Orientador: Fátima Pereira de Souza / Banca: Karina Alves de Toledo / Banca: José Roberto Ruggiero / Resumo: O Vírus Sincicial Respiratório Humano (hRSV) foi identificado em 1957 e mesmo após vários anos de investigação, nenhuma vacina foi desenvolvida. Acredita-se que a chave de inibição da ação viral são suas glicoproteínas de membrana, em especial a proteína de fusão (F), que com auxílio da proteína de ligação (G), é responsável pela instalação do hRSV na célula hospedeira. Há evidências experimentais de que compostos como flavonóides e glicosaminoglicanos podem diminuir a infecção viral, sendo então a proteína F um bom alvo para a ação destes compostos. O presente estudo utilizou de ferramentas de bioinformática para verificar as possíveis regiões de interação da proteína F com a Heparina Sulfatada e Flavonóides. Os programas de bioinformática foram utilizados para: modelagem dos compostos, caracterização e previsão da estrutura secundária da proteína, modelagem da estrutura terciária e docking molecular entre o modelo da proteína F e as estruturas tridimensionais dos Flavonóides e da Heparina Sulfatada. Modelos válidos foram obtidos para as estruturas tridimensionais dos flavonóides e para o modelo completo da proteína F. As características da proteína incluem um alto nível de conservação na seqüência de aminoácidos e, especialmente, em seus sítios de ligação. O docking da proteína com a Heparina, e o virtual screening da biblioteca de Flavonóides e a estrutura da proteína, resultaram em sítios de interação com grande potencial de inibição, uma vez que concordam com evidências experimentais descritos na literatura. A Heparina liga-se ao sítio de clivagem II, importante região para obtenção da atividade de fusão da proteína. Os Flavonóides podem se ligar a região hidrofóbica que desestabiliza... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) was identified in 1957 and even after several years of research, no vaccine has been developed yet. It is believed that the key to the inhibition of viral action is its membrane glycoproteins, including the Fusion Protein (F), responsible for the installation of the hRSV in the host cell. There are evidences that compounds such as flavonoids and glycosaminoglycans can decrease the viral infection, and F protein can be a good target for the action of these compounds. The present study checked the possible sites of interaction between F protein and heparin and flavonoids, using computational tools. Bioinformatics programs were used for: modeling compounds, characterization and prediction of protein secondary structure, tertiary structure modeling and the docking between the protein model and the structures of flavonoids and sulfated heparin. Valid models were obtained for flavonoids structures and the complete model of F protein. The characteristics of the protein include a high level of conservation in amino acid sequence and especially in its binding sites. The heparin docking and virtual screening of flavonoids resulted in interaction sites with great potential for inhibition, since they agree with other studies and experimental evidence of F protein inhibition. This study shows that compounds such as sulfated heparin and flavonoids interact in important sites of F protein. Heparin binds to the cleavage site II and flavonoids can bind to the hydrophobic site that destabilizes the formation of the six-helix-bundle region. Both regions are important for conformational changes that F protein undergoes to get its fusion activity. Docking showed that molecular interactions are likely to occur and selected the best candidates for a possible inhibitor. These evidences... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Marilia de Freitas Calmon / Coorientador: Luis Octavio Regasini / Banca: Ana Paula Girol / Banca: Aripuanã Sakurada Aranha Watanabe / Resumo: Os Papilomavírus humanos (HPVs) são vírus de DNA divididos em dois grupos. O de baixo risco, associado a lesões benignas, e o de alto risco, associado a diversos tipos de câncer. As oncoproteínas E6 e E7 são as principais proteínas envolvidas no processo de carcinogênese decorrente da infecção por esses vírus, de forma que compostos naturais têm sido utilizados na busca por drogas que inibam a expressão viral. Paralelamente, devido aos diversos efeitos colaterais e alto índice de reincidência dos tratamentos tradicionais contra o câncer, a procura por agentes antitumorais é intensa. Nesse contexto, diversas pesquisas estão sendo realizadas afim de explorar as inúmeras propriedades da curcumina, uma substância que apresenta atividade antiinflamatória, imuno-modulatória, antioxidante, anti-angiogênica, quimioprotetora, antiproliferativa, antitumoral e antimicrobiana. Assim, uma estratégia promissora utilizada é a busca por análogos de curcumina que consigam aumentar a eficácia terapêutica desse fitoterápico. Dessa forma, o objetivo desse trabalho é analisar in vitro a ação de diferentes derivados semi-sintéticos de curcumina (AC1, AC2, AC7, AC10 E AC13) sobre a expressão dos oncogenes virais E6 e E7 em linhagem de carcinoma cervical HPV-16 positiva (CasKi) e a atividade antitumoral do composto AC13 em diferentes linhagens tumorais (CasKi, HeLa, MDA-MB- 231, MCF-7 e 786-O). Para isso, após a incubação com os compostos em diferentes concentrações, a viabilidade das células foi analisada por ensaio MTT e uma linhagem imortal transformada de queratinócito humano (HaCaT) foi utilizada como controle para análise da citotoxicidade. Posteriormente, a avaliação da expressão do RNAm de E6 e E7 foi realizada por PCR em tempo real, a determinação da expressão da proteína p53 por Western Blotting e a detecção da atividade das caspases 3 e 7 foi... / Abstract: High risk Human Papilomavírus (HPVs) are DNA vírus divided in two groups. Low risk, associated with benign lesions, and high risk, associated with several types of cancer. Oncoproteins HPV E6 and E7 are the main proteins involved in the carcinogenesis process due to infection by this virus, so that natural coumponds have been used in the search for drugs that inhibit viral expression. At the same time, due to various side effects and high relapse rate of traditional cancer treatments, the search for antitumor agents is intense. In this context, several studies are being conducted in order to explore the numerous properties of curcumin, a substance that has anti-inflammatory, immune-modulatory, anti-oxidant, anti-angiogenic, chemoprotective, anti-proliferative, anti-tumor and anti-microbial properties. Thus, a promising strategy used is the search for curcumin analogues which are able to increase the therapeutic efficacy of phytotherapy. Thus, the aim of this study is to analyze the action of different semi-synthetic derivatives of curcumin (AC1, AC2, AC7, AC10 and AC13) on the E6 and E7 viral oncogenes expression in positive HPV-16 cervical carcinoma cell line (CasKi) and the antitumor activity of AC13 compound in different tumor cell lines (CasKi, HeLa, MDA 231, MCF-7 and 786-O). For this, after incubation with the compounds at different concentrations, cell viability was analyzed by MTT assay and a spontaneously transformed immortal keratinocyte cell line (HaCaT) was used as a control to analyze the cytotoxicity. Subsequently, E6 and E7 mRNA expression evaluation was performed by real-time PCR, p53 protein expression determination was analyzed by Western Blotting, and detecting the caspases 3 and 7 activity was analyzed using the luminescent assay of apoptosis. Although no compound has inhibited E6 and E7 expression in the CasKi cell line, AC13 cytotoxicity analyzes suggest ... / Mestre

Orientador: Ana Carolina Gomes Jardim / Banca: Monika Aparecida Coronado / Banca: Aripuanã Sakurada Aranha Watanabe / Resumo: A Hepatite C é uma doença causada pelo vírus da Hepatite C (HCV), que afeta milhares de pessoas em todo o mundo. Representa um problema de saúde pública, sendo uma das principais causas de doenças e transplantes relacionados ao fígado. Não há uma vacina contra o HCV e os tratamentos atuais não são eficazes para todos os pacientes tratados, apresentando muitos efeitos colaterais e alto custo de desenvolvimento. Desta forma, fica evidente a necessidade do desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas que produzam uma melhor resposta virológica sustentada, efeitos colaterais mais brandos e menor custo de produção. Neste contexto, compostos naturais podem fornecer uma fonte alternativa para a identificação de produtos com potencial terapêutico. O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos de compostos naturais, isolados do veneno da serpente Crotalus durissus terrificus (complexo heterodimérico crotoxina e suas subunidades crotapotina e Fosfolipase A2), e do extrato das folhas de Pterogyne nitens (sorbifolina e pedalitina), no ciclo replicativo do HCV in vitro. Estes compostos foram testados quanto às suas atividades antivirais por meio de infecção e tratamento de células Huh-7.5, e realização de ensaios de luciferase, western-blotting e imunofluorescência. Os dados obtidos demonstraram que tanto os compostos isolados de C. durissus terrificus quanto de P. nitens possuem efeito anti-HCV, sendo que alguns compostos inibiram mais de uma etapa do ciclo replicativo viral. Portanto, os múltiplos efeitos anti-HCV apresentados pelo tratamento com esses compostos demonstraram o potencial terapêutico de fontes naturais no tratamento da Hepatite C / Abstract: Hepatitis C is a disease caused by Hepatitis C virus (HCV) that affects thousands of people worldwide. Represents a public health problem, being one of the main causes of liver disease and transplantation. There is no vaccine for HCV and the current therapy is not effective for all treated patients, presents many side effects and high cost of development. Thus, there is an evident need to develop new therapeutic approaches which result in a better sustained virologic response, milder side effects and lower production cost. In this context, natural compounds can provide an alternative source for the identification of products with therapeutic potential. This study aimed to evaluate the effects of natural compounds, isolated from Crotalus durissus terrificus venom (heterodimeric complex crotoxin and its subunits crotapotin and phospholipase A2), and from leaves extract of Pterogyne nitens (sorbifolin e pedalitin), on HCV life cycle in vitro. These compounds were screened for their antiviral activities by infecting and treating Huh-7.5 cells, and performing luciferase, western blotting and immunofluorescence assays. The data obtained demonstrated that both compounds isolated from Crotalus durissus terrificus and from P. nitens possess anti-, and some compounds inhibited more than one step of the virus life cycle. Therefore, the multiple anti-HCV effects presented by the treatment with these compounds demonstrated the therapeutic potential of natural sources in the treatment of Hepatitis C / Mestre

A VP3, ou Apoptina, é uma das proteínas codificadas pelo vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV). Esta proteína é capaz de induzir apoptose em células humanas tumorais; entretanto, o mesmo não ocorre em células normais. Assim, esta proteína apresenta-se como uma promissora candidata como agente antineoplásico. O girovírus aviário 2 (AGV2), descrito em 2011, é relacionado ao CAV e codifica proteínas homólogas às expressas por este vírus, incluindo a VP3. A comparação da sequência de aminoácidos da VP3 do AGV2 com a da Apoptina do CAV revela uma identidade de 32,2% e o compartilhamento de domínios importantes para a atividade pró-apoptótica tumor-especifica. Nesse trabalho objetivamos investigar o potencial de três variantes da VP3 do AGV2 em induzir seletivamente a morte de células humanas tumorais. Os genes das VP3 foram expressos através de um sistema de expressão adenoviral. Após a transdução dos adenovírus recombinantes expressando as VP3 do AGV2 nas células humanas tumorais A549 e normais MRC-5, a localização subcelular dessas proteínas foi analisada por imunofluorescência e suas implicações sobre a viabilidade celular foram determinadas pelo ensaio de MTT. Nossos resultados evidenciam que os adenovírus expressando as variantes da VP3 do AGV2 possuem a habilidade de inibir preferencialmente a proliferação de células tumorais. Demonstramos também que as VP3 do AGV2 acumulam-se no núcleo das células tumorais, enquanto que na maior parte das células normais essas proteínas ficam restritas ao citoplasma. No entanto, inesperadamente detectamos, em menor proporção, a expressão de VP3 do AGV2 também no núcleo das células normais. Ainda, analisando as sequências de aminoácidos das variantes da VP3 do AGV2, pudemos conjecturar que a presença de um sinal de exportação nuclear com menor eficiência do que o existente na Apoptina do CAV pode estar correlacionado com a localização nuclear dessas proteínas nas células normais e com a inibição da proliferação celular verificada nessas células. Este é o primeiro trabalho demonstrando o potencial da proteína VP3 codificada pelo AGV2 em induzir preferencialmente a morte de células humanas tumorais. / VP3, also known as Apoptin, is one of the proteins encoded by the chicken anemia virus (CAV). This protein is able to induce apoptosis in tumor cells; however, the same does not occur in normal cells. Thus, this protein appears as a promising candidate for anticancer therapy. The recently discovered avian gyrovirus 2 (AGV2) is related to CAV and encodes CAV-homologous proteins, including VP3. The comparison of the AGV2-VP3 amino acid sequence with CAV-Apoptin shows an identity of 32.2% and the presence of functional domains that seem to be important for its tumor-specific pro-apoptotic activity. In this work, we aim to investigate the potential of three AGV2-VP3 protein variants as inducers of apoptosis in human tumor cells. VP3 genes were expressed through an adenoviral expression system. After transduction of the recombinant adenoviruses expressing the AGV2-VP3 variants in human tumor A549 cells and normal MRC-5 cells, subcellular localization of these proteins was analyzed by immunofluorescence and their effects on cell viability was determined by MTT assay. Our results show that the adenoviruses expressing AGV2-VP3 have the ability to inhibit preferentially the proliferation of tumor cells. We also demonstrate that AGV2-VP3 variants accumulate in the nucleus of tumor cells, whereas in most normal MRC-5 cells these proteins are restricted to cytoplasm. However, we unexpectedly detected the expression of AGV2-VP3 proteins, in a lesser extent, in the nucleus of normal cells. Furthermore, analyzing the amino acid sequences of AGV2-VP3 variants we could speculate that the presence of a nuclear export signal (NES) with a lower efficiency than CAV-Apoptin NES may be correlated to the nuclear localization of these proteins in normal cells and to the cell proliferation inhibition observed in these cells. This is the first study validating the potential of AGV2-VP3 protein to preferably induce death of human tumor cells.

O alfaherpesvírus bubalino 1 (BuHV1) e os alfaherpesvírus bovinos 1 (BoHV1), 5 (BoHV5) e são membros da ordem Herpesvirales, família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus. O BoHV1 e o BoHV5 são subdivididos em subtipos (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). No Brasil circulam BoHV1 e BoHV5 de todos os subtipos até o presente reconhecidos. Em vista dessa variedade de alfaherpesvírus potencialmente infecciosos para bovinos e bubalinos, o conhecimento sobre estes agentes é essencial para a implementação de medidas de controle ou erradicação. Com o objetivo de permitir algumas comparações entre estes agentes e as respostas por eles induzidas em seus hospedeiros, primeiramente foi realizado o sequenciamento do genoma completo de uma amostra de BuHV1 (b6), isolada a partir de prepúcio de búfalos (Bubalus bubalis) em 1972, na Austrália. O objetivo foi disponibilizar a primeira sequência completa de um alfaherpesvírus bubalino e avaliar o grau de similaridade entre o genoma desse vírus e os alfaherpesvírus de bovinos. O genoma sequenciado compreende 137.452 pares de bases (pb), com um nível de similaridade nucleotídica de 92,2% com BoHV5 (SV507/99) e 76,7% com BoHV1 (NVSL). Estes resultados permitirão estudos futuros buscando reconstruir a história evolutiva destes vírus, a importância de infecções interespécies na geração de variantes destes agentes e possíveis associações entre tais infecções e patogenicidade. Na segunda etapa dos estudos, foram realizados diversos testes sorológicos buscando definir uma metodologia de diagnóstico adequada para a identificação de anticorpos contra BuHV1 e todos os diferentes subtipos de BoHV1 e BoHV5. Inicialmente, 600 amostras de soros de bovinos de campo foram testadas através do teste de soroneutralização (SN), realizada frente aos sete alfaherpesvírus em estudo. Os resultados da SN foram influenciados pela escolha do vírus desafio utilizado no ensaio. Para obter a sensibilidade máxima do teste (259/600), foi necessário combinar resultados positivos frente a pelo menos cinco diferentes amostras virais. Em seguida, foram preparados ensaios do tipo “ELISA” para detecção de anticorpos utilizando antígenos preparados com cada um dos diferentes tipos/subtipos desses vírus (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individualmente (chamado “single ELISA” ou “sAgELISA”). Os resultados obtidos foram comparados com os resultados da soroneutralização (SN). A sensibilidade do sAgELISA variou significativamente conforme a amostra viral utilizada no preparo dos antígenos. Considerando os resultados frente a apenas um antígeno, a maior sensibilidade foi de 96,1% (249/259), obtida com apenas uma amostra de BoHV5c. Foram necessários pelo menos seis antígenos (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) para atingir a sensibilidade máxima do teste (263/259). Assim, foi desenvolvido um ELISA combinando vários antígenos em um mesmo teste (chamado “multiple ELISA” ou “mAgELISA”). O mAgELISA detectou 263 amostras positivas, resultando em uma concordância ótima entre sAgELISA e mAgELISA (κ=0,99). Frente a SN, o mAgELISA apresentou uma sensibilidade de 96,5% e especificidade de 96,1% (κ=0,93; VPP=95,0%; VPN=97,3%). Essas diferenças não foram estatisticamente significativas. Os resultados obtidos com a SN e mAgELISA foram comparados também a um ELISA comercial para a detecção de anticorpos contra BoHV1. O ELISA comercial utilizado nas comparações não apresentou resultados significativamente diferentes dos demais testes realizados, no entanto, revelou o maior número de resultados discrepantes em relação ao SN, considerado padrão-ouro. Estes resultados revelam que o mAgELISA aqui relatado é adequado para a detecção de anticorpos para BuHV1, BoHV1 e BoHV5, com sensibilidade e especificidade significativamente comparáveis às da SN. / Bubaline alphaherpesvirus 1 (BuHV1), Bovine alphaherpesviruses 1 (BoHV1) and 5 (BoHV5) are members of the order Herpesvirales family Herpesviridae, subfamily Alphaherpesvirinae, genus Varicellovirus. The BoHV1 and BoHV5 are divided into subtypes (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). In Brazil, circulates BoHV 1 and BoHV 5 from all subtypes known to the present. In view of this variety of potentially infectious alphaherpesviruses for bovines and buffaloes, knowledge about these agents is essential for the implementation of control or eradication measures. In order to gain a deeper understanding about these agents and the responses induced by them in their hosts, initially, the complete genome sequence of BuHV1-b6, one of the first BuHV1 viruses isolated in Australia in 1972, is reported. The objective was to provide the first complete sequence of a buffalo alphaherpesvirus and to evaluate the degree of similarity between BuHV1 and bovine alphaherpesviruses genomes. The BuHV1-b6 genome is a linear double-stranded DNA molecule, 137,452 bp long, with overall sequence of the 92.2% similarity at the nucleotide level to the reference BoHV5 (SV507/99) strain and 76.7% with BoHV1 (NVSL) strain. These results are expected to be valuable for further studies involving evolutionary chain of these viruses, the interspecies infections importance in generation of variants and possible associations between such infections and pathogenicity. In the second stage of the study, several serological tests were performed in order to define a appropriate diagnostic methodology for the identification of antibodies against BuHV1 and all different subtypes of BoHV1 and BoHV5. Initially, 600 bovine field serum samples were screened in serum neutralization tests (SN) performed against all seven virus types/subtypes. The SN results were influenced by the choice of the challenge virus. The maximum number of positive sera (259/600) was detected by adding the positive results obtained with at least five different viruses. Seven enzyme linked immunoassays were prepared with each of the seven antigens (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individually (single antigen ELISAs; sAgELISAs). The results obtained were compared to the SN. The sensitivity of the sAgELISAs was also influenced by the choice of antigen. Considering the results against only one of them, the best sensitivity was 96.1% (249/259), obtained with BoHV5c. Maximum sAgELISA sensitivity (263/259) was achieved when positive results of at least six viruses (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) were combined. A multiple antigen ELISA (mAgELISA) was then prepared by combining of different viral antigens in the same test. The mAgELISA detected 263 positive samples, resulting an optimum concordance between sAgELISA and mAgELISA (κ=0.99). When compared to SN, the mAgELISA revealed 96.5% sensitivity and 96.1% specificity (κ=0.93; PPV=95.0%; NPV=97.3%). These differences were not statistically significant. The results of both SN and mAgELISA were compared to a commercially available (IBRgB) ELISA. The results of the commercial ELISA did not vary significantly in relation to others tests performed, however, revealed the highest number of discrepant results in relation to SN, taken as the gold standard. These results reveal that the mAgELISA reported here is suitable for the detection of antibodies to BuHV1, BoHV1 and BoHV5 with sensitivity and specificity significantly comparable to those of SN.

Os herpesvírus bovinos tipos 1 (BoHV-1), 2 (BoHV-2), 4 (BoHV-4), 5 (BoHV-5) e o herpesvírus ovino tipo 2 (OvHV-2) apresentam como característica comum a indução de infecções latentes em seus hospedeiros. Estes agentes estão associados a diferentes enfermidades em bovinos, embora na maioria dos animais infectados a infecção primária ocorra com poucos ou sem sinais clínicos evidentes. Eventualmente, hospedeiros suscetíveis podem apresentar quedas na produtividade, perdas reprodutivas ou mesmo sofrer doença fatal. Esta tese compreende dois estudos independentes, que visam contribuir para um maior conhecimento sobre infecções por herpesvírus em bovinos. O primeiro capítulo reporta os achados de uma pesquisa sobre a presença do DNA de BoHV-2, BoHV-4 e OvHV-2 em gânglios trigêmeos (GT) de bovinos. Fragmentos de 200 GT (de 100 animais) foram coletados e submetidos à extração de DNA. Um conjunto de PCRs, duas das quais “semi-nested”, foi padronizado para amplificar parte do gene que codifica a glicoproteína B de BoHV-2 e BoHV-4. Outra PCR foi desenhada tendo como alvo o gene que codifica a proteína FGAM-sintase de OvHV-2. Controles internos foram construídos e utilizados para determinar a sensibilidade dos testes. Genomas de BoHV-2 foram encontrados em 2% (2/100) das amostras analisadas; genomas de BoHV-4 e OvHV-2 não foram detectados. No segundo capítulo desta tese, na busca de um imunógeno capaz de minimizar as perdas decorrentes de encefalites causadas por BoHV-5, o potencial imunogênico de uma amostra recombinante de BoHV-5, da qual os genes que codificam as glicoproteínas I, E e a proteína US9 foram deletados (BoHV5 gI/gE/US9-), em uma formulação vacinal inativada. Para a avaliação da vacina, oito terneiros (grupo vacinado; GV) foram vacinados com 3 ml da preparação por via subcutânea nos dias 0 e 28. Outros quatro terneiros foram vacinados com a preparação vacinal sem antígeno (grupo controle; GC). Após o desafio com o vírus parental selvagem (EVI 88/95), os animais do GV apresentaram sinais leves de infecção respiratória, enquanto que os animais do GC desenvolveram doença respiratória e encefalite grave, o que levou à eutanásia de dois dos quatro animais controle. A vacina conferiu proteção contra encefalite nos animais do GV após o desafio, porém não impediu a reativação do vírus selvagem. Os estudos aqui realizados permitiram demonstrar pela primeira vez a ocorrência de co-infecções com BoHV-1, BoHV-2 e BoHV-5, mas não com BoHV-4 e OvHV-2, em gânglios trigêmeos de bovinos. No segundo capítulo, foi demonstrada a eficácia do recombinante BoHV5 gI/gE/US9-, na proteção de bovinos contra encefalites causadas por BoHV-5 selvagem. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), 2 (BoHV-2), 4 (BoHV-4), 5 (BoHV-5) and ovine herpesvirus type 2 (OvHV-2) are known to induce latent infections in their natural hosts. These agents are associated with different diseases in cattle, although in the majority of infected animals, primary infections occur with few or no evident clinical signs. Eventually, susceptible hosts may display decreased productivity, reproductive losses or undergo fatal disease. This thesis comprises two studies intended to increase the knowledge on herpesvirus infections in cattle. The first chapter reports the findings of a search for DNA of BoHV-2, BoHV-4 and OvHV-2 in trigeminal ganglia (TG) of cattle. Fragments of 200 TG (from 100 animals) were collected and submitted to DNA extraction. A set of PCRs, two of which "semi-nested" was standardized to amplify a portion of the gene encoding the BoHV-2 and BoHV-4 glycoprotein B. Another PCR was designed targeting the gene coding for the FGAM-synthase of OvHV-2. Internal controls were constructed and used to determine the sensitivity of the tests. BoHV-2 genomes were found in 2% (2/100) of the examined samples. Genomes of BoHV-4 and OvHV-2 were not detected. In the second chapter of this thesis, a recombinant BoHV-5 in which the genes encoding glycoproteins I, E and protein US9 were deleted (BoHV5 gI/gE/US9-) was evaluated in its potential to protect cattle against BoHV-5 encephalitis in an inactivated vaccine. Eight calves were subcutaneously vaccinated with 3 ml of the vaccine on days 0 and 28 (vaccinated group; VG). Another four calves were mock vaccinated with the vaccine diluent (control group, CG). After challenge with wild type virus (EVI 88/95), the VG animals showed mild clinical signs of respiratory infection, whereas animals CG developed severe respiratory disease and encephalitis, which led to euthanasia of two of the four CG animals. The inactivated vaccine conferred protection against encephalitis in animals after challenge, but did not prevent viral reactivation. The studies conducted here demonstrate for the first time the occurrence of co-infections with BoHV-1, BoHV-2 and BoHV-5, but not with BoHV-4 and OvHV-2 in TG of cattle. In the second chapter, demonstrated the efficacy of an inactivated vaccine prepared with the recombinant BoHV5 gI/gE/US9- in the protection of cattle against encephalitis caused by wild-type BoHV-5.

Um total de 144 amostras fecais colhidas de leitões com diarréia provenientes de diversas granjas distribuídas por 10 municípios do Estado de São Paulo, Brasil, foram examinadas para a presença de rotavírus através de eletroforese em gel de poliacrilamida e ELISA, num esquema de triagem em paralelo. Destas, 24 e 39 amostras foram, respectivamente, positivas por estes testes e a caracterização dos genotipos P e G foi realizada em 43 amostras por nested RT-PCR, usando diferentes conjuntos de primers. Utilizando-se primers animais, o genotipo P[6] foi o mais freqüente, detectado em 25,58% das amostras, seguido pelo P[1] (11,62%) e P[7] (9,3%). Infecção concomitante de genotipos P[6]+P[7] (9,3%), P[1]+P[6] (4,65%), P[1]+P[6]+P[7] (2,32%) foi também observada. O genotipo G[5] foi o mais freqüente, detectado em 30,23% das amostras, seguido pelo G[10] (20,93%) e G[6] (4,65%). Infecção concomitante de genotipos G[5]+G[10] (18,6%) foi também observada. Utilizando-se primers humanos, somente o genotipo P[6] (65,11%) foi encontrado. Foram detectados os genotipos G[4] (27,9%), G[3] (13,95%) nas amostras, e as infecções concomitantes G[3]+G[4] (9,3%), G[2]+G[3]+G[4] (4,65%) e G[2]+G[3] (2,32%). A combinação mais freqüente foi G[5]P[6] e G[4]P[6], porém foram encontradas também infecções mistas, genotipos atípicos e reassortants. O seqüenciamento do gene a partir dos produtos de nested PCR dos genotipos animais P e G mostrou diversidade de nucleotídeos e aminoácidos dentro de um mesmo genotipo. As árvores filogenéticas utilizando o critério de maxima parcimônia e o algoritmo branch-and-bound, tiveram topologias nas quais as seqüências de nucleotídeos geradas neste trabalho concordam com as outras descritas anteriormente e pertencentes a um mesmo genotipo, suportadas por índices aceitáveis de \"bootstrap\". Os resultados deste estudo, além de contribuir para um melhor entendimento da epidemiologia dos rotavírus suínos, é relevante ao mostrar que além de haver uma diversidade de genotipos circulantes no campo, há também dentro dos mesmos genotipos, e isto deve ser considerado ao se utilizar e desenvolver métodos de diagnóstico, bem como ao se adotarem medidas preventivas específicas contra esta doença. / A total of 144 fecal specimens collected from piglets with diarrhea from many swine-producing units distributed among 10 municipalities of São Paulo State, Brazil, were examined for rotavirus by polyacrylamide gel electrophoresis and ELISA, in a parallel screening scheme. Twenty-four and thirty-nine samples, respectively, were positive by these tests and the characterization of the P and G genotypes was performed on 43 samples by a nested reverse transcription-PCR typing assay, using different sets of primers. Using the animal set of primers, the P[6] genotype was the most frequent, accounting for viruses in 25.58% of the samples, followed by P[1] (11.62%) and P[7] (9.3%). Concomitant infection of P[6]+P[7] (9.3%), P[1]+P[6] (4.65%), P[1]+P[6]+P[7] (2.32%) genotypes was also observed. The G[5] genotype was the most frequent, accounting for viruses in 30.23% of the samples, followed by G[10] (20.93%) and G[6] (4.65%). Concomitant infection of G[5]+G[10] (18.6%) genotypes was observed. Using human set of primers, only the P[6] (65.11%) genotype was found. It was detected the genotypes G[4] (27.9%), G[3] (13.95%) on the samples. Concomitant infection of the genotypes G[3]+G[4] (9.3%), G[2]+G[3]+G[4] (4.65%) and G[2]+G[3] (2.32%) was also observed. The more frequent combination were G[5]P[6] and G[4]P[6], but it was found mixed infections, atypical genotypes and reassortants. Gene sequencing of nested products of G and P animal genotypes showed a diversity of nucleotides and aminoacids under the same genotype. The phylogenetic trees for P and G genotypes under the maximum parsimony criterion, using the branch-and-bound algorithm, had topologies in which the nucleotide sequences generated by this work agree to others described elsewhere that have the same genotypes, supported by acceptable scores of bootstrapping. The results of the present study, while contributing to a better understanding of epidemiology of porcine rotaviruses, address the relevance that there is not only a diversity of genotypes circulating on the field, but inside the same genotypes, and this must be considered when using and developing diagnostic tests, as well when carrying out specific preventive measures against this disease.

Os herpesvírus bovinos tipos 1 (BoHV-1), 2 (BoHV-2), 4 (BoHV-4), 5 (BoHV-5) e o herpesvírus ovino tipo 2 (OvHV-2) apresentam como característica comum a indução de infecções latentes em seus hospedeiros. Estes agentes estão associados a diferentes enfermidades em bovinos, embora na maioria dos animais infectados a infecção primária ocorra com poucos ou sem sinais clínicos evidentes. Eventualmente, hospedeiros suscetíveis podem apresentar quedas na produtividade, perdas reprodutivas ou mesmo sofrer doença fatal. Esta tese compreende dois estudos independentes, que visam contribuir para um maior conhecimento sobre infecções por herpesvírus em bovinos. O primeiro capítulo reporta os achados de uma pesquisa sobre a presença do DNA de BoHV-2, BoHV-4 e OvHV-2 em gânglios trigêmeos (GT) de bovinos. Fragmentos de 200 GT (de 100 animais) foram coletados e submetidos à extração de DNA. Um conjunto de PCRs, duas das quais “semi-nested”, foi padronizado para amplificar parte do gene que codifica a glicoproteína B de BoHV-2 e BoHV-4. Outra PCR foi desenhada tendo como alvo o gene que codifica a proteína FGAM-sintase de OvHV-2. Controles internos foram construídos e utilizados para determinar a sensibilidade dos testes. Genomas de BoHV-2 foram encontrados em 2% (2/100) das amostras analisadas; genomas de BoHV-4 e OvHV-2 não foram detectados. No segundo capítulo desta tese, na busca de um imunógeno capaz de minimizar as perdas decorrentes de encefalites causadas por BoHV-5, o potencial imunogênico de uma amostra recombinante de BoHV-5, da qual os genes que codificam as glicoproteínas I, E e a proteína US9 foram deletados (BoHV5 gI/gE/US9-), em uma formulação vacinal inativada. Para a avaliação da vacina, oito terneiros (grupo vacinado; GV) foram vacinados com 3 ml da preparação por via subcutânea nos dias 0 e 28. Outros quatro terneiros foram vacinados com a preparação vacinal sem antígeno (grupo controle; GC). Após o desafio com o vírus parental selvagem (EVI 88/95), os animais do GV apresentaram sinais leves de infecção respiratória, enquanto que os animais do GC desenvolveram doença respiratória e encefalite grave, o que levou à eutanásia de dois dos quatro animais controle. A vacina conferiu proteção contra encefalite nos animais do GV após o desafio, porém não impediu a reativação do vírus selvagem. Os estudos aqui realizados permitiram demonstrar pela primeira vez a ocorrência de co-infecções com BoHV-1, BoHV-2 e BoHV-5, mas não com BoHV-4 e OvHV-2, em gânglios trigêmeos de bovinos. No segundo capítulo, foi demonstrada a eficácia do recombinante BoHV5 gI/gE/US9-, na proteção de bovinos contra encefalites causadas por BoHV-5 selvagem. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), 2 (BoHV-2), 4 (BoHV-4), 5 (BoHV-5) and ovine herpesvirus type 2 (OvHV-2) are known to induce latent infections in their natural hosts. These agents are associated with different diseases in cattle, although in the majority of infected animals, primary infections occur with few or no evident clinical signs. Eventually, susceptible hosts may display decreased productivity, reproductive losses or undergo fatal disease. This thesis comprises two studies intended to increase the knowledge on herpesvirus infections in cattle. The first chapter reports the findings of a search for DNA of BoHV-2, BoHV-4 and OvHV-2 in trigeminal ganglia (TG) of cattle. Fragments of 200 TG (from 100 animals) were collected and submitted to DNA extraction. A set of PCRs, two of which "semi-nested" was standardized to amplify a portion of the gene encoding the BoHV-2 and BoHV-4 glycoprotein B. Another PCR was designed targeting the gene coding for the FGAM-synthase of OvHV-2. Internal controls were constructed and used to determine the sensitivity of the tests. BoHV-2 genomes were found in 2% (2/100) of the examined samples. Genomes of BoHV-4 and OvHV-2 were not detected. In the second chapter of this thesis, a recombinant BoHV-5 in which the genes encoding glycoproteins I, E and protein US9 were deleted (BoHV5 gI/gE/US9-) was evaluated in its potential to protect cattle against BoHV-5 encephalitis in an inactivated vaccine. Eight calves were subcutaneously vaccinated with 3 ml of the vaccine on days 0 and 28 (vaccinated group; VG). Another four calves were mock vaccinated with the vaccine diluent (control group, CG). After challenge with wild type virus (EVI 88/95), the VG animals showed mild clinical signs of respiratory infection, whereas animals CG developed severe respiratory disease and encephalitis, which led to euthanasia of two of the four CG animals. The inactivated vaccine conferred protection against encephalitis in animals after challenge, but did not prevent viral reactivation. The studies conducted here demonstrate for the first time the occurrence of co-infections with BoHV-1, BoHV-2 and BoHV-5, but not with BoHV-4 and OvHV-2 in TG of cattle. In the second chapter, demonstrated the efficacy of an inactivated vaccine prepared with the recombinant BoHV5 gI/gE/US9- in the protection of cattle against encephalitis caused by wild-type BoHV-5.

Os morcegos (Ordem Chiroptera) estão entre as espécies de mamíferos mais diversificadas e distribuídas no mundo. É reconhecido o papel fundamental que eles exercem na natureza. Por outro lado, são conhecidos como importantes reservatórios de agentes de doenças infecciosas, dentre os quais vírus, até pouco tempo desconhecidos, que nas últimas décadas se tornaram emergentes em humanos e outras espécies. Dentre os vírus RNA emergentes, destacam-se o SARS-CoV, MERS-CoV, vírus Hendra e Nipah e o último a causar importante surto na África, vírus Ebola.Mais de 100 espécies de vírus já foram detectadas em morcegos em todo o mundo, tanto vírus RNA, quanto vírus DNA, embora importância desses últimos como agentes de zoonoses ainda não tenha sido confirmada. Estudos no Brasil com relação à detecção de vírus em morcegos são praticamente inexistentes, e são focados apenas na vigilância e epidemiologia do vírus rábico. Portanto, este trabalho objetivou a detecção de vírus, tanto RNA, quanto DNA, em amostras de morcegos no estado do Rio Grande do Sul, através de técnicas moleculares e sequenciamento dos fragmentos obtidos. Identificamos a presença de vírus da família Coronaviridae, Circoviridae e Adenoviridae em amostras de fezes e tecidos de morcegos insetívoros e hematófagos. A detecção de novas espécies de vírus da família Circoviridae confirma a diversidade viral que estes vírus podem apresentar. Os resultados obtidos por investigação não podem afirmar se tais vírus apresentam potencial zoonótico, mas por serem dados inéditos no país, reforçam a importância da vigilância e de estudos adicionais para melhor compreender o papel que diferentes espécies de morcegos tem como reservatórios de vírus que possam ter impacto na saúde animal e humana. / Bats (Order Chiroptera) are among the most diverse and worldwide distributed mammal species. It is recognized the important role they play in nature, but, on the other hand, they are known as important reservoirs of infectious diseases, including viruses, until then unknown, that have become emerging in recent decades. Among RNA viruses of great importance are the SARS-CoV, MERS-CoV, Hendra and Nipah viruses and the one responsible to cause major outbreaks in Africa recently, the Ebola virus. More than 100 species of virus have been detected in bats in the world, both RNA and DNA viruses DNA, although the latter still hasn't confirmed its importance on zoonosis or the impact it would cause to the host itself.Studies in Brazil are practically nonexistent, because they are focused only on surveillance and epidemiology of rabies virus. Therefore, this work aimed to virus detection, both RNA and DNA in samples from bats in the State of Rio Grande do Sul, through molecular techniques and sequencing of the fragments obtained.We identify the presence of viruses of the family Coronaviridae, Circoviridae and Adenoviridae in stool samples and tissues. In addition, the discovery of new species of viruses of the family Circoviridae confirms viral diversity that these bats can carry. The results obtained in this investigation cannot confirm if such viruses have zoonotic potential, but as they are the first data published in the country, it underscores the importance of vigilance and additional studies to better understand the role that different species of bats have as reservoirs of viruses that may have an impact on animal and human health.

O vírus da anemia das galinhas (CAV) pode causar imunodepressão em galinhas de todas as idades e doença nos frangos jovens, a qual é caracterizada por severa anemia, atrofia da medula óssea e hemorragias. A doença clínica é rara hoje, porém a forma subclínica é freqüentemente encontrada em criações comerciais e resulta num considerável decréscimo do desempenho. O CAV apresenta variabilidade genética, entretanto, em relação às amostras brasileiras do CAV, pouco ou quase nada desta variabilidade é conhecida. O presente trabalho descreve um protocolo de Nested-PCR para a detecção do CAV diretamente de amostras clínicas e analisa filogeneticamente as seqüências nucleotídicas das amostras positivas buscando verificar se a patologia apresentada por estas está relacionada com a variabilidade genética. Para a extração de DNA, o método baseado em tiocianato de guanidina mostrou-se mais eficiente e prático de executar que os demais testados. Foi selecionado um par de primers que amplifica uma região de 664 pb do gene vp1 e outro par que amplifica uma região interna de 539 pb para a realização da Nested-PCR. A especificidade dos primers foi avaliada utilizando amostras de lotes controlados para CAV e 30 diferentes isolados de vírus e bactérias causadoras de doenças em galinhas, as quais não geraram produto de amplificação. A sensibilidade foi determinada a partir de diluições seriadas da vacina comercial para o CAV. A Nested-PCR mostrou ser mais sensível do que a PCR e foi capaz de detectar 0,16 DICC50% da cepa vacinal. Além disso, a Nested-PCR detectou DNA viral em tecidos, soro e cama aviária de lotes com e sem sintomas clínicos.O produto de amplificação de 539 pb do gene vp1 de 44 amostras, provenientes de diferentes Estados produtores de frangos do Brasil, foi seqüenciado e foram encontradas 10 novas seqüências nucleotídicas do CAV. Estas 10 seqüências nucleotídicas foram analisadas filogeneticamente pelo método de distância neighbour joining com 1000 replicações o qual, mostrou que não houve correlação entre a patogenia apresentada nos animais e os grupos genéticos. Estas seqüências nucleotídicas também foram comparadas com 30 cepas de CAV isoladas em outros países e não foi observada correlação entre a distribuição geográfica e a variabilidade genética. Substituições de amino ácidos foram observadas em 9 posições sendo que, 65R substituindo o resíduo Q e 98F substituindo o resíduo Y ainda não haviam sido observadas. Conclui-se que, como técnica de detecção do CAV, o protocolo de Nested-PCR aqui descrito é mais sensível e menos trabalhoso do que o isolamento viral. As amostras Brasileiras de CAV possuem características filogenéticas similares às isoladas em outros países.