L'épithélium intestinal est un tissu en perpétuel renouvellement. Ceci met en jeu des cellules souches adultes, localisées à la base des villosités dans les cryptes intestinales, qui donnent naissance à des progéniteurs prolifératifs. Le contrôle de la prolifération des cellules souches et des progéniteurs est un facteur clé du maintient de l'homéostasie du tissu. La principale voie de signalisation qui régule cette prolifération est la voie Wnt. <br />Les hormones thyroïdiennes (HT) agissent par l'intermédiaire de récepteurs nucléaires. Des travaux menés précédemment dans l'équipe ont montrés que TRα1 est le récepteur aux HT qui contrôle la prolifération des cellules des cryptes intestinales.<br />Durant mon travail de thèse j'ai montré l'importance de TRα1 et des HT dans le contrôle de l'expression de différents partenaires de la voie Wnt, ainsi que dans l'initiation de pathologiques hyperprolifératives de l'intestin chez la souris.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les β-arrestines (Arrbs) régulent diverses voies de signalisation dont la voie Wnt/β-caténine (Wnt), un acteur clé dans le cancer colorectal. Le but de mon projet était d'étudier l'implication et les mécanismes régulés par les Arrbs dans la tumorigenèse intestinale dépendante de la voie Wnt. L'inhibition de l'expression des Arrbs partielle ou totale dans des souris ApcΔ14/+ montre que seules les souris invalidées pour l'Arrb2 développent 33% des tumeurs détectées chez les souris ApcΔ14/+ ; Arrb2+/+. Ces tumeurs ont une croissance normale. Cependant, l'analyse de leur transcriptome montre qu'elles expriment notamment certains gènes liés au système immunitaire, alors que les tumeurs dépendantes de l'Arrb2 expriment des gènes différents impliqués entre autres dans la voie Wnt. L'invalidation de l'Arrb2 réduit l'expression de gènes cibles de la voie Wnt dans les cellules isolées de 12 sur 18 tumeurs de souris ApcΔ14/+, et inhibe l'augmentation d'activité Wnt et la formation de colonies en agar mou induite par l'invalidation d'Apc dans des cellules murines ApcMin/+. L'Arrb2 est donc essentielle pour l'initiation et la croissance des tumeurs intestinales présentant une activité Wnt élevée. Pour comprendre les mécanismes régulés par l'Arrb2 dans ce contexte, les complexes protéiques associés à l'Arrb2 ont été analysés par protéomique dans des cellules humaines de cancer colorectal SW480 exprimant ou non un dominant négatif de Tcf4. 132 partenaires de l'Arrb2 potentiellement imbriqués dans un réseau de 917 protéines, ont été identifiés dans les cellules où la voie Wnt est active. Une baisse de 80% de l'activité Wnt entraine la disparition de 41 protéines avec 256 interactions potentielles alors que 42 protéines apparaissent avec 244 interactions potentielles. Le rôle clé d'Arrb2 dans le cancer colorectal s'expliquerait par la connexion d'au moins une quarantaine de protéines dépendantes de l'activité Wnt à un réseau de signalisation complexe dont l'analyse est en cours. / Β-arrestins (Arrbs) participate in the regulation of multiple signaling pathways, including Wnt/β-catenin (Wnt), the major actor in human colorectal cancer. The aim of my project was to study the involvement of Arrbs and the mechanisms they regulate in Wnt-dependent intestinal tumorigenesis. The partial or total inhibition of Arrbs in ApcΔ14/+ mice showed that only mice with Arrb2 depletion developed only 33% of the tumors detected in their Arrb2-WT littermates. These remaining tumors grow normally and are Arrb2–independent. Transcriptomic analysis showed that they overexpressed genes that reflect a high interaction with the immune system, whereas those overexpressed in Arrb2–dependent tumors are predominantly involved in Wnt signaling. Moreover, Arrb2 siRNAs decreased the expression of Wnt target genes in cells isolated from 12 of 18 tumors from ApcΔ14/+ mice, completely reversed the increased Wnt activity and colony formation in soft agar induced by Apc siRNA treatment in ApcMin/+ cells. Therefore, Arrb2 is essential for the initiation and growth of intestinal tumors displaying elevated Wnt pathway activity. To better understand the mechanisms involved in this context, Arrb2 protein complexes were analyzed by a differential systematic proteomic approach in SW480 human colorectal carcinoma cells expressing or not a Tcf4 dominant negative. 132 Arrb2 partners potentially involved in a signaling network of 917 proteins were identified in cells with a high Wnt activity. Upon a 80% decrease of this activity 41 partners disappeared with their 256 potential interactions whereas 42 partners appeared with 244 new possible interactions. Arrb2 key role in colorectal cancer could be explained by the cross-talk of about 40 proteins dependent of Wnt activity with a highly complex signaling network that is currently analyzed.

Les tumeurs cortico-surrénaliennes bénignes et malignes sont associées à une morbidité élevée résultant de l’hypersécrétion des hormones cortico-surrénaliennes, retrouvée chez près de 60% des patients. Au delà des perturbations endocrines, les carcinomes cortico-surrénaliens (CCS) sont des tumeurs de mauvais pronostic avec 16 à 38% de survie à 5 ans. Cette agressivité résulte à la fois de la présence de métastases chez de nombreux patients, au moment du diagnostic (30 à 40% des cas) et de l’absence d’approches thérapeutiques, au delà de la résection chirurgicale de la tumeur primaire. Au début de ma thèse, les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement des tumeurs bénignes et malignes de la cortico-surrénale, étaient largement méconnus. L’activation anormale de la voie de signalisation Wnt/ßcaténine dans 48% des tumeurs bénignes et 37% des tumeurs malignes, suggérait que cette voie pouvait, comme dans d’autres tissus, participer au développement tumoral dans la cortico-surrénale. Afin de confirmer cette hypothèse, nous avons développé et caractérisé un modèle de souris transgéniques dans lesquelles la ßcaténine est constitutivement activée, spécifiquement dans le cortex surrénalien (souris ∆Cat). Grâce à ces souris, nous avons démontré pour la première fois que la ßcaténine agit comme un oncogène dans la cortico-surrénale, mais que son activation constitutive ne suffit pas à déclencher systématiquement le développement de tumeurs malignes. Chez plus de 90% des patients, la formation des CCS est associée à la surexpression du facteur de croissance IGF2. Grâce à des modèles de souris transgéniques qui surexpriment Igf2, nous avons pu montrer que cette surexpression n’a que peu d’effet sur l’initiation ou la progression tumorale, suggérant que d’autres altérations sont requises pour favoriser la transition maligne. Des résultats préliminaires encourageants suggèrent que la surexpression de l’histone méthyl-transférase EZH2 et les altérations épigénétiques résultantes, pourraient être la clé du développement des CCS. Parallèlement, nous avons montré que l’activation constitutive de la ßcaténine conduit au développement d’un hyperaldostéronisme primaire chez les souris ∆Cat, suggérant que l’activation de la voie Wnt/ßcaténine pourrait participer à la formation d’adénomes surrénaliens producteurs d’aldostérone (APA) chez les patients. Effectivement, nous avons mis en évidence que l’activation constitutive de la ßcaténine est l’altération moléculaire la plus fréquente dans les APA, avec une prévalence de 68%. Des analyses in vitro m’ont permis de montrer que la ßcaténine stimule la production d’aldostérone en contrôlant directement et indirectement l’expression de deux enzymes clés de la synthèse d’aldostérone – CYP21 et CYP11B2 – et du récepteur à l’angiotensine II (le sécrétagogue naturel de l’aldostérone), AT1R. Nous avons par ailleurs montré que la production excessive d’aldostérone chez les souris ∆Cat, pouvait être maîtrisée par un régime enrichi en quercétine, un inhibiteur naturel de l’activité transcriptionnelle de la ßcaténine. L’ensemble de ces résultats démontre l’importance de la voie Wnt/ßcaténine dans la tumorigenèse surrénalienne et dans l’hypersécrétion d’aldostérone ce qui fait d’elle une nouvelle cible thérapeutique potentielle. / Benign and malignant adrenocortical tumours are associated with a high morbidity caused by the hypersecretion of adrenocortical hormones found in approximately 60% of patients. Moreover, adrenocortical carcinomas (ACC) have poor prognosis with a 5 years survival rate of 16 to 38%. This aggressiveness results from both the presence of metastases at diagnosis in most patients (30 to 40% of cases) and the absence of therapeutic approaches apart from surgical resection of primary tumours. At the start of my thesis, the molecular mechanisms involved in the development of benign and malignant adrenocortical tumours were largely unknown. Abnormal activation of the Wnt/ßcatenin pathway found in 48% of benign tumours and 37% of malignant tumours suggests that as in other tissues, this pathway could participate in tumour development in the adrenal cortex. To confirm this hypothesis, we developed and characterized a transgenic mouse model with constitutive activation of ßcatenin, specifically in the adrenal cortex (∆Cat mice). With this model, we demonstrated for the first time that ßcatenin acted as an adrenocortical oncogene but that this activation was insufficient to systematically induce the development of adrenocortical carcinomas. In almost 90% of patients, CCS formation is associated with the overexpression of the growth factor IGF2. However, the development of a model of Igf2 overexpression in transgenic mice, allowed us to demonstrate that this overexpression could not initiate tumour formation and that it had a mild effect on tumour progression. This suggested that other alterations were necessary for malignant progression. Our encouraging preliminary results suggest that upregulation of the histone methyltransferase EZH2 and the resulting epigenetic defects could be the cause of ACC development. In parallel, we demonstrated that constitutive ßcatenin activation induced primary hyperaldosteronism development in ∆Cat mice suggesting that aberrant activation of the Wnt pathway could be involved in formation of aldosterone-producing adenomas (APA) in patients. Indeed, we showed that constitutive activation of ßcatenin was the most frequent molecular alteration in APA with a prevalence of 68%. In vitro analysis allowed us to demonstrate that ßcatenin stimulates aldosterone production by controlling directly and indirectly the expression of two key enzymes of aldosterone synthesis –CYP21 and CYP11B2- and of the angiotensin II receptor, AT1R. Furthermore, we showed that excessive aldosterone production in ∆Cat mice could be controlled by a diet enriched in quercetin, a natural inhibitor of the transcriptional activity of ßcatenin. Altogether these results demonstrate the essential role of the Wnt/ßcatenin pathway in adrenocortical tumorigenesis and aldosterone secretion. Consequently, this pathway could be a new potential therapeutic target for the treatment of most adrenal tumours.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) présente des mutations génétiques qui altèrent les principales voies de signalisation, notamment la voie Wnt/β-caténine. En absence de mutation génétique, certains CHC peuvent montrer une activité Wnt exacerbée suite à une inactivation épigénétique d’inhibiteurs ou à une surexpression de ligands Wnts ou de ses récepteurs. De plus, le remodelage de la matrice extracellulaire favorise la progression du CHC. Nous avons montré une association entre l’activation du signal Wnt et le remodelage de la matrice extracellulaire (MEC) dans les cirrhoses et le CHC. Puis modélisé in vitro, les effets des stimuli Wnt extracellulaires sur le phénotype de cellules hépatiques, en absence de mutation de la β-caténine. En effet, les cellules HepaRG ne présentent pas de mutations de la β-caténine, de l’axine et de p53. Ainsi, la stimulation Wnt3a des cellules HepaRG induisait la formation de palissades de cellules fusiformes. De plus, les cellules traitées exprimaient des taux élevés de αSMA, COLIV, c-MYC, CK19 et LGR5 suggérant un phénotype myofibroblastique, en accord avec l’expression des marqueurs de transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), SNAIL et TWIST. Ces données sont en faveur du rôle déterminant du microenvironnement Wnt activé dans la progression du CHC entrainant les cellules vers un phénotype progéniteur plus agressif via une TEM. En outre, l'analyse in silico de la signature transcriptomique de l'activation non mutationnelle de la voie Wnt a révélé un réseau de gènes impliqués dans le remodelage de la MEC, la TEM et la différenciation cellulaire. Les résultats suggèrent le rôle de HAPLN1 qui affecterait la migration cellulaire et l'expression des gènes de la MEC. De plus, LGR5 semble favoriser la dédifférenciation des hépatocytes. Au total, 8 gènes marqueurs obtenus in vitro ont été validés in vivo dans une série de 81 CHC humains, par qPCR et immunohistochimie en utilisant des tissus micro-array (78 CHC et 5 foies contrôles). Au total, l'ensemble des données suggère que HAPLN1 a une valeur pronostique sur la récidive et la survie globale du CHC. HAPLN1semble être indépendant du statut mutationnel la β-caténine et des variables cliniques. De plus, sa valeur pronostique est additive avec celle de CK19 + EpCAM et il semble agir en synergie avec NOG. / Hepatocellular carcinoma (HCC) displays signaling pathway disorders, including Wnt/β-catenin. Up-regulation of extracellular Wnt pathway agonists and down-regulation of extracellular Wnt pathway inhibitors result in non-mutational activation of Wnt signaling. In addition, increased extracellular matrix remodeling fosters HCC progression. Thus, we showed that enhanced Wnt signaling is associated with extracellular matrix remodeling in human cirrhosis and cancer. To further investigate non-mutational Wnt pathway activation, we established a model of Wnt activation in HepaRG human HCC progenitor cells carrying wild-type β-catenin, axin and p53. HepaRG progenitor cells treated with Wnt3a became fusiform and grew in palisades with enhanced expression of αSMA, COLIV, CK19, c-MYC, LGR5, SNAIL and TWIST, suggesting that enhanced extracellular Wnt signaling may drive HCC cells toward a more aggressive progenitor and epithelial mesenchymal transition (EMT) phenotype. Moreover, in silico analysis of the transcriptomic signature of non-mutational Wnt activation revealed a gene network involved in ECM remodeling, EMT and cell fate. Results suggest a role of HAPLN1, affecting extracellular matrix gene expression and cell migration and of LGR5 in hepatocyte dedifferentiation. Eight genes among the HepaRG gene expression dataset were validated in vivo in a collection of 81 human HCC samples and controls by qPCR and immunohistochemistry using tissue micro-arrays (78 HCC samples and 5 normal livers) in the light of β-catenin activation and mutational status. In conclusion, data suggest that HAPLN1 has a prognostic value on overall survival and recurrence of HCC. HAPLN1 appears to be independent of clinical features and β-catenin mutationnal status. Moreover, HAPLN1 appears to have an additive prognostic value with CK19 + EpCAM and act synergistically with NOG.

Les carcinomes de la cortico-surrénale (CCS) sont des tumeurs de mauvais pronostic et les thérapies sont encore limitées. La chirurgie reste à ce jour le seul traitement efficace. La compréhension des mécanismes de la tumorigenèse cortico-surrénalienne et l'identification des gènes et des voies de signalisation impliquées sont nécessaires pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Ces dernières années, plusieurs études de génomique ont été réalisées sur des cohortes indépendantes de CCS et ont mis en évidence l'existence de deux groupes de CCS ayant des profils d’expression génique particuliers et associés à des pronostics de survie différents. Il a aussi été identifié de fréquentes mutations touchant les gènes TP53 et CTNNB1 (β-caténine). De plus, l'activation aberrante de la voie WNT/β-caténine est associée au groupe des CCS agressifs. Enfin, des analyses des altérations génomiques par puce SNP et le séquençage de l’exome de cohortes de CCS a permis de préciser les fréquences des mutations de TP53 (~18%) et CTNNB1 (~14%) mais a aussi mis en évidence des mutations et des délétions homozygotes au niveau du gène ZNRF3 (Zinc And Ring Finger 3) dans environs 20% des CCS. ZNRF3 a été montré comme jouant un rôle de régulateur négatif de la voie WNT/β-caténine. Par conséquent, la voie de signalisation WNT/β-caténine est la voie la plus fréquemment altérée dans les CCS (~40%). L’objectif de mon projet était d’étudier comment l’activation constitutive de la voie WNT/β-caténine pouvait participer à la tumorigenèse cortico-surrénalienne, puis d'essayer de comprendre plus spécifiquement le rôle des altérations de ZNRF3 dans le développement et/ou l'agressivité des CCS. En combinant des analyses de transcriptomes de modèles cellulaires et de cohortes de CCS, nous avons établi une signature robuste cortico-surrénalienne de l'activation de la voie WNT/β-caténine. Parmi les gènes de cette signature, nous avons montré que AFF3 était une cible transcriptionnelle de la β-caténine et qu'il était capable de transmettre en partie les effets oncogèniques de la voie WNT/β-caténine dans les cellules cortico-surrénaliennes. En effet, son invalidation entraîne l'apoptose et diminue la prolifération des cellules cortico-surrénaliennes à l'image de l'invalidation de la β-caténine. La surexpression d’AFF3 altère l’organisation des speckles nucléaires et la localisation de CDK9/CyclinT1 impliqués respectivement dans l'épissage des ARNm et la transcription des gènes. ZNRF3 est le gène le plus fréquemment altéré dans les CCS alors qu'il l'est très peu dans les autres types de cancers. ZNRF3 est une E3 ubiquitin ligase qui entraîne l'internalisation et la dégradation des récepteurs Frizzleds de la voie WNT. Nous avons montré que ZNRF3 agit bien comme un gène suppresseur de tumeur dans les cellules cortico-surénaliennes humaines H295R. En effet la surexpression de ZNRF3 diminue la prolifération et augmente l’apoptose cellulaire de ces cellules. Nous avons aussi montré qu'à l'image d'autres régulateurs négatifs de la voie WNT comme AXIN2, ZNRF3 est un gène cible de la voie WNT/β-caténine dans la corticosurrénale. De manière intéressante, les altérations du gène ZNRF3 ne sont pas retrouvées dans des tumeurs présentant une forte activation de la voie de signalisation WNT/β-caténine, suggérant l'implication d'autres voies de signalisation. Nous avons identifié des partenaires protéiques de ZNRF3 par des expériences d'immunoprécipitation / spectrométrie de masse. Nous avons montré que ZNRF3 interagit avec la sous unité catalytique de la pompe NA+/K+, ATP1A1. Cette interaction altère le fonctionnement de la pompe NA+/K+ conduisant à des modifications du flux de Ca2+ intracellulaire. L'ensemble de ces travaux a permis de mieux comprendre comment la voie WNT/β-caténine participe à l'agressivité des cancers de la corticosurrénale et de montrer qu'AFF3 est essentiel pour les effets oncogéniques de cette voie. (...) / Adrenocortical carcinomas are rare tumors with poor prognostic and limited therapy. Up to now, surgery remains the only curative therapy. A better understanding of tumor biology and molecular prognostic factors would help to select relevant therapeutic targets and to develop innovative therapeutic strategies. In the last years, different genomic studies on independent cohorts of ACC have identified two subgroups of cancers with two distinguished profiles of genes expression and two different survival rates. Frequents alterations of CTNNB1 and TP53 are identified in ACC. Moreover, aberrant activation of WNT/β-catenin pathway in ACC is associated with lower overall survival. Using a combination of genomic approaches, we and others have recently analyzed independent cohorts of ACC. These works confirmed recurrent alterations in CTNNB1 (~14%) and TP53 (~18%), but also revealed new loci not previously reported to be altered in ACC. Strikingly, ZNRF3 (zinc and ring finger 3) was the most frequently altered gene (~20%). ZNRF3 encodes a protein that acts as a negative regulator of Wnt/β-catenin pathway. The Wnt/β-catenin pathway represents the most frequently altered pathway in ACC (~40%). The aim of my project was to study how the aberrant activation of WNT/β-catenin pathway could participate to adrenal tumorigenesis and then to identify more specifically the role of ZNRF3 alterations in development/aggressiness of ACC. By a combination of transcriptomic analysis on two cohorts of ACC and on H295R adrenocortical cells, we identified a list of genes whose expression is correlated to the WNT/β-catenin activation. Among these genes, we show that AFF3 is essential to mediate the effect of activation the WNT/β-catenin pathway in adrenocortical cancer. Indeed, AFF3 is a direct target gene of β-catenin and its silencing in H295R adrenocortical cells induces a decreased cell proliferation and an increased apoptosis similar to that induced by β-catenin silencing. Moreover, AFF3 overexpression altered the structure of nuclear speckles and the localization of CDK9/CyclinT1, which are respectively involved in mRNA splicing and transcription. ZNRF3 (zinc and ring finger 3) was the most frequently altered gene (20%) in ACC. ZNRF3 had never been frequently associated with other tumour types. ZNRF3 encodes a protein that had been described as cell-surface transmembrane E3 ubiquitin ligases, acting as negative regulators of Wnt/β-catenin signaling, by promoting the degradation of Wnt ligand receptors (Frizzled receptors). We show that ZNRF3 act as a tumor suppressor gene in adrenocortical cell line H295R. Indeed the overexpression of ZNRF3 decreases cell proliferation and increases apoptosis. We demonstrate also that ZNRF3 is a target gene of WNT/β-catenin pathway. ZNRF3 alterations have less effect on expression of WNT/β-catenin target genes than CTNNB1 mutations in ACC. Moreover, our results with ZNRF3 overexpression in H295R adrenocortical cells suggest that ZNRF3 is also involved in βcatenin independant-pathway(s) to mediate its effects on apoptosis. Using mass spectrometry analysis, we identified that ZNRF3 interacts with ATP1A1 (ATPase Na+/K+ Transporting Subunit Alpha 1), affecting the activity of the Na+/K+ ATPase pump in adrenocortical cells. These results provide a better understanding of the biological process of WNT/βcatenin pathway activation in ACC with AFF3 as new target of this pathway. Moreover, our data provide insight into the tumor suppressor role of ZNRF3 in ACC and uncovers an additional role of ZNRF3 on Na+/K+ ATPase pump activity.

La prévalence du syndrome métabolique (MetS) est en constante augmentation dans les pays industrialisés. La stéatose hépatique, caractérisée par une accumulation massive de lipides dans les hépatocytes est une des manifestations du MetS. Parmi les SNP (Single Nucleotide Polymorphism) associés au MetS et à la stéatose hépatique, le SNP I148M de l'adiponutrine/PNPLA3 (Patatin-like Phospholipase Domain-Containing) est décrit comme un nouveau marqueur de la stéatose et également de la sévérité des différentes atteintes hépatiques des NAFLD (Non-alcoholic Fatty Liver diseases). L'objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle de l'adiponutrine dans le foie, d'une part, en étudiant sa régulation transcriptionnelle par les facteurs de transcription SREBP1c (Sterol Responive Element Binding Protein) et ChREBP (Carbohydrate Responsive Element Binding Protein) en réponse à l'insuline et au glucose et d'autre part, en étudiant l'impact de sa surexpression sur le métabolisme glucido-lipidique dans le foie de souris. L'adiponutrine est régulée de façon semblable aux enzymes lipogéniques et semble avoir un impact sur le métabolisme lipidique dans le foie. Comme l'adiponutrine, différents SNP des médiateurs de la voie Wnt/β-caténine sont également associés au syndrome métabolique et au diabète. La voie Wnt/β-caténine joue un rôle déterminant dans la zonation du lobule hépatique. Nous nous sommes intéressés à la régulation de cette voie par les conditions nutritionnelles et dans un contexte physiopathologique de stéatose et de résistance à l'insuline. Nos résultats montrent la régulation de cette voie par les hormones pancréatiques (insuline et glucagon) dans le foie favorisant ainsi l'orientation métabolique des hépatocytes en fonction des besoins. De plus, cette voie est dérégulée dans le foie d'animaux résistants à l'insuline, suggérant qu'elle pourrait avoir une fonction dans ce désordre métabolique.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une des principales causes de mortalité par cancer dans le monde. Dans environ 50% des tumeurs, on observe les signes d’une activation de la voie Wnt/β-caténine, causée par une mutation de l’exon 3 du gène CTNNB1 ou par stimulation du récepteur FRZD. Des études transcriptomiques du CHCs ont montré que ces deux modes d’activation étaient associés à des sous-types de tumeurs différents. Nous avons cherché à mieux comprendre les caractéristiques cliniques et le phénotype moléculaire de ces deux sous-types de CHCs. Dans un premier temps, nous avons fait le lien entre l'activation Wnt extracellulaire, un phénotype de cellules cancéreuses souches ou progénitrices et la présence de foyers de fibrose discrète intra-tumorale, observable par examen histopathologique, que nous avons appelés "nids fibreux". Nous avons également mis en évidence HAPLN1, une protéine de la matrice extracellulaire dont l’expression est stimulée par Wnt3a dans un modèle de cellules hépatiques progénitrices HepaRG, comme un nouveau marqueur d’agressivité du CHC. Ces résultats montrent une association entre l’activation Wnt extracellulaire et une agressivité tumorale passant par un remodelage matriciel. Dans un second temps, une Méta-analyse de données publiques de transcriptomique a permis de mettre évidence 4 sous-types de CHCs. La mutation CTNNB1, prédite par l’expression de 5 marqueurs par une méthode développée durant la thèse, était associée à un de ces sous-types et à un bon pronostic clinique. Nous avons également isolé un nouveau sous-type de CHC de bon pronostic exprimant un phénotype de tumeur différenciée et des signatures de métabolisme hépatique périportales. Ce sous-type a probablement été un facteur confondant dans les études précédentes mesurant l’association de la mutation CTNNB1 avec un bon pronostic. Enfin, nous avons mis en évidence une forte association négative entre la mutation CTNNB1 et l’inflammation ainsi que la fibrose tumorale dans trois cohortes indépendantes. Cet effet pourrait être provoqué par une inhibition de NF-κB par la β-caténine mutée, comme suggérée par des résultats préliminaires issue d’un modèle in vitro d’HepaRG mutés T41 stimulés par LPS. Nos résultats suggèrent donc que les deux modes d’activation de la voie Wnt/β-caténine sont associés à des mécanismes moléculaires, des profils d’expression, des phénotypes et des pronostics cliniques très différents. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the third cause of cancer-related death worldwide. Half of them show activation of Wnt/β-catenin pathway, caused by activating CTNNB1 exon 3 mutation of by stimulation of FRZD receptor. Transcriptomic based HCC classifications showed that this two types of activation were associated with distinct tumor subtypes. We tried to better understand the molecular phenotypes and the clinical features associated with these subtypes. In a first part, we linked extracellular Wnt activation with a stem/progenitor phenotype and with fibrous hotspot in HCC. Fibrous hotspot, which were called “fibrous nest”, can be detected by routine anatomic pathology analyses. We also showed that HAPLN1, an extracellular matrix protein induced by Wnt3a in progenitor HepaRG cells, was a new marker of stemness and bad outcome in HCC. Those results shows the associations between extracellular Wnt activation, extracellular matrix remodeling and tumor aggressiveness. In a second part, a transcriptome meta-analysis of 1133 HCCs highlighted 4 robust subclasses. CTNNB1 mutation, predicted by a 5-genes score based method, was associated with one of these subclasses and with good clinical features. We also highlighted a new subclass of CTNNB1 wild type HCCs associated with tumor differentiation, signatures of periportal metabolism and good outcome. This subclass was probably a confounding factor in survival studies comparing HCCs carrying mutant versus those carrying wild-type CTNNB1. Finally, we highlighted strong negative associations between CTNNB1 mutation and inflammation as well as tumor fibrosis in three independent cohorts. Preliminary results of in vitro HepaRG cells mutated for CTNNB1 in T41 and stimulated by LPS suggest an inhibitory effect of β-caténine on NF-κB. In conclusion, our results show that the two types of Wnt activation in HCC are associated with very distinct molecular phenotypes and clinical features.

La prévalence du syndrome métabolique (MetS) est en constante augmentation dans les pays industrialisés. La stéatose hépatique, caractérisée par une accumulation massive de lipides dans les hépatocytes est une des manifestations du MetS. Parmi les SNP (Single Nucleotide Polymorphism) associés au MetS et à la stéatose hépatique, le SNP I148M de l’adiponutrine/PNPLA3 (Patatin-like Phospholipase Domain-Containing) est décrit comme un nouveau marqueur de la stéatose et également de la sévérité des différentes atteintes hépatiques des NAFLD (Non-alcoholic Fatty Liver diseases). L’objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle de l’adiponutrine dans le foie, d’une part, en étudiant sa régulation transcriptionnelle par les facteurs de transcription SREBP1c (Sterol Responive Element Binding Protein) et ChREBP (Carbohydrate Responsive Element Binding Protein) en réponse à l’insuline et au glucose et d’autre part, en étudiant l’impact de sa surexpression sur le métabolisme glucido-lipidique dans le foie de souris. L’adiponutrine est régulée de façon semblable aux enzymes lipogéniques et semble avoir un impact sur le métabolisme lipidique dans le foie. Comme l’adiponutrine, différents SNP des médiateurs de la voie Wnt/β-caténine sont également associés au syndrome métabolique et au diabète. La voie Wnt/β-caténine joue un rôle déterminant dans la zonation du lobule hépatique. Nous nous sommes intéressés à la régulation de cette voie par les conditions nutritionnelles et dans un contexte physiopathologique de stéatose et de résistance à l’insuline. Nos résultats montrent la régulation de cette voie par les hormones pancréatiques (insuline et glucagon) dans le foie favorisant ainsi l’orientation métabolique des hépatocytes en fonction des besoins. De plus, cette voie est dérégulée dans le foie d’animaux résistants à l’insuline, suggérant qu’elle pourrait avoir une fonction dans ce désordre métabolique. / The prevalence of metabolic syndrome (MetS) has increased in industrial countries. The hallmark of MetS in the liver is an excessive accumulation of triglyceride, which is called hepatic steatosis. Different SNP (Single Nucleotide Polymorphism) are associated with hepatic steatosis or MetS. One of them is found on adiponutrin/PNPLA3 (Patatin-like Phospholipase Domain-Containing) gene (SNP I148M) and is now considered as a new marker of hepatic steatosis and severity of NAFLD (Non-alcoholic Fatty Liver diseases). In order to understand the physiological role of adiponutrin in the liver, we studied its transcriptional regulation by SREBP1c (Sterol Responive Element Binding Protein) and ChREBP (Carbohydrate Responsive Element Binding Protein), mediators of insulin and glucose respectively. Moreover, by overexpressing adiponutrin in mice liver, we investigated its role in hepatic carbohydrate and lipid metabolism. We showed that adiponutrin is regulated as lipogenic genes and could have a role lipid metabolism. As for adiponutrin I148M, different SNP are found on substrats of Wnt/β-catenin pathway, a major pathway controlling acinus zonation. We examined the regulation of this pathway by nutritionnal status and in a pathophysiological context of insulin resistance and steatosis. We showed that Wnt/β-catenin pathway is regulated by pancreatic hormones (insulin and glucagon) in the liver in order to adapt hepatocyte phenotype to energetic needs. Moreover, this pathway is dysregulated in insulin resistant mice liver. These data may suggest a link between Wnt/β-catenin pathway deregulation and hepatic metabolic disorders.

Nouveau modèle d’étude de l’hépatoblastome in vivo et identification de microARNs régulateurs de la β-caténineL’hépatoblastome (HBL) est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. Au niveau moléculaire, il est caractérisé par des mutations activatrices dans le gène de la β-caténine (CTNNB1) entrainant une accumulation de sa protéine et une activation anormale de la voie de signalisation Wnt, responsables de la transformation maligne des cellules hépatiques. Ainsi, la β-caténine est une cible thérapeutique majeure dans l’HBL.Ce manuscrit décrit les deux parties principales de mon projet de thèse, dont l’objectif était d’étudier le rôle de microARNs régulateurs de la β-caténine sur la carcinogenèse de l’HBL.La première partie présente le développement d’un nouveau modèle d’étude in vivo de l’HBL. Ce travail a consisté à réaliser des xénogreffes de cellules dérivées d’HBL sur la membrane chorioallantoidienne (CAM) de l’embryon de poulet, et à étudier le développement des tumeurs par des approches histologiques et moléculaires. Mes résultats montrent que les cellules d’HBL modifient leur phénotype et activent des mécanismes de survie et de prolifération pour former des nodules tumoraux structurés et vascularisés au sein de la CAM. Le traitement des cellules par le cisplatine conduit à un arrêt net de la progression tumorale.La seconde partie présente les résultats concernant la régulation de la β-caténine et des processus oncogéniques par les microARNs dans les cellules d’HBL. Un crible fonctionnel m’a permis d’identifier plusieurs microARNs ayant un effet inhibiteur sur la β-caténine. Quatre microARNs, sous-exprimés dans les tumeurs de patients, bloquent la prolifération cellulaire et l’activité de la voie Wnt in vitro. Le miARN le plus efficace interagit avec l’ARNm de la β-caténine via un site unique localisé dans sa région 3’ non traduite et bloque la croissance des tumeurs d’HBL sur la CAM.Durant ma thèse j’ai développé un nouveau modèle animal d’étude de l’HBL qui permet de modéliser la croissance tumorale et de tester l’impact de molécules thérapeutiques. Ce travail a également permis d’identifier de nouveaux microARNs sous-exprimés dans les tumeurs d’HBL, qui inhibent l’expression de la β-caténine et agissent comme des gènes suppresseurs de tumeur. Ces microARNs constituent de potentielles nouvelles molécules thérapeutiques dans le traitement de l’HBL et pourraient aussi être utilisés comme des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques. / Hepatoblastoma (HBL) is the most common pediatric liver cancer. At molecular level it is characterized by activating mutations in β-catenin gene (CTNNB1) that cause protein accumulation and abnormal Wnt signaling pathway activation leading to malignant transformation of hepatic cells. Therefore, β-catenin is a key therapeutic target in HBL.This manuscript describes two major parts of my thesis project that aimed to understand the role of β-catenin-regulating microRNAs in HBL carcinogenesis.The first part presents the development of a new in vivo HBL model. This work consisted of making HBL-derived cells xenograft on chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) and studying tumor development using histological and molecular approaches. My results show that HBL cells implanted on CAM modify their phenotype and activate survival and proliferation mechanisms to form organized and vascularized tumor nodules. Cell treatment with cisplatin leads to tumor progression arrest.The second part presents results concerning the regulation of β-catenin and oncogenic processes by microRNAs in HBL cells. A functional screening allowed me to identify several microRNAs with an inhibitory effect on β-catenin. Four microRNAs down-regulated in patient tumors inhibit cell proliferation and Wnt pathway activity in vitro. The most efficient microRNA directly interacts with β-catenin mRNA through a unique site localized in 3’ untranslated region and blocks HBL tumor growth on CAM.During my thesis I developed a new animal model to study HBL that allows modelling rapid tumor growth and testing the impact of therapeutic molecules. My work also led to the identification of new microRNAs down-regulated in HBL tumors that inhibit β-catenin expression and act as tumor suppressor genes. Those microRNAs represent new potential therapeutic molecules for HBL treatment and could be also used as diagnostic and prognostic biomarkers.