Das Amyloid-beta Peptid (Ab) ist der Hauptbestandteil der extrazellulären Plaques bei der Alzheimerschen Krankheit. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Mechanismen der Wechselwirkungen des Ab mit der Plasmamembran und der nachfolgenden zellulären Aufnahme aufzuklären. Die Aggregation, die zelluläre Aufnahme und die Zytotoxizität von Ab42 wurden durch Verwendung von fluoreszenzmarkierten Ab42 in einem Neuroblastomzellkulturmodell untersucht. Sowohl bei Inkubation mit Monomeren als auch mit Aggregaten wurde in den Zellen Ab42 detektiert. Dabei binden Ab42 Monomere und kleine Aggregate zunächst an die Zellmembran. Allerdings erfolgt keine direkte Aufnahme von Monomeren in die Zelle. Erst nach Ausbildung von Aggregaten mit geordneter Sekundärstruktur wurde Ab42 in den endozytotischen Vesikel detektiert. Voraussetzung für den an der Membran ablaufenden Aggregationsprozess ist, dass die Monomere oberhalb einer kritischen Konzentration anwesend sind, um eine Bildung von beta-Faltblatt-Strukturen (bF) und entsprechenden Aggregaten zu ermöglichen. Ab42 Aggregate, die sich durch eine bF auszeichneten, benötigten keine kritische Schwellenkonzentration für die endozytotische Aufnahme. Eng mit der Aufnahme von Ab42 Aggregaten war die Veränderung des zellulären Metabolismus verbunden. Um die Wechselwirkung zwischen Ab und der Membrannäher zu charakterisieren, wurden Modellmembransystemen einschl. riesigen Membranvesikeln genutzt. Dabei wurde beobachtet, dass sowohl Ab42 als auch Ab40 Einstülpungen in der Membran induzieren können. Kleine Aggregate beider Isoformen, die noch keine bF aufweisen, interagierten bevorzugt mit der ungeordneten Lipidphase und induzierten dabei eine negative Membrankrümmung. Diese Beobachtungen legen den Schluss nahe, dass möglicherweise das Ab selbst den endozytotischen Prozess unterstützt oder diesen sogar einleiten könnte. Dies könnte auch auf eine mögliche physiologische Funktion von Ab Aggregaten, die nicht toxisch sind, hindeuten. / The accumulation of Amyloid beta peptide 1-42 (Ab42) in extracellular plaques is one of the pathological hallmarks of Alzheimer’s disease. Several studies have suggested that a cellular reuptake of Ab42 may be a crucial step in its cytotoxicity, but mechanisms of Ab-membrane interaction and subsequent cellular uptake are not yet understood. The first aim of the present study is to answer the question whether aggregate formation is a prerequisite or a consequence of Ab-membrane interaction and of Ab endocytosis. We visualized aggregate formation of fluorescently labeled Ab42 by Förster resonance energy transfer and tracked its internalization by human neuroblastoma cells. Both monomeric and aggregated Ab42 entered the cells, however, monomer uptake faced a concentration threshold and occurred only at concentrations and time scales that allowed beta-sheet-rich (bS) aggregates to form. By uncoupling membrane binding from internalization, we found that Ab42 monomers as well as small aggregate species bound rapidly to the plasma membrane and formed bS aggregates. These structures were subsequently taken up and accumulated in endocytic vesicles. This process correlated with inhibition of cellular metabolism activities. Our data therefore imply that the formation of bS aggregates at the cell membrane is a prerequisite for Ab42 uptake and cytotoxicity. The second aim of the study is to investigate the Ab-membrane interaction in vitro by using giant unilamellar vesicles and giant plasma membrane vesicles as model membrane systems. We found that both Ab isoforms, Ab42 and Ab40, interacted with the liquid disordered phase of model membranes. Early aggregation intermediates, which did not yet bind to the amyloiddophilic dye Thioflavin T, induced negative membrane curvature. The ability of Ab to induce membrane deformation suggests that Ab may facilitate its own endocytosis. It also hints at a possible physiological function of non-toxic Ab aggregate species.

Die vorliegende Arbeit hatte die Aufgabe, die humane Hepatomzellinie Hep G2 hinsichtlich ihrer Biotransformationskapazität zu charakterisieren, um Aussagen über ihre Eignung als in vitro-Testsystem treffen zu können. Dazu wurden die Aktivitäten und die Induzierbarkeit von unterschiedlichen Cytochrom P450 Isoenzymen (CYP) bestimmt und mit Aktivitäten von isolierten Hepatozyten der Wistarratte verglichen. Als Vertreter der Phase II-Reaktionen wurde die Konjugierung von p-Nitrophenol untersucht. Hep G2-Zellen enthielten detektierbare CYP 1 A1 und 2-Aktivitäten, was mit Hilfe des 7-Ethoxyresorufin- und des 7-Ethoxycoumarin-Assays festgestellt werden konnte. Die Enzymaktivitäten waren durch 3-Methylcholanthren und Phenobarbital induzierbar. Die Umsatzraten waren höher als in Monolayerkulturen von Rattenhepatozyten. Die Umsatzraten der Azoreduktion von 4-(N,N-Dimethylamino)azobenzen waren in Hep G2-Zellen ebenfalls höher als in Hepatozyten der Wistarratte. Hep G2-Zellen zeigten sich hinsichtlich der Demethylierung von Aminophenazon, katalysiert durch CYP 3A1 und 2, und der Konjugierung von p-Nitrophenol den Rattenhepatozyten unterlegen. Die Konjugierung war durch 3-Methylcholanthren und Phenobarbital induzierbar. Des weiteren wurde die Biotransformation von 3 potentiellen Arzneistoffen in Hep G2-Kulturen untersucht. Dabei handelte es sich um AWD 100-041(3-(2-Mercaptoethyl)chinazolin-2, 4(1H,3H)-dion), AR 12463 (5-Piperidino-7-[N-pentyl-N (ß-hydroxyethyl)]amino-s-triazolo(1,5a)-pyrimidin) und dem Lipoxygenaseinhibitor FLM 5011(2-Hydroxy-5-methyllaurophenon -oxim). In allen drei Fällen wurden zwar die gleichen Hauptmetaboliten wie in Rattenhepatozyten gebildet, die Umsatzraten waren aber wesentlich geringer. Um die Toxizität dieser drei Verbindungen und die von Solanum lycopersicon- Mazeraten zu untersuchen, wurde der Proteingehalt und der DNA-Gehalt mit Hilfe von Amidoschwarz bzw. bisBenzimid der Kulturen bestimmt. Membranschäden wurden durch den LDH Cytotoxicity Test von Boehringer Mannheim detektiert. Unter anderem konnte gezeigt werden, daß die Toxizität von FLM 5011 in Hep G2-Zellen auf die Induktion apoptotischer Prozesse zurückzuführen ist, welche durch die sinkende Konzentration von 5(S)-Hydroxyeikosatetraensäure in der Zelle ausgelöst wird. Insgesamt stellen Hep G2-Zellen ein brauchbares in vitro-Modell für Biotransformations- und Zytotoxizitätsuntersuchungen dar. / This investigations had the intention to characterise the capacity of biotransformation of the human hepatoblastoma- derived cell line Hep G2 and to draw conclusions about its suitability as in vitro-model. The enzyme activities and inducabilities of cytochrome P450 isoenzymes (CYP) as phase I reactions were measured and compared with the activity of monolayer primary cultures of rat hepatocytes. As a phase II-reaction the conjugation of p-nitrophenol was examined. Hep G2 contained detectable activities of CYP 1A1 and 2 measured by the 7-ethoxyresorufin assay and the 7-ethoxycoumarin assay and which were inducable by 3-methylcholanthrene and phenobarbitone. The turnover was higher than in rat hepatocytes. Also reductive activities, detected by the azoreduction of 4-(N,N-dimethylamino)- azobenzene, had a higher level than rat hepatocytes. Hep G2 cells were inferior compared to rat hepatocytes concerning the demethylation of aminophenazone catalysed by CYP 3A1 and 2 and the conjugation of p-nitrophenol. The latter was highly inducable by phenobarbitone. The biotransformation of the three active substances AWD 100-041 (3-(2-mercaptoethyl) chinazoline-2,4(1H,3H)-dione), AR 12463(5-piperidino-7-[N- pntyl-N (ß-hydroxyethyl)]amino-s-triazolo[1,5a)-pyrimidin) and the lipoxygenase-inhibitor FLM 5011(2-hydroxy-5- methyllaurophenone-oxim) in Hep G2 cell were also examined. In all cases the major metabolites were the same as in rat hepatocytes but the turnover was much lower than in rat hepatocytes. To study the toxicity of these three compounds and of Solanum lycopersicon mazerates the protein and the DNA content of the Hep G2 cultures were measured with amido black and bisbenzimid respectively. Membrane damages were detected by the LDH Cytotoxicity Test of Boehringer Mannheim. It could be proved that the toxicity of FLM 5011 is due to apoptotic activities aroused by the down regulation of 5-(S)hydroxyeicosatetraenoic acid. Hep G2 cells are a useful model for assessing the metabolism and toxicity of xenobiotics.

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Die Behandlung von Dysgnathien ist das Kerngebiet der Kieferorthopädie. Neben der schonenden Korrektur der Zahnfehlstellung legen Patienten im Jugend- und Erwachsenenalter zunehmend Wert auf die Optik der Apparatur. Die Entwicklung ästhetischer Brackets und Bögen strebt auf, muss aber nach aktuellem Medizinproduktegesetz vor dem kommerziellen Einsatz in vitro und in vivo einer Biokompatibilitätsprüfung unterzogen werden. Ziel der vorliegenden Promotion war es, die Biokompatibilität ästhetischer Bögen an primären gingivalen Keratinozyten (HGK) sowie primären gingivalen Fibroblasten (HGF) humanen Ursprungs zu untersuchen. Damit sollte sich die Arbeit von bisher veröffentlichten in-vitro-Studien mit L929-Zellen abheben. Die Zelllinien wurden mit den jeweiligen beschichteten und unbeschichteten Drähten verschiedener Hersteller 11 Tage inkubiert und anschließend die Zellproliferation und die Zytotoxizität analysiert. Zusätzlich wurde eine drahtlose Vergleichslinie und eine Gruppe primärer Gingivafibroblasten 3 Tage als Kurzzeitstudie untersucht. Für die Quantifizierung der vitalen und avitalen Zellen wurde der Cytotox-Glo™-Assay verwendet. Lichtmikroskopische Untersuchungen sollten sicherstellen, dass eine gesunde Zellmorphologie vorliegt und die Zellen eine gute Adhäsion zur Probe aufweisen. Sowohl bei den Keratinozyten als auch bei den Fibroblasten traten signifikante Steigerungen der Zytotoxizität und der Zellproliferation häufig sowohl beim verblendeten als auch beim unverblendeten Probendraht eines Herstellers auf, unabhängig mit welchem Material verblendet wurde. Eine gesteigerte Zytotoxiztiät bei gleichbleibender Zellproliferation im Vergleich zur Kontrollgruppe spricht für einen negativen Einfluss der Drahtprobe auf die Biokompatibilität. Dieses Ergebnis fand sich bei den HGK bei den sowohl verblendeten als auch unverblendeten Drähten von zwei Herstellern (WCO, TPO). Auch bei den Fibroblasten fielen die Drähte von WCO sowie TPO mit einer gesteigerten Zytotoxizität und sogar signifikant niedrigerer Zellproliferation nach 3 Tagen Inkubation auf, was sich nach 11 Tagen allerdings änderte. Ab da waren die Zytotoxiztität und die Zellproliferation gesteigert. Eine erhöhte Zytotoxizität bei gleichbleibender Zellproliferation zeigten die Hersteller Forestadent, Ortho-Technology und Dentalline nach 3 Tagen; Dentalline mit seinen verblendeten Drähten auch bis nach 11 Tagen Inkubation. Hieraus kann geschlussfolgert werden, dass die Kunststoffverblendung von Dentalline sowohl kurz- als auch längerfristig einen negativen Einfluss auf die Fibroblasten hat. Positiv fiel hingegen der Hersteller GC-Orthodontics mit seinem rhodinierten sowie unverblendeten Draht auf. Sowohl die HGK als auch die HGF zeigten eine gute Biokompatibilität. Qualitativ zeigte sich bei den Keratinozyten im Lichtmikroskop ein mehr oder weniger dichter Zellrasen an allen Drahtproben. Es gab nur wenige Unterschiede bezüglich der Hersteller oder der Art der Verblendung. Bei den Fibroblasten zeigten sich klarere Unterschiede, welche sich teilweise mit den quantitativen Ergebnissen deckten. Bei den beschichteten Drähten von American-Orthodontics, Teledenta, Ortho-Technology und Dentalline fand sich kein konfluenter Zellrasen, ebenso beim unverblendeten NiTi-Draht von Ortho-Technology sowie World-Class-Orthodontics. Ein dichter Zellrasen konnte hingegen an beiden Drähten des Herstellers GCOrthodontics detecktiert werden. Aus den Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass alle Verblendmaterialien biokompatibel sind. Bei der Wahl des zu verwendenden Bogens können sowohl Epoxyresin-, Teflonals auch andere Kunststoffbeschichtungen empfohlen werden. Dagegen werden die herstellerspezifischen Unterschiede bezüglich der Biokompatibilität deutlich. Als Grund kann das herstellereigene Nickel-Titan-Grundgerüst vermutet werden. Die Zellen kamen damit sowohl bei den unbeschichteten als auch bei den beschichteten Drähten in Berührung, da die meißten Drähte nur einseitig beschichtet waren.:Abbildungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Ästhetik in der Kieferorthopädie 1.2 Beschichtungsmaterialien ästhetischer Bögen 1.2.1 Rhodium 1.2.2 Kunststoffbeschichtungen 1.2.2.1 Polytetrafluorethylen 1.2.2.2 Epoxyresin 1.3 Untersuchung der Bioverträglichkeit 1.4 Zielstellung der Studie 2 Material und Methode 2.1 Material 2.1.1 Vorbereitende Maßnahmen und allgemeine Ergänzungen 2.1.1.1 Chemikalien und Gase 2.1.1.2 Medium und Puffer 2.1.1.3 Fertigsysteme 2.1.1.4 Geräte und Hilfsmittel 2.1.1.5 Verbrauchsmaterial 2.1.2 Kieferorthopädische Drähte 2.1.3 Zelltypen 2.2 Methode 2.2.1 Versuchsvorbereitung 2.2.2 Auszählen der Zellen 2.2.3 Aufbereitung der Zellen nach der Inkubation 2.2.4 Statistische Auswertung der ermittelten Zellzahlen 3 Ergebnisse 3.1 Zytotoxizitätsrate 3.1.1 Zytotoxizitätsrate der primären Gingivaepithelzellen nach 11 Tagen Inkubation 3.1.2 Zytotoxizitätsrate der primären Gingivafibroblasten nach 3 Tagen Inkubation 3.1.3 Zytotoxizitätsrate der primären Gingivafibroblasten nach 11 Tagen Inkubation 3.2 Proliferationsrate 3.2.1 Proliferationsrate der primären Gingivaepithelzellen nach 11 Tagen Inkubation 3.2.2 Proliferationsrate der primären Gingivafibroblasten nach 3 Tagen Inkubation 3.2.3 Proliferationsrate der primären Gingivafibroblasten nach 11 Tagen Inkubation 3.3 Qualitative Beurteilung der Zelladhärenz an allen untersuchten Bögen nach 11 Tagen mittels Lichtmikroskop 3.3.1 Zelladhärenz der primären Gingivaepithelzellen 3.3.2 Zelladhärenz der primären Gingivafibroblasten 4 Diskussion 5 Zusammenfassung Literaturverzeichnis Anlage 1: Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens Anlage 2: Bestätigung über Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben

The relative configuration of the marine sesquiterpenoid oxyfungiformin, isolated from the soft coral Capnella fungiformis, was confirmed by synthesis using the natural product guaiol as chiral precursor. The absolute configuration of oxyfungiformin could be assigned by combination of X-ray diffraction and comparison of the values for the specific optical rotation. Oxyfungiformin and a diastereoisomer showed cytotoxic activity in cells originating from cancers of the lung, breast, and cervix.

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Die vorliegende Arbeit beinhaltet die Generierung und Evaluation von Natürlichen Killerzellen, die EGFRvIII-positive und SDF-1alpha sekretierende primäre Glioblastomzellen aufspüren, erkennen und effizient abtöten können. Die Kombination der gelenkten Zytotoxizität mit einer optimierten Migration von Effektorzellen des Immunsystems wird auf Grundlage der in dieser Arbeit gewonnenen Daten als ein vielversprechender Ansatz für eine zukünftige Therapie des primären Glioblastoms vorgeschlagen.

Die vorliegende Arbeit beinhaltet die Generierung und Evaluation von Natürlichen Killerzellen, die EGFRvIII-positive und SDF-1alpha sekretierende primäre Glioblastomzellen aufspüren, erkennen und effizient abtöten können. Die Kombination der gelenkten Zytotoxizität mit einer optimierten Migration von Effektorzellen des Immunsystems wird auf Grundlage der in dieser Arbeit gewonnenen Daten als ein vielversprechender Ansatz für eine zukünftige Therapie des primären Glioblastoms vorgeschlagen.

Chorea Huntington (HD) ist eine neurodegenerative Erkrankung, die durch Ablagerungen von N-terminal Polyglutamin-reichen Huntingtin (Htt) -Fragmenten in den betroffenen Neuronen charakterisiert ist. Das mutierte Htt (mHtt) Protein wird ubiquitär exprimiert. Das zellspezifische Absterben von „medium-sized spiny neurons“ (MSN) wird jedoch im Striatum von HD Patienten verursacht (Albin, 1995). Es wird angenommen, dass Striatum-spezifische Proteine, die mit Htt interagieren, eine wichtige Rolle in der Pathogenese von HD spielen (Ross, 1995). Protein-Protein-Interaktionsstudien haben gezeigt, dass einige der Htt-Interaktionspartner mit unlöslichen Htt-Ablagerungen in den Gehirnen von HD-Patienten kolokalisieren und die Bildung von Protein-Aggregaten beeinflussen (Goehler, 2004). Kürzlich wurde durch die Integration von Genexpressions- und Interaktionsdaten ein Striatum-spezifisches Protein-Interaktionsnetzwerk erstellt (Chaurasia, unveröffentlichte Daten). Eines der identifizierten Proteine ist CRMP1 (collapsin response mediator protein 1), das spezifisch in Neuronen exprimiert wird und möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von HD spielt. Experimentelle Untersuchungen mithilfe eines Filter-Retardationsassays zeigten, dass CRMP1 die Anordnung von Htt zu fibrillären, SDS-unlöslichen Aggregaten verringert. Durch Rasterkraftmikroskopie wurde der direkte Effekt von CRMP1 auf den Aggregationsprozess von Htt bestätigt. Ko-Immunopräzipitationsstudien zeigten, dass CRMP1 und Htt in Säugerzellen unter physiologischen Bedingungen miteinander interagieren. Es wurde nachgewiesen, dass CRMP1 die Polyglutamin-abhängige Aggregation und Toxizität von Htt in Zell- und Drosophila-Modellen von HD moduliert. Außerdem konnte CRMP1 in neuronalen Ablagerungen in R6/2 Mäusegehirnen und dessen selektive Spaltung durch Calpaine gezeigt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Lokalisation und Funktion von CRMP1 bei der Krankheitsentstehung verändert werden. / Huntington’s disease (HD) is a neurodegenerative disorder characterized by the accumulation of N-terminal polyglutamine (polyQ)-containing huntingtin (Htt) fragments in affected neurons. The mutant Htt (mHtt) protein is ubiquitously expressed but causes specific dysfunction and death of striatal medium-sized spiny neurons (MSNs) (Albin, 1995). It is assumed that striatum specific proteins interacting with Htt might play an important role in HD pathogenesis (Ross, 1995). Previous protein-protein interaction (PPI) studies demonstrated that many Htt-interacting proteins colocalize with insoluble Htt inclusions in HD brains and modulate the mHtt phenotype (Goehler 2004). A striatum-specific, dysregulated PPI network has been created recently by integrating PPI networks with information from gene expression profiling data (Chaurasia, unpublished data). One of the identified dysregulated proteins potentially involved in HD pathogenesis was the neuron-specific collapsin response-mediator protein 1 (CRMP1). Here, I show that CRMP1 reduces the self-assembly of SDS-insoluble mHtt protein aggregates in vitro, indicating a direct role of CRMP1 on the mHtt aggregation process. Coimmunoprecipitation studies showed that CRMP1 and Htt associate in mammalian cells under physiological conditions. In addition, CRMP1 localizes to abnormal neuronal inclusions and efficiently modulates polyQ-mediated Htt aggregation and toxicity in cell and Drosophila models of HD. This suggests that dysfunction of the protein is crucial for disease pathogenesis. Finally, I observed that CRMP1 localizes to neuronal inclusions and is selectively cleaved by calpains in R6/2 mouse brains, indicating that its distribution and function are altered in pathogenesis. In conclusion, this study presents new findings on the function of CRMP1 and its role in the pathogenesis of HD. The protein interacts with Htt and modulates its aggregation and toxicity, in this way influencing the molecular course of the disease.

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