Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Staudinger-Phosphonit-Reaktion auf Azidohomoalanin-haltiges Ubiquitin angewendet, um ortsspezifisch modifizierte Alkinphosphonamidat-Ubiquitine zu erzeugen. Diese Ubiquitin-basierten Sonden wurden bei neutralem pH-Wert in selektiven Konjugationen mit DUBs, die ein Cystein im aktiven Zentrum beinhalten, eingesetzt, auch in Anwesenheit anderer Thiole. Dabei beobachteten wir DUB-Spezifitäten in Abhängigkeit von der Phosphonamidat-Position innerhalb der Sonde. Die DUB-Selektivität konnte auch an Pull-Down-Experimenten aus Zelllysaten gezeigt werden. Zusätzlich konnte die Cystein-Selektivität der Sonde an ausgewählten konjugierten DUBs mittels MS/MS-Analyse nachgewiesen werden. Wir beobachteten auch unterschiedliche Ausmaße der DUB-Inhibition bei der Inkubation mit den verschiedenen Phosphonamidat-Sonden. Im Hinblick auf das DUB-Targeting in lebenden Zellen untersuchten wir auch Bedingungen für zellpenetrierende Peptid-konjugierte Ubiquitine für einen Transport der Sonde in das Zytosol der Zellen. Im zweiten Teil der Arbeit haben wir die neuartige, chemisch induzierte Phosphonothiolat Elektrophile für Thiol-Konjugation angewendet, um unhydrolysierbare ubiquitinierte Substrate herzustellen. Es gelang uns, ein hoch elektrophiles Ubiquitin-Vinylphosphonothiolat mit guter Ausbeute zu erzeugen. Wir konnten die frisch hergestellte Sonde in Konjugationen mit Cysteinen an ausgewählten Proteinen einsetzen. Um unser Konzept zu etablieren, generierten wir ein monoubiquitiniertes α-Synuclein und demonstrierten dessen strukturelle Integrität in einer enzymatischen Ubiquitinierung des Konjugats. Außerdem stellten wir ein künstlich K48-verknüpftes Diubiquitin her, das von spezifischen Antikörpern ähnlich erkannt wurde wie das native K48-verknüpfte Diubiquitin, aber in Gegenwart von DUBs sich als stabil erwies. Das Ubiquitin-Vinylphosphonothiolat zeigte ebenfalls eine selektive DUB-Konjugation, wenn nur kurze Inkubationszeiten verwendet wurden. / In the first part of this thesis a Staudinger-phosphonite reaction was applied on azidohomoalanine-containing ubiquitin to generate site-specifically modified alkynephosphonamidate ubiquitins. These ubiquitin-based probes were utilized in selective conjugations of active site cysteine-containing DUBs at neutral pH, even in the presence of other thiols. Furthermore, we observed DUB specificities depending on the phosphonamidate position within the probe. The selectivity could also be demonstrated in pull-down experiments from cell lysates. Moreover, the probe’s cysteine selectivity within chosen conjugated DUBs could be determined using MS/MS analysis. Consequently, we observed varying extents of DUB inhibition upon incubation with the different phosphonamidate probes. For DUB targeting in living cells we also investigated conditions of cell penetrating peptide conjugated ubiquitin in order to successfully deliver them to the cytosol. In the second part of this thesis, we applied the novel chemically induced phosphonothiolate electrophiles for thiol conjugation to produce unhydrolyzable ubiquitinated substrates. Starting from a disulfide-activated cysteine ubiquitin mutant, we managed to generate a highly electrophilic ubiquitin vinylphosphonothiolate in satisfactory yield. We could apply the freshly prepared probe in conjugations with cysteines on selected proteins, in which the conjugation product showed to be remarkably stable. To establish our concept, we prepared monoubiquitinated α-synuclein and demonstrated its structural integrity in the performance of an enzymatical ubiquitination of the conjugate. Furthermore, we produced an artificially K48-linked diubiquitin, which was similarly recognized by specific antibodies as the native K48-linked diubiquitin and was not hydrolyzed in the presence of DUBs. The ubiquitin vinylphosphonothiolate displayed also selective DUB conjugation, when only short incubations were used.

Le mépliement et l'agrégation des protéines sont à l'origine de nombreuses maladies neurodégénératives, dont la maladie de Huntington (HD) et la maladie de Parkinson (PD). Même si l’agrégation de différentes protéines liées à des maladies est bien documentée, on en sait peu sur l'interaction entre les protéines mal repliées et les cellules neuronales, qui leur permettent de se propager et affecter différentes régions du cerveau. L'objectif de ma thèse était de générer des modèles cellulaires rapporteurs de la huntingtine et l’α-synucléine, protéines dont le mauvais repliement et l'agrégation sont à l'origine de HD et PD respectivement, et utiliser ces modèles cellulaires pour étudier les interactions entre les agrégats et des lignées cellulaires de mammifères. Notre but c’était de documenter les propriétés de liaison et d’absorption de ces agrégats par les cellules rapporteuses, et les conséquences de leur internalisation pour les cellules. Deux modèles cellulaires de neuroblastome (SH-SY5Y et Neuro2A) et un modèle de cellules d’ostéoblastome (U2OS) exprimant la protéine fluorescente ChFP ont été générés pour HD. Pour simuler ce qui se passe au sein de neurones réels, des cellules de neuroblastome ont été induites à se différencier. Des différences de fixation, internalisation, nucléation de la protéine endogène et localisation finale des agrégats de polyglutamine internalisés ont été observées entre les cellules différenciées et non différenciées. Des cellules rapporteuses U2OS ont été utilisées pour déterminer les différences d’infectiosité entre des fibres de HttExon1 assemblés en présence ou en l’absence de la protéine de choc thermique constitutivement exprimée chez l'Homme Hsc70. Hsc70 a un effet protecteur car il rend les fibres moins infectieuses pour les cellules de mammifères en culture. Enfin, un modèle cellulaire de neuroblastome (Neuro2A) rapporteur pour PD exprimant l’α-synucléine fusionnée à la protéine ChFP a été utilisé pour déterminer des différences de liaison, pénétration, absorption, nucléation de la protéine endogène et persistance entre deux polymorphismes d’α-synucléine générés par notre équipe. L'hétérogénéité observée dans différents patients souffrant de synucléinopaties pourrait s'expliquer par différents polymorphes d’assemblages protéiques d’α-synucléine présents dans les cerveaux des malades, ce qui doit être pris en compte pour les développements thérapeutiques futurs.Ces modèles cellulaires rapporteurs pour différentes maladies sont un système valable pour l'étude de différents processus cellulaires liés à l'interaction entre les protéines agrégées exogènes et des cellules de mammifères en culture. Nos résultats indiquent un mécanisme commun par lequel les différentes protéines agrégées peuvent interagir avec des cellules en culture: les protéines mal repliées exogènes sont capables de se lier à des membranes cellulaires, les pénétrer, entrer dans l'espace intracellulaire et recruter des protéines endogènes solubles. Même si cela semble être un mécanisme générique pour des protéines infectieuses telles que la α-synucléine ou la huntingtine, des lignées cellulaires avec différents phénotypes montrent différences de vulnérabilité à la présence de protéines agrégées. Ceci suggère la présence de récepteurs spécifiques à la surface de la cellule capables de reconnaître des structures de type amyloïde. D'autres études sont nécessaires pour déterminer la nature de ces récepteurs et si sa modulation pourrait être utile pour contrôler la propagation des ces maladies dans le cerveau. / Protein misfolding and aggregation are at the origin of many neurodegenerative diseases, including Huntington’s disease (HD) and Parkinson’s disease (PD). Even if the aggregation of different disease-related proteins is well documented, little is known about the interaction between those misfolded proteins and neuronal cells that allow them to spread and affect several regions of the brain. The objective of my thesis was to generate reporter cellular models of huntingtin and α-synuclein, proteins whose misfolding and aggregation are at the origin of HD and PD respectively, and use these cell models for studying the interactions between misfolded protein aggregates and mammalian cell lines. We aimed to document the binding and uptake properties of those aggregates by reporter cells and the consequences of their internalization for the cells. Two neuroblastoma cell models (SH-SY5Y and Neuro2A) and an osteoblastoma cell model (U2OS) expressing the fluorescent protein ChFP were generated as mammalian reporter cell lines for HD. To mimic what happens in real neurons, neuroblastoma reporter cells were induced to differentiate. Differences in binding, internalization, nucleation of the endogenous protein and final localization of the internalized polyglutamine aggregates were observed between differentiated and undifferentiated cells. U2OS reporter cells were used for determining differences in the infectivity of HttExon1 fibrils assembled in the presence or in the absence of the constitutively expressed heat shock protein Hsc70, suggesting a protective effect of Hsc70, since it renders the fibrils less infectious to mammalian cells. Finally, a neuroblastoma reporter cell model (Neuro2A) of PD expressing α-synuclein fused to the fluorescent and reporter protein ChFP was used to determine the different binding, penetration, uptake, nucleation of the endogenous protein and persistence properties of two α-synuclein polymorphs generated by our team. The heterogeneity observed in different patients suffering from synucleinopathies could be explained due to different α-synuclein assemblies present in diseased brains, what needs to be taken into account for future therapeutic developments. These reporter cellular models for different diseases are a valid system for the study of different cellular processes related with the interaction between exogenous aggregated proteins and mammalian cells in culture. Our results indicate a common mechanism by which different aggregated proteins can interact with cells in culture: exogenous misfolded proteins are able to bind cell membranes, penetrate them, enter the intracellular space and recruit endogenous soluble proteins. Even if this seems to be a generic mechanism for infectious proteins such as α-synuclein or huntingtin, different cell lines or cell phenotypes show distinct vulnerability to the presence of aggregated proteins. This strongly suggests the presence of specific receptors at the surface of the cell able to recognize amyloid-like structures. Further investigations are needed to determine the nature of these receptors and whether their modulation might be helpful for controlling the spread of these diseases within the brain.

De par leurs propriétés d’autorenouvellement et de multipotentialité, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) présentent un intérêt médical majeur et sont au cœur de nombreuses thérapies génique et cellulaire. Cependant, leur utilisation en clinique est encore limitée par leur rareté, leur hétérogénéité fonctionnelle, et leur perte durant l’étape de manipulation in vitro qui précède la transplantation.Dans ce contexte, nous avons mis au point une stratégie de marquage cellulaire par des codes-barres moléculaires afin d’évaluer simultanément et quantitativement les capacités de repopulation des CSH in vivo. Cette stratégie nous a permis de cribler 1200 composés chimiques afin d’identifier des molécules capables (1) d’améliorer l’efficacité de transduction des CSH par un vecteur lentiviral, (2) de maintenir voire d’expandre, lors de l’étape de culture in vitro, les CSH capables de repopulation à long terme. Plusieurs molécules candidates sont en cours de validation.Par ailleurs, grâce au marquage par des codes-barres, nous avons révélé l’hétérogénéité des CSH en comparant leur capacité d’autorenouvellement, la taille de la descendance qu’elles génèrent et leur capacité de différenciation. Notre technique nous a permis non seulement de confirmer l’existence de CSH biaisées vers le lignage myéloïde ou vers le lignage lymphoïde, mais aussi de quantifier leur fréquence.L’application de cette stratégie à un autre système cellulaire nous a permis d’étudier l’influence de facteurs environnementaux et génétiques sur la croissance cellulaire de populations exprimant différentiellement l’-synucléine, une protéine impliquée dans la maladie de Parkinson et certains cancers. / Considerable hope is placed on the use of hematopoietic stem cells (HSC) in engineered gene- and cell- based therapy protocols. Their clinical utilization is, however to some extent, limited by their scarce representation, their heterogeneity and their loss during the ex vivo manipulation procedure. Within this context, we developed a barcode tagging strategy to simultaneously evaluate in vivo the repopulating capacity of HSC cultured in vitro. Barcode deconvolution demonstrated that our strategy constitute a powerful tool for tracking HSC quantitatively even using several dozens of different conditions. Using this strategy, we screened 1200 chemical compounds in order to identify molecules acting (1) on HSC transduction efficiency using a lentiviral vector, (2) on maintenance or even amplification during the in vitro culture step of long-term repopulating HSC. Several candidate molecules are currently under validation. In addition, using this barcoding strategy, we reveal heterogeneous behaviour of HSC examining their proliferation capacity, self-renewal ability and their differentiation lineage option. Our technique allowed us not only to confirm the occurrence of myeloid- and lymphoid-biased HSC, but also to quantify their frequency.We apply this strategy to another cell system to address the effect of different genetic and environmental factors on proliferation of cells expressing -synuclein, a protein involved in Parkinson disease and some cancers.

Mon projet de thèse a porté sur les mécanismes neurodégénératifs dans le contexte de la maladie de Parkinson (MP). Cette maladie est caractérisée notamment par la présence d’inclusions intracytoplasmiques appelées corps de Lewy, dont le composant protéique principal est l’α-synucléine. L’absence de traitements curatifs à ce jour renforce la nécessité de comprendre les processus neurodégénératifs. L’objectif de mon travail de thèse fut de proposer une approche multifactorielle, translationnelle, basée sur trois axes complémentaires: modélisation, thérapeutique et mécanistique. Premièrement, nous nous sommes intéressés à la modélisation de la MP par l’utilisation de vecteurs viraux. Cette première partie nous a permis de conclure que le vieillissement ne constitue pas un facteur de risque pour les trois espèces étudiées. Ensuite, nous avons étudié deux stratégies pour combattre la dysfonction lysosomale existant chez les patients, premièrement par une approche biotechnologique avec des nanoparticules permettant de restaurer le pH des lysosomes dysfonctionnels, et une stratégie de thérapie génique par surexpression d’un régulateur de la biogénèse lysosomale. Grâce à ce travail, nous avons démontré l’intérêt du lysosome comme cible thérapeutique. Enfin, nous nous sommes focalisés sur l’hypothèse « prion » pour les synucléinopathies. Dans ce projet, nous avons mis en œuvre une approche de modélisation chez le primate non-humain ainsi qu’une une approche thérapeutique anti-agrégative chez le rongeur. Ces travaux mettent en évidence le rôle clé de l’α-synucléine dans l’étiologie de la MP et proposent des pistes d’améliorations des modèles animaux actuels ainsi que des approches thérapeutiques innovantes / The aim of this work was to focus on neurodegenerative mechanisms in the context of synucleinopathies, especially on Parkinson’s disease (PD). PD is characterized by the loss of dopaminergic neurons and the presence of intracytoplasmic proteinaceous inclusions named Lewy Bodies of which α-synuclein (α-syn) is the main protein component. To date, there are no curative treatments. Elucidating mechanisms underlying neurodegeneration in PD will allow the identification of new molecular targets for therapeutic intervention. My Ph.D. work intends multifactorial and translational approaches based on modelling, therapeutic intervention and mechanistic studies. We first focused on the development of new animal models of PD based on the use of viral vector-mediated overexpression of α-syn. This word allowed us to conclude on the absence of additive effect of ageing in α-syn-related toxicity, at least in the three investigated species. Then, we worked on two therapeutic strategies to overcome the lysosomal dysfunction occurring in PD. To do so, we first developed a biotechnological approach based on the use of acidic nanoparticles restoring acidic pH of sick lysosomes, and then we used a gene therapy approach based on the overexpression on a central modulator lysosomal biogenesis. We here demonstrated the interest of restoration of lysosomal physiology. Finally, we tested the “prion-like” hypothesis in a cohort of nonhuman primates and assessed the efficacy of a therapeutic approach using an oligomer modulator in mice. This work highlights the central role of α-syn in PD etiology and offers innovative strategies for both modelling and therapeutic intervention.

Les synucléionopathies représentent un groupe de maladies neuro-dégénératives incurables du système nerveux central. Elles regroupent entre autres la maladie de Parkinson, l’atrophie multi-systématisée et la maladie à corps de Lewy. Toutes ces maladies se caractérisent par un déclin progressif des fonctions motrices, cognitives, comportementales et autonomiques. La mal-conformation et l’agrégation de la protéine α-synuclein qui forme des inclusions intraneuronales sont des éléments communs à toutes les synucleinopathies. Ces inclusions portent le nom de corps de Lewy et se forment dans des neurones ou cellules gliales appartenant à des régions cérébrales spécifiques. Elles sont vraisemblablement à l’origine de la perte progressive de neurones dans certaines parties du cerveau. Dans le cas de la maladie de Parkinson et dans d’autres maladies neuro-dégénératives, il a été démontré que la pathologie se propage anatomiquement d’une manière spécifique et prévisible au niveau cérébrale. Ceci suggère donc que la progression de la maladie est étroitement liée au transfert des agrégats d’α-synucléine. Ce procédé est très similaire à celui impliqué dans la maladie du prion qui elle en revanche est infectieuse. Par ailleurs, des inclusions neuronales d’α-synucléine ont été identifiées dans des neurones dopaminergiques d’origine fœtaux qui avaient été transplanté dans des cerveaux de patients parkinsoniens. Cette étude a permis d’envisager pour la première fois la possibilité de la transmission d’inclusions d’α-synucléine entre les neurones. Bien que de nombreuses études aient démontré la propagation d’α-synucléine in vitro et in vivo, le mécanisme permettant ce transfert n’est pas clairement établi. Par conséquent, ma thèse s’attache à étudier le mécanisme de transfert d’assemblages d’α-synucléine (i.e., oligomères et fibrilles). Dans un premier temps, j’ai apporté la preuve que les assemblages d’α-synucléine transfèrent de manière efficace entre les cellules neuronales via les Tunneling nanotubes (TNT). Les TNT sont définis comme étant des ponts membranaires riches en F-actine et permettant de connecter physiquement le cytoplasme de cellules éloignées. Au niveau subcellulaire, j’ai démontré que les assemblages d’α-synucléine qui transfèrent se trouvent dans des lysosomes. En revanche, après le transfert, ces assemblages se retrouvent libres dans le cytoplasme. J’ai également mis en évidence qu’à la suite du transfert, permis par les TNT, les fibrilles d’α-synucléine sont capables de recruter et d’induire l’agrégation de l’α-synucléine soluble afin de perpétuer le processus d’agrégation à l’infinie. Ces résultats indiquent que les TNT peuvent représenter un moyen efficace permettant le transfert d’assemblages d’α-synucléine. Cette découverte offre de nouvelles opportunités pour le développement de nouveaux agents neuro-protectifs contre la propagation des synucléinopathies. / Synucleinopathies are a group of fatal neurodegenerative diseases including Parkinson's disease, dementia with Lewy bodies, and multiple system atrophy, characterized by a chronic and progressive decline in motor, cognitive, behavioral, and autonomic functions. The hallmark of these diseases is the misfolding and aggregation of α-synuclein protein accumulating into intracellular inclusions Lewy bodies in neurons and glial cells which leads to the loss of neurons in specific brain regions. In the case of Parkinson’s disease and other neurodegenerative diseases, the pathology was shown to progress throughout the brain in a specific and predictable manner suggesting that the progression of the diseases is linked to the transfer of aggregated α-synuclein that is reminiscent of prion diseases that are infectious. Importantly, upon transplantation of fetal dopaminergic neurons in the brain of Parkinson’s patients, neuronal inclusions were found in the grafted neurons strongly suggesting that α-synuclein inclusions could transmit between neurons. While several studies showed α-synuclein propagation in vitro and in vivo the mechanism of intercellular transfer remains elusive. The aim of my thesis was to study the mechanism of transfer of α-synuclein assemblies (i.e., oligomers and fibrils) involved in Parkinson’s pathogenesis. I evidenced that α-synuclein assemblies transferred efficiently via tunneling nanotubes (TNT), F-actin based membranous bridges connecting the cytoplasm of remote cells. I demonstrated that, at the sub-cellular level, the transferred α-synuclein assemblies were specifically confined in lysosomes and that upon transfer a large amount of α-synuclein was found free in the cytosol of acceptor cells. Finally, I showed that after TNT-mediated transfer α-synuclein fibrils recruited and seeded the aggregation of the soluble α-synuclein protein in order to perpetuate aggregation. The identification of TNT as an efficient means of α-synuclein transfer opens new avenues to the development of novel therapies targeting the spreading into the brain of amyloidogenic proteins involved in neurodegenerative diseases.

A recent model of Parkinson’s disease (PD) suggests that the neuropathological, behavioural and cognitive symptoms progress in stages. There is substantial evidence for a prodromal stage of PD, during which time pre-motor symptoms develop. Rapid eye movement (REM) sleep behaviour disorder (RBD) is a risk factor for developing PD and may be part of the pre-motor stage. In both disorders, neuropathological α-synuclein aggregates are thought to be a direct cause of the resulting symptoms. One model has shown that in rats, proteasome inhibition produced by systemic exposure to environmental toxins results in α-synuclein pathology and motor behaviour dysfunction that mimics the progression of PD in humans. The present study examined the hypothesis that the systemic proteasome inhibition model would produce pre-Parkinsonian RBD-like pathology in rats. It was expected that sleep disturbances would be seen prior to behavioural disturbances in rats treated systemically with PSI (a proteasome inhibitor). Following baseline sleep recording and training on the inclined beam-traverse task, rats were injected with PSI (a proteasome inhibitor) or ethanol (control), 6 times over 2 wk. Sleep recording over 8 wk and behavioural testing over 16 wk provided no evidence of sleep disturbances or motor dysfunction. Post-mortem immunohistochemical analyses of brain tissue provided no evidence of PSI-associated α-synuclein aggregates in the locus coeruleus, subcoeruleus (dorsal part), or substantia nigra (areas involved in RBD and/or PD). These results did not provide support for RBD as a prodromal phase of PD within the systemic proteasome inhibitor-based model and add to a growing body of research reporting inconsistent findings using this model. We suggest that systemic PSI exposure in rats does not produce a viable model of RBD or PD. Whether RBD is an early symptom in the progression of PD remains to be established. / Thesis (Master, Neuroscience Studies) -- Queen's University, 2010-04-28 12:04:50.613

Abstract: Neurodegenerative diseases are associated with progressive loss of structure or function of neurons which results in cell death. Recent evidence indicate that all neurodegenerative disorders, sporadic or transmissible, may have a common pathological mechanism at the molecular level. This common feature consists of protein aggregation and accumulation of harmful aggregates in neuronal cells resulting in cellular apoptosis and neurotoxicity. Neurodegenerative diseases can affect abstract thinking, skilled movements, emotional feelings, cognition, memory and other abilities. This diverse group of diseases includes Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), Huntington's disease (HD), prion diseases or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) and amyotrophic lateral sclerosis. In my project I worked on the molecular mechanism of protein aggregation, propagation and neurotoxicity in Parkinson's disease and prion disease. Prion disease and PD are associated with misfolding and aggregation of PrPc and a-Synuclein (a-Syn), respectively. Despite being two important neurodegenerative disorders, molecular mechanisms of a-Syn or PrPC aggregation and amyloidogenesis are still unclear in PD and prion disease. Furthermore, the toxic protein species in PD have not been characterized yet. In this study we characterize the mechanism of a-Syn and PrPc misfolding in a physiological-like cell free condition in the absence of a-Syn aggregates, PrPc ggregated isoform (Pre's), denaturants or acidic environment. A number of studies indicate that dimerization of PrPc or a-Syn may be a key step in the aggregation process. To test this hypothesis we verified if enforced dimerization of PrPc or a-Syn may induce a conformational change reminiscent of the conversion of PrPc or a-Syn to PrPR' or a-Syn aggregates, respectively. We used a well-described inducible dimerization strategy where a dimerizing domain called FK506-binding protein (Fv) was fused to PrPc or a-Syn in order to produce chimeric proteins Fv-PrP and a-SynF'''. A divalent ligand AP20187 was used to induce protein dimerization. Addition of AP20187 to recombinant Fv-PrP in physiological-like conditions resulted in a rapid conformational change characterized by an increase in beta-sheet (13-Sheet) structure and simultaneous aggregation of the proteins. However, non-dimerized PrP formed 13-Sheet conformation in very slower rates. In the presence of AP20187, we also report a rapid random coil into 13-sheet conformational transformation of a-SynF" within 24 h, whereas wild type a-Syn showed 24 h delay to achieve P-sheet structure after 48 h. Electron microscopy experiments demonstrated that dimerization induced amyloid fibril formation after 48 h for both Fv-PrP and a-Syr?", whereas in the absence of dimerizing ligand AP20187, PrP or a-Syn converted into amyloid fibrils after 3 days or even later. Dimerization-induced Fv-PrP aggregates were partially resistant to PK digestion which is a characteristics of the naturally occurring PrPR'. The rates of amyloidogenesis in the presence of dimerization was also characterized by Thioflavin T (ThT) fluorescence probing. Whereas the stable structure of Fv-PrP showed no ThT binding for over 60 h of incubation at 37°C, the addition of AP20187 to Fv-PrP resulted in a time-dependent increase in ThT binding. As for a-SynR, dimerization accelerated the rate of ThT binding and amyloid formation comparing to the slower amyloidogenesis rate of wild type a-Syn in the absence of dimerizer AP20187. The impact of dimerization on a-Syn aggregation was further determined by Fluorescence ANS probing, indicating a higher affinity of dimerization-induced a-SynF" aggregates for binding to ANS comparing to wild type a-Syn aggregates. These results indicate that dimerization increases the aggregation and amyloidogenesis processes for Fv-PrP and a-SynF". Both Fv-PrP and a-SynF" amyloids were successfully propagated in vitro by protein misfolding amplification (PMCA) cycle. These results ar in agreement with the theory that all protein aggregates in neurodegenerative diseases propagate with the same molecular mechanism. Neurotoxicity of recombinant Fv-PrP and a-SynF" aggregates was determined in cellulo and in vivo, respectively. Aggregates of Fv-PrP were toxic to cultured cells whilst soluble Fv-PrP and amyloid fibres were harmless to the cells. When injected to the mice brain, both a-Syni" and a-Syn pre-fibrillar aggregates internalized cells and induced neurotoxicity in the hippocampus of wild-type mice. These recombinant toxic aggregates further converted into non-toxic amyloids which were successfully amplified by PMCA method, providing the first evidence for the in vitro propagation of synthetic a-Syn aggregates. These results suggest an important role for protein dimerization in aggregation and amyloidogenesis, and therefore, in the pathology of PD and prion disease. The similarities between aggregation, amyloidogenesis and toxicity of PrPC and ct-Syn provide further evidence on the existance of a prion-like mechanism in all neurodegenerative disorders. // Résumé: Les maladies neurodégénératives sont associées à la perte progressive des propriétés structurales ou fonctionnelles des neurones, ce qui engendre la mort des cellules. De récentes études indiquent que tous les désordres neurodégénératifs, sporadiques ou transmissibles, peuvent avoir un mécanisme pathologique commun au niveau moléculaire. Ce dispositif commun se compose de l'agrégation de protéines, de la propagation des agrégats, et de l'accumulation d’agrégats toxiques dans les cellules neuronales, menant à l'apoptose et à la neurotoxicité cellulaire. Les maladies neurodégénératives peuvent affecter la pensée abstraite, les mouvements habiles, les sentiments émotifs, la connaissance, la Mémoire et d'autres capacités cognitives. Ce groupe divers de maladies inclut la maladie d'Alzheimer (AD), de Parkinson (PD), de Huntington (HD), les maladies à prions ou encéphalopathies spongiformes transmissibles (TSEs) et la sclérose latérale amyotrophique (ALS). [symboles non conformes]

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La maladie de Parkinson (PD) et la démence à corps de Lewy (DLB) sont les deuxième et troisième maladies neurodégénératives les plus communes et font partie d’une classe de maladies appelées synucléinopathies. Les synucléinopathies sont associées à une pathologie liée à l’α-synucléine (α-syn) laquelle se caractérise par une accumulation de cette protéine dans les neurones, formant ainsi les corps de Lewy. L’α-syn pathologique se retrouve aussi sous forme d’oligomères et de fibrilles, qui sont toxiques pour les neurones et leurs synapses. L’une des premières anomalies observables chez les patients atteints de synucléinopathies est la dysfonction synaptique, souvent combinée à une perte de synapses. Il a été rapporté que les oligomères d’α-syn retrouvés au niveau des synapses précèdent la formation de corps de Lewy dans les neurones et leur transmission semble être associée à la progression des symptômes. Pourtant, les mécanismes moléculaires sous-jacents la dysfonction synaptique causée par l’α-syn restent inconnus. D’autre part, le fonctionnement normal des synapses est fortement régulé par une famille de protéines appelées organisateurs synaptiques. Les organisateurs synaptiques, incluant la protéine neurexine, sont des molécules d’adhésion cellulaire qui régulent la synaptogenèse, la plasticité, la libération des neurotransmetteurs et les fonctions cognitives. De plus, nous avons préliminairement montré que l’α-syn interagit avec l’isoforme β des neurexines (NRXs) (β-NRXs). Mon projet avait donc pour but de caractériser l’interaction α-syn/β-NRX et d’évaluer comment celle-ci contribue à la pathologie liée à l’α-syn. Nous avons émis l’hypothèse que cette interaction affecte la fonction synaptogénique liée aux NRXs et son trafic. Dans un premier temps, pour tester notre hypothèse, l’interaction α-syn/β-NRX a été évaluée grâce à des analyses de liaison à la surface cellulaire. Il a été constaté que les oligomères d’α-syn se lient fortement à NRX1,2β de manière dépendante du domaine riche en histidine (HRD), caractéristique de l’isoforme β, et cela sans perturber sa liaison à ses ligands endogènes postsynaptiques, neuroligine 1 (NLG1) et « leucine rich repeat transmembrane neuronal 2 » (LRRTM2). De plus, à travers des essais d’internalisation, nous avons observé que les oligomères d’α-syn altèrent le trafic de NRX1β en augmentant son internalisation de façon dépendante au HRD et altèrent également la différenciation NRX-dépendante de la synapse en synapse inhibitrice. Par conséquent, nous suggérons que cette internalisation accrue pourrait affecter la fonction synaptogénique associée aux NRXs. Ce travail contribue à une meilleure compréhension sur la façon dont l’α-syn provoque un dysfonctionnement synaptique, fournissant de nouvelles perspectives moléculaires et pharmacologiques sur les synucléinopathies. / Parkinson’s disease (PD) and dementia with Lewy bodies (DLB) are the second and the third most common neurodegenerative disorders and are part of a class of diseases called synucleinopathies. Synucleinopathies are associated with an α-synuclein (α-syn) pathology which shows an accumulation of α-syn in neurons, forming Lewy bodies. This pathological α-syn can form oligomers and fibrils, which are toxic for neurons and their synapses. One of the first changes to occur in patients’ brain with synucleinopathies is synaptic dysfunction often combined with synapse loss. Synaptic α-syn oligomers were revealed to precede the formation of Lewy bodies, and their transmission to other neurons to correlate with the progression of the symptoms. Yet, the molecular mechanisms underlying how α-syn leads to synaptic dysfunction are unknown. Synaptic function is highly regulated by a protein family called synaptic organizers. Synaptic organizers are cell adhesion molecules that regulate synaptogenesis, plasticity, neurotransmitter release, synaptic plasticity and cognitive functions. Of this family, we have found that α-syn interacts with the β-isoforms of the neurexins (NRXs) family members (β-NRXs). My project aimed to characterize α-syn/β-NRX interaction and to evaluate how this interaction contributes to α-syn pathology. We hypothesized that this interaction affects NRX trafficking and its synaptic function. Firstly, to test our hypothesis, the α-syn/β-NRX interaction was characterized by performing cell surface binding assays. I found that α-syn oligomers strongly bind to NRX1,2β in a histidine rich domain (HRD)-dependent manner, without disrupting NRX binding to its postsynaptic binding partners, neuroligin 1 (NLG1) and leucine rich repeat transmembrane neuronal 2 (LRRTM2). Moreover, using internalization assays, we discovered that α-syn oligomers impair NRX trafficking by increasing NRX1β internalization in an HRD-dependent manner and impair NRX-dependent inhibitory presynaptic differentiation. Thereby, we suggest that this increased internalization affects the inhibitory synaptogenic function of NRX-based synaptic organizing complexes. This work contributes to a better understanding of how α-syn causes synaptic dysfunction, providing promising new molecular mechanisms and pharmacological insights into synucleinopathies.

Synuclein, Parkinson's disease, network activity, neuron, tau protein, neurodegeneration, connectivity, cAMP,