Made available in DSpace on 2016-04-07T13:16:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 523.pdf: 12385357 bytes, checksum: 83bdf7d32305930d6101aa4695428a19 (MD5) 2011sousa-rcv.pdf: 12385357 bytes, checksum: 83bdf7d32305930d6101aa4695428a19 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A infecção pelo Vírus da Hepatite A (HAV) ainda acomete milhões de pessoas em todo o mundo, causando uma doença que pode variar desde um quadro assintomático até casos mais severos. Apesar da existência de vacinas comerciais, produzidas a partir do vírus inativado ou atenuado, elas ainda não estão disponíveis para grande parte da população mundial, em virtude do seu alto custo. Uma alternativa atraente consiste na pesquisa e desenvolvimento de vacinas de DNA, que potencialmente apresentam algumas vantagens em relação a vacinas convencionais como a maior estabilidade, maior segurança e possibilidade de serem produzidas com um menor custo final. Neste trabalho foi realizada a construção, otimização e avaliação da expressão de protótipos vacinais recombinantes, visando o desenvolvimento de uma vacina de DNA contra o HAV. O segmento traduzível do genoma do HAV é composto por: região P1, formada pelas proteínas estruturais VP1, VP2, VP3 e VP4; região P2, da qual fazem parte a proteína 2A (que funciona como primeiro sinal para a montagem do capsídeo) e as proteínas 2B e 2C (as quais participam do processo de replicação do RNA viral); região P3, onde encontram-se a protease 3C (responsável pelo processamento de todas as proteínas estruturais e não-estruturais) e a RNA polimerase 3D. A sequência vacinal foi gerada a partir dos genes das proteínas estruturais, e da protease 3C viral, sendo denominada de poliproteína truncada (HAV-PTRUNC). Esta sequência foi otimizada e também fusionada a região N-terminal da Proteína de Associação à Membrana Lisossomal (LAMP), com o objetivo de promover a secreção dos antígenos virais, gerando a construção N-LAMP_HAV-PTRUNC. Para a detecção da expressão de HAVPTRUNC e N-LAMP_HAV-PTRUNC, as proteínas individuais VP1, VP3 e 3C foram produzidas em bactérias e utilizadas para imunizar coelhos, para a obtenção de anticorpos policlonais específicos contra as mesmas. Os anticorpos obtidos foram capazes de reconhecer não só as respectivas proteínas recombinantes, como também as proteínas nativas do vírus e N-LAMP_HAV-PTRUNC. De acordo com os resultados obtidos, pretendemos dar continuidade aos nossos estudos através de ensaios clínicos, no intuito de produzir a primeira vacina de DNA contra HAV regulamentada para uso em humanos

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é um dos principais patógenos virais dos bovinos e sua infecção causa importantes perdas na produção dos rebanhos afetados. O presente trabalho contém os estudos realizados para esclarecer determinados aspectos da epidemiologia e da detecção da infecção causada pelo BVDV no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. O primeiro artigo consistiu de um estudo transversal onde os níveis de anticorpos contra o BVDV em amostras de tanque de leite que foram correlacionados com os aspectos produtivos dos rebanhos. As amostras e as informações foram coletadas de 300 criações escolhidas aleatoriamente entre 1.656 associados de uma cooperativa de leite na região central do Estado do Rio Grande do Sul e que não utilizaram vacina contra BVDV nos últimos 12 meses anteriores ao experimento. Dessas, 80 foram consideradas positivas para BVDV pela detecção de anticorpos contra vírus em níveis superiores ao ponto de corte do teste de ELISA comercial utilizado. A prevalência aparente estimada foi de 26,7% e, usando um intervalo de confiança de 95%, apresentou uma variação entre 22 e 31%. Os parâmetros de produção mensal de leite, densidade de bovinos (relação vacas/hectare), tipo de armazenamento do leite e origem do sêmen não apresentaram associação com a infecção pelo BVDV, mas o aumento do número total de animais por rebanho foi correlacionado positivamente com a infecção. A prevalência estimada foi considerada baixa para uma população de rebanhos, criados em sistema semi-intensivo de produção de leite, que não usava medidas específicas de controle contra a infecção. A hipótese proposta no presente artigo é que o pequeno número de animais por rebanho está favorecendo a uma provável limpeza ou erradicação da infecção nas criações e que a prevalência encontrada deve corresponder ao ponto de equilíbrio entre a pressão de infecção e a limpeza da infecção destes rebanhos. A baixa prevalência estimada pode ser uma condição favorável para iniciar um programa de controle para BVDV na população estudada. No segundo artigo, um teste da transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) foi estabelecido para detecção do vírus nas amostras de tanque de leite dos rebanhos suspeitos de infecção ativa pelo BVDV identificados no primeiro artigo. O teste foi capaz de detectar até 0,001 TCID50 de BVDV por mL de leite. Esses resultados demonstraram uma sensibilidade analítica 100 ou 1000 vezes superior aos testes de RTPCR convencionais descritos anteriormente para leite e são semelhantes aos resultados obtidos em testes de RT-PCR em tempo real para BVDV. Na análise das amostras de campo, o teste detectou RNA viral em dois rebanhos entre os 59 analisados. Esses resultados comprovaram a capacidade do teste para identificar amostras naturalmente infectadas e a presença de vacas adultas produtivas e virêmicas em 3% dos rebanhos suspeitos de infecção. Este teste é uma alternativa rápida e sensível para monitorar a infecção pelo vírus em rebanhos leiteiros, a partir de amostras coletivas. O terceiro artigo tratou da detecção do BVDV em carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus alimentados em bovino persistentemente infectado (PI). Seu objetivo foi investigar o papel do carrapato bovino R. microplus na transmissão do BVDV. O RNA viral foi detectado nas teleóginas alimentadas no bovino PI, mas não pode ser identificado em sua progênie (ovos e larvas). Esses resultados sugeriram não haver transmissão transovariana do BVDV nos carrapatos. Por outro lado, a infestação experimental de um segundo bovino com as larvas oriundas das teleóginas contaminadas com BVDV não resultou em manifestação clínica e o animal foi negativo no teste de RT-PCR. O experimento demonstrou que o carrapato R. microplus pode ser contaminado com BVDV durante o repasto sanguíneo, reforçando a idéia de que vetores hematófagos possam estar envolvidos na disseminação da doença e merecem mais investigações. / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is one of the main pathogenic agents in cattle and the infection with the agent causes important production losses in the affected herds. The present work contains studies carried out to clarify some aspects of the epidemiology and detection of the infection caused by BVDV in the State of Rio Grande do Sul, Brazil. The first paper consisted of a transversal study, where antibody levels against BVDV in samples of bulk milk tank were correlated with some aspects of milk production in the herds. Samples and information were collected from 300 herds randomly chosen between 1656 associates of a dairy cooperative in the region of the central area of the state of Rio Grande do Sul, Brazil, that were not using routine vaccination against BVDV in the last 12 months previous to the experiment. Among them, 80 were considered positive to BVDV by detection of antibodies against the virus in levels above the cut off point of the commercial ELISA test used. The apparent estimated prevalence was 26.7% and, using a confidence interval of 95%, showed a range between 22 and 31%. The parameters of average milk production, bovine density (relationship cattle/hectare), milk storing process and origin of the semen were not significantly associated with BVDV infection, but the increase in the total number of cows in the herds was positively correlated with the infection. The prevalence was considered low for a population of herds raised in a semi-intensive milk production system that was not using specific measures to control the viral infection. The hypothesis proposed in the present study is that the small number of animals present in the analyzed herds would favors a likely virus clearance in the herd and that the prevalence found would correspond to a point of balance between the pressure of infection and the virus clearance. The low prevalence detected can be a favorable condition to launch a control program for BVDV in the studied population. In the second paper, a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was established for BVDV detection in bulk tank milk samples of the herds suspected of active infection with BVDV in the first paper. The test detected up to 0.001 TCID50 of BVDV per mL of milk. These results demonstrated an analytical sensitivity 100 to 1000 times higher than conventional RT-PCR tests described previously for milk and are similar to results obtained by the use of real time RT-PCR already published. In the analysis of field samples, the test detected viral RNA in 2 out of 59 analyzed herds. These results demonstrated the relationship between the ability of the test to identify samples naturally infected and the presence of viremic adult cows in 3% of the herds suspected of the infection. This test represents a fast and sensitive alternative for monitoring virus infection in dairy herds, through the analysis of collective samples. The third article dealt with the detection of BVDV in the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus fed in a bovine persistently infected (PI). The objective was to investigate the role of the cattle tick R. microplus in the transmission of BVDV. Viral RNA was detected in adult females fed on the PI bovine, but could not be identified in its progeny (eggs and larvae). These results suggest that there is no transovarial transmission of BVDV in ticks. On the other side, experimental infestation of a second bovine with larvae derived from adult cattle contaminated with BVDV did not result in clinical manifestations and the animal was negative in the RT-PCR test. The study demonstrated that the tick R. microplus can be contaminated with BVDV during blood feeding, strengthening the idea that haematophagous vectors could be involved in the dissemination of the disease and would deserve further consideration.

O Epstein-Barr vírus (EBV) é a única espécie humana pertencente ao gênero Lymphocryptovirus. A transmissão ocorre através da saliva contaminada e geralmente ainda na infância. Nosso estudo analisou 165 amostras clínicas de pacientes, portadores de HIV, em tratamento com antiretrovirais, atendidos no Sistema Hospitalar do Sistema Penitenciário do Estado de São Paulo. Nosso enfoque foi pesquisar o EBV nas células mononucleares do sangue periférico, através das técnicas de PCR, Nested-PCR e seqüenciamento de nucleotídeos. Os resultados obtidos, indicaram que 11,51% (19) das amostras analisadas, apresentaram-se positivas para o EBV. Essas 19 amostras, foram seqüenciadas com primers específicos para a região da EBNA-1 (Epstein Barr Nuclear Antigen 1). As amostras foram alinhadas com o auxílio do DNASTAR. Ao alinharmos as amostras, encontramos uma troca de base (de G para A) em 7 amostras e essa troca não alterou a conformação da proteína EBNA-1. Na análise filogenética de nossas sequências com as depositadas no GenBank, foi possível observar dois grupos, que representam tipo 1 e o tipo 2 do EBV. 100% das amostras estudadas por nós foram identificadas como pertencentes ao grupo que caracteriza o tipo 2. Sendo assim, as 7 amostras que apresentaram a troca sugerem a origem um novo subtipo. / The Epstein-Barr Virus (EBV) is the only species to the genus Lymphocriptovirus that infects humans. One of the possible route for its transmission thought by contamined saliva and usually occurs in the childhood. This study analysed 165 clinical samples from HIV infected patients, treated by HARRT, attended in the Hospitalar System in the Penitentiary System from Sao Paulo State. The aim of this study was to search EBV in peripheral blood mononuclear cells by PCR, Nested-PCR and sequencing analysis. The results showed 11,51% of the analysed samples, positive for EBV. This samples, was sequenced with specifics primers from the EBNA-1 (Epstein Barr Nuclear Antigen 1) region. The samples were aligned by DNASTAR program. The aligned sequences showed the base conversion G to A in seven samples. This conversion caused no alteration in the EBNA-1 protein conformation. In the phylogenetic analysis the studied sequences with the sequences from GenBank was possible to observe two groups represented with type 1 and type 2 from EBV. 100% the samples studied was identified with the group characterized by the type 2 to EBV. So the seven samples showed the conversion, suggesting the origin of the one new subtype.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-10-17T14:19:45Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DeteccaoVirusInfluenza.pdf: 2105812 bytes, checksum: 592b69e553c78f97d0a3a3db69ed7c2f (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-10-30T13:26:13Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DeteccaoVirusInfluenza.pdf: 2105812 bytes, checksum: 592b69e553c78f97d0a3a3db69ed7c2f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-30T13:26:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DeteccaoVirusInfluenza.pdf: 2105812 bytes, checksum: 592b69e553c78f97d0a3a3db69ed7c2f (MD5) Previous issue date: 2014 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O vírus Influenza A é conhecido pela sua capacidade de infectar uma ampla variedade de animais, como os mamíferos (humanos, suínos, equinos, cetáceos, morcegos), aves domésticas (galinha [Gallus gallus], ganso, peru [Meleagris ocellata]), além de aves selvagens das ordens Charadriiformes (gaivotas, andorinhas, aves marinhas e maçaricos) e Anseriformes (pato, ganso selvagem e cisne) sendo estas seu hospedeiro natural. Compreender o movimento de longa distância de aves selvagens migratórias é crucial para explicar a circulação de vírus da gripe aviária. Este evento de circulação faz com que as aves atuem como importante meio de propagação do vírus ao longo de uma rota migratória, fato este já amplamente aceito. Entre os anos de 2006 e 2007 foram coletadas 2.252 amostras (swab de traquéia e cloaca), obtidas em locais que fazem parte da rota de migração do Atlântico e Mississipi, a partir de uma variedade de espécies de aves em regiões dos estados da Bahia, Pará e Pernambuco, para vigilância epidemiológica dos vírus Oeste do Nilo e Influenza. O objetivo deste estudo foi investigar a circulação de vírus Influenza entre aves migratórias que utilizam as rotas que passam pelos estados brasileiros supracitados. Para isso, as amostras foram analisadas através de técnicas de biologia molecular, que compreenderam duas etapas principais: a) extração de DNA/RNA a partir do espécime biológico; b) amplificação do gene controle codificador da Citocromooxidase pela técnica Reação em Cadeia mediada pela Polimerase (PCR) e amplificação do RNAv pela técnica de Transcrição Reversa seguida pela PCR em tempo real (RT-qPCR). Os resultados obtidos mostraram que do total de amostras testadas, 7,2% (n = 158) foram positivas por rRT-PCR para o vírus Influenza A. Observou-se uma diferença de positividade para o virus entre as espécies de aves analisadas, sendo esta de 3,6% para a ordem Charadriformes, 26,3% entre as aves da a ordem Anseriformes, 5,3% das aves pertencentes a ordem Pelecaniformes e 10,9% para aquelas da ordem Suliformes. Entre as amostras das ordens Passeriformes e Columbiformes, nenhuma amostra revelou-se positiva para vírus Influenza. Os dados sugerem variação entre os locais de coleta, tendo o estado do Pará com o menor percentual de positividade, a Bahia com segunda maior taxa e por fim Pernambuco apresentando maior valor de prevalência absoluta. Este estudo mostra que apesar de raras investigações realizadas no território brasileiro, constata-se circulação de vírus Influenza A entre diversas espécies de aves migratórias que utilizam os estados do Pará, Bahia e Pernambuco como locais de parada e reprodução de suas espécies. Estes achados justificam novas investigações para compreender a dinâmica dos vírus da gripe aviária na população de aves selvagens circulantes no Brasil, e seu papel como fonte em potencial de infecção para outros animais, inclusive o homem. / The Influenza virus is known for its ability to infect a wide variety of animals, such as mammals (humans, pigs, horses, whales), domestic birds (chicken [Gallus gallus], goose, turkey [Meleagris ocellata]) beyond wild birds of the orders Anseriformes (duck, wild goose and swan) and Charadriiformes (seagulls, swallows, aquatic birds and sandpipers) these being its natural host. Comprehend the movement of long distance migratory wild birds is crucial to explain the movement of avian influenza viruses. This event causes movement of the birds are acting as an important means of spreading the virus along a migratory route, a fact widely accepted. During the period 2006 and 2007, samples were collected 2,252 samples from a variety of bird species captured in locations which are part of the Atlantic migration route and Mississippi, in the states of Bahia, Para and Pernambuco for epidemiological surveillance of West Nile virus and influenza. The objective of this study was to investigate the circulation of influenza virus among migratory birds that use the routes that pass the above states. For this, the samples were analyzed by means of molecular biological techniques, which comprised two main steps: a) extraction of DNA / RNA from the biological specimen; b) amplification of the gene encoding cytochrome oxidase control of by the technical Polymerase Chain Reaction (PCR) and amplification of the vRNA by Real time Reverse Transcripition polimerase chain reaction (RT-qPCR). The results obtained showed that the total samples tested, 7.2% (n = 158) were positive by RT-qPCR for Influenza A virus. We observed a difference in positivity for the virus among bird species analyzed, which is 3.58% for Charadriformes order, 26.3% among the birds of the order Anseriformes, 5.3% of birds belonging to the order Pelecaniformes and 10.9% for those order Suliformes. Among the samples of the orders Passeriformes and Columbiformes, no sample was positive for Influenza Virus. The data suggest variation among the sampling sites, and the state of Para with the lowest percentage of positivity, the second highest rate with Bahia and Pernambuco finally presenting higher prevalence of absolute value. This study shows that although rare investigations in Brazilian territory, there has been movement of Influenza A viruses among several species of migratory birds that utilize the states of Para, Bahia and Pernambuco as stopping places and reproduction of their species. These findings justify further investigations to understand the dynamics of avian influenza viruses circulating in the population of wild birds in Brazil, and its role as a potential source of infection for other animals, including humans.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-10-17T14:24:05Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DeteccaoGenotipagemNorovirus.pdf: 1697028 bytes, checksum: 20d2d9ece28dd27e87f347b93ca6a6cf (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-10-30T13:49:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DeteccaoGenotipagemNorovirus.pdf: 1697028 bytes, checksum: 20d2d9ece28dd27e87f347b93ca6a6cf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-30T13:49:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DeteccaoGenotipagemNorovirus.pdf: 1697028 bytes, checksum: 20d2d9ece28dd27e87f347b93ca6a6cf (MD5) Previous issue date: 2014 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas / Os vírus entéricos eliminados pelas fezes de indivíduos infectados se dispersam nos ambientes aquáticos por meio do lançamento de esgoto. Dentre esses vírus os norovírus (NoV) são atualmente considerados a principal causa de surtos de gastrenterite mundialmente, decorrentes da ingestão de água e alimentos contaminados, como também estão associados a hospitalizações. O objetivo dessa pesquisa foi detectar e caracterizar parcialmente os NoV humanos (genogrupos I e II) em diferentes tipos de água e esgoto bruto da Região Metropolitana de Belém. O estudo envolveu águas superficiais de baía (Ver-o-Peso), rio (Porto do Açaí), igarapé (Tucunduba) e dois mananciais (Bolonha e Água Preta), como também água tratada (ETA-Bolonha) e esgoto bruto (EEE-UNA), coletadas mensalmente ao longo de dois anos. Essas águas e esgoto (2 litros) foram inicialmente concentradas em membranas filtrantes obtendo-se um volume final de 2mL. O ácido nucléico foi extraído pelo método da sílica e submetido à reação de semi nested RT-PCR (reação em cadeia mediada pela Polimerase precedida de transcrição reversa) utilizando iniciadores específicos para NoV GI e GII. O cDNA obtido após transcrição reversa foi utilizado para pesquisa de GI/GII também por TaqMan® PCR em tempo real. As amostras positivas por ambas as metodologias moleculares foram analisadas para a região 5’-terminal da ORF2 por nested (GI) e semi nested (GII) com o intuito de obter amplicon para identificação das cepas circulantes, sendo posteriormente purificados com uso de kit comercial e submetidos a caracterização molecular em sequenciador automático. As sequências obtidas foram editadas, alinhadas e comparadas com outras depositadas no banco de genes (GenBank - NCBI) e no site NoV genotyping tool. No período de novembro de 2008 a outubro de 2010, 168 amostras de água e esgoto foram coletadas e analisadas quanto a presença de NoV, obtendo-se positividade de 33,9% (57/168), das quais 21,1% (12/57) foram positivas somente por TaqMan® PCR em tempo real, 19,3% (11/57) por semi nested e 59,6% (34/57) por ambas. Considerando as duas metodologias utilizadas, nos casos positivos, GI (82,5% -47/57) foi mais frequente do que GII (79,0% - 45/57). Porém, na maioria das amostras houve coexistência dos dois genogrupos (61,4% - 35/57), principalmente nas amostras do igarapé Tucunduba e EEE-UNA, considerados os locais mais contaminados por NoV. Por outro lado, na ETA-Bolonha esse agente não foi encontrado. Das 57 amostras positivas por TaqMan® PCR em tempo real e/ou semi nested RT-PCR, 53 foram retestadas para a região 5’-terminal da ORF2, uma vez que quatro apresentaram quantidade insuficiente de material que permitisse uma nova análise, assim em 47,2% (25/53) o genoma de NoV foi detectado, das quais 12% (3/25) pertenciam ao GI, 24% (6/25) ao GII e 64% (16/25) para ambos. Os genótipos mais frequentes de GI e GII foram respectivamente GI.8 (n=8) e GII.4 (n=12), porém outros genótipos foram observados com menor incidência como GII.6 (n=3), GII.9 (n=2), GII.12 (n=1), GII.14 (n=1), GI.1 (n=1) e GI.4 (n=2). Devido a baixa qualidade das sequências obtidas oito amostras não puderam ser genotipadas para GI e três para GII. Das 96 amostras com concentração de coliformes termotolerantes acima do recomendado, 34 (35,4%) também foram positivas para NoV. Aumento na condutividade e sólidos totais dissolvidos foi observado nos materiais do Ver-o-Peso e igarapé Tucunduba, assim como a turbidez foi nitidamente mais elevada nesses locais e no Porto do Açaí. No período menos chuvoso (julho a novembro) houve uma tendência no aumento da positividade para NoV, e nos meses de maior pluviosidade (dezembro a junho) notou-se um decréscimo na incidência desse agente. Os resultados obtidos no presente estudo apontam a circulação de NoV GI e GII nos ambientes aquáticos de Belém, revelando a degradação que estes corpos hídricos vêm sofrendo como consequência da precariedade ou ausência de saneamento na nossa cidade, permitindo a permanência nesses ecossistemas, juntamente com seus efluentes, de patógenos causadores de doenças. / Enteric viruses excreted in feces from infected individuals dispersed in aquatic environments by sewage discharge. Among these viruses, the norovirus (NoV) is actually considered the main cause of gastroenteritis outbreaks worldwide, resulting from the ingestion of contaminated food and water as well as is also associated with hospitalizations. This research aimed to detect and partially characterize the human NoV (GI/GII) in different water matrices and in untreated sewage from Metropolitan Region of Belem. The study involved superficial waters from bay (Ver-o-Peso), river (Acai’s Port), stream (Tucunduba) and two lakes (Bolonha and Agua Preta), as well as treated water (WTP-Bolonha) and untreated sewage (SLP-UNA), monthly collected over two years . The water and sewage (2 liters) were initially concentrated on filtering membranes to obtain a final volume of 2 mL. The nucleic acid was extracted by silica method and submitted to semi nested RT-PCR (reverse transcription Polymerase chain reaction) using NoV GI and GII specific primers. The cDNA obtained after reverse transcription was also used to investigate the GI/GII by TaqMan® real time PCR. The positive samples for both molecular methods were analyzed for 5’end ORF2 by nested (for GI) and semi nested (for GII) in order to obtain amplicon for identification of circulating strains, being further purified using a commercial kit and submitted to molecular characterization in the automated sequencer. The obtained sequences were edited, aligned and compared to others available in gene bank (NCBI) and in the site NoV genotyping tool. In the period of November 2008 to October 2010, 168 water and sewage samples were collected and analyzed for NoV presence, obtaining a positivity of 33.9% (57/168) of which 21.1% (12/57) were positive only by TaqMan® real time PCR, 19.3% (11/57) only by semi nested and 59.6% (34/57) for both. Considering the two methodologies used, in the positive cases GI (82.5% - 47/57) was most frequent than GII (79.0% - 45/57). However, in most samples there was coexistence of the two genogroups (61.4% - 35/57), mainly in the Tucunduba and SLP-UNA samples, considered the most NoV contaminated sites. On the other hand, in WTP-Bolonha this agent was not found. Of 57 positive samples by TaqMan® real time PCR and/or semi nested RT-PCR, 53 were retested for 5’end ORF2, since four samples showed insufficient quantity of material which allowed a new analyze, so, in 47.2% (25/53) the NoV genome was detected, of these 12% (3/25) belonging to GI, 24% (6/25) to GII and 64% (16/25) for both. The most frequent GI and GII genotypes were GI.8 (n=8) and GII.4 (n=12), respectively, but others genotypes were also observed with lower incidence as GII.6 (n=3), GII.9 (n=2), GII.12 (n=1), GII.14 (n=1), GI.1 (n=1) and GI.4 (n=2). Due to low quality of sequences obtained, eight samples could not be genotyped for GI and three for GII. Of 96 samples with concentration of thermotolerant coliforms above the recommended, 34 (35.4%) were also NoV positive. Increase on conductivity and total dissolved solids was observed in materials from Ver-o-Peso and Tucunduba, as well as the turbidity was notably higher in these places and the Acai’s Port. In the less rainy period (July to November) there was a trend in positivity increasing for NoV, and in the highest rainfall (December to June) a decrease in the incidence of this agent was noted. The results obtained in the present study indicate the circulation of NoV GI and GII in aquatic environments in Belem, revealing the degradation that these water bodies have suffered, as a result of poverty or lack of sanitation in our city, allowing the permanence of pathogens in these ecosystems, along with its effluents.

O principal subtipo do HIV-1 na América do Sul é o B, mas o C e o F também são importantes. Tem sido relatados um aumento de prevalência do subtipo C no sul do Brasil e a sua ocorrência em outros países da América Latina. O objetivo desse trabalho foi analisar filogeneticamente amostras de HIV-1C para testar a hipótese de que a sua entrada na América do Sul foi um episódio único, e tentar estimar a sua origem. Analisamos 97 seqüências virais com 975pb (protease e dois terços da transcriptase reversa), de amostras de regiões geográficas onde o subtipo C é importante epidemiologicamente (América do Sul, Ásia e África). Análises filogenéticas foram realizadas com os métodos de Máxima Verossimilhança e Inferência Bayesiana usando PAUP, PHYML e MrBayes. Amostras da América do Sul formaram um grupo monofilético em todas as árvores geradas com diferentes metodologias, com altos valores de bootstrap e de probabilidade posterior. Em todas as árvores uma amostra do Quênia foi a mais proximamente relacionada a esse grupo. Análises de bootscanning de seqüências do subtipo C puras e recombinantes da Argentina e do Uruguai demonstraram que elas são similares às seqüências brasileiras. Nossos resultados indicam que a entrada do HIV-1C na América do Sul ocorreu em um único episódio ou em múltiplos episódios de vírus geneticamente próximos, possivelmente provenientes de países do Leste da África. O HIV-1C se espalhou do Brasil para os outros países da América do Sul / The main circulating HIV-1 subtype in South America is B, but C and F also are important and an increasing prevalence of subtype C in southern Brazil and its occurrence in other countries of Latin American has being described. The goal of this study was to analyze phylogenetically HIV-1C samples from South American countries to test the hypothesis that its entry in the region was a unique episode, and try to estimate its origin. We have analyzed 97 viral sequences spanning 975bp (protease and two-thirds of reverse transcriptase), from samples of geographic locations where the subtype C is epidemiologically important (South America, Asia and Africa). Phylogenetic analyses were conducted using ML and Bayesian inference methods using PAUP, PHYML and MrBayes. Samples from South America formed a monophyletic group when compared with the worldwide samples in all trees generated with different methodologies, with high bootstrap and posterior probability values. In all trees a sample from Kenya was the most closely related to that group. Bootscanning analyses of subtype C and C-containing recombinant sequences from Argentina and Uruguay showed that they are more similar to the Brazilian sequences. Our results indicate that the entry of HIV-1C in South America occurred in a single episode or in multiples episodes of genetically close viruses, possibly from a country of the Eastern Africa. HIV-1C spread out from Brazil to other South American countries.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-05Bitstream added on 2014-06-13T20:35:40Z : No. of bitstreams: 1 simas_pvm_me_sjrp.pdf: 757596 bytes, checksum: 7eea9161648de54e0aebc8de24ca086d (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O virus sincicial respiratório humano (hRSV) é o principal agente causador de infecções respiratórias agudas (IRA) em crianças menores que 5 anos de idade. Estudos de variabilidade genética tem identificado 2 grupos antigênicos de hRSV (A e B). A proteína G tem sido alvo destes estudos e tem fornecido informações importantes sobre as características clínicas e epidemiológicas do vírus. Os objetivos deste estudo foram determinar o genótipo, identificar o padrão de circulação das variantes de hRSV e comparar o diagnóstico apresentado por crianças provenientes de grupos clinicamente distintos. Foram colhidas amostras de aspirado nasofaringe de crianças menores que 6 anos de idade com IRA que freqüentaram uma creche municipal no período de julho de 2003 a setembro de 2005 e que foram internadas no Hospital de Base entre maio de 2004 e setembro de 2005 em São José do Rio Preto-SP. O diagnóstico viral foi realizado por RT-PCR e a genotipagem por sequenciamento da região variável (G2) do gene da proteína G. As árvores filogenéticas foram construídas a partir de alinhamentos das seqüências com outras disponíveis no GenBank para hRSV A e B. Foram identificadas 142 amostras positivas para hRSV (29% - 79/272 nas crianças hospitalizadas; e 7,7% -63/817 nas crianças da creche), das quais 61 foram genotipadas (29 da creche e 32 do hospital). Destas, 92% (56/61) pertencem a hRSV A e 8% (5/61) ao hRSV B. As análise filogenéticas hRSVA mostraram a existência de três agrupamentos, GA1, GA2 e GA5, que co-circularam durante o período analisado. Nos isolados de crianças de creche, houve apenas detecção de hRSV GA1 (isolados muito similares a cepa protótipo A2). Os isolados do subgrupo B pertencem ao genótipo BA – GB3 e foram identificados apenas nas crianças hospitalizadas. Nossos isolados foram similares aos identificados nas cidades de Ribeirão Preto, São Paulo... / Not available

O Epstein-Barr vírus (EBV) é a única espécie humana pertencente ao gênero Lymphocryptovirus. A transmissão ocorre através da saliva contaminada e geralmente ainda na infância. Nosso estudo analisou 165 amostras clínicas de pacientes, portadores de HIV, em tratamento com antiretrovirais, atendidos no Sistema Hospitalar do Sistema Penitenciário do Estado de São Paulo. Nosso enfoque foi pesquisar o EBV nas células mononucleares do sangue periférico, através das técnicas de PCR, Nested-PCR e seqüenciamento de nucleotídeos. Os resultados obtidos, indicaram que 11,51% (19) das amostras analisadas, apresentaram-se positivas para o EBV. Essas 19 amostras, foram seqüenciadas com primers específicos para a região da EBNA-1 (Epstein Barr Nuclear Antigen 1). As amostras foram alinhadas com o auxílio do DNASTAR. Ao alinharmos as amostras, encontramos uma troca de base (de G para A) em 7 amostras e essa troca não alterou a conformação da proteína EBNA-1. Na análise filogenética de nossas sequências com as depositadas no GenBank, foi possível observar dois grupos, que representam tipo 1 e o tipo 2 do EBV. 100% das amostras estudadas por nós foram identificadas como pertencentes ao grupo que caracteriza o tipo 2. Sendo assim, as 7 amostras que apresentaram a troca sugerem a origem um novo subtipo. / The Epstein-Barr Virus (EBV) is the only species to the genus Lymphocriptovirus that infects humans. One of the possible route for its transmission thought by contamined saliva and usually occurs in the childhood. This study analysed 165 clinical samples from HIV infected patients, treated by HARRT, attended in the Hospitalar System in the Penitentiary System from Sao Paulo State. The aim of this study was to search EBV in peripheral blood mononuclear cells by PCR, Nested-PCR and sequencing analysis. The results showed 11,51% of the analysed samples, positive for EBV. This samples, was sequenced with specifics primers from the EBNA-1 (Epstein Barr Nuclear Antigen 1) region. The samples were aligned by DNASTAR program. The aligned sequences showed the base conversion G to A in seven samples. This conversion caused no alteration in the EBNA-1 protein conformation. In the phylogenetic analysis the studied sequences with the sequences from GenBank was possible to observe two groups represented with type 1 and type 2 from EBV. 100% the samples studied was identified with the group characterized by the type 2 to EBV. So the seven samples showed the conversion, suggesting the origin of the one new subtype.

Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Bruno Moreira Carneiro / Banca: Laura Cristina Sichero Vetorazzo / Banca: Maurício Lacerda Nogueira / Resumo: A hepatite C é a inflamação do fígado decorrente da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV), frequentemente evolui para quadros crônicos, sendo considerada mundialmente a maior causa de cirrose e carcinoma hepatocelular. O tratamento padrão com PEG-IFN e ribavirina não é efetivo contra alguns genótipos do HCV, possui alto custo e efeitos colaterais severos. Portanto, novos tratamentos vêm sendo buscados. A cafeína vem sendo associada a um efeito benéfico sobre várias doenças hepáticas incluindo a melhora da bioquímica anormal do fígado, cirrose e carcinoma hepatocelular. A cafeína atua diretamente desacelerando a progressão da fibrose, além de melhorar a função de vias celulares hepáticas, dentre elas vias utilizadas durante o ciclo replicativo do HCV. Embora a cafeína tenha demonstrado efetividade no controle de doenças hepáticas e interação direta com vias celulares utilizadas pelo HCV, não há na literatura correlação direta entre o efeito da cafeína e as etapas do ciclo replicativo do HCV. Assim, o presente estudo propôs estabelecer a relação direta entre a cafeína e sua capacidade inibitória sobre as diferentes etapas do ciclo replicativo completo do HCV. Para esse estudo foram utilizados o replicon subgenômico SGR-JFH-FEO, os replicons completos FL-J6/JFH-5′C19Rluc2AUbi e JFH-1 e a linhagem celular Huh-7.5. A expressão viral foi avaliada por ensaios de Luciferase, Western Blotting, Imunofluorescencia indireta e qPCR. A cafeína demonstrou inibição da replicação viral em todos os níveis avaliados, apresentando IC50 de 0.7263 mM e atingindo em concentrações seguras, inibição máxima da replicação de HCVcc em torno de 79 %. A cafeína demonstrou ainda inibição de 30 % sobre a entrada quando aplicada em conjunto ao sobrenadante infeccioso. Entretanto, essa inibição dobra quando há a exposição das partículas à cafeína previamente à introdução em cultura de células, ... / Abstract: Hepatitis C is the liver inflammation arising from hepatitis C virus (HCV) infection, often evolves to chronic conditions and has been considered the major world cause of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Standard treatment using PEG-IFN and ribavirin is not effective against some HCV genotypes, besides that it has high cost and severe side-effects. Therefore, new treatments have been sought. Caffeine has been found to have beneficial effect in several liver disorders, including the improvement of abnormal liver biochemistry, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Caffeine acts directly by delaying fibrosis, beyond improving the function of liver cellular pathways and interfering with pathways used by the HCV replication cycle. Although, the caffeine showed positive effects for liver disorders and a direct interaction with cell pathways used by HCV, there is no evidence of a direct correlation between caffeine and HCV replication cycle. Thus, the current study proposed to establish the direct relationship between caffeine and different steps of HCV replication cycle. To this study, it was used the subgenomic replicon SGR-JFH-FEO, the full-length replicons FL-J6/JFH-5′C19Rluc2AUbi and JFH-1; and Huh-7.5 cell line. The viral expression was evaluated by Luciferase, Western blotting, Indirect immunofluorescence and qPCR. The caffeine demonstrated to be able to inhibit viral replication on different stages of viral replication, demonstrating an IC50 value of 0.7263 mM and reaching on safe concentrations, HCVcc maximal replication inhibition around 79 %. Caffeine demonstrated also 30 % of inhibition on viral entry on host cells when tested in combination with infectious supernatant. Moreover, this inhibition increased two fold when particles were exposed to caffeine before introduction on cell culture, possibly, indicating an interaction between caffeine and viral proteins. On the other hand, there is no influence of caffeine on viral ... / Mestre

Introdução: Os vírus parainfluenza são importante causa de infecções respiratórias. Na população pediátrica a doença característica associada com HPIV-1 e 2 é a laringotraqueobronquite, enquanto que o HPIV-3 está associado com a pneumonia e bronquiolite. Objetivos: Realizar a análise molecular do fragmento do gene da HN. Métodos: Foram analisados aspirados nasofaríngeos coletados entre 1995 a 2005, de crianças com doença respiratória aguda. A detecção dos HPIV 1, 2 e 3 foi realizada por multiplex RT-PCR. Posteriormente, o fragmento de gene HN foi amplificado, sequenciado e, a análise molecular foi realizada. Resultados e discussão: Um total de 6% amostras foram positivas para HPIV, sendo o HPIV-3 o vírus mais prevalente durante todos os anos estudados, o que corresponde a 80% dos casos positivos, seguido por HPIV-1 (15%) e, HPIV-2 (7%). A maioria das mutações observadas foram silênciosas, no entanto, algumas alterações de aminoácidos foram verificadas em áreas conservadas dos HPIV-3 e HPIV-2, e alterações em sítios potencias de N-glicosilação também foram observados. / Introduction: In paediatric population the characteristic illness associated with HPIV-1 and -2 is laryngotracheobronchitis, whereas HPIV-3 is associated with pneumonia and bronchiolitis. There are 5 virus distributed in two distinct genus: Respirovirus (HPIVI-1 and HPIV-3) and Rubulavirus (HPIV-2, HPIVI-4A and HIVI-4B). Objectives: To carry out the molecular analysis of the fragment of the HN gene. Methods: Nasopharyngeal aspirates from infants with acute respiratory illness collected from 1995 to 2005, were analyzed. The detection of HPIV 1, 2 and 3 were performed by multiplex RT-PCR and the fragment of HN gene was amplified, sequenced and, the molecular analysis was carried out. Results and discussion: A total of 6% samples were positive for HPIV. The HPIV-3 was the most prevalent virus during, corresponding to 80% of positive cases, followed by HPIV-1 with 15% and HPIV-2 7%. Most mutations observed were silent in all PIVs, however, some amino acids alterations in conserved areas, verified in PIV-3 and PIV-2, and alterations in N-glicosilation sites were observed.