Introdução: O consumo de drogas é um problema de saúde pública e o combate ao crack coloca em evidência uma das atuais fragilidades do Sistema de Saúde no Brasil. Os níveis de atenção não se encontram integrados e há falta de conhecimento sistematizado para a Atenção Primária à Saúde (APS). Objetivo: Buscar, por meio de Revisão Sistemática, abordagens efetivas no manejo de adultos usuários de crack no contexto da APS. Metodologia: Revisão sistemática realizada nas principais bases de dados eletrônicos e estudos adicionais, no período de 2003 a 2013, com adultos maiores de 19 anos de idade, usuários de crack, sem distinção inicial de estudos por delineamentos e com Língua Portuguesa, Espanhola ou Inglesa. Foram usados dois instrumentos de avaliação da qualidade das evidências científicas – o Health Evidence Bulletin Wales, 2004, e o Grade Working Group (2008). Resultados: De 2017 estudos encontrados nas buscas bibliográficas, e após duas etapas de seleção, foram eleitos 31 estudos e incluídos 16 artigos, 6 com delineamentos observacionais e 10 de intervenção. Dos estudos observacionais, 2 foram avaliados com boa qualidade, e, dos 10 estudos de intervenção, 1 estudo foi classificado com qualidade de evidência moderada, 5 com baixa qualidade de evidência e 4 com muito baixa qualidade de evidência. Conclusões: A Revisão Sistemática não obteve artigos que apresentassem evidências de alta qualidade para serem orientadas ao contexto da APS. O limite estipulado para busca de estudos nos últimos dez anos limitou o aporte de referências com evidências, e permanecem as orientações anteriores a este período. Contudo, foi possível traçar uma proposta para este contexto que pode ser detalhada e merece ser avaliada pelos pares, especialistas em APS. / Introduction: Drug use is a public health problem and combating crack highlights one of the weaknesses of the current health system in Brazil. The levels of care are not integrated and there is a lack of systematic knowledge for dealing with this problem in Primary Health Care. Objective: Search through Systematic Review, effective approaches in the management of adult crack users in the context of the Primary Health. Methodology: A Systematic Review performed in major electronic databases and additional studies in the period 2003-2013, in adults older than 19 years old, crack users, irrespective of study design and including for Portuguese, Spanish or English . We used two evaluation instruments to grade scientific evidence - the Health Evidence Bulletin Wales, 2004 and the Grade Working Group (2008). Results: Of 2017 studies found from literature searches, and after two selection steps 31 studies were elected and 16 articles included, 6 with observational and 10 intervention designs. Two observational studies were evaluated with good quality and among the ten intervention studies, one study was classified with moderate quality of evidence, five with low quality of evidence and four with very low quality of evidence. Conclusions: This Systematic Review did not obtain articles with evidence of high quality to be oriented to the context of Primary Health Care. The limit set for search of studies over the past decade, limited the supply of references with evidence, and the guidelines prior to this period remain. However, it was possible to outline a proposal for this context which can be detailed and should be evaluated by peers, experts in Primary Health Care.

Ornithodoros brasiliensis Aragão é um carrapato endêmico do Brasil, restrito às regiões serranas e frias do estado do Rio Grande do Sul. É uma espécie bastante agressiva aos humanos, causando febre, muita dor e intensa resposta inflamatória no local da picada. O ciclo biológico de O. brasiliensis (ovo a adulto, única geração) realizado nos anos 50, utilizando ratos brancos como hospedeiros, levou um total de 103 e 184 dias de amplitude, com máximo de 7 ínstares ninfais observados e com emergência de adultos a partir de N4, estando os machos em maior proporção. Os hospedeiros apresentaram febre e uma bactéria espiroqueta denominada Borrelia brasiliensis foi descrita de esfregaços sanguíneos desses animais. Porém as borrélias não puderam ser cultivadas por muito tempo, e acabaram desaparecendo. Houve um silêncio de mais de 50 anos sobre relatos de ocorrência de O. brasiliensis, deixando inclusive dúvidas se a espécie estava extinta de fato. No entanto, há cerca de quatro anos, alguns espécimes de carrapatos da mesma localidade foram coletados e identificados como O. brasiliensis. O presente trabalho teve por objetivos estudar a morfologia e a biologia de O. brasiliensis, em condições de laboratório, bem como investigar a presença de bactérias do gênero Rickettsia em espécimes coletados. Ninfas e adultos foram alimentados em cobaias de laboratório e as fêmeas acasaladas realizaram posturas que resultaram nas gerações sucessivas. A larva e os adultos foram descritos e redescritos, e comparados com as espécies próximas, O. rostratus e O. turicata. Análises moleculares de uma porção do gene 16S rDNA mitocondrial foram comparadas com as sequências depositadas no GenBank e apresentaram valores de máximo bootstrap de 100% para ambas, O. rostratus e O. turicata. O ciclo biológico completo (ovo a ovo) de O. brasiliensis foi obtido entre 215,4 e 195 dias, em média, para duas gerações consecutivas, respectivamente. Os períodos médios de pré-oviposição, oviposição e incubação dos ovos (em dias), para a geração F1 foram 76,7 ± 27,01 (31-117); 15,55 ± 5,36 (10-24); 10,6 ± 4,5 (3-19) e para geração F2 foram 54,1 ± 8,7 (40-65), 15,8 ± 8,9 (7-36); 15,4. Os períodos médios de pré-ecdise larval foram de 12,5 ± 1,8 (10-15), considerando as duas gerações. A larva não se alimenta, enquanto que há um repasto sanguíneo para cada instar ninfal, antes de cada muda. Um total de 5 instares ninfais foi observado, sendo que os períodos médios de préecdise para os instares N1, N2, N3, N4 e N5, respectivamente para as duas gerações foram de 33,3 ± 4 (32-45), 38,6 ± 2,5 (36-47), 31,1 ± 3,4 (28-42), 34,8 ± 3,3 (31-43), 37,2 ± 2,4 (35-41) e 32,5 ± 3,3 (29-40), 37,5 ± 2,5 (34-44), 34,6 ± 3,2 (31- 37), 36,5 ± 2,5 (34-42), 32,5 ± 0,7 (32-33). Os períodos médios de alimentação para os ínstares ninfais, foram semelhantes nas duas gerações, sendo de 28,62 ± 3,67 (25,2 35,1) minutos. Adultos alimentam-se repetidas vezes, e as posturas sempre são precedidas de repasto sanguíneo, embora somente dois ciclos gonotróficos foram observados. O primeiro ciclo gonotrófico apresentou maior número de ovos depositados, com 139 ± 13,8 (53 197) em relação ao segundo 73,8 ± 10,6 (53 123). A investigação da presença de riquétsia foi avaliada em 107 espécimes recentemente coletados, evidenciando um total de 12 exemplares positivos. O produto amplificado pela PCR foi sequenciado e as análises moleculares apresentaram homologia de 98% com sequências disponibilizadas no Genbank, correspondentes a uma espécie asiática denominada RDa420 (AF497584) e outra brasileira, Rickettsia bellii (DQ865204) . / Ornithodoros brasiliensis Aragão is an endemic tick to Brazil, restricted to the highlands and cold regions of the state of Rio Grande do Sul. This species is very aggressive to humans, causing fever, great pain and intense inflammatory response at the site of the bite. The life cycle of O. brasiliensis (egg to adult, single generation) previously performed (studied during 50\') using white mice as host, spent a total of 103 and 184 days of amplitude, with maximum 7 nymphal instars observed, with adult emerging from N4, and males in greater proportion. The hosts had fever and spirochete bacteria called Borrelia brasiliensis was described from blood of the animals used. Nevertheless borrelias could not be cultivated for a long time, and they eventually disappeared. A silence of more than 50 years on reports of occurrence of O. brasiliensis, left doubts about whether the species was extinct. However, about four years ago, some specimens of ticks were collected in the same locality and identified as O. brasiliensis. This work aimed to study the morphology and biology of O. brasiliensis, under laboratory conditions, and investigate the presence of bacteria of the genus Rickettsia in the collected ticks. Nymphs and adults were fed on laboratory guinea pigs, and mated females laid eggs that resulted in the successive generations. The larvae and adults have been described and redescribed, respectively, and compared with the closely related species, O. rostratus and O. turicata. Molecular analyzes of a portion of the mitochondrial 16S rDNA gene was compared with the sequences deposited in GenBank, showing maximum bootstrap values out of 100% for both O. rostratus and O. turicata. In this study, the complete life cycle (egg to egg) of O. brasiliensis was obtained between 215,4 and 195 days, on average, for the two generations studied, respectively. The average periods of preoviposition, oviposition and incubation of the eggs to the F1 generation were 76,7 ± 27,01 (31-117), 15,55 ± 5,36 (10-24), and to F2 were 54,1 ± 8,7 (40-65), 15,8 ± 8,9 (7-36). The averaging periods to the preecdysis of the larvae were 12,5 ± 1,8 (10-15), considering the two generations. The larva does not feed, while for the nymphs there is a blood meal for each instar, before each molt. A total of five nymphal instars was observed, and the average periods of pre-molt instars for N1, N2, N3, N4 and N5, for two generations, respectively, were 33,3 ± 4 (32-45), 38,6 ± 2,5 (36-47), 31,1 ± 3,4 (28-42), 34,8 ± 3,3 (31-43), 37,2 ± 2,4 (35-41) and 32,5 ± 3,3 (29-40), 37,5 ± 2,5 (34- 44), 34,6 ± 3,2 (31-37), 36,5 ± 2,5 (34-42), 32,5 ± 0,7 (32-33). The average feeding time of nymphal instars, were similar in the two generations, being 28,62 ± 3,67 (25,2 35,1) minutes. Adults fed repeatedly, and the postures were always preceded by blood meal, although only two gonotrophic cycles have been observed. The first gonotrophic cycle presented higher average number of eggs deposited 139 ± 13,8 (53-197) that the second 73,8 ± 10,6 (53 123). The investigation to the presence of rickettsia was performed in 109 recently collected ticks, showing a total of 12 positive specimens. The amplified PCR product was sequenced and molecular analyzes showed 98% homology with sequences available in Genbank, corresponding to an Asian species named RDa420 (AF497584) e another Brazilian strain named Rickettsia bellii (DQ865204).

Orientador: Rafael Silva Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T23:35:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_AlineLopese_M.pdf: 3394396 bytes, checksum: 696ed48aed8374dfcb4e215ad3c94135 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Eventos de neblina constituem uma importante fonte de água em vários ecossistemas terrestres, pois molham as superfícies foliares das plantas sem aumentar significativamente o conteúdo de água no solo. A água interceptada pode escoar ou ser absorvida diretamente pelas folhas inclusive de espécies lenhosas. No entanto, pouco se sabe sobre o papel ecológico desse processo e os mecanismos e estruturas envolvidos no transporte de água do exterior para os tecidos foliares, especialmente em espécies tropicais. Nesse contexto, avaliamos as vias anatômicas envolvidas na absorção de água pelas folhas e elucidamos as consequências desse processo no desempenho ecofisiológico, crescimento e sobrevivência de três espécies lenhosas comuns em matas nebulares do sudeste brasileiro, Drimys brasiliensis, Eremanthus erythropappus e Myrsine umbellata. Experimentos com água deuterada e sais traçadores apoplásticos mostraram que as espécies são capazes de obter água diretamente pelas folhas. A absorção foliar pode contribuir em até 42% do conteúdo de água das folhas em D. brasiliensis, que inclusive apresentou fluxo reverso de seiva e menores taxas de transpiração noturna quando expostas à neblina. A água pode difundir diretamente pelas cutículas foliares em todas as espécies. Os tricomas tectores de E. erythropappus e os tricomas glandulares peltados de M. umbellata parecem ser estruturas importantes para a absorção de água nessas espécies. Após transpor a barrreira cuticular, as soluções podem difundir pelas vias apoplásticas da epiderme e do parênquima das folhas das três espécies e atingir o xilema de E. erythropappus e acumular nas células coletoras de M. umbellata. A alta concentração de compostos hidrofílicos nos tecidos foliares de D. brasiliensis e M. umbellata pode ter contribuído na retenção das soluções no mesofilo destas espécies. A borrifação de ramos causou aumento imediato do status hídrico foliar nas espécies, benefício também observado em um experimento de longa duração. Após dois meses, plantas das três espécies que receberam neblina exclusivamente na parte aérea apresentaram maior potencial hídrico, fotossíntese e condutância estomática em comparação às plantas do tratamento de seca em casa de vegetação. D. brasiliensis apresentou 100% de mortalidade após um mês no tratamento de seca. O conteúdo relativo de água no solo das plantas dessa espécie sob neblina manteve-se constante ao longo do experimento, indicando que a neblina pode ter sido usada como fonte de água transpirada neste período. E. erytropappus foi a única espécie que manteve taxas de crescimento e sobrevivência semelhantes entre os tratamentos, sendo que e os benefícios da nebulização só se tornaram evidentes no final do segundo mês. O conteúdo de água no solo das plantas de M. umbellata foi reduzido nos tratamentos de neblina e seca, mas não observamos reduções no potencial hídrico, condutância estomática e fotossíntese. Estes dados sugerem que a absorção de água pelas folhas desta espécie causou um desacoplamento das relações hídricas foliares e das trocas gasosas em relação à disponibilidade de água no solo. Demonstramos que durante eventos de neblina, as três espécies lenhosas de matas nebulares tropicais podem absorver água diretamente pelas folhas. Este processo favorece a hidratação, o desempenho ecofisiológico, o crescimento e a sobrevivência das plantas, mesmo sob baixa disponibilidade de água no solo. / Abstract: Fog deposition is an important water source in several terrestrial ecosystems. Fog water intercepted by the plants can run off to the soil or be absorbed by the leaves. However, very little is known about the ecological role of fog and the mechanisms and structures involved in foliar water uptake by woody species in tropical environments. In this context, we investigated the anatomical pathways involved in the process of foliar uptake of water and evaluated the consequences of this process in the ecophysiological performance, growth and survival of three common woody species from Brazilian cloud forests: Drimys brasiliensis, Eremanthus erythropappus e Myrsine umbellata. Greenhouse experiments using artificial fog enriched in deuterium and labelling experiments with fluorescent apoplastic tracers demonstrated that the three species absorbed water directly through their leaf surfaces. Leaf water uptake contributed to as much as 42% of total foliar water content in D. brasiliensis. Fog exposition caused reversals in sap flow and reduced nighttime transpiration for this species. Water diffused directly through leaf cuticles in all species. Tector trichomes of E. erythropappus and glandular peltate trichomes of M. umbellata are important pathways for water uptake in these species. After the cuticular barrier was transposed, solutions moved through apoplast routes at the epidermis and parenchyma in all species, reaching the xylem in E. erythropappus and accumulating on collector cells of M. umbellata. The high abundance of hidrofilic compounds found on leaf surfaces of D. brasiliensis and M. umbellata may have contributed to the great retention of solution with apoplastic tracers in the mesophyll of these species. Sprayed water on isolated branches caused an immediate increase in leaf water status in the three species, a benefit also observed in a long-term experiment. After two months, plants under the fog treatment improved leaf water potential, photosynthesis and stomatal conductance in relation to plants exposed to drought in a greenhouse experiment. Species responses to the treatments were different. D. brasiliensis had 100% mortality after a month under drought. Soil water content (SWC) of fogged plants was constant throughout the experiment, suggesting that fog water might have been used as the main water source for transpiration during this period. E. erytroppappus was the only species with similar growth and survival rates in all treatments and the beneficial effects of fog water was only observed after two months. For M. umbellata, SWC decreased substantially in the drought and fog treatments but no decrease in water potential, photosynthesis and stomatal conductance was observed. For this species, fog water deposition caused a decoupling of foliar water relations and gas exchange from soil water availability.We demonstrated that the three cloud forest woody species can absorb water directly through their leaves during fog deposition, allowing shoot rehidratation and improving ecophysiological performance, growth and survival when soils are dry. / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestre em Biologia Vegetal

O diabetes, relacionado ao estresse celular, altera consideravelmente a cicatrização de úlceras cutâneas. O látex da seringueira Hevea brasiliensis tem se apresentado como importante indutor da cicatrização especialmente nas ulcerações comprometidas pelo diabetes no qual foi observado clinicamente estímulo do látex à total reepitelização. Foram avaliadas as modificações teciduais e os mecanismos de ação da fração proteica (F1) do látex na cicatrização de úlceras cutâneas em ratos diabéticos e não diabéticos. Inicialmente, foi testada a citotoxicidade da F1 em culturas de fibroblastos NIH-3T3 e queratinócitos humanos pelo método MTT. Em seguida, foram utilizados 80 ratos Wistar, dos quais 40 foram induzidos ao diabetes (DM) (por streptozotocina 45 mg/Kg) e 40 não-diabéticos (N), submetidos a úlceras dorsais por punch (1,5 cm de diâmetro), as quais foram tratadas com gel de carboximetil-celulose (CMC) 4% (DM/N-sham) e CMC+F1 0,01% (DM/N-F1), seguidos por 2, 7, 14 e 21 dias após a lesão. Após eutanasiados 10 animais/tempo/grupo, biópsias da pele/úlcera/cicatriz foram coletadas para estudo da reepitelização pelo cálculo do índice de cicatrização; histomorfometria (HE e Gomori) para quantificação de infiltrado inflamatório, vasos, fibroblastos e % da área de colágeno; imunoistoquímica para OSM, OSMR-, iNOS, VEGF, eNOS, TGF-1, IGF, e sinalizadores da insulina: IRS, AKT, SHC e ERK; dosagem do estresse oxidativo (NO-óxido nítrico, LPM-lipoperóxidos de membranas, MPO-mieloperoxidase, MDA-malondialdeído, FOX-H2O2 e defesas antioxidantes: GSH-glutationa e TRAP-Capacidade Antioxidante Total e citometria de fluxo para CD11b+, CD4+ e CD8+. A fração F1 apresentou-se atóxica em relação às culturas de fibroblastos NHI-3T3 e queratinócitos humanos. Além disso, a pele diabética (sem tratamento) apresentou maior quantidade de infiltrado inflamatório (p=0,0001) e estresse oxidativo [NO (p=0,0473) e LPM (p=0,0001)] que a não diabética. No entanto, o DM diminuiu na pele os níveis de angiogênese (p=0,0001), VEGF (p=0,0002) e eNOS (p=0,0206) bem como a sinalização da insulina (IRS-p=0,0001, AKT-p=0,0041, SHC-p=0,0006, ERK-p=0,0002) em relação dos não diabéticos. Quando a proteína F1 foi utilizada no tratamento das úlceras dos ratos diabéticos, houve importante quimiotaxia de células inflamatórias para a úlcera até o 7° dia (p=0,0452), especialmente PMN, com maior estresse oxidativo [OSM, OSMR-, iNOS, NO, MPO, FOX e LPM (p=0,0001)], além de assemelhar-se à cicatrização normal (grupo N sham). Este estímulo à fase inflamatória e ao estresse oxidativo pareceu favorecer as próximas fases da cicatrização, aumentando a angiogênese, VEGF e eNOS no 14° e 21° dia, o que certamente favoreceu a reepitelização (p=0,0026). Os efeitos da associação F1 x DM também pareceu estimular a fibroplasia no 14° e 21° dia (p=0,0121) e colagênese (p=0,0001). Além disso, F1 associada ao DM permitiu maior expressão de IRS, SHC e ERK diferente do DM sham e também semelhante ao N sham. Sendo assim, o maior recrutamento de células inflamatórias, estímulo à produção de citocinas e fatores de crescimento, o estresse oxidativo desencadeado até o 14° dia, o importante estímulo à fibroplasia e colagênese bem como a importante ativação da sinalização da insulina, outrora diminuída nos diabéticos, foram fatores essenciais que permitiram a total reepitelização das úlceras cutâneas tratadas com F1 nos ratos diabéticos. / Diabetes, stress-related cellular changes considerably the healing of skin ulcers. The latex of the rubber tree Hevea brasiliensis has emerged as an important inducer of healing ulcerations especially in compromised by diabetes in which it was clinically observed stimulation of latex to complete reepithelialization. We evaluated the tissue changes and the mechanisms of action of the protein fraction (F1) of the latex on the healing of cutaneous ulcers in diabetic and nondiabetic rats. Initially, we tested the cytotoxicity of F1 in cultured fibroblasts NIH-3T3 and human keratinocytes by MTT method. Then, we used 80 Wistar rats, of which 40 were induced diabetes (DM) (by streptozotocin 45 mg / kg) and 40 non-diabetic (N), dorsal ulcers underwent punch (1.5 cm diameter) , which were treated with gel of carboxymethyl cellulose (CMC) 4% (MD / N-sham) or CMC 0.01% + F1 (DM/N-F1), followed by 2, 7, 14 and 21 days after injury. After euthanized 10 animals / time / group, biopsies of skin / ulcer / scar were collected for the study of reepithelialization by calculating the rate of healing; histomorphometry (HE and Gomori) for quantification of inflammatory infiltrate, vessels, fibroblasts and collagen% of the area ; immunohistochemistry for OSM, OSMR-, iNOS, VEGF, eNOS, TGF-1, IGF and insulin signaling: the IRS, AKT, ERK and SHC; dose of oxidative stress (NO, nitric oxide, LPM-membrane lipoperoxides, MPO, myeloperoxidase, MDA-malondialdehyde, FOX-H2O2 and antioxidant defenses: GSH-glutathione and TRAP-total antioxidant capacity and flow cytometry for CD11b +, CD4 + and CD8 +. fraction F1 presented nontoxic of cultures fibroblast NIH- 3T3 cells and human keratinocytes. In addition, diabetic skin (no treatment) had higher amounts of inflammatory infiltrate (p = 0.0001) and oxidative stress [NO (p = 0.0473) and LPM (p = 0.0001)] that non-diabetic. However, DM skin decreased levels of angiogenesis (p = 0.0001), VEGF (p = 0.0002) and eNOS (p = 0.0206) as well as insulin signaling (IRS P = 0.0001, p = 0.0041 AKT-,-SCH p = 0.0006, ERK-p = .0002) than non-diabetic subjects. When the F1 protein was used in the treatment of ulcers of diabetic rats , there was a significant chemotaxis of inflammatory cells for the ulcer to the 7th day (p = 0.0452), especially PMN with higher oxidative stress [OSM, OSMR-, iNOS, NO, MPO, FOX and LPM (p = 0 , 0001)], and resemble the normal healing (sham group N). This stimulation of the inflammatory and oxidative stress seemed to favor the next phases of wound healing by increasing angiogenesis, VEGF and eNOS in 14 and 21 days , which certainly favored the re-epithelialization (p = 0.0026). The effects of the combination F1 x DM also appeared to stimulate fibroplasia in 14 and 21 days (p = 0.0121) and collagenesis (p = 0.0001). In addition, F1 associated with DM allowed a greater expression of IRS, SHC and ERK different from sham DM and also similar to N sham. Thus, the increased recruitment of inflammatory cells, stimulate the production of cytokines and growth factors, stress oxidative triggered until the 14th day, the important stimulus to fibroplasia and collagenesis well as the important activation of insulin signaling, once diminished in diabetics, were key factors that allowed total reepithelialization of cutaneous wounds treated with F1 in diabetic rats.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fernanda.pdf: 2058487 bytes, checksum: 8d18627071331444bbad758cdb3863e5 (MD5) Previous issue date: 2006-08-31 / The temperature-dependent dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of Paracoccidioidomycosis (PCM), a human systemic mycosis highly prevalent in countries of Latin America. P. brasiliensis is subjected to different insults from human host, such as oxidative stress caused by reactive oxygen species produced by the host during the infection. Thioredoxin (TRX) is an intracellular redox protein that is required to maintain redox homeostasis in response to both reductive and oxidative stress conditions in several organisms. We report here the characterization of a 811 bp cDNA Pbtrx1, encoding a PbTRX1 of 116 amino acids, with a predicted molecular mass of 12 kDa and pI 5.2. This putative protein presented one highly conserved active site motif (WCGPC) between TRXs from several organisms. The phylogenetic analysis performed with PbTRX1 and TRXs from other organisms, putted P. brasiliensis in the fungi clade. We also performed the prediction of the secondary structure of PbTRX1 that shows a pattern characteristic of the open twisted alpha/beta, similar to TRX secondary structures described in other fungus. In order to obtain the recombinant PbTRX1, the expression construct pGEX-4T-3-trx1 was introduced into Escherichia coli cells and the expression and purification of the recombinant protein was obtained. The recPbTRX1 and PbTRX1 from yeast cells extract were found to catalyze the reduction of insulin. However the PbTRX1 from yeast cells extract treated with H2O2 showed highly insulin reduction activity than the yeast cells no treated. PbTRX1 was detected by Western blotting in the extracts from yeast cells growth and from mycelium to yeast transition. The yeast cells growth was significantly inhibited by H2O2; however the mycelium to yeast transition was little affected by this oxidant. Semi-quantitative RT-PCR was employed to analysis the expression of Pbtrx1 gene in response to H2O2. The level of Pbtrx1 transcripts was higher in yeast cells treated with H2O2 than in yeast cells no treated. To realize how P. brasiliensis deals with oxidative stress is essential to understand the mechanisms involved in its survival in the host. It may be possible that PbTRX1 enhances survival of P. brasiliensis in the host, protecting the fungus against the reactive oxygen species and allowing, in this way, the progress of the infection. / O fungo termodimórfico, Paracoccidioides brasiliensis, é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica humana, com alta prevalência na América Latina. No hospedeiro humano, o fungo P. brasiliensis está sujeito a vários insultos, tais como o estresse oxidativo causado pelas espécies reativas de oxigênio, que são produzidas pelas células de defesa do hospedeiro durante a infecção. A tiorredoxina (TRX) é proteina redox intracelular que participa da manutenção da homeostase redox da célula, tanto em condições de estresse oxidativo quanto redutor. Neste trabalho apresentamos a caracterização de um cDNA de 811 pb, designado como Pbtrx1, que codifica para uma proteína, PbTRX1, de 116 resíduos de aminoácidos com massa molecular predita de 12 kDa e pI de 5,2. PbTRX1 apresentou um motivo de sítio ativo conservado (WCGPC) entre as TRXs de vários organismos. Análise filogenética com PbTRX1 e TRXs de outros organismos colocou P. brasiliensis no clado de fungos. Foi também realizada a predição da estrutura secundária da PbTRX1, que apresentou um padrão característico formado por cadeias-β que estão envolvidas por α-hélices. Para obter a proteína recombinante, recPbTRX1, foi realizada a construção do pGEX-4T-3-trx1 e este foi introduzido nas células de Escherichia coli. Assim, a expressão e purificação da proteína recombinante foi obtida. A proteína recPbTRX1 e a PbTRX1, presente no extrato protéico de células leveduriformes, apresentaram atividade redutora de insulina. Entretanto, a PbTRX1 presente no extrato protéico de células leveduriformes tratadas com H2O2, mostrou maior atividade redutora de insulina quando comparada com extrato de células leveduriformes não tratadas. A PbTRX1 foi detectada, por Western blotting, em extratos de células leveduriformes em crescimento e durante a transição de micélio para levedura. O crescimento das células leveduriformes foi inibido por H2O2, entretanto a transição de micélio para levedura foi pouco afetada por este oxidante. A técnica de RT-PCR semi-quantitativo foi empregada para análise da expressão do Pbtrx1 em resposta ao H2O2. O nível de transcritos de Pbtrx1 foi maior nas células leveduriformes tratadas com H2O2 do que nas células não tratadas. Para compreender como P. brasiliensis lida com estresse oxidativo é essencial entender os mecanismos envolvidos em sua sobrevivência no hospedeiro. É possível que PbTRX1 aumente a sobrevivência de P. brasiliensis no hospedeiro, protegendo o fungo contra espécies reativas de oxigênio e, desta maneira, permitindo o progresso da infecção.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica e endêmica na América Latina com maior prevalência no Brasil, Colômbia e Venezuela. A doença é causada pelos fungos P. brasiliensis e P. lutzii. As células dendríticas são eficientes apresentadoras de antígenos e quando utilizadas como adjuvante podem ser de 100 a 1000 vezes mais efetiva nesta função. O peptídeo P10 corresponde a um trecho específico de 15 aminoácidos derivado da gp43, principal antígeno diagnóstico, e é reconhecido pelos linfócitos T CD4+ capaz de induzir resposta preferencialmentedo tipo Th1 e conferindo proteção no modelo experimental. Células indiferenciadas foram obtidas a partir de medula óssea de camundongos machos BALB/c B10.A, cultivadas na presença de GM-CSF e IL-4 por 9 dias, para a diferenciação de células dendríticas (DC). As células foram incubadas na presença do P10 por 2 horas, em estufa com 5% de CO2 a 37°C, e foram utilizadas nas imunizações. A maturação das células foi observada por citometria de fluxo com os marcadores CD11c, MHC-II, CD80 e CD86. Camundongos da linhagem BALB/c e B10.A foram submetidos à imunossupressão com dexametasona, por 20 dias, seguido pela infecção intratraqueal com o isolado Pb18. Após 30 dias, os grupos foram tratados com DCs ou DCs pulsadas com P10 em associação ou não com sulfametoxazol/Trimetoprim, por um período de 15 dias. O sacrifício ocorreu 45 dias após a infecção e foram retirados os pulmões, baço e fígado para quantificação de carga fúngica, análise histológica e dosagem de citocinas. Observamos diminuição significativa da carga fúngica nos pulmões dos animais que receberam DCs pulsadas com P10 associada ou não ao tratamento medicamentoso. Não foi observado crescimento fúngico em outros órgãos como fígado e baço em ambos os grupos. A análise histológica revelou redução da carga fúngica e preservação do parênquima pulmonar nos grupos tratados com Dcs pulsadas com P10. As dosagens das citocinas indicaram uma resposta imune mista Th1/Th2. Inicialmente reportamos que as DCs pulsadas com P10 reduz a carga fúngica em camundongos infectados. Neste trabalho, reportamos que as DCs pulsadas com P10 podem também reduzir a carga fúngica em animais anérgicos, mimetizando pacientes com a forma aguda/subaguda da doença / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic and endemic mycosis in South America, with higher prevalence in Brazil, Colombia and Venezuela. This disease is caused by fungi P. brasiliensis and P. lutzii. The peptide P10 matches a specific path of 15 amonoacids which is derived from gp43, main diagnostic antigen. This peptide is recognized by the T CD4+ lymphocytes and induces a response type Th1, giving protection at an experimental mode. Some dendritic cells (DC) have an efficient antigen and, when used as adjuvant, they can be 100 to 1000 times more effective. Undifferentiated cells were obtained from bone marrow of male mice type BALB/c and B10.A and cultivated in the presence of GM-CSF and IL-4 for 9 days, so that DCs would be differentiated. The cells were incubated in the presence of P10 for 2 hours in incubator at 37°C with 5% of CO2, and later utilized in the immunizations. Maturation of the cells was observed by flow cytometry with CD11c, MHC-II, CD80 and CD86 markers. Mice types BALB/c and B10.A had been submitted to an immunosuppression with dexamethasone for 20 days, before being intratracheally infected with isolate Pb18. After 30 days, the group of animals received immunizations with DCs or DCs pulsed with P10 associated or not with the treatment by Sulfametoxazol/Trimetoprim, this for a period of 15 days. The sacrifice occurred 45 day after the animals had been infected, and their lungs, spleen and liver were taken out for quantification of fungal burden, histology and cytokine assay. We observed a significant decrease of fungal burden in the lungs of animal that received DC pulsed with P10, associated or not with the drug treatment. In both groups we didn\'t observe fungal growth in organs such as liver and spleen. The histological analyses showed reduced fungal burden and preservation of lung parenchyma. The dosages of cytokines showed an immune response mixed Th1/Th2 type. At first we reported that the DCs pulsed with P10 were responsible for reducing the fungal burden in infected mice. In this paper we report that the DCs pulsed with P10 may also be responsible for reducing fungal burden in anergic animals, mimicking patients with the acute/subacute form of the disease

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:30:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao maria regilda araujo fernandes.pdf: 889828 bytes, checksum: eeac21e7e2102f6042640b9c030c3870 (MD5) Previous issue date: 2009-02-27 / The pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiologic agent of Paracoccidioidomycosis (PCM). The main route of contamination is the inhalation of fungal propagules that convert to yeast in the host tissues. The urease is among the factors of virulence described for dimorphic fungus. It hydrolyzes the urea producing molecules of ammonia and carbamate. Pbure has 3,012 bp, corresponding to a predicted protein of 837 amino acids, predicted molecular mass of 90 kDa and pI 6.0. PbURE has signature to nickel-dependent enzyme for its activity. The phylogenetic relationship between PbURE and urease from other fungi was evaluated. The cDNA that encodes PbURE was inserted into the expression vector pET-32a and recombinant protein of 103 kDa was expressed. Polyclonal antibody were produced against PbUREr and used on Western blot, Far-Western blot and ELISA. The results showed that PbUREr interferes on interaction between P. brasiliensis and pulmonary epithelial cells A549. PbUREr was able to bind to proteins fibronectin and type IV collagen, components of the extracellular matrix (ECM). The interaction between PbURE and calnexin protein was identified by the technique of two-hybrid. / O fungo patogênico humano Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da Paracoccidioidomicose (PCM). A principal via de contaminação é a inalação de micélios ou conídios do fungo que se convertem em leveduras no hospedeiro. Dentre os fatores de virulência descritos para fungos dimórficos está a urease, a qual hidrolisa uréia produzindo amônia e carbamato. Pbure possui 3.012 pb, correspondendo a uma proteína predita de 837 aminoácidos, massa molecular predita de 90 kDa e pI 6.0. PbURE possui assinatura de uma enzima dependente de níquel para sua atividade. A relação filogenética entre PbURE e ureases de outros fungos foi avaliada. O cDNA que codifica PbURE foi inserido no vetor de expressão pET-32a e a proteína recombinante de 103 kDa foi expressa. Anticorpo policlonal foi produzido contra PbUREr e utilizados nos ensaios de Western blot, Far-Western blot e ELISA. Os resultados mostram que PbUREr interfere na interação entre P. brasiliensis e células epiteliais pulmonares A549. PbUREr foi capaz de se ligar às proteínas fibronectina e colágeno tipo IV, componentes da matriz extracelular (MEC). A interação entre PbURE e a proteína calnexina foi identificada através da técnica de duplo-híbrido.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2017-09-01T13:05:01Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Wanderson Lucas da Costa - 2017.pdf: 3043089 bytes, checksum: 32c1b9c81dae778ab37d939fdba41eb5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-09-15T13:46:23Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Wanderson Lucas da Costa - 2017.pdf: 3043089 bytes, checksum: 32c1b9c81dae778ab37d939fdba41eb5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-15T13:46:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Wanderson Lucas da Costa - 2017.pdf: 3043089 bytes, checksum: 32c1b9c81dae778ab37d939fdba41eb5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-08-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioides spp. are thermodymorphic fungi that when inhaled by humans, these conidia find a favorable environment, changing to the yeast phase and becoming pathogenic causing paracoccidioidomycosis (PCM), one of the most prevalent systemic mycoses in Brazil. Some antifungals are used in the treatment of PCM. Treatment depends on the patient's progression and tolerability of each drug, but their treatment may be for long periods and cause various side effects in the patient. The chiquimate pathway is coordinated by 7 enzymes that perform consecutive steps to convert erythrose-4-phosphate and phosphoenol pyruvate (PEP) into chorismate. In microorganisms, this pathway is involved in the production of the amino acids phenylalanine, tyrosine and tryptophan; These amino acids are essential to the maintenance of these organisms. In this work, pGEX4T3 vector cloning and heterologous expression of Pb18 EPSP synthase belonging to the chiquimate pathway were performed. This protein was expressed in E. coli (DE3) strain and purified. Antibodies were produced for expression analysis of the protein in Western blot. The modeling of EPSP synthase was performed aiming to identify the amino acids involved in the active site. The pull down-GST assay with soluble Pb18 proteins allowed the identification of 40 proteins that interact with EPSP synthase. These proteins belong to different functional categories, which are involved with the availability of phosphoenol pyruvate, the substrate necessary for the functioning of the chiquimate pathway. / Paracoccidioides spp. são fungos termodimórficos que ao serem inalados pelo ser humano, esses conídios encontram um ambiente propício, mudando para a fase de levedura e tornando-se patogênico causando a paracoccidioidomicose (PCM), umas das micoses sistêmicas de maior prevalência no Brasil. Alguns antifúngicos são empregados no tratamento da PCM. O tratamento depende do avanço da doença e da capacidade de tolerância do paciente a cada medicamento, mas o seu tratamento pode ser por longos períodos e causando diversos efeitos colaterais no paciente. A via do chiquimato é coordenada pela ação de 7 enzimas que realizam passos consecutivos para transformar a eritrose-4-fosfato e fosfoenol piruvato (PEP) em corismato. Em micro-organismos, esta via está envolvida com a produção dos aminoácidos fenilalanina, tirosina e triptofano; estes aminoácidos são essenciais à manutenção desses organismos. Neste trabalho foi realizado a clonagem em vetor pGEX4T3 e expressão heteróloga da EPSP–sintase de Pb18 pertencente à via do chiquimato. Essa proteína foi expressa em linhagem E. coli (DE3) e purificada. Os anticorpos foram produzidos para análise da expressão da proteína em Western blot. A modelagem da EPSP-sintase foi realizada visando identificar os aminoácidos envolvidos no sítio ativo. O ensaio de pull down-GST com proteínas solúveis de Pb18 possibilitou a identificação de 40 proteínas que interagem com EPSP-sintase. Essas proteínas pertencem a diferentes categorias funcionais, as quais estão envolvidas com a disponibilidade de fosfoenol piruvato, substrato necessário para o funcionamento da via do chiquimato.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-04-24T13:45:43Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andrea Leite Camargo Santana - 2017.pdf: 3114758 bytes, checksum: 4fa4c3e9a2e7062f2940b053f1250619 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-04-24T13:46:06Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andrea Leite Camargo Santana - 2017.pdf: 3114758 bytes, checksum: 4fa4c3e9a2e7062f2940b053f1250619 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-24T13:46:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Andrea Leite Camargo Santana - 2017.pdf: 3114758 bytes, checksum: 4fa4c3e9a2e7062f2940b053f1250619 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-03-29 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Paracoccidioides fungi are the causative agents of paracoccidioidomycosis, an endemic disease in Latin America with great socioeconomic importance. Inhalation of spores, the infectious particles of the fungus, is a common way to get the infection. Its treatment is slow and generates long-term side effects making it necessary to study new metabolic pathways that can be potential targets for antifungal development. In this context, stands out the chiquimate pathway in Paracoccidioides spp., related to the production of chorismate and production of aromatic amino acids, and the chorismate synthase involved in the last stage of this pathway. The chorismate synthase from Pb18 was cloned into pGEX-4T3 vector, expressed in pLysS cells and purified on a glutathione-sepharose column. Antibodies were produced from the immunization of mice with the recombinant protein obtained and used in Western blot assay to confirm protein expression. For characterization of the enzyme, its modeling was carried out. Pull-down-GST assay was performed to identify interactions between the chorismate synthase and soluble proteins present in total protein extract of Pb18. The interactions found included proteins of different functional categories related to protein synthesis, related with metabolism of common intermediates such as folate and quinolinate or related with the availability of ATP, phosphoenolpyruvate and erythrose-4-phosphate required in the chiquimate pathway. Unexpected interactions with proteins of the cell cycle and also with regulating proteins of the cell division process were observed. / Fungos do gênero Paracoccidioides são os agentes causadores da paracoccidioidomicose, uma doença endêmica na América Latina de grande importância socioeconômica. A inalação de esporos, partículas infecciosas do fungo, é uma forma comum de adquirir a infecção. O seu tratamento é lento e gera efeitos colaterais tornando necessário o estudo de novas vias metabólicas que sejam potenciais alvos para o desenvolvimento de antifúngicos. Nesse contexto, destaca-se a via do chiquimato em Paracoccidioides spp., relacionada à obtenção de corismato e produção de aminoácidos aromáticos, sendo corismato sintase a enzima envolvida na última etapa dessa via. A corismato sintase proveniente de Pb18 foi clonada em vetor pGEX-4T3, expressa em células pLysS e purificada em coluna de glutationa-sefarose. Anticorpos foram produzidos a partir da imunização de camundongos com a proteína recombinante obtida e utilizados em ensaio de Western blot a fim de confirmar a expressão proteica. A modelagem da corismato sintase foi realizada e os aminoácidos envolvidos no sítio ativo foram identificados. Ensaios de pull-down-GST foram realizados a fim de identificar os complexos de interações entre a corismato sintase e proteínas solúveis presentes em extrato proteico total de Pb18. As interações encontradas incluíram proteínas de diferentes categorias funcionais relacionadas à síntese proteica, ao metabolismo de intermediários comuns como folato e quinolinato ou ainda com a disponibilidade de ATP, fosfoenolpiruvato e eritrose-4-fosfato necessários na via do chiquimato. Interações inesperadas com proteínas do ciclo celular e também com proteínas reguladoras do processo de divisão celular foram observadas.

Paracoccidioides brasiliensis, um fungo termodimórfico, é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica prevalente da América Latina. A patogenicidade aparenta estar intimamente relacionada com a transição dimórfica da forma de micélio para a de levedura, que é induzida pela mudança da temperatura do ambiente pela temperatura do hospedeiro mamífero. Há poucas informações disponíveis sobre genes de P. brasiliensis que são necessários durante a fase patogênica. Nós, então, realizamos as técnicas de SSH (“Suppression Subtraction Hybridization”) e de “Macroarray” com o objetivo de identificar genes que sejam preferencialmente expressos na fase leveduriforme do isolado Pb18. Genes identificados em ambos os procedimentos estão mais expressos na fase leveduriforme e estão envolvidos em metabolismo básico, transdução de sinal, crescimento e morfogênese e metabolismo do enxofre. Para testar se as mudanças observadas na expressão gênica refletem as diferenças entre as condições de crescimento usadas para obter as duas formas morfológicas preferivelmente às diferenças intrínsecas dos tipos celulares, nós realizamos experimentos com RT-PCR em tempo real utilizando preparações de RNA derivadas de ambas as fases, micélio e levedura, crescidas a 26°C e 37°C nos meios de cultura completos (YPD e Sabouraud) e meio mínimo. Vinte genes, incluindo AGS1 ( -1,3-glucan synthase) e TSA1 (thiol-specific antioxidant), foram mostrados como mais expressos na levedura patogênica em relação ao micélio. Embora a expressão de RNA mensageiro foi bastante diferente em relação aos meios completos e meio mínimo, mostramos uma tendência geral para que esses genes serem mais expressos nas células leveduriformes patogênicas de P.x brasiliensis. Além disso, mostramos a complementação dos genes METR e SCONC de P. brasiliensis e uma cepa com estes genes deletados de Aspergillus nidulans, sugerindo uma possível homologia entre eles. Mostramos também a análise de genes da via do metabolismo do enxofre foram mais expressos na levedura patogênica de P. brasiliensis em relação ao micélio saprofítico. / Paracoccidioides brasiliensis, a thermodimorphic fungus, is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a prevalent systemic mycosis in Latin America. Pathogenicity appears to be intimately related to the dimorphic transition from the hyphal to the yeast form, which is induced by a shift from environmental temperature to the temperature of the mammalian host. Little information is available on the P. brasiliensis genes necessary during the pathogenic phase. We have therefore undertaken Suppression Subtraction Hybridization (SSH) and macroarray analyses with the aim of identifying genes that are preferentially expressed in the yeast phase. Genes identified by both procedures as being more highly expressed in the yeast phase are involved in basic metabolism, signal transduction, growth and morphogenesis, and sulfur metabolism. In order to test whether the observed changes in gene expression reflect the differences between the growth conditions used to obtain the two morphological forms rather than differences intrinsic to the cell types, we performed real-time RT-PCR experiments using RNA derived from both yeast cells and mycelia that had been cultured at 37 and 26°C in either complete medium (YPD or Sabouraud) or minimal medium. Twenty genes, including AGS1 ( 1,3-glucan synthase) and TSA1 (thiol-specific antioxidant), were shown to be more highly expressed in the yeast cells than in the hyphae. Although their levels of expression could be different in rich and minimal media, there was a general tendency for these genes to be more highly expressed in the yeast cells. Moreover, complementation of P. brasiliensis METR and SCONC genes in strains of Aspergillus nidulans with these genes deleted suggested a possible homology between them. We show the analyses of genes involved in the xii sulphur metabolism pathway and these genes were more expressed in the pathogenic yeast than saprophytic mycelia of P. brasiliensis.