Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CHAPTER I: Leprosy presents a clinical spectrum that spans from a strong cellular mediated
immunity and bacili growth control of Mycobacterium leprae at the tuberculoid pole
to a poor T cell immunity with extensive bacterial load at the lepromatous pole.
The antigenic profile characterization in both clinical forms is a necessary step for
discover and evaluation of recombinant peptides that are mimotopes of M. leprae
antigens, which may present immunogenic potential, in order to obtain a beTer
understanding of the disease evolution, and allowing the improvement of
diagnosis, prognosis and therapeutics. Mimotopes of M. leprae antigens were
selected from a random heptapeptide conformational library expressed in fusion
with the pIII protein of the M13 phage, using as the ligand target the total purified
IgM from leprosy patients of clinical forms, tuberculoid (TT) and lepromatous (LL),
and a healthy control population. Recombinant peptides were selected by glycine
elution (unspecific) and by mitsudin elution (specific). All clones, after bioinformatic
analyses, were validated by immunoenzymatic and colony reduction assays. For
the glycine selection, the TT pole presented 24 distinct fagotypes, while the LL
pole presented only 14 fagotypes. For the mitsudin selection, only 4 fagotypes
were obtained in the LL pole, and 8 fagotypes in the TT pole. The two most
frequent mimotopes, in both TT and LL poles and in both elution protocols, were
coincidents. The peptides LFPAMHQ and VERHPST were more frequent in the LL
pole, and the peptides KNPTTGT and ETHPTTR were more frequent in the TT
pole. The three cited first mimotopes had an accentuated plaque reduction with
incubation of sera from LL patients; however, the mimotope ETHPTTR presented
the highest reduction with sera from TT patients. The immunogenic potential of
these mimotopes may be useful in the development of new diagnostic and
therapeutic strategies for leprosy control in the future. CHAPTER II: The phenolic glycolipid 1 (PGL-1) is a membrane antigen highly specific of M.
leprae, and it is not found in other mycobacteria. Serological tests with PGL-1
have been performed to detect circulating antibodies in multibacillary patients. Due
to its importance in the clinical classification of leprosy patients, we have
developed mimotopes of this non-proteic antigen through phage display in order to
improve serological assays. In this investigation, a random heptapetide
conformational library was selected to obtain specific ligands to the monoclonal
antibody anti-PGL-1 CS-48. After three rounds of selection, 14 clones were
sequenced and translated, generating six distinct peptides. The mimotope
HWMLPED was the most frequent one (57%), suggesting an immunodominance.
Serological tests with this mimotope were performed in comparison to the
synthetic PGL-1 for 39 patients, classified according to their clinical form, together
with their 44 household contacts, classified according to their index cases. Results
were similar for T and LL patients. However, the intermediate forms were variable,
differently from those results with PGL-1, which presented positivity only for
multibacillary patients. The clinical form BT presented a seropositivity of 55.5% for
the mimotope against 0% for the PGL-1, probably due the greater avidity of the
mimotope to circulating antibodies, or due to the greater spepcificity of the
peptide in detecting pure neural reaction, or yet a cross reaction with other
human antibodies. The serological tests of household contacts for this same
phage clone presented an average positivity of 20.5% versus an average of 7.5 for
the PGL-1 antigen. It is probable that there was cross reaction of the mimotope
with other antibodies; once it presented partial identity with other M. leprae
proteins. The mimotopes must be further investigated, once they may be putative
targets for the PGL-1 action in the immune humoral response, and also they could
be useful in diagnostics and therapeutic strategies. / CAPITULO I: A hanseníase apresenta um espectro clínico que varia de uma forte resposta
imune mediada por células e controle do crescimento do bacilo Mycobacterium
leprae no pólo tuberculóide (T), a uma anergia em resposta celular, com alta
carga bacteriana, no pólo virchoviano (V). A caracterização do perfil antigênico do
bacilo nas formas clínicas se faz necessária para que novos peptídeos
recombinantes, mimotopos de antígenos de M. leprae, sejam avaliados quanto ao
seu potencial imunogênico, para que se tenha um melhor entendimento dos
mecanismos de evolução da doença, e para permitir o aprimoramento do
diagnóstico, prognóstico e terapêutica. Mimotopos de antígenos de M. leprae
foram selecionados a partir de uma biblioteca conformacional de heptapeptídeos
randômicos expressos em fusão com proteína pIII de fagos M13, utilizando como
alvo ligante IgM total purificada de pacientes portadores de hanseníase de ambos
os pólos, tuberculóide e virchoviano, e de contatos intradomiciliares sadios. Os
peptídeos recombinantes foram selecionados por eluição em tampão glicina
(inespecífico) e por eluição com mitsudina (específico). Todos os clones, após
análises de bioinformática, foram validados por ensaios imunoenzimáticos e
alguns por ensaios de redução de colônias. Na eluição com glicina, o pólo
tuberculóide apresentou 24 fagótopos distintos, enquanto que o virchoviano
apresentou 14. Já na eluição com mitsudina, foram obtidos apenas 4 fagótopos
para pólo virchoviano e 8 para o pólo tuberculóide. Os dois mimotopos mais
freqüentes, em ambas as formas clínicas e para as duas eluições foram
coincidentes, sendo que os peptídeos LFPAMHQ e VERHPST foram os mais
freqüentes no pólo virchoviano e os peptídeos KNPTTGT e ETHPTTR os mais
freqüentes no pólo tuberculóide. Os três primeiros peptídeos, dos quatro acima
citados, tiveram redução de colônias mais acentuada com soro de pacientes V, e
o mimotopo ETHPTTR foi o que apresentou a maior redução com soro de
pacientes T. O potencial imunogênico destes mimotopos pode ser útil no
desenvolvimento de novas estratégias diagnósticas e terapêuticas para o controle
da hanseníase. CAPITULO II: O Glicolipídeo Fenólico-1 (PGL-1) é um antígeno de membrana altamente
específico de M. leprae, não sendo encontrado em outras micobactérias. Os
testes sorológicos com o PGL-1 têm sido implementados para a detecção de
anticorpos circulantes nas formas clínicas multibacilares. Por ser um alvo
importante na classificação clínica dos pacientes, procurou-se desenvolver
peptídicos miméticos deste antígeno não-protéico por phage display, como forma
de aprimorar o teste sorológico. Neste estudo uma biblioteca conformacional de
heptapeptídeos randômicos foi selecionada para obtenção de ligantes específicos
ao anticorpo monoclonal anti-PGL-1 CS-48. Após 3 ciclos de seleção, 13 clones
foram seqüenciados e traduzidos, gerando seis mimotopos distintos. O mimotopo
HWMLPED foi o mais freqüente (61,5%), indicando ser imundominante entre os
peptídeos. Testes sorológicos com este mimotopo foram realizados em
comparação com o PGL-1 sintético para 37 pacientes, classificados conforme a
forma clínica, juntamente com seus 44 contatos, classificados conforme seus
casos índice. Os resultados obtidos com o mimotopo e PGL-1 foram similares nos
pacientes com as formas clínicas polares T e V. Contudo, as formas
intermediárias dimorfas foram altamente variáveis e significantes, diferentemente
do PGL-1, que apresentou positividade somente para as formas multibacilares. A
forma clínica DT, apresentou 55,5% de positividade com a utilização do fagótopo,
contra 0% para o PGL-1, podendo ser uma maior avidez do fagótopo ao anticorpo
circulante, ou maior especificidade do fagótopo para lesão neural pura, como
também reação cruzada com outros anticorpos. O teste sorológico em contatos
intradomiciliares para o fagótopo selecionado, apresentou uma média de 20,5%
de positividade contra uma média de 7,5% no teste sorológico para o PGL-1. É
provável que tenha ocorrido reação cruzada do mimotopo por este apresentar
identidade parcial com proteínas do M. leprae. Os mimotopos devem ser
analisados mais profundamente, pois podem indicar provável alvo de ação do
PGL-1 na resposta imune humoral e ainda podem ser usados em estratégias
diagnósticas e terapêuticas. / Doutor em Genética e Bioquímica
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/urn:repox.ist.utl.pt:RI_UFU:oai:repositorio.ufu.br:123456789/15692 |
| Date | 22 February 2007 |
| Creators | Oliveira, Jaqueline das Dores Dias |
| Contributors | Goulart, Isabela Maria Bernardes, Goulart Filho, Luiz Ricardo, Brígido, Marcelo de Macedo, Foss, Norma Tiraboschi, Kipnis, Thereza Liberman |
| Publisher | Universidade Federal de Uberlândia, Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica, UFU, BR, Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFU, instname:Universidade Federal de Uberlândia, instacron:UFU |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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