression exclusivement podocytaire de CR1 au niveau glomérulaire, nous avons émis l'hypothèse que les régulateurs pouvaient jouer un rôle déterminant dans la localisation préférentielle des dépôts de C3 au niveau glomérulaire dans cette pathologie. Dans une deuxième partie, à la fois clinique et expérimentale, j'ai travaillé sur les formes acquises de GP-C3 en étudiant un sous-groupe particulier de patients de la cohorte française de GP-C3, âgés de plus de 50 ans et présentant une gammapathie monoclonale. La partie clinique de ce travail a permis de démontrer que la fréquence des gammapathies monoclonales est très nettement augmentée dans la GP-C3 chez les patients âgés de plus de 50 ans comparée à la population générale, que le pronostic rénal est particulièrement sombre avec une médiane de survie rénale de l’ordre de 2 ans et demi mais que le traitement efficace du clone B sous-jacent permet d'améliorer significativement la survie rénale. Les données de l’étude clinique suggèrent indirectement qu’il existe un lien entre l'immunoglobuline (Ig) monoclonale et l'activation de la VA responsable de l'apparition des lésions rénales. Dans la partie expérimentale, j'ai étudié les mécanismes d'activation de la VA dans ce contexte de gammapathie afin de confronter les données de l’étude clinique. L'étude des biomarqueurs d'activation de la C3/C5 convertase et le démembrement des mécanismes d'activation ont permis de conclure que la GP-C3 associée aux gammapathies monoclonales est caractérisée par une activation tissulaire de la VA impliquant la C3 convertase mais aussi et surtout la C5 convertase. (...) / Complement alternative pathway is physiologically activated. It need to be tightly regulated to avaoid uncontrolled deleterious overactivation on host cell surface. In human, two renal diseaes are associated with uncontrolled AP activation, hemolytic uremic syndrom atypical (aHUS) and C3 glomerulopathy (C3G). C3G occures mainly in children and young adults and regoups two distinct histopathological entities, dense deposit disease (DDD) and C3 glomerulonephritis (C3GN). Renal outcomes in C3G is poor since up to 50% of patients reach end stage renal disease 8 to 10 years after diagnosis. Complement abnormalities in C3G are mainly acquired induced by the presence of C3 Nephritic Factor (C3NeF): an autoantibdy targeting the AP C3 convertase. Less frequently C3G patients have anti-FH autoantibodies (Ref) or genetic abnormalities (variants in the FH, FI or CFHR5 genes. In silico analysis of mutated proteins give information about the role of mutation on AP overactivation. However, characterization of functional consequences of these mutations is required to proved the direct link between the abnormality and the occurrence of C3G. I first studied the functional consequences of the first C3 mutation, C3I734T, identified in a familial C3GN. In silico analysis revealed that the mutated residue, T734, is located on the C3 and C3b protein surface and that the substitution I734T may not be associated with major structural changes. The mutated amino acid is located on interaction site between C3b and complement regulatory proteins, FH and CR1. In vitro, the major defect of C3I734T was a decrease in binding to CR1, resulting in lower CR1 dependent cleavage of C3b by FI. These results provide evidence for a CR1 functional deficiency being responsible for deficient complement regulation. Binding of C3I734T to Factor H (FH) was normal, but C3I734T was less efficiently cleaved by Factor I, leading to enhanced C3 fragments binding on glomerular cells. In the second part of my work, I studied acquired C3G in patients with concomitant monoclonal gammopathy. In the clinical part of this study, we demonstrated The high prevalence of monoclonal gammopathy in C3G patients aged over 50, reaching 65% in the French C3G national cohort, strongly suggests a pathogenic link between the two conditions. Next, we demonstrated that renal outcomes is significantly worser in patients with monoclonal gammopathy compared to patients without monoclonal gammopathy but that efficient chemotherapy resulted in higher renal response rate and longer renal survival than conservative or immunosuppressive therapy. Results of the clinical part of the study strongly suggest a link betwwen the monoclonal gammopathy and the occurrence of C3G. In the experimental part of this work, I studied the mechanisms of complement AP activation in these population. Biomarkers of C3 and C5 convertase activation were present 40% and 81% of patients respectively. Anti-complement protein antibodies were found in 23/41 (56%) patients, including in most of patients, anti-FH and anti-CR1 antibodies. I found new antigenic target, C5 and properdin in few cases. The anti-FH and anti-CR1 antibodies were associated with clear functional consequences. Nevertheless, the anti-complement proteins reactivity was not carried out by the MIg in 75% of the cases. I discovered that the MIg induced a direct AP C3 convertase overactivation in 23/34 (67%) patients responsaible for a C5 convertase overactivation in presence of patients’ Ig, in a properdin dependant manner. Our results suggest that MIg and polyclonal autoantibodies could act in synergy: AP overactivation induced by the MIg could be amplified by the inefficient complement regulation, caused by the polyclonal anti-complement autoantibodies. All my results allow to better understand the pathophysiological mechanisms involved in C3G and open up reflection on therapeutic approaches for C3G associated with monoclonal gammopathy.

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Le récepteur des androgènes (RA) est la principale cible thérapeutique du cancer de la prostate (CaP) métastatique. Bien que cette thérapie soit initialement efficace, les effets sont transitoires. De nombreux mécanismes peuvent expliquer la progression du CaP vers un stade de résistance à la castration, telles les modifications du RA. Des données récentes ont montré que les variants constitutifs RA-Q641X et RA-V7, caractérisés par la perte du domaine de liaison au ligand, étaient associés à l’expression de marqueurs mésenchymateux. L’étude de la régulation de la N-cadhérine a mis en évidence que si le RA sauvage et les variants constitutifs se liaient tous deux aux éléments de réponse du gène codant, seuls les derniers étaient associés à une augmentation de l’acétylation de l’histone H4, marque positive de la transcription. Le RNA-seq a révélé que leur expression était aussi corrélée à la régulation de sets de gènes spécifiques incluant des facteurs de transcription dont certains ont déjà été caractérisés en cancérologie.En ce qui concerne le RA-T576A, porteur d’une mutation faux-sens, les données ont révélé une séquence consensus de liaison à l’ADN moins conservée pour le RA sauvage que pour ce mutant et l’importance du 11ème nucléotide des éléments de réponse. De plus, cette mutation a semblé impacter le transcriptome du RA. Ce travail met en évidence le comportement distinct des variants du RA et aide à mieux comprendre leurs modes d’action en décrivant leurs activités transcriptionnelles. / The androgen receptor (AR) is the main therapeutic target in metastatic prostate cancer (PCa). Although this therapy is initially effective, the effects are transient. Many mechanisms can explain PCa progression toward castration resistance including abnormalities in the AR. Recent data have shown that constitutive AR (e.g AR-Q641X and AR-V7), which have lost the ligand binding domain, were associated with the induction of mesenchymal marker expression. The study of N-cadherin regulation highlighted that while both constitutive AR and wild type AR bound to response elements located in the encoding gene, only the AR variants were associated with an increase of H4 acetylation, a positive transcription mark. RNA-seq revealed that their expression was also correlated to specific sets of genes regulation, including transcription factors and genes involved in migration, AR regulation, and therapeutic resistance.Concerning AR-T576A, which hold a missense mutation, data revealed a less conserved consensus sequence for the wild type AR than for this mutant and highlighted the importance of the 11th nucleotide of the response element for AR recruitment to DNA. Plus, this mutation seemed to impair AR transcriptome. This work highlights the distinct AR variants’ behavior and helps to understand their mode of action by depicting their transcriptional landscapes.

Malgré le rôle des variants constitutivement actifs du récepteur des androgènes (RA) et du stroma tumoral dans le cancer de la prostate résistant à la castration (CRPC), leurs relations restent inconnues. Nous rapportons l’impact de l’interleukine-6 (IL-6) sécrétée par les cellules stromales prostatiques (PrSC) sur les cellules épithéliales tumorales prostatiques exprimant les variants autonomes du RA. Le milieu de culture conditionné par les PrSC (CMPrSC) contenait des taux élevés d’IL-6 et induisait une augmentation de l’activité transcriptionnelle de STAT3 dans les LNCaP et C4-2b exprimant le variant RAQ640X, via une activation de pY705-STAT3. Cette activité de STAT3 était inhibée par la neutralisation de l’IL-6. L’analyse par mRNA array et RT-qPCR a mis en évidence un profil transcriptomique spécifique lié à l’expression du RAQ640X et à l’exposition au CMPrSC, impliquant les fonctions de motilité, d’invasion et de migration cellulaires, et l’expression de gènes favorisant la dissémination métastatique. Ainsi, nos résultats illustrent une coopération épithélio-stromale «privilégiée» en présence de variants autonomes du RA, impliquée dans la progression tumorale. / Constitutively active androgen receptor (AR) variants and stromal microenvironment are involved in castration resistant prostate cancer (CRPC), but their relationship remains unknown. We describe the effects of interleukin-6 (IL6) secreted from prostate stromal fibroblast cells (PrSC) towards prostate epithelial cancer cells expressing constitutively active AR variants. Conditioned culture medium from PrSC (CMPrSC) contained high levels of IL-6 and led to an increased STAT3 transcriptional activity in LNCaP and C4-2b cells expressing the ARQ640X variant, through pY705-STAT3 activation. This STAT3 activity was significantly diminished with neutralizing antibody anti-IL6. Gene expression analysis using mRNA array and RT-qPCR highlighted a specific transcriptional profile related to ARQ640X expression and PrSC exposure, resulting in cellular motility, invasion and cellular migration, and IL-6 genes expression promoting metastatic dissemination. Overall, our data emphasize a “preferred” epithelio-stromal cooperation when expressing constitutive active RA variants, which contributes to tumor progression.

Work to the theme "Analysis of insurance products for small and medium sized enterprises" tries to find the optimal variant of insurance of enterprise for the given company. These variants, also the given insurance companies, are compared by using of monocriteria and multicriteria evaluation of variants. It is possible to apprise basic concept in the first part, relating to insurance industry, insurance, enterprise, small and medium sized enterprises, mono and multicriteria evaluation of variants. There is a given company defined in the practical part, what are these variants evaluate for. There are also requests defined, that a company holder determines with a help of insurance broker, and then insurance offers are in this part defined. I used a method of monocriteria evaluation that supposes pessimistic approach for evaluation of variants. The aim of this evaluation was to determine which combination of insurances would be for the businessman and his company the optimal variant. Variants were evaluated with the help of multicriteria evaluation later, specifically Saaty´ method of weight determination and AHP method for order determination. Criteria, which were evaluated, are for example insurance premium over the discount that was offered through individual insurance companies, requirements for the security of buildings that provide insurance companies, etc. Four variants were evaluated. Today´s businessmen often solve problem, how they should protect themselves and their business against risks that can threaten. At this moment it is important to realize not only what type of risks threaten the business, but also the extent of its. When a businessman decides to one insurance option, it´s necessary to navigate himself through the offers of insurance companies and even get advice from an insurance broker. He can also for example decide based on personal experience with the insurance company. It´s definitely important to analyse the offers from different insurers.

La variabilité phénotypique est définie par la capacité d’une espèce donnée à produire des variants phénotypique à partir d’un seul génotype, sous l’influence de l’environnement. L’origine de la variabilité phénotypique constituait un débat entre les scientifiques jusqu’à l’heure actuelle. Il était généralement admis que les variations génétiques seraient la seule source de la variabilité phénotypique. Cependant, les études récentes montrent que des variations épigénétiques pourraient être une source alternative pour les variants phénotypiques, sans modifier la séquence de l’ADN. L’épigénétique est l’une des composante du « Dual inheritance system », une théorie qui évoque l’existence de deux systèmes d’héritabilité : la génétique et l’épigénétique. Dans les interactions hôte / parasite, les parasites exercent des pressions sélectives sur leurs hôtes et vice versa, conduisant à une véritable course aux armements entre les deux partenaires. Une telle interaction nécessite une adaptation rapide où chaque partenaire doit évoluer sa capacité d’exprimer de nouveaux variants phénotypiques. Schistosoma mansoni est un parasite humain responsable de la bilharziose intestinale. Cette maladie est classée au second rang mondial selon l’OMS. Le schistosome se caractérise par un cycle de vie qui est complexe nécessitant le passage par deux hôtes : l’hôte intermédiaire Biomphalaria glabrata et l’hôte définitif qui pourrait être l’homme ou les rongeurs. Nous nous sommes intéressés au cours de la thèse à l’interaction de S. mansoni avec B. glabrata. Cette thèse avait pour objectif de montrer l’implication des modifications épigénétiques dans la production des variants phénotypiques dans un contexte de coévolution de l’interaction entre S. mansoni et B. glabrata. Les deux principaux buts c’étaient : (i) Déterminer le poids relatif épigénétique / génétique dans l’expression des variants phénotypiques chez le parasite. (ii) Initier l’investigation autour des mécanismes épigénétiques chez l’hôte. Les résultats de nos travaux ont montré que les modifications des histones constituent en effet une origine des variants phénotypiques chez S. mansoni. Ces variants phénotypiques exprimés sont à la base d’une meilleure fitness voire d’une virulence pour le parasite. Finalement, l’étude de l’héritabilité des modifications épigénétiques a montré une transmission qui ne respecte pas les lois mendéliennes. En ce qui concerne B. glabrata, nous étions les premiers à mettre en évidence la méthylation de l’ADN chez ce mollusque. Au niveau du génome, 2% des cytosines totales sont méthylées. / Phenotypic variability is defined by the capacity of a given species to produce phenotypic variants from one genotype under the influence of the environment. There is several thinking about the origin of phenotypic variability. It was generally assumed that the genetic variations are the sole source of phenotypic variants. However, recent studies show that epigenetic variations can provide alternative source for phenotypic variants without change in DNA sequence. Epigenetic is one of the two components of the « Dual inheritance system », theory that evokes the existence of two inheritance system: genetics and epigenetics. In host / parasite interactions, parasites exert selective pressures on their hosts and vice versa, leading to a genuine arms race between both partners. Such interaction requires rapid adaptation where each partner has to evolve the capacity to express new phenotypic variants. We propose that epigenetic variations play an important role in the genesis of phenotypic variability. Schistosoma mansoni is a human parasite that causes intestinal schistosomiasis. Thisdisease is ranking second in the world according to the WHO. Schistosome is characterized by a life cycle that is complex requiring passage by two hosts: the intermediate host Biomphalaria glabrata and the definitive host that could be humansor rodents. During the PhD project, we are interested to the interaction of B. glabrata with S. mansoni. This PhD project aimed to show the involvement of epigenetic changes in the production of phenotypic variants in the context of coevolution of the interaction between S. mansoni and B. glabrata. The two main goals were: (i) To determine the relative weight epigenetic / genetic in the expression of phenotypic variants in the parasite. (ii) To initiate the investigation of epigenetic mechanisms in the host. The results have shown that histone modifications are indeed a source of phenotypic variants in S. mansoni. These phenotypic variants are the basis for better fitness and / or virulence of the parasite. Finally, studying the heritability of epigenetic changes showed a non-mendelian transmission. For B. glabrata, we were the first to highlight the DNA methylation in the snail. 2% of total cytosines are methylated in his genome.

Le genre Staphylococcus, première étiologie des infections ostéo-articulaires (IOA), est associé à des formes particulièrement difficiles à traiter. Trois mécanismes phénotypiques ont été rattachés à ce fort taux de chronicité et de rechutes, permettant l'adaptation bactérienne à la vie au sein du tissu osseux et un échappement au système immunitaire de l'hôte et à l'action des antibiotiques : la formation de biofilm, la persistance des staphylocoques dans les ostéoblastes, et l'évolution vers le morphotype de small colony variant (SCV). Longtemps considéré comme simple commensal cutanéo-muqueux, S. epidermidis est désormais reconnu comme un agent étiologique majeur des IOA sur matériel. Or, si le portage est universel, l'infection est un phénomène rare. A ce jour, aucun facteur génotypique n'a pu être associé au pouvoir invasif de certaines souches de portage. Notre travail a permis de montrer l'absence de pouvoir discriminant des capacités d'internalisation des ostéoblastes et de formation de biofilm entre souches commensales et invasives. Par ailleurs, un très faible taux d'internalisation de S. epidermidis dans les ostéoblastes a été mis en évidence, suggérant une importance moindre de ce mécanisme dans la physiopathologie des IOA à S. epidermidis par rapport aux IOA à S. aureus. Les principales études ayant porté sur les capacités d'interaction de S. aureus avec les ostéoblastes et de formation de biofilm ont cherché à en explorer les mécanismes à partir de souches de laboratoire ou de souches représentatives de quelques clones de S. aureus résistants à la méticilline (SARM). Dans notre cas, nous avons souhaité étudier une large collection de souches cliniques de S. aureus (n=95) sensible à la méticilline (SASM) responsables d'IOA aiguës ou chroniques. La caractérisation des fonds génétiques de cette collection, puis en élargissant notre étude à des collections de différents villes françaises, a d'abord permis de décrire une forte prévalence du clone émergent de SASM CC398 dans les IOA en France / Pas de résumé en anglais

Ce travail de thèse porte sur la formation et l’évolution des microstructures et microtextures des alliages de titane associées à la précipitation de la phase α aux JDGs β/β. L’alliage β-métastable Ti17 a été utilisé comme alliage modèle de par son aptitude à figer sa microstructure haute température, permettant de conserver la phase parente non transformée. De nombreuses analyses cristallographiques EBSD 2D et quelques analyses 3D ont été réalisées pour des microstructures formées sous diverses sollicitations thermiques (transformation en conditions isotherme (TI) ou refroidissement continu (RC)) et thermomécaniques (déformation de la phase parente puis TI ou RC). L’étude statistique automatisée des microtextures a été menée à partir de données EBSD en utilisant un algorithme spécifique conduisant aux mesures d’orientations de variants et à des grandeurs représentatives de la microtexture. Un lien étroit entre la cinétique de germination croissance de la phase α et le développement de la microtexture est mis en évidence, alors que ce paramètre est souvent négligé dans les travaux de la littérature. De plus, l’étude de différents critères de sélection de variants (SV) a conduit à montrer que la SV était fréquente pour les premiers grains formés. Ces premiers grains ont des conditions de germination plus favorables ; le variant choisi est celui qui minimise l’écart à la ROB avec les deux grains β. Autrement dit, l’énergie d’interface et surtout l’énergie élastique associée à la formation de ce variant sont minimales. Les conditions cristallographiques de formation des colonies de lamelles sont également étudiées et discutées / This work focuses on the formation and the evolution of microstructure and microtexture associated with the α phase precipitation at β/β GBs in titanium alloys. A β-metastable alloy (Ti17) has been studied, because the high temperature microstructure is frozen by a rapid quench and the untransformed parent phase remains. Numerous 2D EBSD analyses and some 3D analyses have been carried out after transformation and under various thermal and thermo-mechanical treatments (isothermal conditions and continuous cooling (CC) without and with prior deformation of the parent phase). One great originality of this study is the automated statistical approach used to characterize the microtexture from EBSD data. An algorithm has been specifically developed in order to get the variants orientation as well as different representative data characterizing the microtexture. We have identified the link between the nucleation/growth kinetics of α phase and the microtexture development, a relationship that is often neglected in the literature, where one usually associates the microtexture only to the variant selection and to the initial β texture. The occurrence of variants selection (VS) has been performed considering different VS criteria; it has been shown that VS is very active for the first grains formed. These grains have the most favorable nucleation conditions. The variant selected is the one that minimizes the deviation to the Burgers Orientation Relationship with both β grains; i.e. the one for which interfacial energy and especially the elastic energy associated to its formation are minimized. Moreover, the crystallographic conditions of α colonies formation are studied and discussed