Salmonella Typhimurium est un pathogène intracellulaire dont la virulence repose sur l'expression de protéines effectrices qui sont transportées dans les cellules hôtes infectées. Dans la cellule cette bactérie réside dans un compartiment appelé SCV (Salmonella-containing vacuole). Au cours de l'infection, la protéine effectrice SifA est transportée du cytosol bactérien à celui de la cellule infectée. Après sa translocation SifA est retrouvée à la surface de la SCV et des tubules. Cette protéine est constituée de deux domaines distincts. Le domaine N-terminal interagit avec la protéine hôte SKIP. Le domaine C-terminal a une structure similaire à d'autres protéines bactériennes possédant une activité d'échange de nucléotide guanine (GEF). Cependant on ignore si le domaine C-terminal contribue aux fonctions de SifA dans la virulence de Salmonella et, si c'est le cas, si il exerce une activité GEF sur une protéine de l'hôte. Nous avons utilisé un modèle de souris invalidée pour SKIP pour montrer que SKIP est un médiateur du rôle de SifA dans la virulence de Salmonella et que SifA à également un rôle qui est indépendant de son interaction avec SKIP. Ce dernier est porté par le domaine C-terminal de SifA. Nous avons montré que ce domaine de SifA se lie à la petite GTPase Arl8b, une protéine lysosomale. Le domaine C-terminal de SifA et Arl8b sont importants pour le recrutement de LAMP1 sur les SCVs et les tubules associés. L'utilisation d'une lignée cellulaire invalidée pour l'expression d'Arl8b a montré une prolifération réduite de Salmonella. Ces résultats nous permettent de proposer un modèle pour le rôle du domaine C-terminal de SifA dans la virulence de Salmonella. / The virulence of the intracellular pathogen Salmonella Typhimurium relies on the expression of bacterial effector proteins that are translocated into infected host cells. This bacterium resides and proliferates in a host-cell compartment named the Salmonel-la-containing vacuole (SCV). Following translocation in the infected host cells, the effector protein SifA localizes onto the SCV and SCV-associated membrane tubules. This protein is made of two distinct domains. The SifA N-terminal domain interacts with the host-cell protein SKIP. The SifA C-terminus has a fold similar to other bacterial effector proteins having a guanine nucleotide exchange factor (GEF) activity. Indeed, SifA binds preferentially a GDP-bound form of RhoA but does not stimulate GDP disso-ciation. Therefore it remains unknown whether the SifA C-terminus contributes to the functions of SifA in Salmonella virulence and, if it does, whether it has a GEF activity towards a host protein. We used a model of SKIP knockout mice to show that SKIP mediates susceptibility to Salmonellosis and to establish that SifA also contributes to Salmonella virulence independently of its interaction with SKIP. We next identified that the SifA C-terminal domain supports this contribution. We have further showed that the SifA C-terminus binds the small GTPase Arl8b and that both SifA C-terminus and activated Arl8b are important for the recruitment of LAMP1 on SCVs and associated tubules. Using an Arl8b knock down cell line, we observed that the absence of Arl8b results in a reduced proliferation of wild-type Salmonella. Finally, we proposed a model for the role of the SifA C-terminus in Salmonella virulence.

Les PLLs sont une famille d’enzyme dont l’activité catalytique est double. L’activité lactonase permet entre autre de détruire les AHLs, molécules médiatrices de la communication chez les bactéries Gram négatives, empêchant ainsi la synchronisation à l’échelle de la population de la sécrétion de facteurs de virulence ou la formation de biofilm. Elles sont non seulement capables d’hydrolyser les molécules possédant un noyau lactone, mais aussi les phosphotriésters par promiscuité de substrat. L’activité phosphotriestérase permet de dégrader les composés organophosphorés (OPs) hautement toxiques, que ce soit les insecticides (Paraoxon) ou les agents neurotoxiques de guerre (Sarin, VX). Les travaux effectués ont consisté à évaluer l’efficacité de la PLL SsoPox, provenant de l’archée extrêmophile Sulfolobus solfataricus, pour empêcher la mise en place de la virulence et du biofilm chez Pseudomonas aeruginosa PAO1. Cette évaluation a été effectuée in vitro et in vivo via un modèle d’infection pulmonaire chez le rat. D’autre part, une étude in vitro a été réalisée sur 73 souches cliniques de P. aeruginosa isolés sur des patients atteints de pied diabétique, en évaluant la quantité de pyocyanine et l’activité protéolytique. Enfin, une phase prospective pour identifier de nouvelles PLLs a permis la caractérisation enzymatique et structurale de 2 nouvelles enzymes, SacPox et VmoLac, contribuant ainsi à affiner la connaissance sur cette famille et leur potentiel d’amélioration par ingénierie protéique. Au final, les PLLs offrent un intérêt biotechnologique majeur et peuvent mener à une valorisation concrète pour la santé humaine mais également pour la bioremédiation des OPs. / Phosphotriesterase-Like Lactonases (PLLs) are a family of enzyme displaying a dual catalytic activity. Lactonase activity allows for, among others, the destruction of Acyl Homoserine Lactones (AHLs). These molecules mediate the communication in Gram negative bacteria, allowing them to synchronize group behavior like virulence factor secretion or biofilm formation. Beside their ability to hydrolyze molecules with a lactones moiety, PLL also show substrate promiscuity for hydrolyzing highly toxic organophosphate compounds (OPs), such as pesticides (i.e. Paraoxon) or Chemical Warfare Nerve Agents (CWNAs) (e.g. Sarin & VX). The work described here consisted in evaluating the efficacy of the PLL SsoPox, originating from the extremophile Archaea Sulfolobus solfataricus, to prevent virulence and biofilm formation on the model strain Pseudomonas aeruginosa PAO1. This evaluation was performed both in vitro and in vivo, by using a rat pulmonary infection model. A study has been performed on a strain collection of 73 clinical strains of P. aeruginosa isolated from diabetic foot, to assess the enzyme effects on pyocyanin secretion and protease activity. Finally, a prospective phase to identify new PLLs allowed for the enzymatic and structural characterization of two new enzymes, SacPox and VmoLac, thus contributing to refine the knowledge about this enzyme family and their engineering potential. In conclusion, PLLs are of prime biotechnological interest and could lead to developments in human health, but also for OPs bioremediation with a non aggressive decontamination solution.

La phosphorylation de protéines correspond à l’addition covalente d’un groupement phosphate (PO4 3-) par une protéine kinase sur un substrat. Cette réaction est réversible : la déphosphorylation est catalysée par des protéines phosphatases. Chez S. aureus, la sérine/thréonine kinase Stk1 phosphoryle des acides aminés sérines et thréonines et a été montrée impliquée dans la régulation de la virulence du pathogène : nous avons approfondi les connaissances sur ce mécanisme en identifiant trois nouveaux substrats et en étudiant les effets de la phosphorylation sur leur activité : - l’enzyme LuxS, responsable de la synthèse de l’AI-2 impliqué dans la communication intra bactérienne, voit son activité enzymatique drastiquement diminuée en étant phosphorylée par Stk1 sur un site thréonine unique (T14) ; - le régulateur CcpA, dont la fixation sur l’ADN module l’expression de nombreux gènes de virulence, est phosphorylée par Stk1 sur deux sites (T18 et T33) et cette phosphorylation diminue l’affinité de la protéine régulatrice CcpA pour l’ADN de ses gènes cibles ; - l’élément réponse du système à deux composants SaeR est phosphorylé sur deux sites thréonines (T87 et T192) de la région impliquée dans l’affinité de SaeR pour l’ADN. Les rôles de la kinase Stk1 sont donc multiples et liés à la régulation de la virulence de S. aureus. Les autres voies mettant en jeu la phosphorylation de protéines bactériennes, comme les systèmes à deux composants ou le système CcpA/HPr, sont couplées à cette phosphorylation par la sérine/thréonine kinase : ces résultats soulignent à la fois la diversité et la complexité de la régulation des mécanismes responsables de la virulence de S. aureus / Protein phosphorylation consists in the catalyzed addition of a phosphate group on a substrate. This reversible reaction is ensured by both kinase and phosphatase proteins. S. aureus is a human prokaryote pathogen and a part of its virulence is known to be regulated by the serine/threonine kinase Stk1, which phosphorylates serine or threonine residues of its substrates. We investigated the mechanisms of this virulence regulation and newly identified three substrates of Stk1: the quorumsensing LuxS protein, the catabolite carbon protein CcpA and the two components system response element SaeR. LuxS is phosphorylated on a unique threonine residue in position 14 and phosphorylation dramatically influences its enzymatic activity on AI-2 production. CcpA phosphorylation on two threonine residues in the DNA-binding region of the protein (T18 and T33) decreases the affinity of the protein for its targeted DNA sequences. Besides, Stk1 also phosphorylates the response element SaeR on two threonine residues (T87 and T192) in the DNAbinding region. Therefore Stk1 kinase plays numerous roles in S. aureus virulence regulation and the complexity of this regulation pattern increases when considering that three of the phosphorylation pathways in prokaryotes are crossed over: the two components system phosphorylation, the HPr/HPrK system and the serine/threonine kinase proteins phosphorylation. These results highlight the need to focus on Stk1 as a key element in the complexity of virulence regulation in S. aureus

La pathogénicité des bactéries a toujours été attribuée à des facteurs de virulence et les bactéries pathogènes sont considérées comme étant mieux armées, comparé à des bactéries ne provoquant pas de maladies. Selon les premières études génomiques, le fait de supprimer un certain nombre de gènes des bactéries pathogènes, limiterait leur capacité à infecter leurs hôtes. Au contraire, des études de génomique comparatives récentes, démontrent que la spécialisation des bactéries dans les cellules eucaryotes est associée à une perte de gènes massive, en particulier pour les endosymbiontes allopatriques qui sont isolés depuis longtemps dans une niche intracellulaire. En effet, les bactéries sympatriques, extracellulaires, ont souvent des génomes plus grands et présentent une résistance et une plasticité plus importante. Ces bactéries constituent, de fait, plutôt des complexes d’espèces que de vraies espèces. Certaines bactéries spécialistes, comme les bactéries pathogènes, arrivent à s’échapper de ces complexes et à coloniser une niche, bénéficiant alors d’un nom d’espèce. Leur spécialisation leur permet de devenir allopatriques et leurs pertes de gènes favorisent une évolution réductive. Ces observations nous ont conduits à réaliser une étude afin de quantifier le taux de perte de gènes lors de l’évolution de ces bactéries extracellulaires vers celle de bactéries spécialistes intracellulaires. Notre objectif était de vérifier que ce qui caractérise l’évolution des bactéries intracellulaires est bien la réduction génomique, en prenant en compte tous les événements possibles de gains de gènes. Par ailleurs, dans une étude neutre comparant les 12 espèces pandémiques les plus dangereuses pour l’homme avec les espèces non-épidémiques les plus proches, nous avons voulu identifier des spécificités génomiques associées à la capacité virulente de bactéries pathogènes et démontrer que, à part les toxines et les modules toxine-antitoxine, ce qui caractérise ces espèces ce ne sont pas les facteurs de virulence, mais la perte des gènes de régulation. Au final, les bactéries pathogènes ont un répertoire virulent dans lequel les gènes absents sont aussi importants que les gènes présents. / The virulence of pathogenic bacteria has been attributed to virulence factors and pathogenic bacteria are considered to have more genes compared to bacteria that do not cause disease. According to the first genomic studies, removing a certain number of genes from pathogenic bacteria impairs their capacity to infect hosts. However, more recent studies have demonstrated that the specialization of bacteria in eukaryotic cells is associated with massive gene loss, especially for allopatric endosymbionts that have been isolated for a long time in an intracellular niche. Indeed, bacteria living in sympatry often have bigger genomes and exhibit greater resistance and plasticity and constitute species complexes rather than true species. Specialists, including specific pathogenic bacteria, escape these bacterial complexes and colonize a niche; thereby gaining a species name. Their specialization allows them to adopt allopatric lifestyle and experience reductive genome evolution. These observations led us to design a study to quantify the rate of gene losses during the evolution of free-living bacteria to intracellular specialists. Our objective was to verify that what characterizes the evolution of intracellular bacteria is genomic reduction, taking under consideration all possible gene gain events. Furthermore, in another neutral study comparing the 12 most dangerous pandemic bacteria to Humans to their closest non-epidemic species, we wished to identify any genomic specificities associated to the virulent capacity of pathogenic bacteria and demonstrate that, besides toxins and surprisingly, toxin-antitoxin modules, pathogenic bacteria are not characterized by more virulence factors, but rather by a loss of regulatory genes. Finally, virulent bacteria exhibit a genomic repertoire in which absent genes are as important as present ones.

Les entérobactéries du genre Xenorhabdus sont pathogènes de larves d'insectes et symbiotiques de nématodes du genre Steinernema. En lutte biologique, les couples Steinernema-Xenorhabdus sont utilisés contre un large spectre d'insectes ravageurs de culture. Les deux partenaires du couple modèle Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila peuvent être expérimentalement dissociés tout en restant pathogènes pour les insectes. En revanche, certaines souches de Xenorhabdus sont non-virulentes lorsqu'elles sont injectées directement dans une larve d'insecte. L'objectif de cette thèse est de caractériser deux souches non-virulentes de Xenorhabdus, X. poinarii G6 (Xp G6) et X. bovienii CS03 (Xb CS03). Les souches appartenant à l'espèce non-virulente X. poinarii possèdent des génomes de petite taille. Nous avons mis en évidence un phénomène de réduction génomique due à la délétion de larges régions génomiques chez la souche Xp G6. Cette évolution pourrait avoir eu lieu suite à un transfert des fonctions bactériennes de virulence à son nématode hôte et/ou à sa spécialisation envers certains coléoptères. Au sein de l'espèce X. bovienii, Xb CS03 est non-virulente par injection dans les lépidoptères Spodoptera littoralis et Galleria mellonella. Par rapport à d'autres couples némato-bactériens Steinernema sp.-X. bovienii, le couple formé par Xb CS03 et son nématode symbiotique S. weiseri 583 présente également une virulence atténuée sur ces lépidoptères. Le génome de Xb CS03 est de très grande taille et contient un grand nombre de gènes dégradés (pseudogènes). Une comparaison génomique entre Xb CS03 et une souche virulente appartenant à la même espèce, X. bovienii SS-2004 (Xb SS-2004), montre que Xb CS03 est plus riche que Xb SS-2004 en gènes codant des chaînes d'assemblage enzymatiques NRPS/PKS (non-ribosomal peptide synthase/polyketide synthethase) produisant des métabolites antimicrobiens potentiels. A l'inverse, Xb SS-2004 contient davantage de gènes codant des facteurs de virulence de type hémolysine, adhésine ou systèmes de sécrétion. Ceci suggère deux scénarios évolutifs différents, privilégiant une forte virulence pour Xb SS-2004 et l'élimination des compétiteurs au sein du cadavre de l'insecte pour Xb CS03. Enfin, une recherche de facteurs de virulence potentiels a été effectuée par une approche de génomique comparative entre les souches non-virulentes Xp G6 et Xb CS03, d'une part et trois souches de Xenorhabdus virulentes, d'autre part. L'analyse fonctionnelle de gènes candidats a été entamée. En conclusion, la caractérisation de nouveaux modèles bactériens dans le genre Xenorhabdus ouvre le champ à l'identification de nouvelles stratégies de virulence et de nouveaux facteurs de virulence chez les bactéries entomopathogènes. / Xenorhabdus are enterobacteria pathogenic of insect larvae and symbiotic of nematodes from the Steinernema genus. The Steinernema-Xenorhabdus associations are used against a wide range of insect pests. The two partners of the model Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila association can be experimentally dissociated. Each partner is pathogenic for insect larvae. Contrarily, some other Xenorhabdus strains are non-virulent when injected directly into insect larvae. In this thesis, we characterized two non-virulent Xenorhabdus strains, X. poinarii G6 (Xp G6) and X. bovienii CS03 (Xb CS03). Strains from the X. poinarii species had small-sized genomes. We showed that the Xp G6 strain had undergone a genome reduction due to the deletion of large genomic regions. Transfer of virulence functions from the bacteria to the nematode and/or the specialization of the association towards coleopteran insects are likely the cause of this evolution. Within the X. bovienii species, Xb CS03 was non-virulent strain when injected into the Spodoptera littoralis and Galleria mellonella lepidopteran insects. When compared to other Steinernema-X. bovienii pairs, the association between Xb CS03 and its symbiotic nematode S. weiseri 583 had also a lower virulence on those insects. Xb CS03 had a large-sized genome and harbored numerous degraded genes (pseudogenes). Genome comparison between Xb CS03 and a virulent strain from the same species, X. bovienii SS-2004 (Xb SS-2004), showed that Xb CS03 contained more loci encoding NRPS/PKS enzymes (non-ribosomal peptide synthase/polyketide synthethase), producing potential antimicrobial metabolites, than Xb SS-2004. On the other hand, Xb SS-2004 contained more genes encoding virulence factors such as hemolysins, adhesins or secretion systems. This suggests that the two strains followed different evolutionary scenarios, favoring strong virulence in Xb SS-2204 and elimination of competitors for Xb CS03.Finally, we searched for potential virulence factors by comparing the genomes of the non-virulent strains Xp G6 and Xb CS03 with three virulent strains. Functional analyses of the candidates are in progress. In conclusion, characterizing new bacterial models in the Xenorhabdus genus paves the way for the identification of new virulence strategies and new virulence genes in entomopathogenic bacteria.

Previous research in our laboratory showed that when knockout mutations were created in the pyrB and pyrC genes of the pyrimidine pathway in Pseudomonas aeruginosa, not only were the resultant mutants auxotrophic for pyrimidines but they were also impaired in virulence factor production. Such a correlation had not been previously reported for P. aeruginosa, a ubiquitous opportunistic pathogen in humans. In an earlier study it was reported that mutants blocked in one of the first three enzymes of the pyrimidine pathway in the non-pathogenic strain P. putida M produced no pyoverdin pigment while mutants blocked in the later steps produced copious amounts of pigment, just like the wild type. This study probed for the same connection between pyrimidine auxotrophy and pigment production applied in P. aeruginosa. To that end a knockout mutation was created in pyrD, the fourth step in the pyrimidine pathway which encodes dihydroorotate dehydrogenase. The resulting mutant required pyrimidines for growth but produced wild type pigment levels. Since the pigment pyoverdin is a siderophore it may also be considered a virulence factor, other virulence factors were quantified in the mutant. These included casein protease, hemolysin, elastase, swimming, swarming and twitching motility, and iron binding capacity. In all cases these virulence factors were significantly decreased in the mutant. Even supplementing with uracil did not attain wild type levels. Starvation of the pyrimidine mutant for uracil caused increased specific activity of the pyrimidine enzymes, suggesting that regulation of the pyrimidine pathway occurred at the level of transcription. This effect has also been reported for P. oleovorans. The present research consolidates the idea that pyrimidine auxotrophs cause decreased pathogenicity in P. aeruginosa. Such a finding may open the search for chemotherapy targets in cystic fibrosis and burn victims where P. aeruginosa is an infecting agent.

Notre système immunitaire détecte les microorganismes via des molécules absentes de l’hôte appelées MAMPs. Mais étant donné que les MAMPs sont exprimés par tous les microorganismes indépendamment de leur potentiel pathogène, ce mécanisme n’explique pas comment le système immunitaire distingue les microorganismes pathogènes des non-pathogènes. De récents travaux ont mis en évidence un mécanisme de détection de l’activité des facteurs de virulence bactériens. En utilisant la drosophile, notre laboratoire a précédemment démontré que l’activation de la Rho GTPase Rac2 par la toxine CNF1 d’Escherichia coli induisait une réponse immunitaire innée conservée au cours de l’évolution chez le mammifère et similaire à l’immunité induite par les effecteurs chez la plante. Par la suite, nous avons évalué l’importance de cette réponse immunitaire au cours de la bactériémie chez la souris et démontré le rôle central de la cytokine IL-1β dans l’élimination des bactéries en réponse à la détection de CNF1. Des expériences in vitro nous ont permis d’identifier les mécanismes moléculaires mis en jeu et l’inflammasome responsable de l’activation de la caspase-1 et du clivage de l’IL-1β. De manière intéressante, CNF1 est toujours co-exprimée avec la toxine hémolysine-α (HlyA) dans les souches pathogènes d’E. coli. En outre, nous avons découvert que l’HlyA bloquait l’élimination des bactéries induite par CNF1 au cours de la bactériémie et inhibait la sécrétion de l’IL-1β. Ici, nous avons rapporté le premier exemple d’immunité induite par une toxine (CNF1) et contrecarrée par une autre (HlyA). / Our immune system detects microorganisms via molecules absent from the host called MAMPs. Since MAMPs are shared by all microorganisms regardless of their pathogenic potential, this mechanism does not explain how the immune system distinguishes between pathogenic and non pathogenic microorganisms. The detection of the activities of pathogen-encoded virulence factors has emerged as a new paradigm of pathogen recognition. Using Drosophila we previously demonstrated that the Escherichia coli CNF1 toxin-induced activation of the Rho GTPase Rac2 is sufficient to initiate a defense signal evolutionarily conserved from flies to mammals and similar to Effector-Triggered Immunity in plants. We further addressed the importance of this innate immune mechanism during bacteremia in mice and demonstrated the central role of the IL-1β cytokine in the clearance of bacteria in response to the detection of CNF1. In vitro experiments allowed us to identify the involved molecular mechanisms and the inflammasome responsible of caspase-1 activation and IL-1β maturation. Interestingly, CNF1 is always co-expressed with α-hemolysin toxin in pathogenic E. coli. In addition, we found that HlyA blocked the elimination of bacteria induced by CNF1 during bacteremia and inhibited the secretion of IL-1β. Here, we have reported the first example of immunity induced by a toxin (CNF1) and counteracted by another (HlyA).

Le taux de mortalité associé aux infections par le S. aureus résistant à la méticilline (SARM) est le plus élevé parmi les infections staphylococciques. Le SARM est aussi la plus fréquente des bactéries multirésistantes, plaçant souvent le médecin en situation d'impasse thérapeutique. Une meilleure compréhension des phénomènes de résistance aux antibiotiques permettrait de mieux détecter ces bactéries et concevoir de nouveaux antibiotiques. Dans ce contexte, ces travaux de thèse visaient à étudier le phénotype de résistance à la méticilline de S. aureus par une approche métabolomique.La première partie de ce travail a été dédiée au développement des outils nécessaires aux analyses métabolomiques globales de S. aureus. Ces développements ont impliqué la mise place d'un protocole de préparation d'échantillon spécifique et multi-étapes, de méthodes de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (LC/HRMS) et l'implémentation d'une base de données spectrales dédiée.Dans ces conditions, nous avons pu extraire et identifier jusqu'à 210 métabolites intracellulaires, ce qui représente la plus large couverture métabolique de S. aureus obtenue à ce jour. Dans un second temps, nous avons appliqué l'approche développée à l'étude de souches SARM et de souches sensibles à la méticilline (SASM). Après optimisation rigoureuse des conditions de culture, l'étude approfondie de 24 souches cliniques nous a permis de dégager une signature métabolique du phénotype de la résistance à la méticilline, signant notamment l'implication des voies de biosynthèse de la paroi et de la capsule bactérienne.Le séquençage complet du génome de ces 24 souches combiné à l'étude complémentaire de 16 souches de SARM de fonds génétiques différents nous a ensuite permis de souligner la pertinence de cette signature métabolique vis-à-vis du phénotype étudié. Enfin, l'étude de souches isogéniques en présence d'antibiotique a également confirmé l'implication de la synthèse de la paroi dans la distinction SARM/SASM. / The mortality rate associated with Methicillin resistant S. aureus (MRSA) is the highest among the staphylococcal infections. A better understanding of antibiotic resistance phenomena would lead to better detect these bacteria and design new antibiotics. In this context, this PhD work aimed to study the MRSA phenotype by using a metabolomics approach. The first part of this work has been dedicated to developing a global metabolomic analysis of S. aureus: i.e., the setting up of a reliable sample preparation protocol, the development of liquid chromatography-high resolution mass spectrometry methods, and the implementation of a dedicated spectral database. Under these conditions, 210 metabolites have been extracted and identified in bacterial cell extracts, which is the widest metabolic coverage of S. aureus obtained to date.Secondly, we have performed a metabolomic study of MRSA and methicillin susceptible S. Aureus (MSSA) strains. The analysis of 24 clinical strains has allowed us to highlight a metabolic signature of MRSA phenotype of which metabolites involved in bacterial wall and capsule biosynthesis pathways were part. The complete genome sequencing of these 24 strains combined with the complementary study of 16 MRSA strains of different genetic backgrounds have reinforced the relevance of this metabolic signature. Finally, the study of isogenic strains in the presence of an antibiotic has confirmed the involvement of metabolites of the wall and capsule biosynthesis pathways in the distinction of MRSA/MSSA phenotypes.

The Bordetellae are aerobic Gram-negative coccobacilli colonizing the upper respiratory tract of mammals and thereby causing diseases with similar symptoms but different host specificity. The bacteria produce a variety of adhesins and toxins that facilitate their ability to promote infection and evade the innate immune system. Among them, the filamentous hemagglutinin (FHA) and the adenylate cyclase toxin (CyaA) are the major virulence factors providing the adherence to the host epithelial cells and the protection against bactericidal activity of phagocytic cells, respectively. Moreover, CyaA along with the Escherichia coli α-hemolysin (HlyA) and the Kingella kingae cytotoxin (RtxA) represent a prominent group of Repeats in ToXin (RTX) cytotoxins/hemolysins that undergo post-translational acylation on conserved lysine residues. Here, different mass spectrometry approaches were employed to analyze the structural features of FHA and to characterize the acylation status of the RTX toxins and their various hybrid molecules. First, the differential 16O/18O labeling revealed that the mature FHA proteins of B. pertussis (Bp-FHA) and the B. bronchiseptica (Bb-FHA) are processed at different sites, after Ala2348 and Lys2479 of the FhaB precursor, respectively. Second, the bottom-up proteomics of the...

Staphylococcus aureus d'origine communautaire (SARM-C) est responsable d'infections sévères comme la pneumonie nécrosante. La leucocidine de Panton-Valentine (PVL), l'Hémolysine-α(Hla) et la protéine A (Spa) sont les facteurs de virulence impliqués dans cette infection. L'analyse bibliographique montre que les polynucléaires neutrophiles (PNN) sont la principale cible de la PVL et que les α-défensines secrétées par les PNN peuvent neutraliser des toxines bactériennes. De plus, il est montré que des antibiotiques modulent la sécrétion des facteurs de virulence par S. aureus. Dans ce contexte, nous avons étudié l'effet des défensines sur la cytotoxicité de la PVL ainsi que l'effet des antibiotiques seuls et couplés aux défensines sur la production de PVL, Hla et Spa par des SARM-C. Nous montrons pour la première fois que les défensines peuvent diminuer la cytotoxicité de la PVL. Dans la deuxième partie du travail personnel, nous avons observé que l'effet de faibles concentrations d'antibiotique sur les SARM- C dépendait de l'antibiotique et du facteur de virulence. La clindamycine et le linézolide diminuent la PVL, Hla et Spa alors que la tigécycline supprime essentiellement la production de PVL. La daptomycine et la vancomycine n'ont pas d'effet. Nous avons démontré que l'effet des α-défensines couplé aux antibiotiques sur la virulence concerne essentiellement Spa. De façon intéressante, les α-défensines couplé aux antibiotiques ne diminuent pas la production de Spa pour le clone USA300 contrairement aux autres SARM-C, ce qui pourrait expliquer la sévérité de ses infections et son succès épidémique / Community Acquired Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (CA-MRSA) induce severe diseases such as necrotizing pneumonia. Panton-Valentine Leucocidin (PVL), Hémolysine-α(Hla) and protein A (Spa) are important virulence factors involved in this infection. The literature review shows that polymorphonuclear neutrophils (PMNs) are the target cells of PVL action in lungs and α-defensins secreted by PMNs have the capability to neutralize bacterial toxins. Moreover, low concentrations of antibiotic can modulate virulence factor production by S. aureus. In this context, the goal of this work was to study the impact of defensins on various cytotoxicity effects induced by PVL on human PMNs and to study the effect of antibiotics combined with defensins on the production of PVL, Hla and Spa by CA-MRSA. We show for the first time that α-defensins can decrease PVL toxicity mainly interacting with pore formation. Secondly, we show that low concentrations of antibiotic s’ effect on CA-MRSA virulence expression depend on the antibiotic and the virulence factor. Clindamycin and linezolid consistently suppress the expression of PVL, Hla and Spa by CA-MRSA, whereas tigecycline specifically suppress PVL expression. Daptomycin and vancomycin have no significant effects at these concentrations. For the first time, we demonstrate that the modulatory effect of α-defensins on virulence, in conjunction with antibiotics, mainly regards Spa production. Interestingly, antibiotics and defensins do not decrease Spa expression in USA300, unlike in other CA-MRSA clones. It could explain the severity of USA300 related infections and the spreading success of this CA-MRSA lineage