La réinitiation de la traduction est un mécanisme permettant de traduire des ORF qui sont présents dans la région leader de différents ARNm cellulaires (uORF). La majorité des cas de réinitiation de la traduction chez les eucaryotes concerne des uORF de petite taille. Des stratégies alternatives ont été développées, entre autres par les virus, afin de réinitier la traduction après un long uORF. Le virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) exprime un ARNm polycistronique codant la totalité des protéines virales. L’une d’entre elle, la protéine TAV (TransActivateur/Viroplasmine) est un facteur essentiel qui rend possible la réinitiation de la traduction après de longs ORF et qui, de plus, active la protéine kinase TOR. La sous-unité h du facteur d’initiation de la traduction eIF3, requise pour promouvoir la reinitiation après un petit ORF chez les plantes, a été identifiée comme étant une nouvelle cible de phosphorylation de la voie de signalisation de TOR. L’objectif principal de ma thèse a été d’élucider la fonction de la protéine eIF3h dans la réinitiation après un petit ORF ainsi que dans la réinitiation de la traduction, assurée par TAV, après un long ORF. Nous avons exploité les lignées transgéniques eif3h-1 d’Arabidopsis exprimant la protéine eif3h tronquée de son extrémité C-terminale, qui sont déficientes pour la réinitiation mais pas pour l’initiation de la traduction. Nous avons montré que la phosphorylation de eIF3h est essentielle pour stabiliser eIF3 au niveau des ribosomes durant l’élongation, ce qui favorise la ré-acquisition par le ribosome de facteurs nécessaires à la réinitiation de la traduction, et que la délétion de sa région Ct abolit son intégration dans le complexe eIF3. De plus, nous avons montré que eIF3h, la cible de la voie de signalisation de TOR, interagit avec S6K1. Des protoplastes préparés à partir des plantes mutantes eif3h-1 sont incapables de promouvoir la réinitiation après de longs ORF en présence de TAV. La surexpression de eIF3h, indifféremment de son état de phosphorylation, est indispensable pour restaurer la reinitiation assurée par TAV dans les protoplastes eif3h-1. Par ailleurs, les plantes eif3h-1 déficientes dans la réinitiation, sont résistantes à l’infection par le CaMV démontrant l’importance de eIF3h pour la réplication du CaMV. En revanche, ces plantes eif3h-1 peuvent être infectées par d’autres virus dont la traduction de l’ARN génomique est coiffe- ou IRES-dépendante. Ainsi, nos résultats suggèrent que eIF3h est un facteur de reinitiation important aussi bien pour la reinitiation après un petit qu’après un long ORF (controlée par TAV), et que TAV exploite cette machinerie cellulaire, et plus particulièrement TOR et eIF3h, pour exprimer ses propres protéines par réinitiation de la traduction. / Translation of mRNAs that harbor upstream open reading frames (uORFs) within their leader regions operates via a reinitiation mechanism. In plants, reinitiation is up regulated by the target of rapamycin (TOR) signaling via phosphorylation of the subunit h of initiation factor 3 (eIF3). The eif3h-1 mutant expressing the C-terminally truncated eIF3h while maintaining high translation initiation efficiency is not active in reinitiation. Cauliflower mosaic virus (CaMV) pregenomic polycistronic RNA is translated via an exceptional mechanism of reinitiation after long ORF translation under control of CaMV protein TAV, which ensures activation of TOR. To find the link between underlying mechanisms, we examined eIF3h function in cellular and viral context. Here we show that eIF3h, if phosphorylated, has a role in recruitment of eIF3 into actively translating ribosomes that is a prerequisite for formation of reinitiation-competent ribosomal complexes. C-terminal truncation of eIF3h abolished its integration into the eIF3 complex and eIF3 loading on polysomes as manifested by the eIF3 core subunit c. We also show that eIF3h as a putative target of TOR/S6K1 binds S6K1 in vitro. eIF3h phosphorylation is not required for eIF3 complex formation. We demonstrated that eIF3h is essential for TAV to activate reinitiation after long ORF translation. Protoplasts derived from eif3h-1 mutant failed to support TAV function in reinitiation, which is restored only upon overexpression of recombinant eIF3h indifferent to its phosphorylation status. eif3h-1 mutant defective in reinitiation was found resistant to CaMV infection suggesting that eIF3h is critical for virus amplification. In contrast, viruses that evolve translation initiation dependent on either cap or the internal ribosome entry site infect reinitiation deficient mutant. Thus, we conclude that TAV exploits the basic cell reinitiation machinery, particularly TOR and eIF3h, to overcome cellular barriers to reinitiation after long ORF translation.

Chez Arabidopsis, la protéine RISP est détournée par le virus CaMV pour assurer, ensemble avec la protéine virale TAV, la traduction de son ARN polycistronique. RISP a été identifiée comme une cible de la voie de signalisation de TOR et il a été montré que sa phosphorylation est requise pour promouvoir la réinitiation de la traduction activée par TAV. Les résultats que j’ai obtenus suggèrent que RISP, lorsqu’elle n’est pas phosphorylée, intervient ensemble avec eIF3, au niveau du complexe de pré-initiation 43S pour recruter le complexe ternaire grâce à l’interaction entre RISP et la sous-unité b du facteur eIF2. Il s’est avéré que RISP a la capacité, lorsqu’elle est phosphorylée, d’interagir non seulement avec la protéine ribosomique eL24 mais également avec eS6. Nos résultats indiquent que la liaison entre les sous-unités ribosomiques 60S et 40S sous l’effet de RISP, est régulée par la voie de TOR et qu’elle joue un rôle important dans le contrôle de la réinitiation de la traduction. / Many factors are required to recruit the tRNAi and a 60S ribosomal subunit to the 40S ribosomal subunit preinitiation complex. This recruitment is normally strictly limited during reinitiation of translation if factors recruited during the primary translation event are shed from 40S. However, factor retention can occur during long ORF translation if the CaMV viral factor TAV is present. RISP is a downstream target of TOR and found either within the 43S preinitiation complex, if bound to eIF3, and/or attached to 60S, if phosphorylated by TOR. We show here that RISP interacts with subunit b of eIF2 before phosphorylation. Critically, TOR activation up-regulates phosphorylation of both RISP and eS6 as well as the binding of both factors. Importantly, eS6-deficient plants are less active in TAV-mediated reinitiation and are thus less susceptible to CaMV infection. It is attractive to propose that eS6 phosphorylation contributes to retention and re-use of 60S during 40S scanning.

Chez les mammifères l’initiation de la traduction et, plus particulièrement, la formation du complexe eIF4F, est principalement régulée par la protéine kinase TOR (Target of rapamycin). Cette voie de régulation fait intervenir les protéines 4E-BP (eIF4E-binding proteins) dont l’activité est modulée par la phosphorylation par TOR. Sous leur forme non-phosphorylée, les 4E-BP se lient au facteur d’initiation eIF4E, empêchent son recrutement dans le complexe eIF4F et inhibent ainsi l’initiation de la traduction. Phosphorylées par TOR, les 4E-BP perdent leur affinité pour eIF4E et sont remplacées par eIF4G ce qui active la traduction. La régulation de l’initiation de la traduction par TOR via 4E-BP a été bien décrite dans plusieurs modèles eucaryotes, tels que la levure, les insectes et les mammifères, mais reste encore obscure chez les plantes. Les recherches réalisées au cours de ma thèse ont permis l’identification de deux protéines homologues de 4E-BP chez Arabidopsis. Ces protéines, que nous avons appelées ToRP1 et ToRP2 (TOR Regulatory Proteins), sont caractérisées par la présence d’un motif consensus indispensable pour la liaison à eIF4E, et qui existe chez les protéines 4E-BP des mammifères ainsi que chez eIF4G et eIFiso4G d’Arabidopsis. La protéine ToRP1 est capable d’interagir spécifiquement avec eIF4E, mais aussi avec TOR via son extrémité N-terminale en système double-hybride de levure. ToRP1 et ToRP2 ont également été caractérisées comme étant des cibles directement phosphorylées par TOR chez Arabidopsis. Deux sérines, en position 49 et 89 dans la protéine ToRP1, ont été identifiées comme des sites potentiels de cette phosphorylation. De plus, l’état de phosphorylation de ces sites affecte l’interaction avec eIF4E en système double-hybride de levure. Par ailleurs, des plants d’Arabidopsis déficients en ToRP1 et ToRP2 renforcent la traduction strictement coiffe-dépendante de l’ARNm CYCB1;1, alors que la surexpression de ToRP1 ou de ToRP2 réprime sa traduction. Ces résultats suggèrent donc que les protéines ToRP, identifiées chez Arabidopsis, sont de nouvelles cibles directes de TOR, qui, par leur phosphorylation, régule l’initiation de la traduction coiffe-dépendante. / The target of rapamycin (TOR) is an evolutionarily conserved kinase that is a critical sensor of nutritional and cellular energy and a major regulator of cell growth. TOR controls cap-dependent translation initiation, in particular the assembly of the eIF4F complex, by modulating the activity of eIF4E-binding proteins (4E-BPs). In their unphosphorylated state 4E-BP proteins sequester eIF4E and repress translation. Upon phosphorylation by TOR, 4E-BPs have a low affinity binding to eIF4E and are replaced by eIF4G thus activating translation initiation. 4E-BPs have been discovered in yeast and mammals but remain to be obscure in plants. Here, we identified and characterized two Arabidopsis proteins termed TOR Regulatory Proteins (ToRPs 1 and 2) that display some characteristics of mammalian 4E-BPs. ToRP1 and ToRP2 contain a canonical eIF4E-binding motif (4E-BM) found in mammalian 4E-BPs and Arabidopsis eIF4G and eIFiso4G. ToRP1 interacts with eIF4E, and, surprisingly, the N-terminal HEAT domain of TOR in the yeast two-hybrid system. ToRP1 and ToRP2 are highly phosphorylated at several phosphorylation sites in TOR-dependent manner in planta. Two of these phosphorylation sites have been identified as—S49 and S89—their phosphorylation status modulates ToRP1 binding to eIF4E in the yeast two-hybrid system. In plant protoplasts, ToRP2 can function as translation repressor of mRNAs that are strictly cap-dependent. Our results suggest that ToRPs can specifically bind the Arabidopsis cap-binding proteins (eIF4E/eIFiso4E) and regulate translation initiation under the control of TOR

Le cancer de vessie représente la sixième cause de mortalité par cancer en France. Son incidence a augmenté ces 20 dernières années, mais les taux de survie restent inchangés. La carcinogénèse vésicale fait intervenir différents mécanismes moléculaires qui agissent en réseau comme c’est le cas dans de nombreux cancers. Le développement récent de nouveaux traitements prenant spécifiquement pour cible certaines voies de signalisation apportent de nouveaux espoirs thérapeutiques. Nous nous sommes intéressés dans ce travail à trois axes de recherche pour tenter d’identifier, dans les carcinomes urothéliaux, de nouveaux marqueurs pronostiques moléculaires et de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles: l’angiogénèse, la voie de signalisation Hedgehog et les microARNs. Nous avons choisi la RT-PCR quantitative en temps réel à grande échelle permettant d’évaluer le niveau d’expression de nombreux gènes, avec une quantification précise et reproductible des transcrits. L’expression de ces gènes a été corrélée aux données de suivi clinique afin d’identifier de nouveaux biomarqueurs moléculaires prédictifs de l’évolution des tumeurs de vessie.Nous avons ainsi pu démontrer que les niveaux d’expression de certains de ces gènes variaient de façon significative dans les tumeurs de vessie, confirmant le rôle de l’angiogénèse dans la carcinogénèse urothéliale, et plus particulièrement de la voie du VEGF, et suggérant une implication majeure de la voie de signalisation Hedgehog et des microARNs. Par ailleurs, nous avons également pu identifier plusieurs biomarqueurs ayant une valeur pronostique en terme de survie globale dans les tumeurs infiltrantes. C’est le cas du VEGF, qui semble être un biomarqueur moléculaire particulièrement intéressant puisqu’il existe des thérapies ciblées spécifiquement dirigées contre ce ligand ou ses récepteurs avec plusieurs essais cliniques actuellement en cours dans le cancer de vessie. C’est également le cas d’une signature moléculaire associant 3 miARNs (miR-9, miR-182 et miR-200b) ayant une valeur péjorative dans les tumeurs infiltrantes, ouvrant la voie vers de nouvelles stratégies thérapeutiques.L’ensemble de ces études confirment l’intérêt majeur d’une meilleure compréhension des bases moléculaires de la carcinogénèse urothéliale vésicale débouchant sur l’utilisation rationnelle de nouvelles thérapies ciblées dans le cancer de vessie, avec l’espoir d’en améliorer la prise en charge et l’évolution. / Bladder cancer is the sixth cause of cancer mortality in France and its incidence is increasing since the last 20 years, with no improvement in survival outcomes. Bladder carcinogenesis involves different molecular mechanisms such as in many cancers. The recent development of new targeted therapies targeting signaling pathways provides new therapeutic hopes.In this work, we choose to study three molecular pathways in order to identify new prognostic markers and new therapeutic targets in urothelial carcinoma: angiogenesis, Hedgehog signaling pathway, and microRNAs. Real-time quantitative RT-PCR was performed to measure simultaneously expression levels of several genes with precise and reproductible RNA quantification. Our results were correlated with clinical outcomes to identify new molecular markers associated with bladder cancer evolution and to guide the potential use of targeted therapies.We were able to demonstrate that expression levels of several transcripts differ significantly in bladder tumors as compared to normal bladder and that some of them may have a prognostic implication. This is the case of VEGF, which appears to be an interesting molecular marker since there are targeted therapies specifically targeting the pathway and several ongoing trials in bladder cancer. The Hedgehog pathway also appears to be altered in bladder tumors, with a ligand-dependent activation. Then, we were able to identify several deregulated microRNAs and describe a molecular 3 miRNA-signature (miR-9, miR-182 and miR-200b) having a prognostic value in muscle-invasive bladder tumors. All these studies confirm the major interest of molecular biology and new targeted therapies in the treatment of bladder cancer, with the hope of improving management and evolution.

L'acide rétinoïque (AR) est un morphogène dérivé de la vitamine A, qui intervient dans le contrôle de l'organogenèse, de la prolifération et de la différenciation cellulaires chez les Chordés. Dans ce contexte, nous avons étudié les régulations spatio-temporelles de la voie de signalisation de l’AR au cours du développement de l’amphioxus, en mettant l'accent sur l’espèce européenne Branchiostoma lanceolatum.Nous avons tout d'abord inhibé ou activé la voie de signalisation de l’AR lors du développement embryonnaire en traitant des embryons d’amphioxus à des doses variables de composés pharmacologiques interférant avec le métabolisme des rétinoïdes. Grâce à l’utilisation d’outils mathématiques spécifiques, nous avons établi un schéma détaillé des effets des traitements effectués sur le développement du système nerveux central (SNC) et du pharynx chez l’amphioxus en nous basant sur l’expression de gènes marqueurs de tissus spécifiques. À l’issue de cette première analyse, nous avons par la suite étudié les effets d’une perturbation de la signalisation de l’AR à des points clés du développement chez l’amphioxus lors de la régionalisation du SNC et du pharynx. Nous avons ainsi montré que la voie de signalisation de l’AR intervient dans la régionalisation de l’axe antéro-postérieur via le contrôle des gènes hox dès le stade gastrula et jusqu’aux stades larvaires. En outre, nous avons réalisé l'étude préliminaire du gène homologue chez l’amphioxus du gène aldh1a2 des Vertébrés, et avons démontré que la régulation du niveau de synthèse de l’AR au cour du développement est conservée entre l’amphioxus et les Vertébrés. Finalement, nous avons montré que la voie de l’AR participe également à la morphogenèse caudale chez l’amphioxus, et que le mécanisme impliqué semble différent de celui proposé chez les Vertébrés où l’AR contrôle la structuration de la nageoire caudale par le ciblage des tissus mésenchymateux. / Retinoic acid (RA) is an endogenous vitamin A-derived morphogen. In this context, we studied the spatiotemporal roles of RA signaling in amphioxus development, focusing on the European amphioxus species: Branchiostoma lanceolatum. We first created excess and insufficiency models of RA signaling by exposing amphioxus embryos to series of doses of different pharmacological compounds targeting either the RA receptors or the RA metabolism machinery. By introducing the important mathematical concept of a Cartesian coordinate system founded by René Descartes, we created detailed diagrams of the concentration-dependent defects caused by RA signaling in the central nervous system (CNS) and pharynx of amphioxus by evaluating the statistical significances of tissue-specific marker gene expression in labeled embryos. This analysis yielded a very detailed description of the sensitivities of the developing amphioxus CNS and pharynx to altered RA signaling levels. Following this initial challenge, we correlated the effects of altered RA signaling levels with key amphioxus developmental stages characterized by structural transitions in CNS and pharynx. We show that hox-mediated RA signaling in axial patterning is active beyond the gastrula stage and might be maintained until at least early larval stage, with possible roles in more regionalized axis formation and organ induction. In addition, we carried out a preliminary study on a RA synthesizing gene in amphioxus, called aldh1a, a possible homolog of the vertebrate aldh1a2 gene, demonstrating that the feedback between RA signaling and RA synthesizing levels has emerged before the split of the cephalochordate and vertebrate lineages. Moreover, we are able to show that RA signaling also participates in tail fin morphogenesis in amphioxus by a mechanism that is probably not comparable to that in vertebrates, where RA modulates caudal fin patterning through targeting mesenchymal derivatives.

Les canaux potassiques à deux domaines pore (K2P) sont des régulateurs principaux de l’excitabilité cellulaire car ils jouent un rôle central dans l’établissement et le maintien du potentiel de repos des cellules animales. Malgré leur rôle fondamental, peu d’informations sont connues sur les processus cellulaires qui contrôlent la fonction des canaux K2P in vivo. En particulier, nous ne connaissons que quelques facteurs qui contrôlent directement le nombre, l’activité et la localisation des K2P à la surface des cellules.Durant ma thèse, j’ai utilisé des stratégies d’ingénierie du génome que j’ai associé à des approches génétiques afin de caractériser le canal potassique EGL-23. Pour cela, j’ai réalisé un crible suppresseur du phénotype de défaut de ponte du mutant egl-23(n601) et un crible visuel sur le rapporteur fluorescent traductionnel egl-23::TagRFP-T. Grâce au reséquençagecomplet du génome, j’ai pu cloner 4 gènes impliqués dans la régulation du canal EGL-23. / Two-pore domain potassium channels (K2P) are major regulators of cell excitability, playing a central role in the establishment and maintenance of the resting potential of animal cells. Despite their fundamental role, little is known about the cellular processes that control K2P channels function in vivo. In particular, we know only few factors that directly control thenumber, activity, and localization of K2P on the cell surface.During my thesis, I used state-of-the art genome engineering technologies combined with genetic approaches to characterize the C. elegans potassium channel EGL-23. For this, I realized a phenotypic suppressor screen of the egg-laying defective mutant egl-23(n601) and a visual screen on an egl-23 translational fluorescent reporter. Using whole genome sequencing, I was able to clone for new genes involved in EGL-23 regulation

Comment la taille d'un organisme est-elle régulée au cours du développement embryonnaire ? Quels sont les mécanismes génétiques à l'origine de l'arrêt de la prolifération pendant la croissance d'un organisme pluricellulaire ? Afin d'identifier des acteurs de la sortie du cycle cellulaire au cours du développement, mon travail s’est orienté sur l’étude de gènes suppresseurs de tumeurs pendant la croissance du toit optique (TO) du médaka Oryzias latipes. Le TO, structure dorsale du cerveau moyen des Vertébrés, est un modèle particulièrement adapté à l’étude de la régulation de la prolifération. Trois zones de la marge vers le centre du TO sont discernables : une zone périphérique de prolifération, une zone intermédiaire de cellules sortant du cycle cellulaire et une zone centrale de cellules différenciées. Un crible d'expression par hybridation In Situ a été réalisé et a permis d'identifier 28 gènes exprimés dans le TO, suggérant leur implication dans le contrôle de la sortie du cycle cellulaire au cours du développement. Dans le but de caractériser in vivo la fonction de gènes issus de ce crible, le gène BTG1 (B-cell Translocation Gene 1) et les membres de sa famille, ont été étudiés au cours du développement du médaka. J’ai mené des expériences fonctionnelles sur BTG1, permettant de mettre en évidence son rôle central pour la morphogenèse du système nerveux central. De plus, une autre partie de mon travail s’est penchée sur l’étude de l’expression des membres de la voie de signalisation Hippo, bien connue et caractérisée chez la drosophile et les Mammifères pour son rôle dans le contrôle de la taille des organes via une régulation de l’arrêt de la prolifération. A l’issu de notre travail, une fonction de la voie de signalisation Hippo dans la formation du TO et des somites a pu être mise en évidence au cours du développement du médaka. / How is an organisms’ size regulated during embryonic development? What are the genetic mechanisms that control the proliferation arrest during multicellular organisms growth? In order to identify a cell cycle exit developmental actor genes, I have analysed the role of tumor suppressor genes (TSGs) in the optic tectum (OT) of the medaka Oryzias latipes. This structure is particularly suited for this kind of studies because, during its morphogenesis, there is a strict correlation between the position of a cell and its degree of differentiation. 3 zones can be easily distinguished from the border to the center: a marginal zone made of proliferative cells, an intermediate zone in which cells exit the cycle, and a central zone made of postmitotic cells. Using this criterium, I have performed an in situ hybridization expression screen on 150 TSGs on medaka embryos. The expression patterns of 28 TSGs in the OT suggest their implication in the OT proliferation arrest mechanisms. I focused my study on the BTG1 gene, implicated in many cancers, and for which few developmental data are available. A functional analysis on developing medaka embryos has been performed and permitted to highlight the essential role of BTG1 in central nervous system morphogenesis. Furthermore, I performed an expression study on Hippo signalling pathway components. Hippo pathway is well caracterised for its organ size control function in drosophila and Mammals. Our results show that this pathway could act in OT formation and somitogenesis in medaka fish.

Les leucémies aigües lymphobastiques (LAL) représentent un tiers des leucémies et constituent le cancer pédiatrique le plus fréquent chez l’enfant. Les LAL de type T (LAL-T)sont caractérisées par l’expansion anormale de progéniteurs de lymphocytes T. Aujourd’hui,la réponse curative aux traitements est proche de 80% chez l’enfant et 50% chez l’adulte. La rechute reste donc fréquente et souvent de mauvais pronostic. Pour ces raisons,l’identification de nouvelles voies de signalisation en vue de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques est cruciale afin d’améliorer le traitement des LAL-T.Les résultats précédents du laboratoire ont révélé l’activation soutenue de la voie calcineurine (Cn)/NFAT dans des échantillons humains de lymphomes et de LAL, ainsi que dans des modèles murins de ces pathologies. Le laboratoire a ensuite montré que Cn est intrinsèquement requise pour la capacité des cellules leucémiques de LAL-T à propager la maladie (activité LIC « Leukemia Initiating Cells ») dans un modèle murin de LAL-T induit parun allèle activé de NOTCH1 (ICN1). Puisque l’inhibition pharmacologique de Cn induit de nombreux effets secondaires, la recherche de cibles thérapeutiques en aval de Cn constitue un axe de recherche important. J’ai participé à une étude du laboratoire montrant que l’expression à la surface cellulaire de CXCR4 est régulée par Cn et requise pour la migration des cellules de LAL-T, mais non suffisante pour rétablir le potentiel de ré-initiation suggérant que d’autres effecteurs doivent être impliqués dans cette activité.Les facteurs de transcription NFAT (NFAT1, NFAT2 et NFAT4) sont des effecteurs importants de Cn en réponse à la signalisation calcique lors du développement des thymocytes, mais également dans les lymphocytes T. L’essentiel de ce travail de thèse a utilisé des LAL-T induites par ICN1 dans lesquelles l’inactivation génique des trois facteurs NFAT par recombinaison homologue. Nous avons ainsi montré que (i) les facteurs NFAT sont requis en aval de Cn pour le potentiel LIC des LAL-T-ICN1 in vivo, (ii) leur inactivation altère la survie, la prolifération et la migration des cellules de LAL-T in vitro, (iii) NFAT1,NFAT2 et NFAT4 ont une fonction largement redondante dans les LAL-T. Nous avons également par une approche transcriptomique identifié deux gènes dont l’expression estsous contrôle des facteurs NFAT et impliqués dans la régulation de la survie et de la prolifération des LAL-T in vitro : CDKN1A et MAFB.Tout comme la voie Cn/NFAT, les CaMKs sont des protéines kinases activées en aval de la signalisation calcique dans les lymphocytes T. Nous avons montré par une approche pharmacologique que l’inhibition des CaMKs dans les LAL-T-ICN1 in vitro altère la survie etla prolifération des cellules leucémiques. L’inhibition spécifique par une approche d’ARN interférence de deux isoenzymes CaMKIIγ et CaMKIIδ suggèrent que ces protéines jouent dans le maintien des cellules leucémiques in vitro. / T cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is an aggressive malignancy of T cell progenitors. Despite initial response to chemotherapy, relapses remain frequent in children and adults. Previous results identify sustained activation of Calcineurin (Cn)/NFAT signaling pathway in human T-ALL and murine T-ALL models. Importantly, they also demonstrated Cn is essential for T-ALL Leukemia Initiating Cells (LIC) activity in a murine model of T-ALL induced by an activated allele of NOTCH1 (ICN1). Since pharmacologic inhibition of Cn induces side effects, we aim to identify downstream effectors involved in T-ALL. NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) factors play crucial roles downstream Cn during development and activation of T cells. To address their role in T-ALL, we generated mouse ICN1-induced T-ALL in which NFAT genes can be inactivated either single or in combination following Cre-mediated gene deletion. We demonstrated that (i) NFAT factors are required downstream Cn for LIC activity in T-ALL in vivo (ii) ex vivo NFAT factors deletion alters survival, proliferation and migration of T-ALL (iii) NFAT1, 2 and 4 have a largely redundant function in T-ALL. Moreover, the NFAT-dependant transcriptome allowed to identify important targets (CDKN1A, MAFB) involved in T-ALL survival and proliferation in vitro. Calmodulin-dependant kinases (CaMK) are kinases activated by calcium signaling in T cells. We showed that pharmacologic inhibition of CaMKs in ICN1-induced T-ALL alters survival and proliferation of T-ALL in vitro. Beside, specific inhibition by RNA interference of CaMKIIg and CaMKIId suggests a putative role of these kinases in T-ALL maintenance.

La Ténascine-C (TNC) est un composé majeur de la matrice extracellulaire tumorale et sa forte expression est directement corrélée à l’angiogenèse tumorale et au processus métastatique. Lors de ma thèse j’ai pu démontrer que la TNC dérégulait DKK1, un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt et par ce biais augmentait l’activité de cette voie impliquée dans la cancérogenèse. La diminution de la formation des fibres de stress en présence de TNC est l’un des mécanismes majeurs qui contribue à la diminution de DKK1. L’activité de MKL1, facteur co-transcriptionnel de SRF et régulable par l’actine, s’avère diminuée en présence de TNC. Mes données indiquent que la fonction de MKL1 n’est peut-être pas le mécanisme majeur de la régulation de DKK1 par la statu de l’actine. D’autres facteurs, probablement liés aux fibres de stress d’actine pourraient être impliqués. L’augmentation de l’activité de la voie de signalisation Wnt, dépendante de DKK1, est probablement le mécanisme majeur par lequel la TNC active la progression tumorale. Cette étude a permis de mettre en évidence un nouveau mécanisme de régulation de DKK1 faisant intervenir l’intégrité du cytosquelette d’actine. / Tenascin-C (TNC) is a major component of the tumor specific extracellular matrix and its expression has been linked to tumor angiogenesis and metastasis. I demonstrated that TNC downregulates the expression of the Wnt signalling inhibitor DKK1 and by that enhances Wnt/-catenin signalling. Reduced stress fibre formation in the presence of TNC was identified as a major mechanism contributing to DKK1 downregulation. The activity of the actin-regulated SRF co-transcription factor MKL1 was found to be reduced in the presence of TNC. My results indicate that TNC-regulated MKL1 function maybe one, but not the major mechanism of DKK1 regulation by the actin status and that other factors, presumably regulated by actin stress fibres, are involved. Enhanced Wnt signalling activity downstream of TNC-induced DKK1 downregulation might be a major mechanism by which TNC promotes tumor progression. Furthermore, this study discovered a novel mechanism of regulating the Wnt inhibitor DKK1 by the integrity of the actin cytoskeleton.

Les bactéries commensales digestives jouent un rôle primordial dans l'homéostasie épithéliale et la santé de l'hôte, avec notamment un rôle modulateur du système immunitaire. Des effets bénéfiques dans le traitement des pathologies inflammatoires intestinales ont été caractérisés chez certaines souches de bactéries commensales. La compréhension de ces effets dans le maintien de l'homéostasie intestinale repose sur la connaissance des interactions entre les bactéries, l'épithélium intestinal et le système immunitaire muqueux. Streptococcus salivarius est l'un des premiers colonisateurs de la cavité buccale et du tractus digestif de l'homme. Cette bactérie a été utilisée comme modèle pour rechercher des mécanismes impliquée dans l'homéostasie.La recherche d'interactions entre des souches de l'espèce S. salivarius et les cellules humaines a été réalisée pour caractériser leurs éventuelles propriétés immunomodulatrices. Nous avons montré que les bactéries vivantes et les surnageants de cultures des souches de cette espèce modulent la réponse inflammatoire in vitro via un effet inhibiteur sur l'activation de la voie NF-B dans les cellules épithéliales intestinales (HT-29 et Caco-2) et les monocytes (THP-1). Cette modulation de l'inflammation a été confirmée par la capacité des surnageants bactériens à inhiber la sécrétion d'IL-8 par les cellules épithéliales. Ces surnageants agissent via une étape impliquant IB-, un inhibiteur du facteur NF-B. Ils inhibent la dégradation de la protéine IB- phosphorylée et diminuent ainsi la translocation nucléaire des composants NF-B. Nous avons également identifié et caractérisé un métabolite bactérien présent dans ces surnageants exerçant cette activité anti-inflammatoire. L'utilisation de ce métabolite et son isomère miment in vitro l'effet inhibiteur des surnageants sur l'activation de la voie NF-B dans les cellules épithéliales et les monocytes. Nous avons ainsi caractérisé un métabolite secrété par la bactérie commensale S. salivarius qui est capable d'inhiber une des voies centrales de signalisation impliquée dans la réponse inflammatoire intestinale. Enfin, une capacité anti-inflammatoire de S. salivarius a également été montrée dans un modèle murin d'inflammation digestive dans lequel les bactéries métaboliquement actives ont protégé les animaux de colites induites avec du TNBS. Ces travaux ouvrent la voie pour le développement d'applications thérapeutiques dans le traitement de pathologies inflammatoires de l'intestin basées sur ce composé actif ou l'utilisation de S. salivarius comme probiotique.