O Ensaio Cometa (Eletroforese em Gel de Célula Única) foi aplicado ao estudo do potencial genotóxico da β-naftoflavona (BNF) em exposição in vivo a eritrócitos de robalos, Centropomus parallelus. Condições específicas para o ensaio cometa de células de sangue de robalos foram estabelecidas com base em informações obtidas em literatura; e através de experimentos com exposição in vitro a diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio, e com desenrolamento e eletroforese em diferentes alcalinidades e voltagens. Para avaliar o potencial genotóxico da BNF, os peixes foram expostos a 1ppm e 5ppm de BNF por 24, 48 e 72 horas. Controles foram mantidos em água do mar e em água do mar com DMSO, utilizado com solvente. Células de sangue foram coletadas, submetidas a ensaio cometa em versão alcalina de pH>13 e coradas por prata. Os cometas foram analisados por métodos visuais, incluindo Índice de Danos, Porcentagem de Danos e Freqüência de Danos, e através do sistema de análise de imagem ScionImage. Exposições in vitro de eritrócitos a H2O2 resultaram em relação dose-resposta em pH 12,6 e pH>13, indicando aplicabilidade do ensaio a células de sangue de robalos. Exposições in vivo a BNF indicaram tendência a maior Índice de Danos em grupos expostos comparados a controles, porém não ocorreu diferença significativa estatisticamente. A grande amplitude de variação dos dados, em controles e nos demais grupos experimentais, dificultou sua análise e interpretação. / Single Cell Gel Electrophoresis or Comet Assay was applied to study the genotoxic potential of exposure in vivo to β-naphthoflavone (BNF) on erythrocytes of fat snook, Centropomus parallelus. Specific conditions for the comet assay on fat snook blood cells were established based on information obtained from literature together with results of experiments in which slides were exposed in vitro to different concentrations of hydrogen peroxide, submitted to unwinding and electrophoresis at different alkalinity and different voltages. To assess the genotoxic potential of BNF, fish were exposed in vivo to 1ppm and 5ppm of BNF for 24, 48 and 72 hours. Controls were exposed to sea water only and sea water plus DMSO, used as carrier. Blood cells were collected, submitted to alkaline version of comet assay at pH>13 and silver stained. Comets were analyzed by visual methods including Damage Index, Percentage of Damage and Frequency of Damage, and by ScionImage image analysis system. In vitro expositions of erythrocytes to H2O2 resulted in dose-response relationship, at pH 12,6 and pH>13, indicating applicability of the assay to blood cells of fat snook. In vivo exposure to BNF showed a slight tendency towards a higher Damage Index, though not statistically significant, in exposed groups as compared to controls. Wide amplitude of variations of data, in the controls as well as in other experimental groups, made their analysis and interpretation difficult.

Foram avaliados as atividades quimiopreventivas da β-ionona (BI) e do geraniol (GR) durante a etapa de promoção da hepatocarcinogênese. Ratos Wistar foram submetidos ao modelo de hepatocarcinogênese do \"Hepatócito Resistente\" e receberam durante 5 semanas consecutivas: 16 mg/100 g p.c. de BI, 25 mg/100 g p.c. de GR, 16 mg/100 g p.c. de BI + 25 mg/100 g p.c. de GR ou somente 25 ml/100 g p.c. de óleo de milho (grupo OM, controle). Em comparação ao grupo OM, o grupo BI apresentou menor multiplicidade de nódulos hepáticos e os grupos BI, GR e GR+BI apresentaram menor número de lesões pré-neoplásicas (LPN) persistentes e maior porcentagem de LPN em remodelação. Comparados ao grupo OM, o grupo BI apresentou menor área de LPN em remodelação e menor porcentagem da área do corte histológico ocupado por LPN persistentes enquanto o grupo GR apresentou menor porcentagem da área do corte histológico ocupado por LPN em remodelação. O tratamento com BI tendeu a reduzir o colesterol plasmático e inibir a proliferação celular em LPN. O grupo GR apresentou maior número de corpúsculos apoptóticos em LPN persistentes em comparação ao grupo OM. Comparados ao grupo OM, os grupos BI e GR+BI apresentaram menor porcentagem de LPN hepáticas em remodelação positivas para a proteína p53 citoplasmática. Já o grupo GR apresentou maior porcentagem de LPN hepáticas persistentes positivas para p53. Os níveis da proteína RhoA nas membranas celulares hepáticas foram menores no grupo GR quando comparados aos do grupo OM. Assim, BI e GR são quimiopreventivos supressores promissores da hepatocarcinogênese. / Chemopreventive activities of β-ionone (BI) and geraniol (GR) were evaluated during promotion phase of hepatocarcinogenesis. Wistar rats received GR (25 mg/100 g body weight), BI (16 mg/100 g body weight), GR (25 mg/100 g body weight) +BI (16 mg/100 g body weight) or corn oil (CO, control). Multiplicity of hepatic nodules were smaller in BI group, compared to CO group. BI, GR and GR+BI groups presented decreased number of persistent preneoplastic lesions (PNL) and increased % of remodeling PNL. BI group presented decreased % liver section area occupied by persistent and remodeling PNL. GR group presented decreased % liver section area occupied by remodeling PNL. BI group tended to present reduced cholesterol concentration and inhibited cell proliferation. GR group increased number of apoptotic bodies in persistent PNL. BI and GR+BI groups reduced the % of remodeling and increased the % of persistent p53 positive PNL. RhoA protein in cellular membranes was reduced in GR group. Thus, BI and GR could be considered as chemopreventive agents against hepatocarcinogenesis.

A carcinogênese é um processo longo que envolve múltiplas etapas na transformação das células normais em malignas. Duas hipóteses têm sido propostas para explicar o potencial heterogêneo de células neoplásicas e o processo de desenvolvimento de neoplasias: o modelo estocástico, em que uma população distinta de células neoplásicas adquire um conjunto de mutações somáticas e desenvolve capacidade metastática e o modelo hierárquico, no qual neoplasias primárias e suas metástases são iniciadas por um número pequeno de células, conhecidas \"cancer stem cells\" (CSC). Assim, o HCC poder ser originado de células tronco/progenitoras hepáticas ou células ovais e hepatócitos. Aventou-se a hipótese neste trabalho que a BI reduz o número de células ovais hepáticas, regulando proteínas (CK19, β-catenina e ALDH1A1) que possam estar relacionadas ao papel destas células na hepatocarcinogênese. Ratos Wistar foram submetidos ao modelo de hepatocarcinogênese do \"Hepatócito Resistente\" e receberam durante 4 semanas consecutivas: 16mg/100g p.c. de β-ionona (BI) ou somente 0,25mL/100g p.c. de óleo de milho (grupo controle - OM). Estes animais foram distribuídos em 4 pontos de eutanásia (P0, P1, P2 e P3 - 7, 14, 21 e 35 dias após a HP respectivamente), para avaliação da cinética das células ovais hepáticas. Foi observado que o tratamento com BI diminuiu a presença de células ovais GST-P positivas e reduziu o percentual de LPN positivas para ALDH1A1, β-catenina e CK19 quando comparado ao do respectivo grupo controle OM. Em conclusão, o tratamento com BI reduziu o número das células ovais, bem como os níveis de proteínas a elas relacionadas e que conferem ao HCC mau prognóstico e maior agressividade. / Carcinogenesis is a long process that involves multiple phases in the transformation of normal cells into malignant. Two hypotheses have been proposed to explain the heterogeneous potential of neoplastic cells and the process of carcinogenesis: a stochastic model in which a distinct population of neoplastic cells acquires a set of somatic mutations and develops metastatic capacity and hierarchical model in which the primary tumors and their metastases are initiated by a small number of cells, known \"cancer stem cells\" (CSC). Therefore, the HCC can be originate from stem/progenitor cells or hepatic oval cells and hepatocytes. Ventured the hypothesis in this work that β-ionone (BI) reduces the number of hepatic oval cells, regulating proteins (CK19, β-catenin and ALDH1A1) that may be related to the role of these cells in hepatocarcinogenesis. Wistar rats were submitted to hepatocarcinogenesis model of \"Resistant Hepatocyte\" and received for 4 consecutive weeks: 16mg/100g body weight of BI or 0,25 mL/100g body weight of corn oil (control group - CO). These animals were euthanized at 4 points (P0, P1, P2 and P3 - 7, 14, 21 and 35 days after PH, respectively) to evaluate the kinetics of hepatic oval cells. It was observed that the treatment of BI decreased the presence of GST-P oval cells positive and reduced the percentage of positive ALDH1A1 LPN, β-catenin and CK19 compared to the respective control group OM. In conclusion, the treatment with BI reduced the number of oval cells as well as the levels of proteins related to them and gives a poor prognosis in HCC and increased aggressiveness.

A disfunção cognitiva é definida como alterações dos processos mentais e sua detecção é feita com auxílio de testes neuropsicológicos. Pesquisas vem sendo realizadas na tentativa de estabelecer prováveis marcadores neurobioquímicos precoces para estimar morte neuronal. O presente estudo avaliou 24 cães distribuídos em dois grupos: GC grupo controle (até 8 anos) (n=10) e GI grupo idoso (acima de 8 anos) (n=14). Todos os animais foram submetidos ao tratamento periodontal sob anestesia geral e avaliados previamente quanto à presença de outras doenças sistêmicas. Para tal foram submetidos a teste neurológico completo, exame cardiológico e à colheita de sangue venoso periférico para realização de hemograma completo, perfil renal e hepático. Os animais foram avaliados quanto a cognição com auxílio de duas escalas neuropsicológicas (ARCAD e CCDR) e à avaliação dos valores séricos das proteínas marcadoras de danos neuronais (NSE e S100β), nos períodos pré e pós-operatórios. Constatou-se aumento significativo da proteína S100β no GI em relação ao GC (p=0,014) no momento pré-operatório, e também entre os momentos pós-extubação nos animais do GC (p=0,04). Por meio das escalas comportamentais empregadas, não foi possível detectar a disfunção cognitiva no pós-cirúrgico de cães idosos submetidos a procedimento cirúrgico-anestésico. Os valores obtidos da proteína S100β sugerem que os animais idosos possuem possível neuroinflamação pré-operatória, ocasionada por inflamação sistêmica ou mesmo central; entretanto não foi possível correlacionar com as escalas comportamentais empregadas / Cognitive dysfunction is defined as changes in mental processes and it detection is performed with the aid of neuropsychological tests. Recently research has been conducted in attempt to establish early neuro biochemicals markers to estimate neuronal death. This study evaluated 24 dogs that were distributed into two groups: CG - control group (up to 8 years old) (n = 10) and EG - elderly group (over 8 years) (n = 14). All animals underwent periodontal treatment under general anesthesia and were previously evaluated to detect the presence of systemic diseases. A complete neurological and cardiac examination were performed in all animals and also a peripheral venous blood samples were collected for blood count, kidney and liver profile. The animals were assessed for cognition by using two neuropsychological scales (ARCAD and CCDR) and the assessment of serum levels of protein markers of neuronal damage (NSE and S100β) pre and postoperatively. A significant increase in S100β protein in EG compared to the CG (p = 0.014) in the preoperative period was observerd and also between the post-extubation times in the animals of CG (p = 0.04). Through behavioral scales used it was not possible to detect cognitive dysfunction in the postoperative elderly dogs underwent surgical - anesthetic procedure. The values of S100β protein suggest that elderly animals may have preoperative neuroinflammation caused by systemic or central inflammation; however we could not correlate with the behavioral scales

Neste trabalho estudamos vários fatores que tem uma forte influência sobre o comportamento da alumina- &#946 &#34, um condutor iônico para íons de sódio com composição 8,85%Na2O+0,75%Li2O+90,40%Al2O3 (% em peso). O papel das impurezas freqüentemente encontradas na alumina-&#945 obtida pelo processo Bayer, tais como cálcio, silício e ferro, é estudado na alumina -&#946 &#34. Dopagem destas impurezas, separadas e em conjunto, na alumina-&#946 &#34 mostram a forte influência que exercem sobre a conversão de fase alumina - &#946 &#8594 &#946 &#34, condutividade iônica, resistência mecânica e microestrutura da alumina-&#946. Os resultados obtidos indicam claramente que a presença simultânea de cálcio e silício tem forte efeito negativo sobre as propriedades da alumina-&#946 &#34, devido à presença de uma nova fase intergranular. A presença simultânea de ferro, cálcio e silício deprimem a formação dessa fase causando um efeito positivo sobre as propriedades da alumina-&#946 &#34. O uso da técnica de redução carbotérmica do hidróxido de alumínio produz uma alumina-&945 com excelentes características para a preparação de alumina-&#946 &#34, que quando comparada à alumina-&#946 &#34 preparada com a alumina Baikowski, mostrou ser superior. A redução carbotérmica reduz consideravelmente os teores de impurificação da alumina pelo sódio, silício, cálcio e ferro, além de produzir uma alumina livre de aglomerados que conduz a uma melhor conversão de fase alumina -&#946 &#8594 &#946 &#34. A alumina obtida através da redução carbotérmica, além de possuir características desejáveis para a preparação da alumina-&#946 &#34, também é própria para outras aplicações especiais / The ionic conductor for sodium ions known as &#946 &#34 alumina with composition 8,85%Na2O+0,75%Li2O+90,40%Al2O3 (% wt), was studied considering the influence of several variables on its ceramic processing. The effect of impurities frequently found on the raw material used for the preparation of this ionic conductor such as silicon, calcium and iron were studied isolated and mixed together on such properties as phase conversion &#946 &#8594 &#946 &#34 - alumina, ionic conductivity, mechanical properties and microstructure. The results of the experiments clearly indicates that calcium and silicon generates a new phase when present simultaneously in the &#946 &#34 - alumina. This new phase, located at the grain boundary, has a strong negative effect on the ionic conductivity addition of iron destroys this new phase improving the properties of the impure material. The carbothermal reduction of the aluminum hydroxide gives a &#945- alumina that is excelent for &#946 &#34 - alumina preparation when compared with Baikowski alumina. The carbothermal reduction decreases the impurification of &#945-alumina as calcium, iron, silicon and sodium and a fine particle size distribution, without aggregates, that makes the phase conversion &#946 &#8594 &#946 &#34 -alumina very efficient due to a better distribution of the Li+ ion. The &#945 - alumina obtained by carbothermal reduction of the aluminum hydroxide is also adequate for others special applications of &#945 - alumina alone

A Doença de Alzheimer (DA) é uma patologia senil neurodegenerativa, cujo desenvolvimento está relacionado a vários fatores, tais como deposição de proteínas, alterações no ciclo celular, disfunção mitocondrial, acúmulo de danos e deficiência dos mecanismos de reparo do DNA, entre outros. Os mecanismos moleculares associados a essas alterações ainda não foram esclarecidos. Assim, considerando a hipótese de que algumas características da DA podem ser observadas em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs, peripheral blood mononuclear cells), o presente trabalho teve como objetivo avaliar se PBMCs de indivíduos com a DA apresentam alterações nos perfis de expressão gênica, com enfoque nos processos relacionados ao ciclo celular e reparo do DNA. Além disso, o trabalho buscou verificar as consequências do nocaute da polimerase ? (Pol?), principal polimerase envolvida no reparo por excisão de bases (BER), em fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs, mouse embryonic fibroblastos). Foram coletadas amostras de sangue de 25 pacientes com DA e 15 controles para a realização do ensaio de microarranjos de mRNAs e microRNAs. As análises de bioinformática indicaram 593 mRNAs e 12 microRNAs diferencialmente expressos nos indivíduos com DA comparados aos controles. A partir desses dados foram realizadas análises de enriquecimento de vias, as quais mostraram que processos relacionados à regulação do ciclo celular, resposta a danos no DNA, inflamação, entre outros, estavam alterados em PBMCs de DA. No entanto, a expressão proteica de PCNA avaliada por Western blot não identificou alterações na proliferação das células de pacientes DA, mas foi observada a diminuição da expressão da proteína Pol?, principalmente nos pacientes em estágio mais severo da doença. Assim, as consequências da diminuição da expressão de Pol? foram avaliadas em MEFs nocauteados ii para essa enzima, o que resultou em alterações no ciclo celular e disfunção mitocondrial. Dessa maneira, esses resultados suportam as hipóteses de que falhas nos mecanismos de reparo do DNA estão relacionadas à DA e que as PBMCs podem manifestar algumas das condições patológicas que ocorrem nos neurônios. Foram ainda destacados no presente trabalho alguns genes como potenciais alvos de estudo na busca por biomarcadores da DA. Além disso, foi também demonstrado que a deficiência de Pol? pode acarretar disfunção mitocondrial, uma característica inerente às células de pacientes com DA. / Alzheimer\'s disease (AD) is an age-related neurodegenerative pathology associated with a range of features such as deposition of proteins in the brain, alterations in cell cycle, accumulation of DNA damage, DNA repair deficiency and mitochondrial dysfunction. However, the molecular mechanisms implicated in the pathogenesis of AD are still uncertain. Thereby, the present study aimed to evaluate whether peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of AD patients display alterations in gene expression profiles, mainly focusing on processes related to cell cycle and DNA repair. Furthermore, we evaluated the implications of deficiency in polymerase ? (Pol?), which is a major polymerase involved in base excision repair (BER), in mouse embryonic fibroblasts (MEFs). Blood samples were collected from 25 AD patients and 15 age-matched controls in order to perform genome-wide mRNA and microRNA expression (microarrays). Moreover, mouse embryonic fibroblasts that are knockout for Pol? were evaluated in order to determine the effects of Pol? deficiency. In PBMCs cells, bioinformatics analysis indicated 593 mRNAs and 12 microRNAs differentially expressed in AD compared to controls. Analysis of pathway enrichment indicated that processes related to cell proliferation, DNA repair, and inflammation, among others, were altered in AD blood cells. Despite the enrichment of pathways associated with cell cycle regulation, PCNA protein expression (related to cell proliferation) analyzed by Western blot did not show difference in AD. However, Pol? expression was decreased in AD blood cells, especially in patients stricken with severe AD, in spite of the lack of alterations in terms of transcript expression. Based on the results regarding decreased Pol? expression in AD cells, we studied the consequences of Pol? knockout in MEFs, and the results clearly showed mitochondrial dysfunction along time. Thus, our study demonstrated that iv PBMCs of AD patients present alterations in cell cycle and DNA repair processes, as proposed for AD neurons, reinforcing the hypothesis that failures of DNA repair mechanisms are related to AD, and PBMCs can somehow express some of pathological conditions that may occur in neurons. We also found some genes that represent potential targets to be studied as biomarkers of the disease. Furthermore, this study demonstrated that Pol? deficiency can lead to mitochondrial dysfunction, which is an inherent characteristic of AD.

A leucemia linfoide aguda (LLA) compreende um grupo heterogêneo de neoplasias caracterizadas por proliferação anormal e acúmulo de células imaturas na medula óssea, o que prejudica a produção de eritrócitos, leucócitos e plaquetas. O fator de crescimento semelhante à insulina 1 (insulin-like growth factor 1; IGF1) e seu receptor (IGF1R) regulam o crescimento celular normal e contribuem para a transformação e crescimento de células malignas através da ativação de vias de sinalização intracelular. A via de sinalização do IGF1 é iniciada através da ativação de seu receptor seguido da ativação de seus substratos, incluindo o substrato 1 do receptor de insulina (insulin receptor substrate 1; IRS1). IRS1 é uma proteína predominantemente citosólica envolvida na transdução de sinal, e também desempenha um papel na transformação maligna, sendo altamente expresso em muitos tipos de câncer. Em fibroblastos de camundongos, Irs1, através da sinalização do Igf1, foi descoberto como uma proteína chave para a translocação nuclear da ?-catenina e ativação da transcrição de seus genes alvos, como o Myc e a ciclina D1. MYC e ciclina D1 podem atuar como oncogenes, contribuindo para o desenvolvimento de diversas neoplasias, inclusive as hematopoéticas. Deste modo, o objetivo deste projeto de pesquisa foi investigar a participação do IRS1 nuclear na via da ?-catenina em LLA. Foram utilizadas no estudo linhagens celulares de LLA (Jurkat, MOLT4, Raji e Namalwa) e células hematopoéticas primárias de doadores normais (n=13) e de pacientes adultos com LLA (n=45) atendidos em nossa Instituição. Estudos de expressão gênica (PCRq), expressão, associação proteica (western blotting, imunoprecipitação) e localização celular (fracionamento subcelular e microscopia confocal) foram utilizados. Células da linhagem Jurkat foram submetidas à estimulação com IGF1 e/ou inibição farmacológica de IGF1R (OSI-906). Observamos elevada expressão gênica relativa de IRS1, ?-catenina e MYC nos pacientes com LLA quando comparada aos controles normais (p<0,05), mas não houve diferença na expressão gênica de ciclina D1 e IGF1R entre os dois grupos. Observamos uma correlação positiva entre a expressão gênica de ?-catenina e MYC (p=0.0004; r=0.50), e entre a expressão de IRS1 e MYC (p=0.001; r=0.45) na coorte de pacientes com LLA. Na análise univariada, idade e expressão de MYC correlacionaram-se negativamente com a sobrevida global de pacientes com LLA; idade foi fator independente de prognóstico para a sobrevida. Em linhagens celulares de LLA (Jurkat, MOLT4, Raji e Namalwa), observamos co-localização de IRS1 e ?-catenina no núcleo e no citoplasma. Em células primárias de doador normal, IRS1 e ?-catenina localizaram-se predominantemente no citoplasma. Em células da linhagem celular Jurkat, observamos interação entre IRS1 e ?- catenina e o estímulo com IGF1 provocou o aumento da fosforilação em tirosina de IRS1. O tratamento com OSI-906 diminuiu a fosforilação em tirosina de IGF1R, a translocação nuclear de ?-catenina e a expressão proteica de MYC em células Jurkat. Em conclusão, nossos dados suportam uma relação entre a via de sinalização IGF1R/IRS1 e a ativação da ?- catenina em leucemia linfoide aguda, o que pode representar um importante eixo de sinalização envolvido na fisiopatologia da doença. / The acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a heterogeneous group of malignancies characterized by abnormal proliferation and accumulation of immature cells in the bone marrow, which impairs the production of erythrocytes, leukocytes and platelets. Insulin-like growth factor 1 (IGF1) and its receptor (IGF1R) regulate normal cell growth and contribute to transformation and growth of malignant cells through activation of downstream signaling pathways. The IGF1 signaling pathway is initiated through activation of its receptor followed by activation of its substrates, including insulin receptor substrate 1 (IRS1). IRS1 is well known as a cytosolic protein involved in signal transduction, but also plays a role in malignant transformation, being highly expressed in many cancers. In mouse fibroblasts, Irs1, through Igf1 signaling, was found to be the key protein for nuclear translocation of ?-catenin and transcription activation of its target genes, such as Myc and cyclin D1. MYC and cyclin D1 may act as oncogenes, contributing to the development of cancers, including hematopoietic neoplasm. Thus, the aims of this study were to investigate the role of nuclear IRS1 in the ?-catenin pathway in LLA. We used in the study ALL cell lines (Jurkat, MOLT-4, Namalwa and Raji) and primary hematopoietic cells from healthy donors (n=13) and from adult patients with ALL (n=45) treated at our Institution. Studies of gene expression (qPCR), protein expression, association (Western blotting and immunoprecipitation) and cell location (subcellular fractionation and confocal microscopy) were used. Jurkat cells were submitted to IGF1 stimulation and/or IGF1R pharmacological inhibition (OSI-906). IRS1, ?-catenin and MYC relative gene expression were significantly elevated in ALL patients compared to normal controls (p<0.05), but there was no difference in gene expression of cyclin D1 and IGF1R between the two groups. A positive correlation between ?-catenin and MYC relative expression (p=0.0004; r=0.50) and between IRS1 and MYC expression (p=0.001; r=0.45) was found. Univariate analysis revealed that increasing age and elevated expression of MYC are factors that adversely affect the overall survival; age was an independent prognostic factor for survival. IRS1 and ?-catenin co-localized in the nucleus and cytoplasm of ALL cell lines (Jurkat, MOLT4, Raji e Namalwa). In primary cell of normal donor, IRS1 and ?-catenin were found predominantly in the cytoplasm. In Jurkat cells, a constitutive IRS1 and ?-catenin protein interaction was observed and IGF1 stimulation increased IRS1 tyrosine phosphorylation. OSI-906 treatment decreased IGF1R tyrosine phosphorylation, nuclear translocation of ?-catenin and MYC protein expression in Jurkat cells. In conclusion, our data support a link between the signaling pathway IGF1R/IRS1 and activation of ?-catenin in acute lymphoblastic leukemia, which may represent an important axis involved in the pathophysiology of the disease.

A literatura têm indicado que a via metabólica de degradação de amido em bananas é regulada tanto por etileno quanto por auxinas, dentre outros fatores. Visando melhor entender o mecanismo pelo qual isso ocorre, acompanhou-se o amadurecimento de bananas infiltradas com ácido indol-3-acético (AIA) utilizando um modelo de infiltração do hormônio em fatias do fruto. Foram avaliados os níveis de AIA endógeno, a evolução na degradação de amido e síntese de açúcares solúveis, a ocorrência de alterações na transcrição e atividade das enzimas &#946;-amilase e DPE2 e a possível correlação destes eventos com alterações na via de transdução de sinal de etileno - hormônio reconhecidamente responsável por desencadear a ativação do metabolismo degradatório de amido durante o amadurecimento. Nos frutos tratados com AIA, os resultados apontaram atraso na degradação de amido e no acúmulo de açúcares solúveis; as variações nos níveis de atividade e de transcritos de &#946;-amilase nos grupos controle e tratado foram semelhantes; contudo, no grupo tratado a evolução destes processos ocorreu com atraso em relação ao controle. Os níveis de transcritos de DPE2, mais expressivos no início do amadurecimento em ambos os grupos, foram sustentados por mais tempo nos frutos tratados; a atividade, no entanto, parece ter sido sensivelmente inibida pelo tratamento com AIA. Os perfis de transcritos dos receptores de etileno ERS3 e ETR1 apontam que os mesmos foram fortemente afetados pelo tratamento. Assim, os resultados sugerem que modificações no padrão de sinalização do etileno podem ser parte do mecanismo pelo qual AIA afeta o perfil de transcritos e atividade de &#946;-amilase e DPE2, provocando, em consequência, atraso no processo de mobilização da reserva de amido na banana e também na síntese de açúcares. / The literature indicates that the starch degradation in bananas is probably regulated by ethylene and auxins, among other factors. To understand the mechanisms involved, we followed the ripening of banana slices infiltrated with indole-3-acetic acid (AIA). We measured the evolution of endogenous AIA levels and starch degradation, as well as shifts in transcription and activity of &#946;-amilase and DPE2 and their possible correlation with alterations in the ethylene signal transduction path. In AIA-treated slices, results indicated delay in starch degradation and acummulation of soluble sugars; the changes in &#946;-amilase transcripts and activity levels in control and treated groups were similar, although they were delayed for the AIA-treated group, when compared to control. DPE2 transcript levels, stronger in the earlier stages of rippening in both groups, were sustained longer in AIA-treated bananas; on the other hand, its activity seems to has been severely inhibited by the AIA treatment. The transcript profiles of ERS3 and ETR1 ethylene receptors indicate that they were both strongly affected by the treatment. In this way, the results sugest that modifications in the ethylene signaling pathway may be part of the mechanism by which high level of AIA affects the profile of transcripts and activities of &#946;-amilase and DPE2, inducing the delay in the mobilization of the starch reserve of the bananas, as well as the sugar synthesis.

Apesar de diversos estudos in vitro e em populações indicarem um efeito protetor do &#946;-caroteno em sistemas biológicos, estudos epidemiológicos como o \"The Alpha-Tocopherol, Beta-Carotene Cancer Prevention Study\" (ATBC) e o \"The Beta-Carotene and Retinol Efficacy Trial\" (CARET) mostraram um aumento na incidência de câncer pulmonar em indivíduos fumantes suplementados com &#946;-caroteno. Essa ação contraditória tem sido chamada na literatura de \"Paradoxo do &#946;-Caroteno\". Sabe-se que este carotenóide sob altas pressões de oxigênio ou na presença de peróxidos pode sofrer oxidação e levar a formação de compostos como aldeídos, epóxidos, etc, que são capazes de se adicionarem covalentemente ao DNA. Estudos, in vitro e in vivo têm demonstrado a possibilidade de os metabólitos do &#946;-caroteno agirem como agentes pró-carcinogênicos. Estes agentes quando ativados quimicamente podem levar à formação de adutos de DNA. Já se sabe que alguns desses adutos encontramse em níveis aumentados em diversas situações de risco de câncer. Diversos grupos, incluindo o nosso, têm demonstrado a formação de lesões em DNA a partir de aldeídos e epóxidos exógenos ou gerados endogenamente. O presente trabalho mostra que a reação do &#946;-caroteno e dois de seus produtos de oxidação, retinal e &#946;-apo-8\'-carotenal, com 2\'-desoxiguanosina e DNA leva à formação de adutos. Dentre os adutos formados, foi caracterizado o aduto 1,N2eteno-2\'-desoxiguanosina (1 ,N2-&#949;dGuo). Os níveis de outro aduto de DNA, a 8-oxo-7,8-dihidro-2\'-deoxiguanosina (8-oxodGuo), também foram monitoradas para estudo comparativo. A formação dos adutos também foi verificada em fibroblastos normais de pulmão humano (linhagem IMR-90) expostos ao &#946;-caroteno e aos seus produtos de oxidação. Experimentos com ratos suplementados com &#946;-caroteno e expostos à fumaça de cigarro em períodos de 7, 30 e 180 dias, mostraram níveis aumentados de 1,N2-&#949;dGuo nos animais suplementados com o carotenóide comparado ao grupo veículo. Aumento no nível de 8-oxodGuo também foi verificado nos tratamentos de 7 e 180 dias. Um aumento significativo no nível do eteno aduto também foi verificado nos animais suplementados com &#946;-caroteno e expostos à fumaça de cigarro, comparado ao grupo apenas exposto à fumaça após 7 e 180 dias de exposição. Nestes mesmos grupos, o aumento do 8-oxodGuo só foi observado no tratamento por 180 dias. Sabendo que estas lesões são comprovadamente mutagênicas, nossos estudos podem contribuir para o esclarecimento dos mecanismos envolvidos na formação de câncer em fumantes suplementados ou não com &#946;-caroteno. / Despite several studies performed in vitro and in population indicate a protector effect of &#946;-carotene, the epidemiological studies \"The Alpha-Tocopherol, Beta-Carotene Cancer Prevention Study\" (ATBC) and \"The Beta-Carotene and Retinol Efficacy Trial\" (CARET) showed a relative risk for lung cancer in smokers supplemented with &#946;-carotene. It is well known that this carotenoid is able to oxidize in high oxygen tension or in the presence of peroxides yielding to aldehydes, epoxides, and other compounds that are capable to bind to DNA. lhe possibility that &#946;-carotene oxidation products can act as pro carcinogenic agents is under investigation. Lhese products can be activated by peroxides, ar by enzymes such as cytochromr P450, leading to DNA adducts formation. Several groups, like ours, showed the formation of DNA adducts from aldehydes or epoxides generated by endogenous or exogenous sources. We investigated here the reactions of &#946;-carotene, and two of its oxidation products, retinal and &#946;-apo-8\'-carotenal, with 2\'-deoxyguanosine to evaluate their DNA damaging potential. A known mutagenic adduct, 1,N2-etheno-2\'-deoxyguanosine (1 ,N2 edGuo) was isolated and characterized on the basis of its spectroscopic features. After treatment of calf thymus DNA with &#946;-carotene or &#946;-carotene oxidation products, significantly increased levels of the etheno adduct were detected and quantified in DNA by a sensitive LC/ESI/MS-MS technique. For comparative purposes, levels of 8-oxo7,8-dihydro-2\'-deoxyguanosine were also evaluated (8-oxodGuo). Levels of these lesions were also increased. Exposure of human lung cells (IMR 90) to the carotenoids also leads to increased levels of the two adducts. As the main noteworthy result, rats supplemented with &#946;-carotene for 7, 30, and 180 days showed significantly higher lung DNA concentrations of the 1,N2-&#949;dGuo adduct than those of the control group. lhe level of 8-oxodGuo was also increased after 7 and 180 days in the group supplemented with the carotenoid. Rats supplemented with &#946;-carotene and exposed to cigarette smoke for 7 and 180 days also showed significantly increased levels of the adduct 1,N2-&#949;dGuo when compared with the group exposed to cigarette smoke. In the same groups level of 8-oxodGuo was only increased after 180 days of treatment. These DNA lesions are confirmed mutagenic, so our data could contribute to the elucidation of the mechanisms responsible for the association between &#946;-carotene and lung cancer in smokers.

A clonagem de mamíferos por transferência nuclear de células somáticas (TNCS) ainda é afetada pela baixa eficiência. As modificações epigenéticas estabelecidas durante o processo de diferenciação celular estão entre os principais fatores. Uma vez que estas modificações atuam como barreiras epigenéticas restringindo a reprogramação do núcleo somático. Considerando isso, a maioria dos fatores que promovem a descondensação da cromatina, incluindo os inibidores das Histonas Deacetilases (HDACis), tem sido demonstrado aumentarem a eficiência da reprogramação nuclear, tornando o seu uso comum para melhorar as taxas da TNCS. Neste trabalho, nós testamos dois inibidores das histonas deacetilases: o Ácido Valpróico (VPA) e o Ácido &#946;-Hidróxibutírico (BOHB), sendo um farmacológico e o outro um metabólito endógeno na TNCS. Nosso objetivo era testar se o tratamento de células doadoras de núcleo ou zigotos com estes HDACis melhoravam o desenvolvimento de embriões bovinos clonados. Em relação ao VPA, nós observamos que o tratamento de fibroblastos com o VPA aumentou a acetilação das histonas e a expressão de genes importantes para o desenvolvimento como IGF2R e PPARGC1A. Entretanto, quando as células tratadas foram usadas como doadoras de núcleo, não foi observado diferença nos níveis de acetilação das H3K9 entre os grupos. Além disso, as alterações foram rapidamente removidas após a transferência nuclear. Em relação as taxas de desenvolvimento, o uso de células tratadas como doadoras de núcleo não resultou em diferença durante o desenvolvimento pré- e pós-implantacional. Em relação ao BOHB, nós executamos um série de experimentos para testar se esta molécula age como um inibidor das HDACs em bovinos. Nós observamos que fibroblastos tratados com BOHB apresentam aumento nos níveis globais de H3K9ac. O tratamento altera a expressão de genes importantes como os transportadores de glicose e a enzima chave no metabolismo lipídico SCD. Também, nós demonstramos que este metabólito é capaz de alterar uma marca epigenética em zigotos clonados, que persiste até o estágio de blastocisto. Entretanto, o tratamento dos zigotos com este metabólito endógeno não aumentou a taxa de desenvolvimento pré-implantacional, embora tenha alterado a expressão de um fator de transcrição que protege embriões contra estresse oxidativo, o FOXO3a. O tratamento de zigotos partenogenéticos com BOHB não afetou o desenvolvimento embrionário, nem a produção de ATP, sugerindo que o BOHB não apresenta efeitos tóxicos como anteriormente pensado. Concluindo, os resultados deste trabalho mostram que a inibição das HDACs através de uma molécula farmacológica ou um metabólito endógeno, não aumenta a eficiência da TNCS em bovinos. Entretanto, aqui nós mostramos que o corpo cetônico BOHB pode ser um elo de ligação entre o ambiente extracelular e a regulação do metabolismo. E serve como um modelo in vitro para testar como distúrbios metabólicos como a cetose afeta o metabolismo e epigenoma celular e embrionário em bovinos / Cloning of mammals by somatic cell nuclear transfer (SCNT) is still plagued by the low efficiency. The epigenetic marks established during the cell differentiation process are among the main cause. These modifications act as a barrier restricting the nuclear reprogramming process of somatic nuclei. Based on this, molecules that promotes chromatin decondensing, including Histone Deacetylases inhibitors (HDACis), has been demonstrated increase the efficiency of nuclear reprogramming, making their use common on SCNT procedure. Herein, we tested two histone deacetylase inhibitors: Valproic Acid and &#946;-hydroxybutyric Acid, the former a pharmacological drug and the latter, an endogenous metabolite on SCNT. Our objective was to test whether the donor cells treatment or zygotes with these HDACis improve the bovine cloned embryos development. Regarding the VPA, we observed that fibroblasts treatment with VPA increases the histone acetylation and expression of developmentally important genes such as IGF2R and PPARGC1A. However, when treated cells were used as nuclear donors, we did not observe difference on H3K9ac levels between the groups. Moreover, the alterations were quickly removed after SCNT. Regarding the developmental rates, the use of treated cells as nuclear donors did not affect the pre- and post-implantation development. In the second experiment, we used the BOHB in a series of experiments to test whether this molecule acts as a histone deacetylase inhibitor in bovines. We observed that treatment of fibroblasts with BOHB increased the global levels of H3K9ac. Also, treatment alters the expression of important genes such as glucose transporters and a key enzyme regulating lipid synthesis. Additionally, we demonstrated that this metabolite affect at least one epigenetic mark in cloned zygotes, that lasts until the blastocyst stage. However, zygote treatment with this endogenous metabolite did not increase the pre-implantation developmental rates, albeit increased the expression of a transcription factor that protects cells against oxidative stress, the FOXO3a. Treatment of parthenogenetic embryos with BOHB did not affect the embryo development, neither ATP production, suggesting that BOHB is not toxic as previously believed. Concluding, the results presented here shows that the HDAC inhibition through a pharmacological compound or an endogenous metabolite did not increase the efficiency of bovine SCNT. However, here we showed that the ketone body BOHB might be a nexus between the extracellular environment and the cellular metabolism. Also, it can used as a in vitro model to interrogate questions about does metabolic disturbances such as ketosis in cattle affects the epigenome and cellular metabolism in bovines