The cell cycle is an orchestrated mechanism ensuring cell division and differentiation to form multicellular organisms as well as to promote tissue homeostasis and regeneration. To secure correct cell division end ensure genome integrity for the next cell generation, the cell cycle must be strictly controlled. As part of this control cells have to adequately respond to the intra- and extracellular environment. Among the key molecules mediating the exchange of information from the surrounding environment are reactive oxygen species (ROS). ROS are small oxygen species, which control cellular signaling pathways through reductive-oxidative (redox) reactions with cellular proteins. For instance, mitogen signaling is sustained through ROS production by the NADPH oxidases in order to pass the information to proliferate or not to proliferate onto downstream cascades. Furthermore, cellular processes enabling proliferation and thus cell cycle progression require a level of high energy. Here, the cell cycle machinery meets mitochondria. Mitochondrial metabolism is the basis of aerobic respiration, the mechanism which supplies cells with energy and metabolites important for protein and DNA synthesis. By-products of mitochondrial metabolism as a result of incomplete reduction of oxygen are ROS molecules. Whether produced as metabolic by-product by mitochondria or as a growth factor stimulant by NADPH oxidases, many studies have demonstrated the broad influence of ROS on signaling pathways. When looking at ROS in context of cell division, ROS levels have been proposed to oscillate as cells progress through individual cell cycle phases. Perturbations of the cellular redox environment affect cell cycle progression and depending on the perturbation, may promote proliferation, cell cycle arrest or cell death. Thus, the interplay between redox mechanism and the cell cycle appears to be key to cell cycle decision making. Although the mechanisms of how ROS regulate proliferation-related proteins such as growth factor receptors or protein tyrosine phosphatases are known, the mechanisms of how ROS influence the cell cycle core machinery remain to be fully uncovered. To investigate the interplay between redox signaling and the cell cycle, I took advantage of approaches that allowed me to visualize and study changes in both systems at the same time. I visualized ROS dynamics in physiological and unperturbed conditions in non-transformed cells using redox specific dyes and indeed, observed that the levels of ROS oscillate during the cell cycle. ROS changes are characterized by basal levels in G1 phase and increased levels in S and G2 phases. My data provide evidence that ROS oscillations mainly originate from ROS produced by mitochondria. To investigate cause-consequence relations between ROS and the cell cycle I interfered with the cellular redox environment and studied the effect on cell cycle progression. Firstly, I discovered that the protein levels of NADPH oxidase 4 (NOX4), the enzyme producing ROS in response to mitogens, decrease shortly before cells enter S phase. Because NOX4 is constitutively active and its regulation is not known, this observation suggests that there is a mechanism of cell cycle-dependent NOX4 regulation that is important for entry into S phase. Secondly, I showed that reduction of ROS production by decreasing metabolites important for their production slowed proliferation due to prolonged S phase. This allowed me to establish that the main S phase regulator Cdk2 is a redox regulated cell cycle protein. Precisely, full phosphorylation of threonine 160 (T160) in the activatory segment of Cdk2, which is required for full Cdk2 activity was promoted by ROS derived from mitochondria. Furthermore, using a chemo-selective probe for cysteine oxidation I showed that Cdk2 is directly oxidized by ROS. Mutating the only surface exposed cysteine of Cdk2, C177, resulted in a change of Cdk2 binding to KAP, the phosphatase responsible for removing T160 phosphorylation. I found that only in reductive conditions KAP bound to Cdk2 resulting in Cdk2 dephosphorylation and thus reduced activity. In contrast oxidative conditions abolished the interaction between KAP and Cdk2. Thus, I propose a model of redox-dependent regulation of Cdk2 whereby the increase of mitochondrial ROS during S phase negatively regulates the Cdk2-KAP interaction to enable full activation of Cdk2 necessary for cells to rapidly progress through S phase. Altogether, in my thesis I investigated the link between mitochondrial ROS production and the cell cycle machinery and identified a mechanism of how increased levels of ROS drive the cell cycle. Furthermore, I outlined a potential cell cycle-dependent regulation of the NOX4 protein, which might provide a step towards understanding of its regulation. Thus, my thesis provides new views on the interplay between the redox system and the cell cycle machinery.:1. Introduction 1.1 Reactive oxygen species (ROS) 1.1.1 ROS and signal transduction 1.1.2 Antioxidant systems 1.1.3. Redox homeostasis, oxidative and reductive stress 1.2 ROS producing mechanisms 1.2.1 Mitochondria 1.2.2 NADPH oxidases 1.3 The cell cycle 1.4. ROS and the cell cycle 1.5 Aims of the thesis 2. Results 2.1 CellRox, a ROS sensitive dye, reveals redox changes during the cell cycle progression 2.2 Investigating the role of NADPH oxidases in cell cycle progression 2.2.1 General NOX inhibition causes defect in proliferation and suggests G1 phase delay 2.2.2 NOX4 and NOX1 specific inhibition causes a G1 delay or arrest 2.2.3 Specific down-regulation of NOX4 might have a negative impact on cell proliferation 2.2.4 NOX4 over-expression affects proliferation 2.2.5 NOX4 expression drops at G1 and S phase transition 2.3 Cell cycle dependent ROS oscillations correlate with mitochondria ROS production 2.4 Interference with mtROS decreases proliferation on the level of S phase 2.4.1 MitoTempo negatively affects proliferation and decreases population of EdU positive cells 2.4.2 Genetic interfering with mtROS production results in affected Cdk2 activation 2.5 Redox dependent Cdk2 activation via KAP binding 2.5.1 BTD labeling reveals Cdk2 as a direct target for oxidation 2.5.2 Preventing Cdk2 oxidation of cysteine 177 results in a drop of T160 phosphorylation 2.5.3 KAP binds to Cdk2 in a redox dependent manner 3. Discussion 3.1 ROS levels oscillate during the cell cycle in physiological cell culture conditions 3.2 Expression levels of NOX4 might determine the entry into S phase 3.3 Mitochondria are the main source of redox oscillations during the cell cycle 3.4 mtROS production contributes to Cdk2 activation and thus drives S phase progression 3.5 KAP phosphatase contributes to redox dependent regulation of Cdk2 3.6. Model of interconnection between the cellular redox environment and cell cycle regulation 4. Materials and methods 4.1 Cell culture 4.1.1 Cell lines 4.1.2 Cell treatments 4.1.3 Plasmids and cell line generation 4.1.4 RNA interference (RNAi) 4.1.5 EdU incorporation assay 4.2 Quantitative PCR (qPCR) 4.3 Protein studies 4.3.1 Cdk2-KAP/CAK interaction 4.3.2 Cdk2 sulfenylation by BTD labeling 4.4 SDS-PAGE and Western blot analyses 4.4.1 Total lysate preparation 4.4.2 SDS-PAGE 4.4.3 Western blotting 4.5 Flow cytometry analysis (FACS) 4.6 Hypoxia experiments 4.7 Microscopy 4.8 Automated image and data analysis 4.9 Statistical methods 5. Contributions 6. Bibliography 7. Acknowledgements 8. Appendix / Der Zellzyklus ist ein komplexer Mechanismus, der Zellteilung und Differenzierung in mehrzelligen Organismen, sowie die Homöostase und die Regeneration von Geweben gewährleistet. Um eine korrekte Zellteilung zu ermöglichen und die Integrität des Genoms für die nächste Zellgeneration sicherzustellen, muss der Zellzyklus streng kontrolliert werden. Im Rahmen dieser Kontrolle müssen die Zellen angemessen auf die intra- und extrazellulären Umgebungen reagieren. Zu den Schlüsselmolekülen, die den Austausch von Informationen aus der Umgebung vermitteln, gehören reaktive Sauerstoffspezies (ROS). ROS enthalten Sauerstoff und kontrollieren durch reduktiv-oxidative (Redox-) Reaktionen mit zellulären Proteinen viele verschiedene zelluläre Signalwege. So wird beispielsweise die Proliferation aufgrund von Wachstumssignalen durch die Produktion von ROS durch NADPH-Oxidasen ermöglicht, da sie die Information, ob eine Zellteilung stattfinden soll oder nicht, an nachgeschaltete Kaskaden weiterleiten. Darüber hinaus benötigen zelluläre Prozesse, die den Fortgang des Zellzyklus ermöglichen, ein hohes Energieniveau. Hier trifft die Zellzyklusmaschinerie auf die Mitochondrien. Der mitochondriale Stoffwechsel ist die Grundlage der aeroben Atmung, des Mechanismus, der die Zellen mit Energie und Metaboliten versorgt, die für die Protein- und DNA-Synthese notwendig sind. Als Nebenprodukte des mitochondrialen Stoffwechsels entstehen dabei häufig ROS, die aus der unvollständigen Reduktion von Sauerstoff resultieren. Unabhängig davon, ob sie als Nebenprodukte des Stoffwechsels in den Mitochondrien oder als wachstumsfördernde Substanzen in den NADPH-Oxidasen entstehen, viele Studien haben den weitreichenden Einfluss von ROS auf zahlreiche Signalwege gezeigt. Betrachtet man ROS im Zusammenhang mit der Zellteilung, so wird angenommen, dass die ROS-Konzentration mit dem Durchlaufen der einzelnen Zellzyklusphasen schwankt. Störungen der zellulären Redoxumgebung wirken sich auf den Verlauf des Zellzyklus aus und können je nach Störung Proliferation, Stillstand des Zellzykluses oder Zelltod fördern. Das Zusammenspiel zwischen Redox-Mechanismen und dem Zellzyklus scheint also der Schlüssel zur Entscheidungsfindung im Zellzyklus zu sein. Obwohl die Mechanismen, mit denen ROS essentielle Proteine wie Wachstumsrezeptoren oder Protein-Tyrosin-Phosphatasen regulieren, bekannt sind, sind die Mechanismen, mit denen ROS die Kernmaschinerie des Zellzyklus beeinflussen, noch nicht vollständig aufgeklärt. In der hier vorliegenden Arbeit nutzte ich daher Ansätze, die es mir ermöglichten, Veränderungen im Zellzklus, als auch Veränderungen in Redox-Signalen und deren Zusammenspiel gleichzeitig zu untersuchen. Ich habe die Dynamik reaktiver Sauerstoffspezies unter physiologischen und ungestörten Bedingungen in nichttransformierten Zellen mit redox-spezifischen Farbstoffen visualisiert und beobachtet, dass die ROS-Konzentrationen während des Zellzyklus oszillieren. Die Veränderungen der ROSKonzentrationen sind durch einen Grundwert in der G1-Phase und erhöhte Werte in der Sund G2-Phase gekennzeichnet. Meine Daten belegen, dass ROS-Oszillationen hauptsächlich von ROS herrühren, die von den Mitochondrien produziert werden. Um die Ursache-Folge-Beziehungen zwischen ROS und dem Zellzyklus zu untersuchen, habe ich in die zelluläre Redox-Balance eingegriffen und die Auswirkungen auf den Verlauf des Zellzyklus untersucht. Zunächst entdeckte ich, dass die Proteinkonzentration der NADPHOxidase 4 (NOX4), des Enzyms, das ROS als Reaktion auf Wachstumsfaktoren produziert, kurz vor dem Eintritt der Zellen in die S-Phase abnimmt. Da NOX4 konstitutiv aktiv ist und seine Regulierung nicht bekannt ist, deutet diese Beobachtung darauf hin, dass es einen zellzyklusabhängigen Mechanismus der NOX4-Regulierung gibt, der für den Eintritt in die S-Phase wichtig ist. Zweitens konnte ich zeigen, dass die Verringerung von Metaboliten zu einer Verringerung der ROS-Produktion führt, welches die Proliferation aufgrund einer verlängerten S-Phase verlangsamt. Dadurch konnte ich feststellen, dass Cdk2, der wichtigste S-Phasen-Regulator, ein redoxreguliertes Zellzyklusprotein ist. Genauer gesagt wurde die vollständige Phosphorylierung von Cdk2 am Threonin 160 (T160), welche für die volle Cdk2-Aktivität erforderlich ist, durch ROS aus Mitochondrien gefördert. Außerdem konnte ich mit einer chemo-selektiven Probe für Cysteinoxidation zeigen, dass Cdk2 direkt durch ROS oxidiert wird. Die Mutation des einzigen exponierten Cysteins von Cdk2, C177, führte zu einer Veränderung der Bindung von Cdk2 an KAP, die Phosphatase, die für die Aufhebung der T160-Phosphorylierung verantwortlich ist. Ich fand heraus, dass KAP nur unter reduktiven Bedingungen an Cdk2 bindet, was zu einer Dephosphorylierung von Cdk2 und damit zu einer verringerten Aktivität führt. Unter oxidativen Bedingungen hingegen wurde die Interaktion zwischen KAP und Cdk2 aufgehoben. Daher schlage ich ein Modell der redoxabhängigen Regulierung von Cdk2 vor, bei dem der Anstieg der mitochondrialen ROS während der S-Phase die Interaktion zwischen Cdk2 und KAP negativ reguliert, um eine vollständige Aktivierung von Cdk2 und damit eine erfolgreiche S-Phase zu ermöglichen. Insgesamt habe ich in meiner Dissertation die Verbindung zwischen mitochondrialer ROS-Produktion und der Zellzyklusmaschinerie untersucht und einen Mechanismus identifiziert, wie erhöhte ROS-Konzentrationen den Zellzyklus antreiben. Darüber hinaus habe ich die zellzyklusabhängige Regulierung des NOX4-Proteins aufgezeigt, was neue Einblicke zum Verständnis der Zellzykluskontrolle durch ROS gewährt. Somit bietet meine Arbeit neue, interessante Erkenntnisse für das Zusammenspiel zwischen dem Redoxsystem und der Zellzyklusmaschinerie.:1. Introduction 1.1 Reactive oxygen species (ROS) 1.1.1 ROS and signal transduction 1.1.2 Antioxidant systems 1.1.3. Redox homeostasis, oxidative and reductive stress 1.2 ROS producing mechanisms 1.2.1 Mitochondria 1.2.2 NADPH oxidases 1.3 The cell cycle 1.4. ROS and the cell cycle 1.5 Aims of the thesis 2. Results 2.1 CellRox, a ROS sensitive dye, reveals redox changes during the cell cycle progression 2.2 Investigating the role of NADPH oxidases in cell cycle progression 2.2.1 General NOX inhibition causes defect in proliferation and suggests G1 phase delay 2.2.2 NOX4 and NOX1 specific inhibition causes a G1 delay or arrest 2.2.3 Specific down-regulation of NOX4 might have a negative impact on cell proliferation 2.2.4 NOX4 over-expression affects proliferation 2.2.5 NOX4 expression drops at G1 and S phase transition 2.3 Cell cycle dependent ROS oscillations correlate with mitochondria ROS production 2.4 Interference with mtROS decreases proliferation on the level of S phase 2.4.1 MitoTempo negatively affects proliferation and decreases population of EdU positive cells 2.4.2 Genetic interfering with mtROS production results in affected Cdk2 activation 2.5 Redox dependent Cdk2 activation via KAP binding 2.5.1 BTD labeling reveals Cdk2 as a direct target for oxidation 2.5.2 Preventing Cdk2 oxidation of cysteine 177 results in a drop of T160 phosphorylation 2.5.3 KAP binds to Cdk2 in a redox dependent manner 3. Discussion 3.1 ROS levels oscillate during the cell cycle in physiological cell culture conditions 3.2 Expression levels of NOX4 might determine the entry into S phase 3.3 Mitochondria are the main source of redox oscillations during the cell cycle 3.4 mtROS production contributes to Cdk2 activation and thus drives S phase progression 3.5 KAP phosphatase contributes to redox dependent regulation of Cdk2 3.6. Model of interconnection between the cellular redox environment and cell cycle regulation 4. Materials and methods 4.1 Cell culture 4.1.1 Cell lines 4.1.2 Cell treatments 4.1.3 Plasmids and cell line generation 4.1.4 RNA interference (RNAi) 4.1.5 EdU incorporation assay 4.2 Quantitative PCR (qPCR) 4.3 Protein studies 4.3.1 Cdk2-KAP/CAK interaction 4.3.2 Cdk2 sulfenylation by BTD labeling 4.4 SDS-PAGE and Western blot analyses 4.4.1 Total lysate preparation 4.4.2 SDS-PAGE 4.4.3 Western blotting 4.5 Flow cytometry analysis (FACS) 4.6 Hypoxia experiments 4.7 Microscopy 4.8 Automated image and data analysis 4.9 Statistical methods 5. Contributions 6. Bibliography 7. Acknowledgements 8. Appendix

The radiosensitivity of tumour cells depends mainly on their capacity to maintain genomic integrity. This requires efficient repair of radiation-induced DNA double strand breaks, a process governed by the cell cycle. Based on their functions in cell cycle regulation and DNA damage repair, we hypothesised that targeting of CDK2 and CDK9 modifies cancer cell response to radiotherapy. Therefore, we evaluated the significance of CDK2 and CDK9 for the cellular radiation response in a panel of human head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) cell lines. In order to achieve our goal, we performed a series of experiments to measure several key parameters such as clonogenic radiation survival, cell cycling, DNA damage repair and apoptosis. We found that loss of CDK2 radiosensitises mouse embryonic fibroblasts (MEFs) as well as HNSCC two dimensional (2D) cell cultures. However, under more physiological three dimensional (3D) growth conditions in laminin-rich extracellular matrix, targeting of CDK2 failed to modulate the radiosensitivity of HNSCC cells. Moreover, CDK2 attenuated the repair of radiogenic double strand breaks (DSBs) in MEFs as well as SAS and FaDu HNSCC cells indicating a possible role of CDK2 in DNA damage repair. However, we found that CDK2 is dispensable for cell cycle and checkpoint regulation in response to irradiation in SAS and FaDu cells. Taken together, our results suggest that targeting of CDK2 may not provide a therapeutic benefit to overcome HNSCC cell resistance to radiotherapy. We also showed that depletion of CDK9 clearly enhances the radiosensitivity of HNSCC cultures. In addition, the ectopic expression of CDK9 has a radioprotective effect. These findings suggest a potential role of CDK9 in the radiation response of HNSCC cells. Moreover, our study indicates a possible role of CDK9 in the DNA damage repair response and cell cycling of HNSCC cells. Conclusively, on the basis of these data, targeting of CDK9 in addition to conventional radiotherapy might be a viable strategy to overcome cancer cell resistance.

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Um die Rolle von Bx42 in der Regulation des Zellzyklus von Drosophila zu verstehen, habe ich die Auswirkungen der Expression von dominant negativen Bx42 Allel in Drosophila Augenimaginalscheiben untersucht, sowie die Auswirkungen der Bx42 Protein Abbau in Drosophila S2-Zellen mit Hilfe der RNA-Interferenz-Methode. In meiner Studie fand ich, dass die Expression von Bx42-SNW, einer abgeschnittenen dominant negative Version von Bx42, in den Augenimaginalscheiben zu kleinen und groben Augen führte. Analyse des Zellzyklus in den betroffenen Scheiben zeigte keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der S-Phase-Zellen, aber eine starke Reduktion der mitotischen Zellen und die Herunterregulation von Cyc A und B Cyc in dem normalen mitotischen aktiven SMW Bereich des Augenimaginalscheibes. Ziel dieser Studie war auch Faktoren zu finden, die den kleinen Augenphänotyp von Überexpression der negativen Form Bx42-SNW modifizieren können. Die definierten Modifikatoren waren E2F / Dp, Rb, Tribbles, Cdk1, Cyclin B3, EGFR, Dpp und Armadillo. Um weitere Einblicke in der Rolle des Bx42 in Proliferation, dsRNA-vermittelte Knockdown der Expression von Bx42 in S2-Zellen verwendet wurde. Zellen, die mit dsRNA behandelt wurden, zeigten eine signifikante Abnahme der Proliferationsraten im Vergleich zu kontrol dsRNA-OFP-Zellen. Zellzyklusanalyse zeigte, dass die Herunterregulation von Bx42 Zellpopulationen in der G1 und G2 Phasen verringerte, gleichzeitig S-Phasen-Zellen durch Zyklusarrest vermehrete, was führte zu einem Zustand, die Zellen unfähig die zellteilung zu vervollständigen. Semi q-RT-PCR ergab, dass die Herunterregulation von Bx42 die Transkription von E2F, Dap, Cyc A und Cyc B beeinflusst. Eine Reduktion von Cyc A und Cyc B auf Proteinebene wurde auch nachgewiesen. / In order to understand the role of Bx42 in cell cycle regulation of Drosophila, I have investigated the effects of the expression of dominant negative Bx42 allele in Drosophila eye imaginal discs, as well as the effects of depleting the Bx42 protein in Drosophila S2 cells by RNAi. In my study, I found that the expression of Bx42-SNW, a truncated dominant negative version of Bx42, in eye imaginal discs resulted in small and rough eyes. Analyzing the cell cycle in the affected discs showed no significant differences in the number of S-phase cells, but a strong reduction of mitotic cells and the downregulation of Cyc A and Cyc B in the normally mitotic active SMW region of the eye disc. This study aimed also at finding factors that modify the small eye phenotype resulting from overexpression of Bx42-SNW in the eye. The defined modifiers were E2F/Dp, Rb, Tribbles, Cdk1, Cyclin B3, EGFR, Dpp and Armadillo. To gain further insight into the role of Bx42 in proliferation, dsRNA-mediated knockdown the expression of Bx42 was employed in S2 cells. Cells treated with dsRNA exhibited a significant decrease in proliferation rates compared to control dsRNA-OFP cells. Cell cycle analysis demonstrated that down-regulation of Bx42 decreased cell populations in the G1& G2 phases simultaneously augmenting S-phase cells by cycle arrest, leading to a state unable to complete cell division. Semi q-RT PCR, revealed that downregulation of Bx42 affects the transcription of E2F, Dap, Cyc A and Cyc B. A reduction of Cyc A and Cyc B was also demonstrated at the protein level.

Das grundlegende Problem in der Transplantationsimmunologie ist es, die Langzeitakzeptanz eines fremden (allogen) Organs zu erreichen, ohne die sonstige Immunkompetenz des Empfängers zu beeinträchtigen. Die Induktion einer solchen spenderspezifischen Toleranz würde eine Alternative zum Langzeiteinsatz von Immunsuppressiva darstellen. Deswegen versucht man, während der Transplantation die Aktivierung der für die Abstoßung entscheidenden T-Helferzellen zu unterdrücken, bis eine Akzeptanz des Spenderorgans etabliert ist. Wichtig für eine Aktivierung der T-Zellen ist das für alle T-Helferzellen typische Zelloberflächenmolekül CD4. Antikörper gegen CD4 können in Tiermodellen eine Transplantattoleranz induzieren. Ein besonderes Interesse gilt der Charakterisierung der genauen Mechanismen dieser induzierten Transplantatakzeptanz, da diese noch wenig verstanden sind. Der von uns verwendete nicht-depletierende Maus-anti-Ratten-CD4mAk (RIB5/2) besitzt im allogenen Nierentransplantationsmodell der Ratte eine hohe toleranzinduzierende Wirkung und erzielt eine permanente Transplantatakzeptanz bei >80% der Empfängertiere. In dieser Arbeit wurde versucht, die Effekte dieses monoklonalen Antikörpers auf die T-Zellaktivierung näher zu untersuchen. Ausdruck der blockierten T-Zellaktivierung ist eine verminderte T-Zell-Proliferation und die Reduzierung der Synthese von TH-1-Effektorzytokinen, welche eine zelluläre Immunantwort fördern. Zu diesen für die Abstoßung gefährlichen Th-1-Effektorzytokinen gehören Interleukin 2 (=IL-2, Hauptwachstumsfaktor aktivierter T-Zellen) und Interferon gamma (=IFNgamma, wichtiger Aktivator von APC''s). Während die IL-2 Produktion vollständig verhindert wird, ist die Alloantigen-induzierte IFNgamma mRNA Expression nicht reduziert. Allerdings kommt es unter dem Einfluss des Antikörpers nicht zur IFNgamma Proteinsekretion. Wird jedoch das fehlende IL-2 ersetzt, kann sowohl die defekte Proliferation als auch die posttranskriptionelle Blockade der IFNgamma Produktion wieder aufgehoben werden. Das spiegelt sich auch in vivo wieder, da rekombinantes IL-2 auch hier den Toleranzstatus brechen kann. In dieser Arbeit konnte ein Kandidat dieser IFNgamma Translationskontrolle ermittelt werden. Zusätzlich wurde das Kochaperon p23, Teil eines Hsp90-Komplexes, in unsere Untersuchungen miteinbezogen, da es als ein differentiell reguliertes Gen in allogenen und anti-CD4mAk-behandelten T-Zellen identifiziert wurde. Hsp90 stabilisiert z.B. Kinasen, die wichtige Mediatoren der Signaltransduktion sind. p23 könnte aufgrund seiner Funktion als Kofaktor von Hsp90 an der Regulierung dieser Kinasen beteiligt sein, ist jedoch bisher kaum im Zusammenhang mit T-Zellaktivierung analysiert worden. Meine Untersuchungen ergaben, dass die p23 Expression ebenfalls durch den anti-CD4mAk reduziert wird. Da die Proliferation/p23 und die IFNgamma Synthese IL-2-abhängig reguliert werden, wurden IL-2-induzierte Signalwege auf ihre Relevanz für Proliferation und IFNgamma Regulation hin untersucht. Die Aufklärung der molekularen Mechanismen der anti-CD4mAk-Behandlung auf die T-Zellaktivierung soll mit dazu beitragen, Grundlagen für ein besseres Verständnis des Abstoßungsprozesses und damit Transplantatfunktions-Monitoring zu schaffen. / The major problem in transplantation immunology is the development of long-term donor-specific nonresponsiveness without reduction of the normal recipient immunocompetence. A tolerant state would obviate the need for continuing immunosuppressive therapy. One level of immunosuppression for inducing graft acceptance involves antibodies specific for T-cells of the recipient leading to donorspecific tolerance (e.g. by using of anti-CD4 monoclonal antibodies = aCD4mAb). CD4+ T cells play a predominant role in the cascade of immune processes following transplantation of foreign tissues. The anti-rat CD4 mAb RIB5/2 is very potent in inducing allo-specific tolerance to renal and heart allografts in rat recipients. Here I investigated the molecular mechanisms underlying anti-CD4 antibody mediated inhibition of allo-specific T cell activation and how this is antagonised by exogenous IL-2. IL-2 acts as growth factor for antigen-activated T cells by inducing the expression of cell cycle proteins and also enhances the expression of cytokines, e.g. IFNgamma in T cells. IFNgamma profoundly affects a variety of immune responses, including activation of antigen presenting cells. Anti-CD4 treatment, in vivo and in vitro, completely abrogated IL-2 production by alloreactive T cells. In contrast, anti-CD4 treated allo-activated T cells showed similar IFNgamma mRNA expression as untreated allo-activated T cells, but did not secrete any protein. Thus, the anti-CD4 antibody cannot prevent IFNgamma mRNA expression but is interfering with posttranscriptional mechanisms controlling IFNgamma production during allo-activation of T cells. The investigations revealed a candidate of these IFNgamma translation control. Additionally I investigated the heat shock protein 90 (Hsp90)-associated cochaperone p23. p23 upregulation during T cell activation is also abrogated by anti-CD4 treatment. Hsp90 chaperoning is critical for proper folding, stabilization and trafficking of a number of cellular signaling proteins as e.g. kinases. Hsp90-kinase complexes play an important role in T-cell signal transduction and little is known about the importance or even regulation of Hsp90-cochaperones like p23 during T-cell activation. I analysed the regulation of p23 and downstream effects on different kinases involved in T-cell signaling. These findings are supposed to contribute to a better understanding of the mechanisms underlying tolerance induction.

Das Kernstueck der vorliegenden Arbeit ist die Betonung von kleinen Modulen als Schluesselkomponenten von biologischen Netzwerken. Unter den zahlreichen moeglichen Modulen scheinen besondere diejenigen interessant zu sein, welche die Rueckkopplungen realisieren und in regulatorischen Einheiten auftreten. Prozesse wie Genregulation, Differentiation oder Homeostasis benoetigen haeufig Autoregulation. Auf Grund dessen ist die detaillierte Kenntnis der dynamischen Eigenschaften von kleinen Modulen von groesserem Interesse. Es werden zwei biologische Systeme analysiert. Das erste beschaftigt sich mit dem Zellzyklus, das zweite Beispiel kommt aus der Immunologie und betrifft die Aktivierung von T-Zellen. Beide Modelle, d.h. ihre zugrundeliegende Netzwerke, lassen sich in Untereinheiten mit wohldefinierten Funktionen zerlegen. Diese Module entscheiden ueber das Verhalten des gesamten Netzwerkes. Mit anderen Worten, die von den Modulen getroffenen Entscheidungen, werden von dem gesamten System uebernommen. Bei der Analyse des Modells zum Zellzyklus wurde eine interessante Eigenschaft von gekoppelten Modulen deutlich, die wir dann getrennt behandelt haben. Seriell geschaltete Module mit positiver Rueckkopplung liefern ueberraschende Konstruktionsmoeglichkeiten fuer Systeme mit mehreren stabilen Gleichgewichtslagen. Obwohl nicht alle hier aufgestellten Hypothesen derzeit experimentell ueberpruefbar sind, es kann eine wichtige Aussage getroffen werden. Uebereinstimmende Strukturen und Mechanismen, die in verschiedenen biologischen Systemen vorkommen, bieten uns die Moeglichkeit einer Klassifizierung von biologischen Systemen bezueglich ihrer strukturellen Aehnlichkeiten. / The thesis emphasizes the importance of small modules as key components of biological networks. Especially, those which perform positive feedbacks seem to be involved in a number of regulatory units. Processes like gene regulation, differentiation and homeostasis often require autoregulation. Therefore, detailed knowledge of dynamics of small modules becomes nowadays an important subject of study. We analyze two biological systems: one regarding cell cycle regulation and one immunological example related to T-cell activation. Their underlying networks can be dissected into subunits with well defined functions. These modules decide about the behavior of the global network. In other words, they have decision taking function, which is inherited by the whole system. Stimulated by the cell cycle model and its interesting dynamics resulting from coupled modules, we analyzed the switching issue separately. Serial coupling of positive feedback circuits provides astonishing possibilities to construct systems with multiple stable steady states. Even though, in current stage, no exact experimental proof of all hypotheses is possible, one important observation can be made. Common structures and mechanisms found in different biological systems allow to classify biological systems with respect to their structural similarities.

Die zelluläre Antwort auf einen spezifischen Stimulus wird nicht nur durch den Stimulus selbst, sondern auch von dem Zustand der Zelle bestimmt. Um ein tieferes Verständnis für die Variabilität in einer Zellpopulation zu gewinnen, ist es notwendig, die verschiedenen zellulären Antworten mit definierten zellulären Zuständen zu verbinden. In dieser Arbeit wurde ein System etabliert, welches es ermöglicht, die zelluläre Antwort auf DNA-Schäden und den Einfluss unterschiedlicher zellulärer Zustände zu studieren sowie die zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen zu identifizieren. Im Zuge dessen wurde eine auf CRISPR/Cas9 basierende Methode entwickelt, mit der Fluoreszenzreporter für endogene Signalproteine in nicht transformierten Brustepithelzellen (MCF10A) generiert wurden. Anhand dieses Reportersystems konnte durch time-lapse Mikroskopie die Dynamik des Tumorsuppressors p53 und eines seiner Zielgene, des Zellzyklusinhibitors p21, verfolgt werden. Dabei wurde deutlich, dass die p21 Antwort der einzelnen Zellen auf DNA-Schäden sehr heterogen ausfällt. Über eine Form-basierte Gruppierungsmethode wurden vier verschiedene Subpopulationen mit charakteristischen p21 Dynamiken identifiziert. Um den Einfluss der Zellzyklusphase zu untersuchen, wurde die Zellteilung vor Bestrahlung analysiert und so Rückschlüsse auf die initiale Zellzyklusphase gezogen. 24h nach Bestrahlung wurde ein EdU labeling durchgeführt und der Zellzyklus mittels semi-supervised Klassifizierung bestimmt. Durch Einführen einer Mutation in der Bindedomäne von p21 wurde gezeigt, dass proliferating cellular nuclear antigen (PCNA) für die Heterogenität der p21 Antwort verantwortlich ist. Alles in allem bietet mein Projekt eine Pipeline, um auf Einzelzellebene zu erforschen, wie zelluläre Antworten durch den Zellzyklus beeinflusst werden. Dieser Ansatz könnte zukünftig Anwendung in der Erforschung von Medikamentenresistenz finden, zumal zelluläre Heterogenität in der Tumortherapie zu fractional killing führt. / The cellular response to a given stimulus is not only governed by the stimulus itself, but also depends on the state of the cells. However, it remains obscure how cellular states influence cell fate decisions. In this thesis, I established a framework to study how the cellular response to DNA damage is affected by varying cell states and to identify the underlying molecular mechanisms. To this end, I generated fluorescent reporters using CRISPR/Cas9 in non-transformed breast epithelial cells (MCF10A) and measured the dynamics of the tumor suppressor p53 and one of its target genes, the cell cycle inhibitor p21 using time-lapse microscopy. I found DNA damage induced highly diverse p21 dynamics in individual cells. A shape-based clustering identified four subpopulations of characteristic p21 dynamics. To examine the source of variability, I analyzed initial cell cycle states by monitoring cell division prior to damage, and determined final cellular state by EdU labelling and a semi-supervised classification 24h post damage. The results suggested that p21 dynamics depend on cell cycle phases and determine cell cycle progression. Furthermore, proliferating cellular nuclear antigen (PCNA)--a cell cycle dependent factor-- was shown to determine p21 heterogeneity using a mutant p21 deficient in interaction with PCNA. Overall, my project provides a pipeline to study at the single cell level how cellular response is affected by cellular states. Considering that cellular heterogeneity leads to fractional killing in tumor therapies, this approach also suggests future application on studying drug-resistance in cancer therapy.

Die Störung von Apoptose-Signalwegen spielt eine zentrale Rolle sowohl bei der Tumorentstehung als auch bei der Entwicklung von Therapieresistenz in malignen Tumoren. Von besonderer Bedeutung für das Ansprechen auf zytotoxische Tumortherapien sind die Komponenten des mitochondrialen Apoptosesignalwegs und dessen übergeordneten Regulatoren. Durch die Analyse solch zentraler Regulatoren der Apoptose, wie den Mitgliedern der Bcl-2 Genfamilie, des p53- und des Rb-Signalwegs, konnten Patienten mit guter bzw. schlechter Prognose identifiziert werden. Hierbei zeigte sich, dass die kombinierte Analyse von einander nachgeschalteten Signalwegkomponenenten, wie z.B. p53 und Bax, der Analyse einzelner Markergene überlegen ist. Solche Signalweganalysen konnten bei akuten und chronischen Leukämien, Kolon-, Ösophagus-, und Mammakarzinomen erfolgreich durchgeführt werden. Neben diesen deskriptiven genetischen Analysen an Tumorproben ermöglichte die funktionelle Manipulation dieser Signalwege die Sensibilisierung von Tumorzellen für Chemo-, Radio- und auch biologische Therapien. Mittels nicht-viraler, retro- und adenoviraler Gentransfervektoren wurden Regulatoren der Apoptose, wie z.B. Apoptose-fördernde Mitglieder der Bcl-2 Genfamilie, das Tumorsuppressorgen p14ARF oder auch Procaspase-3 in Tumorzellen eingebracht, um Resistenzen zu überwinden bzw. um direkt Zelltodsignalwege in den malignen Zellen zu aktivieren. Signalweganalysen sowohl in primärem Tumorgewebe von Patienten als auch in Zellinienmodellen identifizierten die hierfür notwendigen Komponenten der betreffenden Signalwege. Von besonderem Interesse war hierbei, dass durch die genetische Manipulation von Apoptose- und Zellzyklus-Regulation Signaldefekte in resistenten Tumoren umgangen und überwunden wurden. Dies könnte in Zukunft als mögliche Basis für neue, molekulare Therapieansätze in der Tumortherapie dienen. / Disruption of apoptosis signaling pathways plays a key role in both tumorigenesis and the development of resistant phenotypes in malignant tumors. Components of the mitochondrial apoptosis signaling pathway and its upstream regulators are of special importance regarding the response to cytotoxic anticancer therapies. The analysis of such central regulators, e.g. members of the Bcl-2 gene family, or the p53 and Rb pathways, identifies patients with good or poor prognosis. In this context, the combined analysis of consecutively involved signaling components, e.g. p53 and Bax, was shown to be superior as compared with analysis of single marker genes. Such signaling pathway analyses were successfully performed in acute and chronic leukemia, colon, esophageal and breast carcinoma. Apart from these descriptive genetic analyses in tumor specimen, the functional manipulation of these signaling events permitted to sensitize tumor cells for chemotherapy and irradiation as well as biological therapeutic modalities. To overcome resistance or to directly promote cell death signaling in the malignant cells, apoptosis regulators such as apoptosis promoting Bcl-2 homologs, the p14ARF tumor suppressor gene or procaspase-3 were introduced in cancer cells by means of non-viral, retro- and adenoviral gene transfer vectors. Analysis of signaling pathways identified the critical components in the respective model system. Interestingly, the genetic manipulation of cell cycle and apoptosis components was capable to circumvent signaling defects in resistant tumors and to overcome resistance to therapy. Such strategies could therefore serve as basis for novel, molecular therapeutic strategies in future cancer therapy.

Der Cholesterin-Stoffwechsel ist sehr streng auf zellulärer Ebene reguliert und ist essentiell für das Zellwachstum. MicroRNAs (miRNAs), eine Klasse nicht-kodierender RNAs, wurden als kritische Regulatoren der Genexpression identifiziert und entfalten ihre Wirkung vorwiegend auf posttranskriptioneller Ebene. Aktuelle Arbeiten aus der Gruppe um Fernández-Hernando haben gezeigt, dass hsa-miR-33a und hsa-miR-33b, miRNAs die in den Intronsequenzen der Gene für die Sterol-regulatorischen Element- Bindungsproteine (SREBP-2 und SREBP -1) lokalisiert sind, den Cholesterin-Stoffwechsel im Einklang mit ihren Wirtsgenen regulieren. Gleichermaßen inhibiert miR-33 Schlüsselenzyme in der Regulation der Fettsäureoxidation, einschließlich CROT, CPT1A, HADHB, SIRT6, AMPKα, genauso wie IRS2, eine wesentliche Komponente des Insulin-Signalwegs in der Leber. Diese Studie zeigt, dass hsa-miR-33 Familienmitglieder nicht nur Gene in Cholesterin- und Fettsäure-Stoffwechsel sowie Insulin-Signalwege regulieren, sondern zusätzlich die Expression von Genen des Zellzyklus und der Zellproliferation modulieren. miR-33 inhibiert die Expression der CDK6 und CCND1, wodurch sowohol die Zellproliferation als auch die Zellzyklusprogression verringert wird. Die Überexpression von miR-33 induziert einen signifikanten G1 Zellzyklusarrest. Durch eine Inhibierung der miR-33 Expression mittels 2''F/MOE-modifiziert Phosphorothioat-Backbone Antisense-Oligonukleotiden, wird die Leberregeneration nach partieller Hepatektomie (PH) in Mäusen verbessert, was auf eine wichtige Rolle für miR-33 in der Regulation der Hepatozytenproliferation während der Leberregeneration hinweist. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass Srebf/miR-33 Locus kooperieren, um Zellproliferation und Zellzyklusprogression zu regulieren, und könnte somit auch relevant für die menschliche Leberregeneration sein. / Cholesterol metabolism is tightly regulated at the cellular level and is essential for cellular growth. Cellular imbalances of cholesterol and fatty acid metabolism lead to pathological processes, including atherosclerosis and metabolic syndrome. MicroRNAs (miRNAs), a class of noncoding RNAs, have emerged as critical regulators of gene expression acting predominantly at posttranscriptional level. Recent work from Fernández-Hernando´s group and others has shown that hsa-miR-33a and hsa-miR-33b, miRNAs located within intronic sequences of the sterol regulatory element-binding protein (SREBP-2 and SREBP-1) genes, respectively, regulate cholesterol metabolism in concert with their host genes. Similarly, miR-33 targets key enzymes involved in the regulation of fatty acid oxidation including CROT, CPT1A, HADHB, SIRT6 and AMPKα, likewise, IRS2, an essential component of the insulin- signaling pathway in the liver. This study shows that hsa-miR-33 family members not only regulate genes involved in cholesterol and fatty acid metabolism and insulin signaling, but in addition modulate the expression of genes involved in cell cycle regulation and cell proliferation. Thus, miR-33 inhibited the expression of CDK6 and CCND1, thereby reducing cell proliferation and cell cycle progression. Over-expression of miR-33 induced a significant G1 cell cycle arrest and most importantly, inhibition of miR-33 expression using 2’F/MOE-modified phosphorothioate backbone antisense oligonucleotides improved liver regeneration after partial hepatectomy (PH) in mice, suggesting an important role for miR-33 in regulating hepatocyte proliferation during liver regeneration. Altogether, these data establish that Srebf/miR-33 locus may co-operate to regulate cell proliferation, cell cycle progression and may also be relevant to human liver regeneration.

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