Introdução: As arboviroses causam graves problemas de saúde pública no Brasil e em muitos dos países da América Latina. A epidemiologia molecular é um instrumento valioso na compreensão da dispersão, persistência e diversidade desses patógenos virais. Objetivos: Neste projeto, buscamos investigar a dinâmica epidemiológica molecular dos arbovíroses (com especial enfoque aos vírus da dengue-DENV, chikungunya - CHIKV e zika -ZIKV) que circularam no estado do Amapá entre os anos de 2013 e 2016. Métodos: 824 amostras de plasma humano foram coletadas pelos laboratórios de Saúde Publica (LACEN) no estado do Amapá entre os anos de 2013 e 2016; essas amostras foram obtidas de pacientes que apresentavam sintomas consistentes com uma das arboviroses. O material genético viral presente nestas amostras foi extraído e os ensaios de qPCR foram realizados. Todas as amostras foram submetidas inicialmente a um ensaio triplex (ZIKV/DENV/CHIKV), as amostras negativas foram posteriormente submetidas a um ensaio de pan-flavivírus. As amostras positivas para um dos ensaios foram submetidas a NGS (sequenciamento de nova geração). Resultados: Das 824 amostras testadas, 36 foram positivas para DENV, ZIKV ou CHIKV; desses 36 positivos, 24 foram para DENV, 11 para CHIKV e 1 para ZIKV. Foram obtidos 27 genomas completos: 16 de DENV (15 DENV1, genótipo V e 1 DENV2, genótipo III) e 11 de CHIKV (genótipo asiático / caribenho). Das 788 amostras testadas com o ensaio de pan-flavivírus, 22 amostras foram positivas; porem apenas uma amostra produziu genoma completo pela técnica de NGS. Este genoma foi relacionado com um flavivírus com semelhante em 76,81% com o vírus Long Pine Key - LPKV, que anteriormente só tinha sido descrito em mosquitos. Árvores de Maximum likelihood e Maximum clade credibility foram construídas utilizando os genomas do DENV1 obtidos neste estudo. Essas árvores exibiam duas linhagens distintas de DENV1, genótipo V presentes na América Latina. Uma destas linhagens tem um padrão de circulação que inclui países do Caribe, América Central e América do Sul (incluindo Brasil); a outra linhagem distinta circula dentro das fronteiras do Brasil. As árvores também indicam que o DENV1 presente no estado do Amapá é da linhagem que tem o padrão de circulação que inclui o Caribe e as Américas Central e do Sul e que essa linhagem surgiu no Amapá entre 2005 e 2010. Conclusão: Este estudo fornece dados importantes sobre as arboviroses no Amapá e os dados genômicos mais recentes disponíveis para a região, bem como o contexto brasileiro e latino-americano para esses dados. Dados dessa natureza são inestimáveis nos esforços das autoridades de saúde pública para a prevenção e controle de epidemias por estes agentes. / Introduction: Arboviral febrile illnesses plague the nation of Brazil and many of its surrounding Latin America countries. Molecular epidemiology is a growing and increasingly invaluable tool in the field of public health for understanding the dispersal, persistence, and diversity of these impactful viral pathogens. Objectives: In this project, the identities and molecular epidemiological dynamics of arboviruses circulating in the Brazilian state of Amapá between the years 2013 and 2016, with special focus on DENV, CHIKV and ZIKV, were investigated and given Brazilian and Latin American geographical and temporal context via molecular epidemiological analyses. Methods: 824 human blood plasma samples were collected from LACEN laboratories in the state of Amapá between the years 2013 and 2016; these samples originated from patients showing symptoms consistent with any of the common arboviral febrile illnesses. The viral genetic material present in these samples was extracted and qPCR diagnostics assays were performed; all samples first underwent a triplex assay (ZIKV/DENV/CHIKV - ZDC), then the samples yielding negative results for the triplex assay underwent a pan-flavivirus assay. The samples yielding positive results for either assay were submitted for NGS and all whole viral genomes subsequently obtained underwent phylogenetic molecular epidemiological analyses. Results: Of the 824 samples tested, 36 tested positive for the ZDC assay; of those positives, 24 tested positive for DENV, 11 for CHIKV, and 1 for ZIKV. 27 full genomes were obtained from these ZDC positives: 16 of DENV (15 DENV1, genotype V and 1 DENV2, genotype III) and 11 of CHIKV (Asian and Caribbean genotype). Of the 788 samples tested with the pan-flavivirus assay, 22 samples yielded positive results, from only one of which a genome was obtainable. This genome was found to be closely related to a flavivirus previously only found in mosquitoes (76.8% identity with Long Pine Key Virus - LPKV). Maximum likelihood and maximum clade credibility trees were constructed using the DENV1 genomes obtained from this study. These trees displayed two distinct lineages of DENV1, genotype V present in Latin America, one of which has a circulation pattern spanning widely across the Caribbean and Central and South America (including Brazil), while the other circulates within Brazilian borders. The trees also indicate that the DENV1 present in the state of Amapá is of the lineage having the wider circulation pattern and that this lineage emerged in Amapá between 2005 and 2010. Conclusion: This study provides important data concerning the range of the arboviral landscape in Amapá and the most recent genomic data available for the region as well as Brazilian and Latin American context to that data. Data of this nature are invaluable in the efforts of public health officials for the prevention and control of epidemics of these impactful arboviral pathogens.

O alfaherpesvírus bubalino 1 (BuHV1) e os alfaherpesvírus bovinos 1 (BoHV1), 5 (BoHV5) e são membros da ordem Herpesvirales, família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus. O BoHV1 e o BoHV5 são subdivididos em subtipos (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). No Brasil circulam BoHV1 e BoHV5 de todos os subtipos até o presente reconhecidos. Em vista dessa variedade de alfaherpesvírus potencialmente infecciosos para bovinos e bubalinos, o conhecimento sobre estes agentes é essencial para a implementação de medidas de controle ou erradicação. Com o objetivo de permitir algumas comparações entre estes agentes e as respostas por eles induzidas em seus hospedeiros, primeiramente foi realizado o sequenciamento do genoma completo de uma amostra de BuHV1 (b6), isolada a partir de prepúcio de búfalos (Bubalus bubalis) em 1972, na Austrália. O objetivo foi disponibilizar a primeira sequência completa de um alfaherpesvírus bubalino e avaliar o grau de similaridade entre o genoma desse vírus e os alfaherpesvírus de bovinos. O genoma sequenciado compreende 137.452 pares de bases (pb), com um nível de similaridade nucleotídica de 92,2% com BoHV5 (SV507/99) e 76,7% com BoHV1 (NVSL). Estes resultados permitirão estudos futuros buscando reconstruir a história evolutiva destes vírus, a importância de infecções interespécies na geração de variantes destes agentes e possíveis associações entre tais infecções e patogenicidade. Na segunda etapa dos estudos, foram realizados diversos testes sorológicos buscando definir uma metodologia de diagnóstico adequada para a identificação de anticorpos contra BuHV1 e todos os diferentes subtipos de BoHV1 e BoHV5. Inicialmente, 600 amostras de soros de bovinos de campo foram testadas através do teste de soroneutralização (SN), realizada frente aos sete alfaherpesvírus em estudo. Os resultados da SN foram influenciados pela escolha do vírus desafio utilizado no ensaio. Para obter a sensibilidade máxima do teste (259/600), foi necessário combinar resultados positivos frente a pelo menos cinco diferentes amostras virais. Em seguida, foram preparados ensaios do tipo “ELISA” para detecção de anticorpos utilizando antígenos preparados com cada um dos diferentes tipos/subtipos desses vírus (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individualmente (chamado “single ELISA” ou “sAgELISA”). Os resultados obtidos foram comparados com os resultados da soroneutralização (SN). A sensibilidade do sAgELISA variou significativamente conforme a amostra viral utilizada no preparo dos antígenos. Considerando os resultados frente a apenas um antígeno, a maior sensibilidade foi de 96,1% (249/259), obtida com apenas uma amostra de BoHV5c. Foram necessários pelo menos seis antígenos (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) para atingir a sensibilidade máxima do teste (263/259). Assim, foi desenvolvido um ELISA combinando vários antígenos em um mesmo teste (chamado “multiple ELISA” ou “mAgELISA”). O mAgELISA detectou 263 amostras positivas, resultando em uma concordância ótima entre sAgELISA e mAgELISA (κ=0,99). Frente a SN, o mAgELISA apresentou uma sensibilidade de 96,5% e especificidade de 96,1% (κ=0,93; VPP=95,0%; VPN=97,3%). Essas diferenças não foram estatisticamente significativas. Os resultados obtidos com a SN e mAgELISA foram comparados também a um ELISA comercial para a detecção de anticorpos contra BoHV1. O ELISA comercial utilizado nas comparações não apresentou resultados significativamente diferentes dos demais testes realizados, no entanto, revelou o maior número de resultados discrepantes em relação ao SN, considerado padrão-ouro. Estes resultados revelam que o mAgELISA aqui relatado é adequado para a detecção de anticorpos para BuHV1, BoHV1 e BoHV5, com sensibilidade e especificidade significativamente comparáveis às da SN. / Bubaline alphaherpesvirus 1 (BuHV1), Bovine alphaherpesviruses 1 (BoHV1) and 5 (BoHV5) are members of the order Herpesvirales family Herpesviridae, subfamily Alphaherpesvirinae, genus Varicellovirus. The BoHV1 and BoHV5 are divided into subtypes (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). In Brazil, circulates BoHV 1 and BoHV 5 from all subtypes known to the present. In view of this variety of potentially infectious alphaherpesviruses for bovines and buffaloes, knowledge about these agents is essential for the implementation of control or eradication measures. In order to gain a deeper understanding about these agents and the responses induced by them in their hosts, initially, the complete genome sequence of BuHV1-b6, one of the first BuHV1 viruses isolated in Australia in 1972, is reported. The objective was to provide the first complete sequence of a buffalo alphaherpesvirus and to evaluate the degree of similarity between BuHV1 and bovine alphaherpesviruses genomes. The BuHV1-b6 genome is a linear double-stranded DNA molecule, 137,452 bp long, with overall sequence of the 92.2% similarity at the nucleotide level to the reference BoHV5 (SV507/99) strain and 76.7% with BoHV1 (NVSL) strain. These results are expected to be valuable for further studies involving evolutionary chain of these viruses, the interspecies infections importance in generation of variants and possible associations between such infections and pathogenicity. In the second stage of the study, several serological tests were performed in order to define a appropriate diagnostic methodology for the identification of antibodies against BuHV1 and all different subtypes of BoHV1 and BoHV5. Initially, 600 bovine field serum samples were screened in serum neutralization tests (SN) performed against all seven virus types/subtypes. The SN results were influenced by the choice of the challenge virus. The maximum number of positive sera (259/600) was detected by adding the positive results obtained with at least five different viruses. Seven enzyme linked immunoassays were prepared with each of the seven antigens (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individually (single antigen ELISAs; sAgELISAs). The results obtained were compared to the SN. The sensitivity of the sAgELISAs was also influenced by the choice of antigen. Considering the results against only one of them, the best sensitivity was 96.1% (249/259), obtained with BoHV5c. Maximum sAgELISA sensitivity (263/259) was achieved when positive results of at least six viruses (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) were combined. A multiple antigen ELISA (mAgELISA) was then prepared by combining of different viral antigens in the same test. The mAgELISA detected 263 positive samples, resulting an optimum concordance between sAgELISA and mAgELISA (κ=0.99). When compared to SN, the mAgELISA revealed 96.5% sensitivity and 96.1% specificity (κ=0.93; PPV=95.0%; NPV=97.3%). These differences were not statistically significant. The results of both SN and mAgELISA were compared to a commercially available (IBRgB) ELISA. The results of the commercial ELISA did not vary significantly in relation to others tests performed, however, revealed the highest number of discrepant results in relation to SN, taken as the gold standard. These results reveal that the mAgELISA reported here is suitable for the detection of antibodies to BuHV1, BoHV1 and BoHV5 with sensitivity and specificity significantly comparable to those of SN.

A VP3, ou Apoptina, é uma das proteínas codificadas pelo vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV). Esta proteína é capaz de induzir apoptose em células humanas tumorais; entretanto, o mesmo não ocorre em células normais. Assim, esta proteína apresenta-se como uma promissora candidata como agente antineoplásico. O girovírus aviário 2 (AGV2), descrito em 2011, é relacionado ao CAV e codifica proteínas homólogas às expressas por este vírus, incluindo a VP3. A comparação da sequência de aminoácidos da VP3 do AGV2 com a da Apoptina do CAV revela uma identidade de 32,2% e o compartilhamento de domínios importantes para a atividade pró-apoptótica tumor-especifica. Nesse trabalho objetivamos investigar o potencial de três variantes da VP3 do AGV2 em induzir seletivamente a morte de células humanas tumorais. Os genes das VP3 foram expressos através de um sistema de expressão adenoviral. Após a transdução dos adenovírus recombinantes expressando as VP3 do AGV2 nas células humanas tumorais A549 e normais MRC-5, a localização subcelular dessas proteínas foi analisada por imunofluorescência e suas implicações sobre a viabilidade celular foram determinadas pelo ensaio de MTT. Nossos resultados evidenciam que os adenovírus expressando as variantes da VP3 do AGV2 possuem a habilidade de inibir preferencialmente a proliferação de células tumorais. Demonstramos também que as VP3 do AGV2 acumulam-se no núcleo das células tumorais, enquanto que na maior parte das células normais essas proteínas ficam restritas ao citoplasma. No entanto, inesperadamente detectamos, em menor proporção, a expressão de VP3 do AGV2 também no núcleo das células normais. Ainda, analisando as sequências de aminoácidos das variantes da VP3 do AGV2, pudemos conjecturar que a presença de um sinal de exportação nuclear com menor eficiência do que o existente na Apoptina do CAV pode estar correlacionado com a localização nuclear dessas proteínas nas células normais e com a inibição da proliferação celular verificada nessas células. Este é o primeiro trabalho demonstrando o potencial da proteína VP3 codificada pelo AGV2 em induzir preferencialmente a morte de células humanas tumorais. / VP3, also known as Apoptin, is one of the proteins encoded by the chicken anemia virus (CAV). This protein is able to induce apoptosis in tumor cells; however, the same does not occur in normal cells. Thus, this protein appears as a promising candidate for anticancer therapy. The recently discovered avian gyrovirus 2 (AGV2) is related to CAV and encodes CAV-homologous proteins, including VP3. The comparison of the AGV2-VP3 amino acid sequence with CAV-Apoptin shows an identity of 32.2% and the presence of functional domains that seem to be important for its tumor-specific pro-apoptotic activity. In this work, we aim to investigate the potential of three AGV2-VP3 protein variants as inducers of apoptosis in human tumor cells. VP3 genes were expressed through an adenoviral expression system. After transduction of the recombinant adenoviruses expressing the AGV2-VP3 variants in human tumor A549 cells and normal MRC-5 cells, subcellular localization of these proteins was analyzed by immunofluorescence and their effects on cell viability was determined by MTT assay. Our results show that the adenoviruses expressing AGV2-VP3 have the ability to inhibit preferentially the proliferation of tumor cells. We also demonstrate that AGV2-VP3 variants accumulate in the nucleus of tumor cells, whereas in most normal MRC-5 cells these proteins are restricted to cytoplasm. However, we unexpectedly detected the expression of AGV2-VP3 proteins, in a lesser extent, in the nucleus of normal cells. Furthermore, analyzing the amino acid sequences of AGV2-VP3 variants we could speculate that the presence of a nuclear export signal (NES) with a lower efficiency than CAV-Apoptin NES may be correlated to the nuclear localization of these proteins in normal cells and to the cell proliferation inhibition observed in these cells. This is the first study validating the potential of AGV2-VP3 protein to preferably induce death of human tumor cells.

O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é um vírus pequeno, sem envelope e com genoma DNA circular de fita simples pertencente ao gênero Circovirus da família Circoviridae. O PCV2 está associado a uma síndrome multissistémica, atualmente denominada de porcine circovirus–associated disease (PCVAD) que acomete suínos e causa sérios prejuízos econômicos. Esta doença caracteriza-se por apresentar uma variedade de manifestações clínicas, como diminuição do ganho de peso, distúrbios respiratórios e entéricos, desordens reprodutivas e alta mortalidade. Além disso, PCVAD está fortemente associada a manifestações de dermatite, comprometimento renal e depleção linfóide. Apesar das grandes perdas econômicas e das inúmeras manifestações clínicas, a patogenia e o mecanismo de infectividade do PCV2 ainda não estão totalmente esclarecidos. O objetivo deste trabalho é avaliar a patogenia do PCV2 em suínos naturalmente infectados e em cultivo celular através da caracterização dos efeitos da infecção no sistema vascular. Primeiramente, foi realizada uma investigação para determinar os parâmetros hemostáticos de suínos naturalmente infectados por PCV2. Além disso, avaliou-se, in vitro, as alterações nas propriedades hemostáticas em células endoteliais infectadas pelo PCV2. Nossos resultados, mostram que suínos naturalmente infectados pelo PCV2 apresentam um estado protrombótico, demonstrado pela diminuição do tempo de coagulação e dos níveis de fibrinogênio, ativação e consumo plaquetário, aumento na atividade de trombina no plasma, e presença de vasculite nos capilares sanguíneos. In vitro, foi demonstrado que as células endoteliais infectadas pelo PCV2 apresentam um fenótipo ativado, caracterizado pelo aumento na atividade procoagulante na superfície celular. Além disso, foi observado que o tratamento com trombina exógena nos cultivos celulares infectados por PCV2 induz um aumento na carga viral. A partir disso, evidencia-se a participação do endotélio na infecção pelo PCV2, e a capacidade do vírus em modular a hemostasia. O conjunto destes dados permite um melhor entendimento dos fenômenos que ocorrem no hospedeiro durante a infecção pelo PCV2, especialmente no sistema vascular, permitindo uma maior compreensão dos mecanismos patogênicos da PCVAD e fornecendo novos conhecimentos dos processos envolvendo a interação PCV2-suíno. / Porcine circovirus type 2 (PCV2) is a small non-enveloped virus with a single-strand DNA genome, which belongs to the Circovirus genus of the Circoviridae family. PCV2 is related to a multisystemic syndrome nowadays called porcine circovirus-associated disease (PCVAD), which affects pigs and causes considerable economic losses. The disease is characterized by a variety of clinical manifestations, such as decrease in weight gain, respiratory and enteric disturbance, reproductive disorders and high mortality rates. Apart from this, PCVAD is also associated to dermatitis, renal failure and lymphoid depletion. In spite of the large economic losses and of the numerous clinical manifestations, the pathogenesis and infection mechanism of PCV2 have not been fully clarified. The aim of this study is to evaluate the PCV2 pathogenesis in naturally infected pigs and in cell culture, by characterizing the effects of the infection in the vascular system. Firstly, an investigation aimed at determining the hemostatic parameters in naturally infected pigs was conducted. Also, an in vitro evaluation of the hemostatic properties of PCV2-infected endothelial cells was performed. Our results show that pigs naturally infected with PCV2 presented a prothrombotic state manifested as decreased coagulation time and fibrinogen levels, reduced platelet activation and consumption, increased thrombin plasma activity, and as the occurrence of vasculitis in capillary vessels. In vitro, it was demonstrated that endothelial cells infected with PCV2 presented an activated phenotype characterized by a higher procoagulant activity on the cell surface. Apart from this, the treatment with exogenous thrombin in PCV2 infected cell cultures induces an increase in viral load. These findings reveal the role played by the endothelium in the PCV2 infection and the capacity of the virus to modulate hemostasis. Taken together, these results afford to better understand the phenomena taking place in the host during PCV2 infection, namely in the vascular system, shedding new light on the pathogenic mechanisms of PCVAD and on the processes involved in the swine-PCV2 interaction.

Membros da família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) tem sido associados a diferentes condições clínicas em bovinos. Assim, diferenciação entre BoHV-1 e BoHV-5 é uma valiosa informação objetivando um melhor entendimento da patogenia e epidemiologia destes vírus no rebanho bovino. Contudo, métodos para diferenciação são escassos devido às reações cruzadas originadas da alta homologia genômica e antigênica entre estes vírus. O presente estudo concentrou-se na análise da região carboxi-terminal da glicoproteína C (nucleotídeos 16763 - 17337 em BoVH-1 e 17671 - 18242 em BoHV-5), uma vez que tal região apresentou características potenciais que permitissem a diferenciação entre estes vírus. Assim, no primeiro capítulo do presente trabalho a região carboxi-terminal da gC foi utilizada como alvo para o desenvolvimento de uma Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) seguida da Análise da Restrição Enzimática (REA) do fragmento amplificado, capaz de diferenciar entre isolados de BoHV-1 ou BoHV-5, gerando fragmentos com tamanhos de 575 pares de base (pb) frente a BoHV-1 e 572 pb frente a BoHV-5. A diferenciação entre BoHV-1 e BoHV-5 foi obtida após a digestão dos amplicons com a enzima de restrição Bgl I. No segundo capítulo, a região carboxi-terminal de 23 amostras Sul-Americanas de BoHV-1 ou BoHV-5 foram amplificadas e sequenciadas. A análise filogenética realizada com as sequências de nucleotídeos revelou identidade variando entre 98,7 a 99,8% (BoHV-1/ BoHV-1), 88,3 a 92% (BoHV-1/ BoHV-5) e 96 to 99,7% (BoHV-5/ BoHV-5). Alinhamentos realizados com sequências de aminoácidos revelaram identidade variando entre 97,5 a 99,5% (BoHV-1/ BoHV-1), 77,5 a 84,4% (BoHV-1/ BoHV-5) e 92,1 a 99,5% (BoHV-5/ BoHV-5). Análises filogenéticas revelaram, ainda, que: i) alguns isolados de BoHV-5 apresentaram um padrão diferente daqueles até o presente reconhecidos; ii) uma amostra isolada no Uruguai (BoHV-1.2) apresentou um padrão de agrupamento distinto quando comparado com as outra amostras de BoHV-1.2. O terceiro capítulo apresenta o primeiro relato de detecção de BoHV-5 de sêmen bovino através da análise antigênica, amplificação diferencial da região amino-terminal do gene da gC de BoHV-1 e 5, seguida da caracterização por REA do isolado em estudo. Em síntese, através da utilização da gC foi possível avaliar a homologia entre as amostras Sul- Americanas estudadas; desenvolver uma PCR/REA diferencial entre estes vírus e relatar a detecção de uma amostra de BoHV-5 isolada à partir de sêmen contaminado. / Members of the Herpesviridae family, Alphaherpesvirinae subfamily bovine herpesvirus types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) have been associated to different clinical conditions of cattle. Thus, differentiation has become an important tool for a better understanding of the pathogenesis and epidemiology of BoHV infections in cattle. However, currently available methods for such differentiation are hampered by cross-reactions from high genomic and antigenic homology between these viruses. The present work focused on the analysis of the carboxy-terminal portion of glycoprotein C (gC), corresponding to nucleotides 16763 - 17337 on BoHV-1 and 17671 - 18242 on BoHV-5 once such region showed characteristics that would allow a clear distinction between BoHV-1 and 5. In view of that, in the first chapter, the carboxy-terminal region of gC was the target for the development of a Polymerase Chain Reaction followed by a Restriction Enzyme Analysis (PCR/REA) for differentiation between BoHV-1 and 5. The PCR/REA was designed to amplify a segment on the carboxy-terminal portion of the glycoprotein C (gC) gene, giving rise to amplicons of 575 base pairs (bp) for BoHV- 1, and 572 bp for BoHV-5. The amplicons were digested with the Bgl I for differentiation between BoHV-1 and 5. In the second chapter the region previously described of 23 South American isolates of BoHV-1 and BoHV-5 were amplified and sequenced. Nucleotide sequence alignments revealed identity ranged from 98,7 to 99,8% (BoHV-1/ BoHV-1), 88,3 to 92% (BoHV-1/ BoHV-5) and 96 to 99,7% (BoHV-5/ BoHV-5). The identity deduced from amino acid sequences ranged from 97,5 to 99,5% (BoHV-1/ BoHV-1), 77,5 to 84,4% (BoHV-1/ BoHV-5) and 92,1 to 99,5% (BoHV-5/ BoHV- 5) . Phylogenetic analyses and deduced amino acid sequences revealed that: i) some BoHV-5 isolates seem to be “non a non b” subtype and ii) there is a Uruguayan BoHV-1.2 strain that has a distinct nucleotide and amino acid sequence when compared to others BoHV-1.2 strains. The third chapter of the present work contains the first report of a BoHV-5 strain isolated from the bovine semen by antigenic characterization, differential amplification of the N-terminal region of gC gene from BoHV-1 and 5 followed by genomic characterization by REA and antigenic characterization of the isolate analyzed.

Um total de 144 amostras fecais colhidas de leitões com diarréia provenientes de diversas granjas distribuídas por 10 municípios do Estado de São Paulo, Brasil, foram examinadas para a presença de rotavírus através de eletroforese em gel de poliacrilamida e ELISA, num esquema de triagem em paralelo. Destas, 24 e 39 amostras foram, respectivamente, positivas por estes testes e a caracterização dos genotipos P e G foi realizada em 43 amostras por nested RT-PCR, usando diferentes conjuntos de primers. Utilizando-se primers animais, o genotipo P[6] foi o mais freqüente, detectado em 25,58% das amostras, seguido pelo P[1] (11,62%) e P[7] (9,3%). Infecção concomitante de genotipos P[6]+P[7] (9,3%), P[1]+P[6] (4,65%), P[1]+P[6]+P[7] (2,32%) foi também observada. O genotipo G[5] foi o mais freqüente, detectado em 30,23% das amostras, seguido pelo G[10] (20,93%) e G[6] (4,65%). Infecção concomitante de genotipos G[5]+G[10] (18,6%) foi também observada. Utilizando-se primers humanos, somente o genotipo P[6] (65,11%) foi encontrado. Foram detectados os genotipos G[4] (27,9%), G[3] (13,95%) nas amostras, e as infecções concomitantes G[3]+G[4] (9,3%), G[2]+G[3]+G[4] (4,65%) e G[2]+G[3] (2,32%). A combinação mais freqüente foi G[5]P[6] e G[4]P[6], porém foram encontradas também infecções mistas, genotipos atípicos e reassortants. O seqüenciamento do gene a partir dos produtos de nested PCR dos genotipos animais P e G mostrou diversidade de nucleotídeos e aminoácidos dentro de um mesmo genotipo. As árvores filogenéticas utilizando o critério de maxima parcimônia e o algoritmo branch-and-bound, tiveram topologias nas quais as seqüências de nucleotídeos geradas neste trabalho concordam com as outras descritas anteriormente e pertencentes a um mesmo genotipo, suportadas por índices aceitáveis de \"bootstrap\". Os resultados deste estudo, além de contribuir para um melhor entendimento da epidemiologia dos rotavírus suínos, é relevante ao mostrar que além de haver uma diversidade de genotipos circulantes no campo, há também dentro dos mesmos genotipos, e isto deve ser considerado ao se utilizar e desenvolver métodos de diagnóstico, bem como ao se adotarem medidas preventivas específicas contra esta doença. / A total of 144 fecal specimens collected from piglets with diarrhea from many swine-producing units distributed among 10 municipalities of São Paulo State, Brazil, were examined for rotavirus by polyacrylamide gel electrophoresis and ELISA, in a parallel screening scheme. Twenty-four and thirty-nine samples, respectively, were positive by these tests and the characterization of the P and G genotypes was performed on 43 samples by a nested reverse transcription-PCR typing assay, using different sets of primers. Using the animal set of primers, the P[6] genotype was the most frequent, accounting for viruses in 25.58% of the samples, followed by P[1] (11.62%) and P[7] (9.3%). Concomitant infection of P[6]+P[7] (9.3%), P[1]+P[6] (4.65%), P[1]+P[6]+P[7] (2.32%) genotypes was also observed. The G[5] genotype was the most frequent, accounting for viruses in 30.23% of the samples, followed by G[10] (20.93%) and G[6] (4.65%). Concomitant infection of G[5]+G[10] (18.6%) genotypes was observed. Using human set of primers, only the P[6] (65.11%) genotype was found. It was detected the genotypes G[4] (27.9%), G[3] (13.95%) on the samples. Concomitant infection of the genotypes G[3]+G[4] (9.3%), G[2]+G[3]+G[4] (4.65%) and G[2]+G[3] (2.32%) was also observed. The more frequent combination were G[5]P[6] and G[4]P[6], but it was found mixed infections, atypical genotypes and reassortants. Gene sequencing of nested products of G and P animal genotypes showed a diversity of nucleotides and aminoacids under the same genotype. The phylogenetic trees for P and G genotypes under the maximum parsimony criterion, using the branch-and-bound algorithm, had topologies in which the nucleotide sequences generated by this work agree to others described elsewhere that have the same genotypes, supported by acceptable scores of bootstrapping. The results of the present study, while contributing to a better understanding of epidemiology of porcine rotaviruses, address the relevance that there is not only a diversity of genotypes circulating on the field, but inside the same genotypes, and this must be considered when using and developing diagnostic tests, as well when carrying out specific preventive measures against this disease.

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG) / Consorci CSIC-IRTA-UB-UAB / En esta tesis se aborda la identificación de factores del pulgón Myzus persicae que podrían participar en el proceso de transmisión del potyvirus del grabado del tabaco, Tobacco etch virus (TEV), y se explora la posibilidad de alterar la expresión de genes particulares en el insecto vector como una manera de dificultar o impedir la diseminación de este virus. Se conoce la intervención de un factor auxiliar de origen viral, la proteína HCPro, en la transmisión de potyvirus, actuando como un puente molecular reversible para retener las partículas de virus en el aparato bucal del pulgón. La proteína HCPro interacciona con la proteína de la cápside viral, CP, y previsiblemente con receptores específicos en el pulgón. Después de analizar un conjunto de productos capaces de interaccionar con la proteína HCPro de TEV (interactoma), se han considerado dos proteínas candidatas. La primera, MpRPS2, presenta homología con proteínas ribosomales, y la segunda MpRR1Cp2 es una proteína cuticular. La interacción entre HCPro y MpRPS2 se ha verificado en ensayos Far Western Blot y en el sistema de doble híbrido de levaduras. Los intentos para confirmar la localización de esta proteína en estiletes diseccionados de pulgón no fueron concluyentes, aunque con un antisuero específico sí se ha podido detectar la presencia de MpRPS2 en la cutícula de mudas de pulgón aisladas. Para validar la participación de estos hipotéticos receptores en el proceso de transmisión viral, se han explorado estrategias de interferencia con la expresión génica de MpRPS2 y MpRR1Cp2 en pulgones. Tras analizar sus niveles de expresión durante a lo largo del desarrollo, se consideraron dos sistemas para inducir respuestas de silenciamiento (RNAi) basados en la alimentación. El uso de dietas artificiales suplementadas con dobles cadenas de RNA específicas sintetizadas in vitro no produjo en general reducciones de la acumulación de RNA mensajeros, mientras que la alimentación de pulgones sobre plantas infectadas con un vector viral basado en el virus del cascabeleo del tabaco, Tobacco rattle virus (TRV), que contiene un fragmento de la secuencia del gen, tuvo un efecto más pronunciado. Las reducciones de expresión observadas fueron variables entre los dos genes, con el efecto más fuerte en el caso del gen MpRR1Cp2, en pulgones alimentados en plantas de tabaco infectadas con una variante de TRV que incorporaba un fragmento de este gen. Este sistema de RNAi nos ha permitido ensayar el efecto de la reducción de la expresión de los dos candidatos seleccionados en experimentos de transmisión de TEV. Estos resultados podrían ayudar a mejorar la comprensión de las interacciones moleculares necesarias durante la transmisión, a identificar factores en el vector que participan en el proceso, y eventualmente podrían usarse para el diseño de estrategias innovadoras de bloqueo de la diseminación viral basadas en la interferencia de la expresión de dichos factores. / This thesis addresses the identification of Myzus persicae aphid factors that could be involved in the transmission process of Tobacco etch virus (TEV), a potyvirus, and explores the possibility of altering the expression of specific genes in the insect vector as a way to prevent virus spread. An auxiliary factor of viral origin, the HCPro protein is known to participate in potyvirus transmission. HCPro acts as a reversible molecular bridge retaining virus particles in aphid mouthparts. HCPro interacts with the viral coat protein, CP, and predictably with specific receptors in aphid mouthparts. After analyzing a set of products able to interact with the TEV HCPro (interactome), we have considered two candidate proteins. The first one MpRPS2, shows homology with ribosomal proteins, and the second one, MpRR1Cp2 is a cuticular protein. The interaction between HCPro and MpRPS2 has been verified in Far Western Blot assays and in yeast two-hybrids. Attempts to confirm the localization of this protein in dissected aphid stylets were not conclusive, although using an specific antiserum it has been possible to detect the presence of the MpRPS2 in the cuticle of isolated aphid moults. To confirm the involvement of these hypothetical receptors in the viral transmission process, strategies of interference with expression of MpRR1Cp2 and MpRPS2 have been explored in aphids. After analyzing their expression levels along development, two systems based on feeding were considered to induce silencing responses (RNAi). The use of artificial diets supplemented with specific in vitro synthesized dsRNA did not produced reductions in mRNA accumulation, while aphids fed on plants infected with a viral vector based on Tobacco rattle virus (TRV), which contains a fragment of the targeted genes, showed more clear effects. The observed reductions in expression were rather variable between the two genes considered, with a stronger effect in the case of MpRR1Cp2 in aphids fed on tobacco plants infected with a TRV variant that incorporates a fragment of this gene. This RNAi system allowed us to test the effect of knocking down the expression of the two selected candidates in TEV transmission experiments. Our results might help to improve our understanding of the molecular interactions during transmission, to identify factors in the vector that participate in the process, and eventually could serve to design new strategies to interfere with viral dissemination based on specifically interfering with their expression.

En la segunda mitad del siglo XX se produjo probablemente la diseminación inicial del virus de la hepatitis C (VHC) a través de inyecciones parenterales poco seguras, procedimientos médicos y quirúrgicos invasivos, y transfusiones de sangre y hemoderivados.A finales de los años setenta se extendió en España el uso intravenoso de drogas, fundamentalmente heroína, lo que abrió una nueva vía de contagio: el uso compartido de material de inyección de drogas intravenosas. El pico de máxima incidencia de nuevos consumidores de heroína inyectada fue a comienzos de la década de los ochenta. En Europa se observan tres patrones de transmisión, el Norte de Europa, con baja prevalencia 0,1%-1% de la población general, la región centroeuropea, con una prevalencia media, y el sur de Europa (sur de Francia, España, Italia y Grecia) con prevalencias de 2,5-3-5%. Con el control de la transmisión nosocomial y transfusional, los genotipos más prevalentes pasaron a ser los relacionados con la adicción a drogas por vía parenteral, 1b, 3 y 4, en detrimento de los genotipos 1a y 2. Apareció entonces la pandemia del síndrome de inmunodeficicencia adquirida SIDA, cuyo agente causal, el VIH, fue rápidamente identificado. Hasta 1989 no se identifica el agente responsable de la hepatitis crónica noA noB, el Flavivirus VHC.Al compartir mecanismos de transmisión, ambas infecciones se entrecruzaron, dando lugar a un solapamiento de las dos epidemias que según algunas estimaciones podría afectar a 10-12 millones de personas. En nuestro país, la cifra de personas infectadas por el VIH-1 es aproximadamente 160.000, de las cuales globalmente, el 55%-65% están coinfectados por VHC, siendo esta cifra mayor entre aquellos que adquirieron la infección vía parenteral, hemofílicos y adictos a drogas, entre los que puede alcanzar el 80-90% de prevalencia, y más baja entre aquellos que adquirieron la infección por transmisión sexual, en los que la prevalencia es tan baja como 4-8%; estas diferencias se deben a que el VHC se transmite muy eficazmente vía parenteral, se estima que el 90% de los adictos de infectan en el primer año de adicción, y poco eficazmente por transmisión sexual. La transmisión vertical, aunque algo mayor en pacientes coinfectados, está alrededor del 10%.La coexistencia en el mismo enfermo de ambas infecciones tiene efectos deletéreos para ambas enfermedades. En la mayoría de los pacientes la respuesta inmunológica frente al VHC llega tarde o no es suficientemente vigorosa o completa, lo que permite una replicación viral sostenida que, a través de errores de trascripción en los continuos ciclos de replicación viral, dará lugar a una cuasi especie del VHC cada vez más adaptada al ambiente del huésped y, por tanto, con mayor capacidad para eludir su sistema inmunitario. La coinfección, además, se asocia con títulos mas elevados de ARN-VHC sobretodo en pacientes con CD4 bajos lo cual posiblemente refleja un déficit en el control de la replicación del VHC secundario a la inmunodeficiencia causada por el VIH-1. El valor de la carga viral del VHC en sangre no se ha relacionado con la evolución de la enfermedad pero si tiene valor pronóstico de cara a la respuesta al tratamiento. La enfermedad hepática progresa más rápidamente hacia la cirrosis y la muerte comportándose para algunos autores como una infección oportunista.En cuanto al VIH, la tolerancia al tratamiento antirretroviral y la respuesta inmunológica son peores en los pacientes coinfectados por el VHC. El VHC podría actuar como cofactor acelerando la progresión de la enfermedad por VIH-1 por diferentes mecanismos: mediante la estimulación del sistema inmunológico podría favorecer la replicación del VIH-1; además la infección de células inmunitarias por el VHC podría favorecer la depleción de linfocitos CD4 y reducir la recuperación inmunológica que acompaña a la supresión de la replicación viral con el tratamiento antirretroviral y, por último, la infección por VHC podría comprometer el beneficio proporcionado por dicho tratamiento como consecuencia de una más frecuente toxicidad hepática que motivaría interrumpir el tratamiento.Al comienzo de la pandemia de SIDA la mortalidad era tan masiva y precoz que minimizaba el impacto de la hepatitis crónica C entre los pacientes coinfectados. Pero incluso entonces ya había descripciones de cómo la infección VIH era capaz de modificar la historia natural de la hepatitis crónica C (HCC), acelerando la evolución hacia la cirrosis. Con el advenimiento del TARGA (terapia antirretroviral de gran actividad), a partir de 1996, la mortalidad por SIDA desciende dramáticamente, y es a partir de entonces que la mortalidad y morbilidad de causa hepática comienza a ser un problema y es responsable en gran medida del exceso de mortalidad de los pacientes infectados por VIH y VHC, comportándose como un epidemia dentro de la epidemia de SIDA. La presente tesis doctoral se presenta como compendio de publicaciones según la normativa aprobada por la Comisión de Doctorado del Consejo de Gobierno de este Universidad en julio de 2008. Los trabajos presentados se enmarcan un una misma línea de investigación: el cuidado de los enfermos de hepatitis crónica C e infección VIH-1.ARTÍCULOS, INCLUIDOS COMO ANEXOS:1. Laguno M, Cifuentes C, Murillas J, Veloso S, Larrousse M, Payeras A, Bonet L, Vidal F, Milinkovic A, Bassa A, Villalonga C, Pérez I, Tural C, Martínez- Rebollar M, Calvo M, Blanco JL, Martínez E, Sánchez-Tapias JM, Gatell JM, Mallolas J. "A randomized trial to compare the efficacy and safety of PEGinterferon alfa-2b plus ribavirin versus PEG-interferon alfa-2a plus ribavirin for treatment of chronic hepatitis C in HIV co-infected patients". Hepatology 2009; 49:22-3102. Laguno M, Larrousse M, Murillas J, Blanco JL, León A, Milinkovic A, Loncá M, Martinez E, Sánchez-Tapias JM, de Lazzari E, Gatell JM, Costa J, Mallolas J. "Predictive Value of Early Virologic Response in HIV/Hepatitis C Virus- Coinfected Patients Treated With an Interferon-Based Regimen Plus Ribavirin". J Acquir Immune Defic Syndr. 2007 Feb 1; 44(2):174-8.3. Laufer N, Laguno M, Perez I, Cifuentes C, Murillas J, Vidal F, Bonet L, Veloso S, Gatell JM, Mallolas J. "Abacavir does not influence the rate of virological response in HIV-HCV-coinfected patients treated with pegylated interferon and weight-adjusted ribavirin". Antivir Ther. 2008; 13(7):953-7.4. Murillas J, Rimola A, Laguno M, De Lazzari E, Rascón J, Aguero F, Blanco JL, Moitinho E, Moreno A, Miro JM, and the ESLD-HIV Working Group Investigators. "The Model for End-Stage Liver Disease Score Is the Best Prognostic Factor in Human Immunodeficiency Virus 1-Infected Patients with End-Stage Liver Disease: A Prospective Cohort Study". Liver Transplantation 2009, en prensa.5. Murillas J, Del Río M, Riera M, Vaquer P, Salas A, Leyes M, Angeles Ribas M, Peñaranda Vera M, Villalonga C. "Increased incidence of hepatocellular carcinoma (HCC) in HIV-1 infected patients". Eur J Intern Med. 2005 Apr; 16(2):113-115.6. Miró JM, Murillas J, Laguno M, Tuset M, Aguero, Moreno A, Rimola A and the Hospital Clinic OLT in HIV Working Group. "Liver Transplantation in HIV-Infected Patients: Update in 2006". HEPATOLOGY Reviews 2006; 3:16-29

.La recurrencia de la infección por el VHC se produce de forma universal tras el trasplante hepático. La hepatopatía secundaria a la recurrencia de la infección tras el trasplante hepático evoluciona de forma más rápida que en sujetos inmunocompetentes y condiciona una peor supervivencia del injerto y del paciente.-El estudio de la cinética viral del VHC durante el trasplante y en la fase inmediatamente posterior. A través de este estudio se describió un descenso rápido de la carga viral en la fase anhepática y en la de reperfusión debido a la falta de producción de viriones y de aclaramiento hepático. Sin embargo, el ARN del VHC es detectable durante prácticamente todo el proceso y es a partir de estas partículas circulantes que se infecta el injerto. La replicación viral se inicia a las pocas horas tras la reperfusión hepática como lo demuestra el incremento de la carga viral que se produce en los días posteriores.-Eficacia y seguridad del tratamiento antiviral con interferón y ribavirina en pacientes cirróticos infectados por el VHC en lista de espera para trasplante hepático. Una de las estrategias propuestas para impedir la recidiva de la infección tras el TH es la erradicación del VHC en la fase pre-TH. La cirrosis avanzada constituye una contraindicación para el tratamiento antiviral con interferón y ribavirina. Sin embargo, con una selección adecuada de los pacientes y un seguimiento estrecho, la eficacia del tratamiento antiviral alcanzó un 30% (negativización del ARN-VHC).En un 20% de los pacientes del estudio se logró evitar la recidiva de la infección tras el trasplante-Recurrencia de la infección por el VHC tras el TH en receptores de órganos cadavéricos versus receptores de donante vivo. A través de este estudio prospectivo se demostró que la recurrencia de la infección por el VHC en receptores de donante vivo es significativamente más grave que en los receptores de órgano cadavérico. Las complicaciones biliares o el fenómeno de la regeneración hepática podrían justificar esta mayor agresividad. Estos resultados deberían tenerse en cuenta en la toma de decisiones por parte de los diferentes equipos de transplante ya que podría comprometer la supervivencia del injerto y del paciente. / ."Hepatitis C virus (HCV) infection recurrence after liver transplantation: prognostic factors for early and severe recurrence."HCV recurrence after liver transplantation (LT) is almost universal. HCV-related liver disease progresses more rapidly after liver transplantation than in immunocompetent individuals. Thus, survival after LT is also lower in these patients compared to other groups.-HCV virus kinetics during and immediately after LT. This study demonstrated a sharp decrease in viral load during the anhepatic phase and reperfusion, most likely owing to a lack of virions production and hepatic clearance.However, HCV-RNA is detectable during almost all the surgical procedure and circulating virions are supposed to cause graft infection.Viral replication begins immediately after graft reperfusion as demonstrated by the rapid increase in viral load during the first days after transplantation.-Efficacy and safety of antiviral therapy in HCV-cirrhotic patiens awaiting liver transplantation. One of the strategies that may avoid HCV-recurrence after LT is to erradicate viral infection before the surgery. Antiviral therapy is contraindicated in decompensated cirrhotic patients because its relative low efficacy and high risk of adverse events. However, we have demonstrated that an accurate selection and follow up of patients can lead to a succesful outcome in 30% of them (HCV-negativization during treatment). HCV-recurrence after LT was avoided in 20% of patients.-HCV-recurrence after living donor and cadaveric donor liver transplantation. In this prospective study we observed that HCV recurrence was significantly more severe in living donor liver transplantation compared to cadaveric liver transplantation.Type of donor (living vs cadaveric) was an independent prognostic factor for severe HCV-recurrence. Biliary complications and liver regeneration may play a role in this more severe outcome of HCV recurrence after living donor liver transplantation.These results should be taken into account in the decission-making process of transplant programs, since severe HCV-recurrence may ultimately compromise graft and patient survival.

Thesis (doctoral)--Uppsala, 1983.