Orientador: Célia Regina Nogueira / Resumo: O sistema esquelético é um sistema complexo com intenso metabolismo composto de células, proteínas e minerais. Os osteoblastos, são células fundamentais para o tecido, desempenhando duas funções principais: formação óssea e regulação da reabsorção por meio da modulação da osteoclastogênese. Sendo assim, essas células desempenham funções primordiais para o desenvolvimento e manutenção óssea. Diversas moléculas sistêmicas atuam no tecido, sendo os hormônios tireoidianos um destes. Eles são fundamentais para o metabolismo ósseo já que alterações hormonais culminam em desordens ósseas. Osteoblastos possuem receptores nucleares para T3 e apesar de pouco compreendido, ele afeta diversos aspectos do desenvolvimento da célula, assim como vias modulatórias da remodelação óssea. Diversas linhagens celulares têm sido utilizadas para estudos de osteoblastos, sendo as células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano (hA-CTMs) um modelo promissor para osteoindução. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi verificar a influência do T3 suprafisiológico (T3S) na expressão gênica diferencial em osteoblastos diferenciados a partir de hA-CTMs. As células obtidas de 3 doadores foram submetidas a osteoindução por 16 dias com coquetel de diferenciação (dexametasona, ácido ascórbico e β-glicerofosfato) e caracterizadas pela presença de osteocalcina, fosfatase alcalina e matriz mineralizada. O tratamento com T3 (10-8M) foi realizado por 72h e o RNA foi extraído para preparação das bib... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The skeletal system is complex and have an intense metabolism compound with cells, proteins and minerals. The osteoblasts are fundamental cells to the tissue, executing two mainly functions: bone formation and regulation of reabsorption through osteoclastogenesis modulation. Therefore, these cells perform primordial functions to the bone development and maintenance. Several systemic molecules act in the tissue and the thyroid hormones are one of them. They are fundamental to the bone metabolism, once hormone alterations result in bone disorders. Osteoblasts have T3 nuclear receptors, and although not well elucidated it affects many aspects of the cell development so as pathways that modulates the bone remodeling. Several cells lineages have been used in osteoblasts studies, and human adipose-derived Mesenchymal stem-cells (hA-MSCs) are a promising model to osteoinduction. Thus, the aim of this study was to investigate the supraphysiological T3 (T3S) influence in the gene differential expression in osteoblasts differentiated from hA-MSCs. The cells obtained from three donators were submitted to osteoinduction for 16 days with a differentiation cocktail (dexamethasone, ascorbic acid, β-glycerophosphate) and characterized by the presence of osteocalcin, alkaline phosphate and mineralized matrix. The cells were treated with T3 (10-8M) for 72h and the RNA was extracted to mRNA library prepare and sequenced by Illumina platform. The bioinformatic analysis included the software: Fas... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A reducao ou minimizacao das consequencias das fraturas osseas e a regeneracao tecidual e objetivo de recursos clinicos e terapeuticos. O tecido osseo tem funcao mecanica, de deposito mineral e hematopoietica sendo composto por tres tipos celulares, osteoblastos, osteocitos e osteoclastos. Diversas substancias sao secretadas pelos osteoblastos, entre elas o calcio, que tem papel fundamental na homeostase celular e na producao do tecido osseo mineralizado e em cujo fluxo estao envolvidos os genes S100A6, PMCA1b e a osteocalcina ligados ao processo transporte e de mineralizacao. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do laser de baixa intensidade, no que concerne a sinalizacao de calcio e mineralizacao ossea, na expressao dos genes S100A6, PMCA1b e osteocalcina em celulas osteoblasticas adultas. Trinta fragmentos mediais de femures com aproximadamente 5mm foram coletados cirurgicamente de ratos Wistar e distribuidos em dois grupos A (n=15, laser) e B (n=15, sem laser). Os fragmentos foram digeridos mecanica e enzimaticamente com colageno tipo II. Apos sete dias de cultura o grupo A foi irradiado com laser de baixa intensidade de Arseneto de Galio e Aluminio &#955;=808nm, 250mW de potencia nominal, densidade de potencia de 200mW/cm2, densidade de energia de 2000mJ/cm2, dose de energia de 2J/cm2, diametro de feixe de 0,02mm, tempo de 5s em 1 ponto de aplicacao durante 6 dias. Em seguida, o RNA foi extraido, quantificado, submetido a sintese de cDNA e realizada quantificacao de Ct comparativo pela Reacao em Cadeia da Polimerase em Tempo Real. Os valores foram submetidos a analise estatistica de teste Mann-Whitney com p<0,05. A analise em relacao a quantidade de RNA dos grupos A (mediana 3,80) e B (mediana 3,80) e os valores das medianas de &#916;Ct dos tres genes, S100A6 (A=2,22 e B=2,89), osteocalcina (A=4,06 e B=3,45) e PMCA1b (A=1,85 e B=4,16) nao mostraram diferencas significativas. O laser de baixa intensidade em osteoblastos adultos nao alterou a expressao dos genes S100A6, PMCA1b e osteocalcina descartando a relacao, no periodo estudado, destes genes com a mineralizacao e regeneracao ossea / The aim of clinical and therapeutic features is to reduce or minimize the consequences of fractures and bone regeneration. The bone has mechanical, mineral deposit and hematopoietic functions due to three types of cells, osteoblasts, osteocytes and osteoclasts. Several substances are secreted by osteoblasts, including calcium, which plays a fundamental role in cellular homeostasis and production of mineralized bone tissue and in whose flow are involved the S100A6, PMCA1b and osteocalcin genes related to the transport and mineralization process. This study was designed to evaluate the effects of low-level laser, when it comes to calcium signaling and bone mineralization, in S100A6, PMCA1b and osteocalcin genes expression in adult osteoblast cells. Thirty medial femoral fragments with approximately 5mm were surgically collected from Wistar rats and distributed into two groups A (n=15, laser) and B (n=15 without laser). The fragments were digested mechanical and enzymatically with type II collagen. After seven days of culture group A was irradiated with low intensity Gallium-Aluminum-Arsenide laser λ=808nm, 250mW nominal power, power density 200mW/cm2, energy density 2000mJ/cm2 dose of energy 2J/cm2 beam diameter 0,02 mm, length of 5s in one application point for 6 days. Then, RNA was extracted, quantified, underwent to cDNA synthesis and quantification performed by the comparative Ct by Real Time Polymerase Chain Reaction. The values were underwent to statistical analysis by Mann-Whitney test with p<0,05. The analysis for the amount of RNA of group A (median 3,80) and B (median 3,80) and ΔCt median values of the three genes, S100A6 (A=2.22 and B=2.89), osteocalcin (A=4.06 and B=3.45) and PMCA1b (A=1.85 and B=4.16) showed no significant differences. Low-level laser irradiation in adult osteoblasts did not modify the expression of S100A6, PMCA1b and osteocalcin genes discarding the relationship of these genes with the mineralization and bone regeneration in the studied period. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Pesquisas prévias evidenciaram que a desmineralização óssea com ácido cítrico melhora a consolidação de enxertos autógenos em bloco e favorece o espalhamento e a morfologia de pré-osteoblastos em cultura. Os resultados promissores encontrados com o ácido cítrico levantaram a suspeita de que a tetraciclina ácida pudesse suscitar efeitos semelhantes. Assim, este estudo se propôs a avaliar comparativamente o comportamento de células pré-osteoblásticas MC3T3-E1 cultivadas sobre superfícies ósseas de calvária de ratos desmineralizadas com tetraciclina ácida (50mg/mL) e com ácido cítrico (10%, pH1) em diferentes tempos de aplicação. Foram removidas 126 amostras ósseas bicorticais da calvária de 63 ratos Wistar adultos machos empregando broca trefina de 5 milímetros de diâmetro. As amostras foram distribuídas aleatoriamente em um dos seguintes grupos de estudo (n=18): AC 15 no qual as amostras foram desmineralizadas por ácido cítrico durante 15 segundos; AC 30, no qual as amostras foram desmineralizadas por ácido cítrico durante 30 segundos; AC 60, no qual as amostras foram desmineralizadas por ácido cítrico durante 60 segundos; TCN 15 no qual as amostras foram desmineralizadas por tetraciclina durante 15 segundos; TCN 30, no qual as amostras foram desmineralizadas por tetraciclina durante 30 segundos; TCN 60, no qual as amostras foram desmineralizadas por tetraciclina durante 60 segundos e C, grupo controle formado por amostras não desmineralizadas. Os pré-osteoblastos foram cultivados sobre as amostras por 24, 48 e 72 horas (n= 6) para serem examinadas à microscopia eletrônica de varredura. Vinte e uma amostras coletadas de outros 11 animais foram distribuídas entre os mesmos grupos e analisadas com espectroscopia de energia dispersiva (EDS) para análise da composição química superficial (n=3). A área de recobrimento superficial por células foi significantemente maior após 24 e 48 horas de cultura nos grupos AC15 (60,38% e 100% respectivamente), AC30 (99,32% e 100% respectivamente), AC60 (99,22% e 100% respectivamente), TCN15 (96,73% e 70,24% respectivamente) e TCN30 (64,72% e 57,40% respectivamente) do que nos grupos TCN60 (9,67% e 51,45% respectivamente) e C (5,99% e 31,83% respectivamente). Às 72 horas os grupos apresentaram recobrimento praticamente completo das superfícies ósseas por células, com exceção do grupo TCN60 (56,15%). As células apresentaram-se com morfologia compatível com em estágios mais avançados de diferenciação nos grupos que sofreram desmineralização do que no controle. As variações nas porcentagens anatômicas (A%) dos elementos C, O, Na, Mg, P e Ca foram insuficientes para justificar mudanças no comportamento celular. Concluiu-se que a desmineralização quer por ácido cítrico ou tetraciclina de superfícies ósseas são favoráveis para o crescimento e diferenciação de células pré-osteblásticas especialmente quando empregada conforme os grupos AC30 e TCN15. Os mecanismos por trás desses resultados ainda carecem de elucidação. / Previous researches have demonstrated that bone demineralisation by citric acid improves the consolidation of bone autografts and promotes spreading and morphology of pre-osteoblasts in culture. The promising results with citric acid raised the suspicion that tetracycline could elicit similar effects. Thus, the aim of this study was to comparatively evaluate the behavior of pre-osteoblastic MC3T3-E1 cultured on bone surfaces of rat calvaria demineralized with tetracycline (50mg / ml) and citric acid (10%, pH1) at different times of application. 126 bicortical samples were removed from the calvarial bone of 63 adult male Wistar rats using trephine drill of 5 mm in diameter. Samples were randomly assigned to one of the following study groups (n = 18) AC 15 in which the samples were demineralized by citric acid for 15 seconds; AC 30, in which the samples were demineralized by citric acid for 30 seconds; AC 60 wherein the samples were demineralized by citric acid for 60 seconds; TCN 15 in which the samples were demineralized tetracycline for 15 seconds; TCN 30, in which the samples were demineralized tetracycline for 30 seconds; TCN 60 wherein the samples were demineralized tetracycline for 60 seconds, and C, control group of samples not demineralized. The pre-osteoblasts were cultured on the samples for 24, 48 and 72 hours (n = 6) to be examined in the scanning electron microscope. Twenty-one samples were collected from other 11 animals and were distributed among the same groups for analysis of the surface chemical composition by energy dispersive spectroscopy (EDS) (n = 3). The average percentage of the bone surfaces covered by cells was significantly higher after 24 and 48 hours of culture in groups AC15 (60.38% and 100% respectively), AC30 (99.32% and 100% respectively), AC60 (99.22% and 100% respectively) TCN15 (96.73% and 70.24% respectively) and TCN30 (64.72% and 57.40% respectively) than in groups TCN60 (9.67% and 51.45% respectively), and C (5.99% and 31.83% respectively). At 72 hours, all the groups presented almost complete covering of the surfaces by cells, with the exception of TCN60 group (56.15%). Cells presented with morphology compatible with more advanced stages of differentiation in groups undergone to demineralization than control. Variations in the anatomical percentages (A%) of the elements C, O, Na, Mg, Ca and P were insufficient to justify changes in cell behavior. The conclusion was that both demineralization of citric acid or tetracycline are favorable for the growth and differentiation of pre-osteoblasts especially when used according to AC30 and TCN15 groups. The mechanisms behind these results still need elucidation.

Dentre os vários compostos utilizados na pesquisa e na terapia de doenças osteo-degenerativas, a fototerapia com laseres de baixa potência (LLLT) e os diodos emissores de luz (LEDs) vem sendo investigada com o intuito de avaliar seus efeitos no metabolismo ósseo. Estes, que possuem comprimentos de ondas específicos, atuam na biomodulação das células, funcionando como um agente terapêutico, reequilibrando e normalizando a sua atividade. No entanto, pouco se sabe sobre o efeito dos diferentes espectros na proliferação e diferenciação de osteoblastos humanos, bem como seus efeitos no metabolismo celular como a síntese e a ativação de proteínas sinalizadoras envolvidas nesses processos. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar, comparativamente, a influência da fototerapia com LLLT e LED na proliferação e diferenciação de osteoblastos humanos. Além disso, investigamos o envolvimento da ativação da via de sinalização ERK1,2 nestas respostas, utilizando o seu inibidor específico e/ou avaliando a sua ativação durante a proliferação e após fototerapia. Para esse estudo, osteoblastos humanos (HOAL) foram cultivados em meio de cultura DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e incubados em estufa de CO2. As células foram irradiadas pontualmente com os laseres vermelho (660nm), infravermelho (780nm) e LED (637nm), nas doses de 10, 20 e 50 J/cm2 na potência de 40mW, após adesão celular. Após 24, 48, e 72 horas foram realizados os ensaios de redução do MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5- difeniltetrazólio) e cristal violeta (CV) para avaliar a viabilidade das células e após 72 horas foi realizada a análise da proliferação por citometria de fluxo nos quais os resultados sugerem aumento de células viáveis ou proliferação quando estimuladas pelos diferentes espectros. Após a verificação do efeito positivo dos laseres e LED na viabilidade e/ou proliferação, foi realizada a análise da ativação da proteína intracelular ERK por western blotting usando anticorpo específico após 10 minutos da irradiação pontual. Mostramos que a irradiação das células HOAL com LLLT, na dose de 10 J/cm2, aumentou significativamente a fosforilação da ERK1/2 em relação ao controle. Para os ensaios de diferenciação, as células receberam pontualmente o estimulo a cada 6 dias e após os períodos de 07, 14, 21 e 28 dias foram realizados os ensaios da atividade de fosfatase alcalina (ALP), expressão gênica do colágeno I (COL1A1) e SPARC (osteonectina) por RT-PCR em tempo real e ensaio de mineralização com vermelho de alizarina. De um modo geral, não foram observados diferenças na atividade da ALP entre os grupos tratados em relação ao controle. A expressão gênica do COL1A1 e SPARC foi aumentada, no qual o LED em ambas doses apresentou maior eficácia em aumentar a expressão desses genes. No que se refere à mineralização, foram observadas pequenas diferenças quanto a deposição de cálcio. Dessa forma, a LLLT e LED, nesse regime de aplicação modulou positivamente o metabolismo dos osteoblastos humanos em relação à viabilidade, porém, no processo de mineralização foram observadas poucas diferenças. / Among the various compounds used in research and bone degenerative diseases therapy, phototherapy with low level laser (LLLT) and light emitting diodes (LEDs) has been investigated in order to evaluate its effects on bone metabolism. Those, who have specific wavelengths, act in biomodulation cells functioning as a therapeutic agent, rebalancing and normalizing their activity. However, little is known about the effect of the different spectra in the proliferation and differentiation of human osteoblasts and their effects on cellular metabolism as well as the synthesis and activation of signaling proteins involved in these processes. Therefore, the aim of this study was to compare the influence of LLLT and LED phototherapy in the proliferation and differentiation of human osteoblasts. In addition, we investigated the involvement of activation of ERK1,2 signaling pathway these responses using its specific inhibitor and/or evaluating their activation during the proliferation and after phototherapy. For this study, human osteoblasts (HOAL) were cultured in DMEM culture medium supplemented with 10 % fetal bovine serum (FBS) and incubated in CO2 incubator . Cells were irradiated with punctual red lasers (660nm), infrared (780nm) and LED (637nm) at doses of 10, 20 and 50 J/cm2 in power 40mW, after cell adhesion. After 24, 48, and 72 hours, MTT assay (- (4,5- dimethylthiazol-2- yl) -2,5 - diphenyltetrazolium bromide 3 ) and violet crystal (CV) were performed to assess the viability of cells and after 72 hours, was performed of proliferation analysis by flow cytometry. The results suggest an increase in viable and proliferation of cells when stimulated by different spectra. After checking the positive effect of lasers and LED viability and/or proliferation, analysis of ERK activation of intracellular protein by western blotting using a specific antibody was performed 10 minutes after the spot irradiation. We show that irradiation of HOAL cells with LLLT at a dose of 10 J/cm2, significantly increased the phosphorylation of ERK1/2 compared to control. For differentiation assays, cells promptly received stimulation every 6 days and after periods of 07, 14, 21 and 28 days testing the activity of alkaline phosphatase (ALP), gene expression of type I collagen (COL1A1) and SPARC (osteonectin) were performed by Real Time RT-PCR and mineralization experiment with alizarine red. In general, no differences in the activity of ALP between the treated groups compared to the control were observed. The gene expression was increased, and SPARC COL1A1, where in the LED in both doses showed greater effectiveness in increasing the expression of these genes. With respect to mineralization, small differences in the deposition of calcium were observed. Thus, LLLT and LED, this enforcement regime, positively modulated the metabolism of human osteoblasts during the cell viability, but in the process of mineralization few differences were observed.

O osteossarcoma (OS) é o tumor maligno primário mais comum do tecido ósseo, caracterizado pela formação de osteócitos anormais. Apesar do avanço nas terapias convencionais (quimioterapia e retirada do tumor), essas não conseguem eliminar totalmente as células tumorais e impedir a progressão da doença. Recentemente, agentes derivados de fontes naturais ganharam considerável atenção por causa de sua segurança, eficácia e disponibilidade imediata. Nesse sentido, a apocinina, inibidor do complexo NADPH-oxidase, vem sendo estudada como agente antitumoral em alguns tipos de câncer como: pâncreas, próstata, pulmão e mama. Apocinina é um pró-fármaco e sua ação parece estar relacionada à sua conversão produzindo a diapocinina, a qual se mostrou mais efetiva do que a apocinina. Portanto, o objetivo desse estudo é avaliar, in vitro, o potencial antitumoral da apocinina e diapocinina em células de osteossarcoma humano. Para isso, foram utilizados osteoblastos humanos normais (HOb) e osteossarcoma humano imortalizadas (SaOS-2) tratados ou não com apocinina e diapocinina em diversas concentrações. Foram realizados os ensaios de viabilidade celular, alterações morfológicas, apoptose celular, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), formação de colônias, migração, invasão e expressão do fator indutor de hipóxia-1alfa (HIF-1). Também foram conduzidos ensaios para verificar a atividade de metaloproteinase de matriz (MMP) 2 e 9. Os resultados em SaOS-2 mostraram que o tratamento com apocinina nas concentrações de 1,5 e 3 mM; e diapocinina nas concentrações de 0,75 e 1,5 mM reduziram a viabilidade; aumentaram o número de células em apoptose e diminuíram a produção de EROs; sem causar danos às células HOb. Além disso, essas mesmas concentrações inibiram a migração e invasão celular; diminuíram a expressão de HIF-1; e reduziram a atividade de MMP-2 em SaOS-2. Considerando os resultados obtidos, concluímos que a apocinina e diapocinina podem atuar como possíveis moduladores de células tumorais, sendo que a diapocinina mostrou ser mais efetiva nos parâmetros testados. / Osteosarcoma (OS) is the most common primary malignant tumor of bone tissue, characterized by the formation of abnormal osteocytes. Despite advances in conventional therapies (chemotherapy and surgery) they cannot completely eliminate tumor cells and prevent the progression of the disease. Recently, agents derived from natural sources have achieved considerable attention because of their safety, efficacy and immediate availability of therapies. In this way, apocynin, an inhibitor of the NADPH-oxidase complex, has been studied as an antitumor agent in some types of cancer, such as pancreas, prostate, lung and breast. Apocynin is a prodrug and its action indicate to be related to its conversion to diapocynin, which has been shown to be more efficient than apocynin itself. Thus, the aim of this study is to evaluate, in vitro, the antitumor potential of apocynin and diapocynin in human osteosarcoma cells. For this, normal human osteoblasts (HOb) and immortalized human osteosarcoma cells (SaOS-2) were treated or no-treated with apocynin and diapocynin in various concentrations. Cell viability assay, morphological alterations, cellular apoptosis, reactive oxygen species (ROS) production, colony formation, migration, invasion and expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1) were performed. We also performed assays to verify the activity of matrix metalloproteinase (MMP) 2 and 9. The results in SaOS-2 showed that treatment with apocynin at concentrations of 1,5 e 3 mM; and diapocynin at concentrations of 0,75 e 1,5 mM reduced cell viability; increased the number of cells in apoptosis and decreased the production of ROS; without damaging HOb cells. Moreover, these same concentrations inhibited cell migration and invasion; decreased HIF-1 expression; and reduced MMP 2 activity in SaOS-2. Considering the results, we suggest that apocynin and diapocynin may act as possible modulators of tumor cells, and diapocynin has been shown to be more effective.

Orientadores: Pedro Duarte Novaes, Marcelo Rocha Marques / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-13T11:15:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vasconcelos_DanielFernandoPereira_D.pdf: 3147772 bytes, checksum: f14ddeae900959b567ea4b605c927b8b (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A administração intermitente de hormônio paratireóideo (PTH) é capaz de promover anabolismo ósseo, favorecendo a neoformação óssea em condições como osteoporose e reparo de fraturas. Sabendo-se que tanto os tecidos ósseos mandibulares e alveolares como os tecidos periodontais podem responder à administração de PTH de forma intermitente, o objetivo deste estudo foi avaliar histomorfometricamente o efeito da administração de PTH (1-34) em um modelo de defeito periodontal, do tipo fenestrado, na mandíbula de ratos. Foram utilizados neste estudo 32 ratos Wistar machos, com o objetivo de expor a região vestibular da raiz distal do primeiro molar inferior direito. A criação do defeito possibilitou a remoção parcial de ligamento periodontal e do cemento dentário. Após a cirurgia os animais foram separados aleatoriamente em 4 grupos (n=8): Grupo C14: administração intermitente (3 vezes por semana) do veículo de diluição do PTH por 14 dias; Grupo P14: administração intermitente de PTH (1-34) por 14 dias; Grupo C21: injeções intermitentes do veículo de diluição do PTH por 21 dias; Grupo P21: injeções intermitentes de PTH por 21 dias. Os animais foram mortos e preparados para avaliação histomorfométrica dos seguintes parâmetros: I - extensão inicial do defeito, II - extensão do defeito remanescente, III - área do defeito ósseo remanescente, IV - densidade do osso neoformado, V - área do calo formado e marcação para TRAP, VI - área do cemento neoformado, VII - análise do retardo óptico (birrefringência) do ligamento periodontal reinserido sobre a raiz operada. A análise intergrupo demonstrou que os defeitos tinham tamanhos similares inicialmente e que a administração de PTH reduziu significativamente (p<0,05) a extensão e a área do defeito remanescente. Além disso, o PTH aumentou significativamente (p<0,05) a densidade do osso neoformado, a área do calo, o número de osteoclastos presentes no calo formado, a área de cemento neoformado e a birrefringência do ligamento periodontal reinserido. Conclui-se que a administração intermitente de PTH (1-34), em modelo experimental de reparo em de ratos, pode influenciar positivamente o processo de reparação óssea e periodontal. / Abstract: The intermittent PTH administration is known to contribute to bone formation in cases of osteoporosis and bone fractures. Also, it has been reported to reduce periodontitis-related bone loss. The aim of this study was to evaluate the effect of anabolic PTH on periodontal repair and mandibular bone defect in rats. Fenestration defects were created unilaterally at the buccal surface of distal roots of lower first molars in Wistar rats (n=32), and both periodontal ligament and cementum were removed. Animals were then assigned to 4 groups (n=8): 1) C14 - placebo administration for 14 days; 2) P14 - PTH administration for 14 days; 3) C21 - placebo administration for 21 days; and 4) P21 - PTH administration for 21 days. All groups were treated intermittently (3 times a week). All animals were killed and prepared to histomorphometric analysis considering the following parameters: I - extension of the initial defect; II - extension of the remaining defect; III - area of the remaining defect; IV - density of neoformed bone; V - total callus area and staining for tartrate-resistant acidic phosphatase (TRAP); VI - area of the neoformed cementum; VII - polarized light microscopic analysis of root periodontal ligament reattachment. Intergroup analysis showed that the bone defects were initially similar in size (p>0.05). The intermittent PTH administration decreased (p<0.05) both extension and area of the remaining defect, and increased (p<0.05) the neoformed bone density and the total callus area. An increase in TRAP-positive cells was observed in the PTH treated groups (p<0.05). The area of the neoformed cementum and reattachment of the periodontal ligament were also observed to increase concerning PTH-treated groups (p<0.05). Data analysis suggests that the intermittent PTH administration might contribute to bone and periodontal repair in rats. / Doutorado / Histologia e Embriologia / Doutor em Biologia Buco-Dental

O objetivo deste estudo foi estabelecer cultura primária de células derivadas da granulação óssea (GO) de seres humanos para determinar seu padrão de crescimento in vitro e determinar os efeitos biológicos de três membranas reabsorvíveis feitas de colágeno (BioGide®, GenDerm®, CollaTape®) em culturas de fibroblastos gengivais humanos (FGH) e células da granulação óssea (GO). Foram coletadas amostras de tecido ósseo presente no alvéolo de cicatrização de dois pacientes adultos saudáveis sistemicamente com indicação de cirurgia periodontal regenerativa pela técnica do enxerto ósseo em neoformação. Imediatamente após a coleta, as amostras foram transportadas ao laboratório de cultura de células para estabelecimento da cultura primária. As células foram cultivadas em atmosfera úmida, contendo 5% CO2 a 37oC. A curva de crescimento das células foi determinada por meio de contagem de células viáveis. Após a caracterização da curva de crescimento, foram realizadas a caracterização da amostra por meio de determinação da atividade de fosfatase alcalina e de mineralização. Posteriormente, os efeitos de três diferentes tipos de membranas colágenas sobre a proliferação de células GO e FGH foram investigados por meio do teste MTT. As amostras foram divididas em oito grupos: (1) células FGH em meio DMEM (C-FGH); (2) células FGH em meio DMEM condicionado com membrana GenDerm (GD-FGH); (3) células FGH em meio DMEM condicionado com membrana BioGide (BG-FGH); (4) células FGH em meio DMEM condicionado com membrana ColaTape (CT-FGH); (5) células GO em meio DMEM (C-GO); (6) células GO em meio DMEM condicionado com membrana GenDerm (GD-GO); (7) células GO em meio DMEM condicionado com membrana BioGide (BG-GO); (8) células GO em meio DMEM condicionado com membrana CollaTape (CT-GO). O teste de proliferação celular mostrou que houve aumento significativo (p< 0.05; ANOVA para medidas repetidas) do número de células vitais presentes na cultura nos dias 3 (90,8%), 5 (132,50%), 7 (137,50%) e 10 (227,50%) em relação ao controle (dia 0). Foram observadas atividade de fosfatase alcalina e de mineralização in vitro. Houve aumento do número de células FGH e GO viáveis em todos os grupos (p< 0.05; ANOVA para medidas repetidas). Houve maior efeito proliferativo nas células FGH e GO nos grupos GD e CT, com diferenças estatisticamente significantes entre os grupos (p< 0.05; Mann Whitney) apenas no período de 96 horas. Esses achados sugerem que as células GO apresentam alta atividade de proliferação e síntese, sendo compatíveis com células de linhagem osteoblástica. Duas membranas colágenas testadas exerceram maior ação proliferativa tardia sobre osteoblastos, indicando sua eficácia na regeneração dos tecidos periodontais. / The aim of this study was to establish primary culture of cells derived from human bone granulation tissue (GO) in order to determine its growth pattern in vitro and the biological effects of three absorbable collagen membranes (BioGide®, GenDerm®, CollaTape®) in human gingival fibroblasts (FGH) and human bone granulation (GO) cell cultures. Samples of bone tissue present at healing sockets of two systemically healthy adults with indication of periodontal regenerative therapy by the newly forming bone were collected. Immediately after, samples were transported to the laboratory of cell culture to the establishment of primary cultures. Cells were cultivated in humid atmosphere with 95% CO2 at 37oC. Cells growth pattern were determined by counting of viable cells. After characterization of growth pattern, samples were characterized according to alkaline phosphatase activity and mineralization detected by alizarin red. Afterwards, the effects of three different types of collagen membranes on GO and FGH cells were investigated by MTT test. Samples were divided into eight groups: (1) FGH cells in DMEM (C-FGH); (2) FGH in DMEM conditioned by GenDerm® membrane (GD-FGH); (3) FGH in DMEM conditioned with BioGide® (BG-FGH); (4) FGH in DMEM conditioned by CollaTape® (CT-FGH); (5) GO cells in DMEM (C-GO); (6) GO cells in DMEM conditioned by GenDerm® (GD-GO); (7) GO cells in DMEM conditioned by BioGide® (BG-GO); (8) GO cells in DMEM conditioned by CollaTape® (CT-GO). Cell proliferation test showed a significant (p< 0.05; ANOVA for repeated measures) increase in the number of vital cells present in the culture at days 3 (90.8%), 5 (132.50%), 7 (137.50%) and 10 (227.50%) compared to control (dia 0). It was observed alkaline phosphatase activity and mineralization in vitro. There was an increase in the number of FGH and GO viable cells at all groups (p< 0.05; ANOVA for repeated measures). Greater proliferative effect at FGH and GO cells at GD and CT groups, with significant differences between groups (p< 0.05; Mann Whitney) only at 96 hs. Two of the collagen membranes tested exerted greater late proliferative effects on osteoblasts, suggesting its efficacy in the regeneration of periodontal tissues.

Em Implantodontia, o titânio (Ti) é o material de escolha para a confecção dos implantes dentários por apresentar excelentes propriedades mecânicas e biocompatibilidade. Entretanto, novas estratégias de modificações da topografia e da composição bioquímica da superfície de Ti vêm sendo pesquisadas com o objetivo de incrementar a biocompatibilidade do Ti. A combinação de alterações topográficas em escala nanométrica e revestimento com o colágeno tipo I seria uma modificação com potencial para aumentar e/ou acelerar o processo de osseointegração. Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de superfície de Ti com nanotopografia revestida com colágeno sobre a osteogênese in vitro. Para isso, osteoblastos derivados de calvária de ratos foram cultivados em meio osteogênico sobre 4 superfícies de Ti: usinada (Ti Usi), usinada revestida com colágeno (Ti Usi/Col), com nanotopografia (Ti Nano) e com nanotopografia revestida com colágeno (Ti Nano/Col). A osteogênese foi avaliada pelos seguintes parâmetros: viabilidade celular; expressão das proteínas sialoproteína óssea (BSP) e osteopontina (OPN); atividade de fosfatase alcalina (ALP); expressão dos genes ALP, colágeno tipo I (COL), osteocalcina (OC), OPN, osterix (OSX) e runt-related transcription factor 2 (RUNX-2); e a formação de matriz extracelular mineralizada. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo pós-teste Student- Newman-Keuls e o nível de significância adotado foi de 5%. Aos 7 dias, a viabilidade celular foi maior sobre a superfície Ti Nano/Col, comparada às outras superfícies, dentre as quais não foi detectada diferença estatisticamente significante. Houve um 11 aumento da atividade da ALP dos 7 para os 10 dias; aos 7 dias, a atividade da ALP foi menor na superfície Ti Usi em comparação às superfícies Ti Nano e Ti Nano/Col; e aos 10 dias a atividade da ALP foi maior nas células crescidas sobre a superfície Ti Nano/Col comparado às demais superfícies. A imunolocalização, tanto para a OPN aos 3 dias quanto para BSP aos 7 e 10 dias, foi maior nos grupos Ti Nano e Ti Nano/Col com marcações fortes por todo o citoplasma além de depósitos extracelulares adjacentes às células. A expressão dos genes marcadores osteoblásticos avaliados foi maior sobre as superfícies Ti Nano e Ti Nano/Col, em comparação com as superfícies Ti Usi e Ti Usi/Col. A formação de matriz mineralizada foi maior nas superfícies Ti Usi/Col e Ti Nano/Col em relação às superfícies Ti Usi e Ti Nano, dentre as quais não foi detectada diferença estatisticamente significante. Esses resultados sugerem que a combinação de nanotopografia com revestimento com colágeno de superfícies de Ti estimula os eventos intermediários da osteogênese e tem potencial para favorecer a osseointegração dos implantes de Ti. / In Implantology, titanium (Ti) is the material of choice for the manufacture of dental implants because of its excellent mechanical properties and biocompatibility. However, new strategies to modify the topography and biochemical composition of Ti surfaces have been tested in order to increase the biocompatibility of Ti. The combination of topographic changes at the nanoscale and coating with collagen type I has potential to increase and/or accelerate the osseointegration process. The aim of this study was to evaluate the effect of Ti surface with nanotopography coated with collagen on in vitro osteogenesis. For this, osteoblasts harvested from rat calvaria were cultured in osteogenic medium on 4 Ti surfaces: machined (Ti Usi), machined coated with collagen (Ti Usi/Col), nanotopography (Ti Nano) and nanotopography coated with collagen (Ti Nano/Col). The osteogenesis was evaluated using the following parameters: cell viability; expression of bone sialoprotein protein (BSP) and osteopontin (OPN); Alkaline phosphatase (ALP) activity; gene expression of ALP, type I collagen (COL), osteocalcin (OC), OPN, osterix (OSX) and runt-related transcription factor 2 (RUNX-2); and the formation of mineralized extracellular matrix. Data were compared by analysis of variance (ANOVA) followed by Student-Newman-Keuls post-test and the significance level was set at 5%. At 7 days, cell viability was higher on the Ti Nano/Col compared 13 to other surfaces, among which was not detected statistically significant differences. There was an increase in ALP activity from 7 to 10 days; at 7 days, the activity of ALP was lower in Ti Usi surface compared to Ti Nano and Ti Nano/Col surfaces; and at 10 days the activity of ALP was higher in cells grown on the Ti Nano/Col surface compared to other surfaces. The immunolocalization to both OPN at 3 days and BSP at 7 and 10 days was higher in Ti Nano and Ti Nano/Col surfaces with strong labeling throughout the cytoplasm as well as extracellular deposits. The expression of the osteoblast marker genes was higher on Ti Nano and Ti Nano/Col surfaces compared to Ti Usi and Ti Usi/Col surfaces. The formation of mineralized matrix was higher in Ti Usi/Col and Ti Nano/Col surfaces than in Ti Usi and Ti Nano between which there was no statistically significant difference. These results suggest that the combination of nanotopography with collagen in Ti surfaces stimulates the intermediate events of the in vitro osteogenesis and seems to have potential to promote osseointegration of Ti implants.

Os osteoblastos são células de origem mesenquimal envolvidas na formação óssea. Essas células podem sofrer alterações decorrentes de traumas, intervenções, e infecções. As infecções podem ser minimizadas a partir do uso de antimicrobianos. O poli(L-lactídeo) ou PLLA, é um polímero sintético que se destaca por sua biocompatibilidade e absorção, o qual pode ser utilizado como um liberador farmacológico local, como alternativa à terapêutica antimicrobiana sistêmica. Esse polímero também é empregado como matriz de suporte celular na engenharia de tecidos ósseos, por auxiliar na reparação e regeneração. A incorporação de partículas nesse polímero pode gerar reações adversas, portanto, devemos nos certificar que o dispositivo polimérico incorporado com antimicrobianos não seja citotóxico. Proposição: Analisar a estrutura e a citotoxidade em osteoblastos de dispositivos poliméricos de PLLA incorporados com antimicrobianos, sendo eles: Amoxicilina ou Azitromicina ou Clindamicina ou Metronidazol para uso local. Metodologia: Foram confeccionados 270 dispositivos poliméricos com 6mm de diâmetro composto de PLLA com a incorporação de antimicrobianos a 20%, Amoxicilina (AM) ou Azitromicina (AZ) ou Clindamicina (CL) ou Metronidazol (ME) sendo confeccionados através de dois métodos: eletrofiação (malhas) ou deposição (filmes). Posteriormente, foi realizado o teste de citotoxicidade direta MTT nesses dispositivos com a cultura de osteoblastos em 24, 48 e 72h de experimento. Para análise da estrutura do dispositivo, foram feitas análises macroscópicas através de fotografias digitais e microscópicas com Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV). Resultados: A reação de citotoxidade mostrou que malhas e filmes incorporados à antimicrobianos são compatíveis com a cultura de osteoblastos, não apresentando citotoxicidade em nenhum momento do estudo (p<0.05). Na fotografia pudemos observar que os dispositivos apresentam coloração semelhante em relação às malhas e coloração diferenciada para filmes dependendo do tipo de antimicrobiano incorporado. No MEV, através da análise dos dispositivos pudemos notar que houve diferença no aspecto das superfícies dos filmes, sendo que os filmes de AM apresentaram aspecto irregular e poroso, enquanto AZ aparece liso com alguns grânulos, os de CL e ME possui superfícies ásperas e os de PLLA apresentaram superfície lisa. Quanto às malhas, notamos que todas as amostras apresentaram microfibras e poros que imitam a matriz extracelular, diferenciando-se apenas na espessura das fibras. Houve a presença de osteoblastos em todos os filmes confeccionados, mas os filmes de AM não induziram a proliferação, aparecendo apenas células isoladas. Enquanto nas malhas só foram observados osteoblastos em malhas de AM, ME e PLLA. Conclusão: Os dispositivos poliméricos confeccionados com PLLA incorporados com antimicrobianos podem ser usados na reparação e regeneração óssea uma vez que não apresentaram citotoxicidade em osteoblastos. / Osteoblasts are mesenquima originated cells, which are involved in the bone formation. These cells may suffer alterations due to traumas, interventions and infeccions. The infections can be minimized by the handling of antimicrobials. Poly (L-lactide) or PLLA is a synthetic polymer known for its biocompatibility and absorption, which can be used as a local pharmacological releaser, as an alternative to the systemic antimicrobial therapy. This polymer also can be frequently used as a supporting structure to cellular matrix in the bone tissue engineering as it can be used for support in repair and regeneration. The particle incorporation in this polymer can create side effects, therefore, we need to certificate that the polymeric device incorporated with antimicrobials are not cytotoxic. Proposition: Analyse the structure and cytotoxicity in osteoblasts of PLLA polymeric devices associated with antimicrobials, being them: Amoxicillin, Azithromycin, Clindamycin and Metronidazole. Methods: For this study 270 polymerical devices were manufactured with 6mm diameter of PLLA with a 20% antimicrobials incorporation of Amoxicillin (AM), Azithromycin (AZ), Clindamycin (CL) and Metronidazole (ME) that have been produced through two methods: eletrospinning (mesh) or casting (film). Afterwards a MTT cytotoxicity test was made over the periods of 24, 48 and 72 hours of experiment. To make a structural analysis of the device a macroscopic analysis was performed through photographs and microscopic imaging with scanning electron microscope (SEM). Results: The cytotoxicity reaction exhibited that meshes and films incorporated with antimicrobials are comparable with the osteoblasts culture, indicating that there was no cytotoxicity in any moment (p < 0.05). In the phothograph we could observe that the devices showed a similar coloration among the meshes and different coloration for the films depending on the incorporated antimicrobial. The SEM analysis displayed a difference in the surface appearance of the films. The AM films displayed an irregular and porous appearance, meanwhile, AZ looked smooth with few grains, the CL and ME have rough surfaces and PLLA presents smooth surfaces. As for the meshes, we noticed that all the samples had microfibers and pores that mimic the extracellular matrix, differing only in the thickness of the fibers. Osteoblasts were present in all films but AM did not induce proliferation, with only isolated cells emerging. In meshes osteoblasts were only found in AM, ME and PLLA. Conclusion: Polymeric devices made with PLLA incorporated with antimicrobials can be used in bone repair and regeneration given that they did not offer cytotoxicity for osteoblasts.

Orientador: Eliana Aparecida de Rezende Duek / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Mecânica / Made available in DSpace on 2018-08-18T20:14:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Messias_AndreDutra_M.pdf: 3979732 bytes, checksum: a037cfe8915578970a94fa33568fbd91 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Polímeros a base de ácido láctico são largamente investigados como materiais para a engenharia tecidual. A capacidade de sofrer degradação hidrolítica, de ser reabsorvido pelo organismo e sua biocompatibilidade inerente, tornam-nos uma excelente escolha para tal aplicação. Entretanto, características como baixa flexibilidade e pequena capacidade de alongamento antes da fratura, tendem a limitar esses dispositivos em determinadas aplicações, o que pode ser melhorado com a adição de compostos que agem como plastificantes, como é o caso do trimetileno carbonato (TMC), quando presente na cadeia polimérica do copolímero de ácido láctico (PLDLA). O objetivo deste trabalho foi sintetizar e caracterizar o terpolímero de L-ácido láctico, D,L-ácido láctico e TMC, e obtenção de arcabouços para avaliação da viabilidade celular e atividade de células osteoblásticas (SaOS-2), em 1, 3, 7, 14 e 21 dias de cultivo, visando aplicação na engenharia tecidual óssea. Dessa forma, sintetizou-se o terpolímero a partir de 20 e 30% de TMC, através da polimerização em massa dos monômeros, como confirmado por RMN de 1H e 13C, utilizando como catalisador o Sn(Oct)2. A análise de GPC mostrou que os terpolímeros sintetizados apresentaram massa molar média (Mw) na ordem de 105 g/mol, característica importante que permite a obtenção de propriedades mecânicas mínimas para uma aplicação estrutural. A investigação térmica do PLDLA-TMC demonstrou uma discreta diminuição da Tg em relação ao PLDLA. Além disso, a degradação do terpolímero em etapa única iniciou-se em torno dos 290 ºC, como visto pelo TGA. O ensaio de MTT mostrou que o arcabouço de PLDLA-TMC permitiu um aumento na viabilidade celular, atingindo valores máximos em 7 dias, e mantendo-se estável até 14 dias de cultivo. Similarmente, a atividade de fosfatase alcalina foi crescente até 7 dias de cultivo, importante indicador da atividade osteoblástica. Esses resultados mostram que é possível produzir com sucesso o terpolímero PLDLA-TMC. Além disso, os arcabouços produzidos apresentaram características importantes considerando a aplicação para engenharia tecidual óssea / Abstract: Lactic acid based polymers are widely investigated as materials for tissue engineering. The ability to allow hydrolytic degradation, to be reabsorbed by the body and its inherent biocompatibility, make them an excellent choice for this application. However, characteristics such as low flexibility and low elongation ability before the fracture tend to limit these devices in particular applications, which can be enhanced with the addition of compounds that act as plasticizers, as the trimethylene carbonate (TMC) when present in the polymer chain of the copolymer of lactic acid (PLDLA). The objective of this work was to synthesize and characterize the terpolymer of L-lactic acid, D,L-lactic acid and TMC, obtain evaluation of scaffolds for cell viability and alkaline phosphatase activity of osteoblastic cells (SaOS-2) in 1, 3, 7, 14 and 21 days of culture, aiming its application in bone tissue engineering. Thus, the terpolymer is synthesized from 20 and 30% of TMC, by bulk polymerization of monomers, confirmed by 1H and 13C RMN. The GPC analysis showed that the copolymers synthesized showed average molar mass (Mw) in the order of 105 g/mol, an important feature that allows the attainment of minimum mechanical properties necessary for structural applications. The thermal investigation of thermal PLDLA-TMC showed a slight decrease of Tg comparing to PLDLA. Furthermore, the one step terpolymer degradation was initiated around 290 ºC, as shown by TGA. The MTT assay showed that the PLDLA-TMC scaffolds enabled an increase in cell viability, reaching a peak in 7 days, and remained stable until 14 days of cultivation. Similarly, the alkaline phosphatase activity was increased up to 7 days of culture, an important indicator of osteoblastic activity. These results show that it was possible to successfully produce a terpolymer from L-lactic acid, D,L-lactic acid and trimethylene carbonate. In addition, the scaffolds exhibited important characteristics considering the application for bone tissue engineering / Mestrado / Materiais e Processos de Fabricação / Mestre em Engenharia Mecânica