La coacervation complexe, une séparation de phase associative principalement induite par des interactions électrostatiques, entre la B-lactoglobuline (BLG, protéine animale) et la gomme d’Acacia (AG, polysaccharide végétal) a été étudiée dans ce travail. La plus grande difficulté pour comprendre la coacervation complexe au niveau moléculaire entre BLG et AG révèle être la polymolécularité élevée d’AG. A partir de là, la motivation principale de cette thèse était de comprendre et contrôler les interactions entre la BLG et les fractions moléculaires d’AG, FI (~88% d’AG) et FII (~10% d’AG) en utilisant la titration calorimétrique isotherme, la diffusion statique et dynamique de lumière, la mobilité électrophorétique, la Granulo-Polarimétrie et la microscopie optique. Une énergie d’interaction plus forte, une stoechiométrie d’association plus faible et ainsi une complexation favorable ont étés montrées entre la BLG et FII en relation avec l’accessibilité et la densité de charges plus élevées de FII. Les résultats majeurs de cette étude ont ainsi montré des rôles différents des fractions de l’AG dans la coacervation complexe avec la BLG / The complex coacervation mechanism, an associative phase separation mainly induced by electrostatic interactions, between ?-lactoglobulin (BLG, animal protein) and Acacia gum (AG, vegetal polysaccharide) was studied in this work. The most significant difficulty to understand complex coacervation between BLG and AG at the molecular level is the molecular weight polydispersity of AG. From there, the main motivation of this research was to better understand and control the interactions between BLG and the major molecular fractions of AG, FI (~88% of AG) and FII (~10% of AG) using isothermal titration calorimetry, static and dynamic light scattering, electrophoretic mobility, Granulo-Polarimetry and optical microscopy. Higher energy of interaction, lower stoichiometry of association and then favorable complexation were shown between BLG and FII in relation with higher accessibility and density of charges for FII. The major results of this study reveal then different roles of AG fractions in complex coacervation with BLG

Fouling is a chronic problem in many heat transfer systems and results in the need for frequent heat exchanger (HEX) cleaning. In the dairy industry, the associated operating cost and environmental impact are substantial. Antifouling coatings are one mitigation option. In this work, the fouling behaviour of fluoropolymer, polypropylene and stainless steel heat transfer surfaces in processing raw milk and whey protein solution are studied. Methodologies to assess the economics of antifouling coatings are developed and applied. Two experimental apparatuses were designed and constructed to study fouling at surface temperatures around 90 °C. A microfluidic system with a 650 x 2000 µm flow channel enables fouling studies to be carried out by recirculating 2 l of raw milk. The apparatus operates in the laminar flow regime and the capability to probe the local composition of delicate fouling deposit $\textit{in-situ}$ with histological techniques employing confocal laser scanning microscopy. A larger bench-scale apparatus with a 10 x 42 mm flow channel was built to recirculate 17 l of solution in the turbulent flow regime which is more representative of conditions in an industrial plate HEX. Experimental results demonstrate that fluoropolymer coatings can reduce fouling masses from raw milk and whey protein solution by up to 50 %. Surface properties affect the structure and composition of the deposit. At the interface with apolar surfaces raw milk fouling layers are high in protein, whereas a strongly attached mineral-rich layer is present at the interface with steel. Whey protein deposits generated on apolar surfaces are more spongy and have a lower thermal conductivity and/or density than deposits on steel. The attraction of denatured protein towards apolar surfaces and the formation of a calcium phosphate layer on steel at later stages of fouling are explained with arguments based on the interfacial free energy of these materials in water. The financial attractiveness of coatings is considered for HEX subject to linearly and asymptotically increasing fouling resistance and using a spatially resolved fouling model. An explicit solution to the cleaning-scheduling problem is presented for the case of equal heat capacity flow rates in a counter-current HEX. Scenarios where the use of coatings may be attractive or where there is no financial benefit in cleaning a fouled exchanger are identified. Finally, experimental data are used to estimate the economic potential of fluoropolymer coated HEXs in the ultra-high-temperature treatment of milk. In the considered case, the value of a fluoropolymer coating inferred from the reduction in fouling is estimated to be around 2000 US$/m².

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-01-08T14:33:50Z No. of bitstreams: 1 gustavotorresdesouza.pdf: 5085443 bytes, checksum: eada917698a8738ea1947743e940692c (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-01-23T11:05:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gustavotorresdesouza.pdf: 5085443 bytes, checksum: eada917698a8738ea1947743e940692c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-23T11:05:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gustavotorresdesouza.pdf: 5085443 bytes, checksum: eada917698a8738ea1947743e940692c (MD5) Previous issue date: 2017-08-08 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O advento sistema CRISPR/Cas9 tornou o processo de edição gênica consideravelmente mais fácil e direto, uma vez que retirou empecilhos técnicos relacionados aos sistemas já disponíveis. Desta forma, foram permitidos diversos avanços no entendimento da função de elementos genômicos, assim como a produção de embriões geneticamente modificados com diversas finalidades. O atual trabalho objetivou a edição gênica no gene da beta-lactoglobulina em células somáticas bovinas objetivando a produção futura de embriões da espécie geneticamente modificados. Considerando-se que a hipersensibilidade a essa proteína responde pela maior parte das alergias ao leite bovino, a produção de animais cujo leite não contenha essa molécula é de grande interesse para a indústria de laticínios. Durante os experimentos, foi possível obter uma linhagem de células bovinas MDBK expressando a enzima Cas9 (MDBK-Cas). Usando células MDBK e as células MBDK-Cas foi possível se obter com sucesso edições gênicas no locus beta-lactoglobulina utilizando-se os componentes do sistema CRISPR/Cas9 na forma de mRNA da proteína Cas9 e sgRNAs. Conclui-se que o sistema CRISPR/Cas9 pode ser usado com os sgRNA desenhados neste estudo para editar o gene da betalactoglobulina em células MDBK. Assim, células MDBK podem ser utilizadas como alvo o locus em estudo. Modelos de estudos para edição do genoma bovino. Em vista da escassa literatura constando de trabalhos em que tenha sido feita a edição gênica em embriões bovinos, os dados gerados por esse trabalho colaborarão para o avanço do estado da arte no que diz respeito a engenharia gênica de bovinos e no conhecimento do funcionamento do sistema CRISPR/Cas9. / The advent of the CRISPR / Cas9 system made the process of gene editing considerably easier and more straightforward, since it removed technical impediments related to the systems already available. In this way, several advances were made in the understanding of the function of genomic elements, as well as the production of genetically modified embryos for various purposes. The present work aimed at the genetic editing of the beta-lactoglobulin gene in bovine somatic cells aiming at the future production of genetically modified embryos of the species. Considering that hypersensitivity to this protein accounts for most of the allergies to bovine milk, the production of animals whose milk does not contain this molecule is of great interest to the dairy industry. During the experiments, it was possible to obtain a lineage of bovine MDBK cells expressing the Cas9 enzyme (MDBK-Cas). Using MDBK cells and MBDKCas cells it was possible to successfully obtain gene editions at the beta-lactoglobulin locus using the components of the CRISPR / Cas9 system as mRNA of the Cas9 protein and sgRNAs. It is concluded that the CRISPR / Cas9 system can be used with the sgRNAs designed in this study to edit the beta-lactoglobulin gene in MDBK cells. Thus, MDBK cells can be targeted as the locus under study. Models of studies for editing the bovine genome. In view of the scarce literature consisting of studies in which bovine embryos have been genetically engineered, the data generated by this work will contribute to the advancement of the state of the art regarding the genetic engineering of cattle and the knowledge of the functioning of the system CRISPR / Cas9.

Le fer ajouté dans des systèmes complexes tels que les aliments induit divers problèmes comme l'oxydation des lipides ou la précipitation d’autres composés présents dans la matrice. Il s’en suit une diminution de sa biodisponibilité et des défauts de goût. L'utilisation de chélates de fer, comme le bisglycinate de fer ou l’EDTA de fer, constitue une voie intéressante : le fer ainsi protégé n’interagirait pas avec la matrice alimentaire. La stabilité des chélates de fer (bisglycinate de fer et NaFe EDTA), supposés peu réactif pour l’initiation de peroxydation, a été attestée sur des modèles d’émulsions huile dans eau stabilisées par du caséinate de sodium ou de la β lactoglobuline. Dans un second temps, le travail a consisté à vérifier la faible influence de ces complexes sur la nature de l’interface huile/eau (étude de la tension et de la rhéologie interfaciales). La stabilité du bisglycinate de fer en solution aqueuse et en présence de β lactoglobuline a également été évaluée en fonction du pH (pH 2, 3,5 et 6,5) par rayons X. Il a ainsi été montré que la nature des protéines formant l’interface huile/eau et le type de sels de fer jouent un rôle crucial sur la stabilité oxydative des émulsions enrichies en fer. L'affinité des protéines de lait pour les ions fer libres est le premier facteur qui contrôle la peroxydation des matières grasses par l’absence de transfert à l'interface huile/eau. La capacité du complexe bisglycinate à retenir les ions fer et donc à limiter la présence d’ions fer libres (ferriques ou ferreux) apparaît comme le second facteur principal à contrôler. La compétition pour les ions fer entre les groupes fonctionnels des protéines et les contre ions de chélates (glycinate ou EDTA) gouverne ainsi l'état d'oxydation du système dans des conditions acide/base proche de la neutralité. En milieu acide, l'oxydation est principalement gouvernée par l’instabilité du complexe bisglycinate de fer et par conséquent la lente libération fer ionique dans la phase aqueuse. Pour résumer, si le complexe de fer n’est pas déstabilisé et que la protéine à l’interface huile/eau ne présente pas de groupe fonctionnel ayant une forte affinité pour le fer, alors la peroxydation des lipides en émulsion est faible. Dans notre démonstration, si une protéine n’est pas phosphorylée et pour des pH proches de 7, alors l’émulsion ne sera pas peroxydée car le fer ne migre pas à l’interface huile/eau. / Iron incorporated into food systems induces oxidation and precipitation. The consequences are a reduced bioavailability and a modification of other food flavor. The iron chelates such as Fe-bisglycinate and Fe-EDTA represent a possibility to avoid side effects, since the iron is protected. The inertety of Fe bisglycinate and NaFe EDTA for lipid peroxidation has been verified in oil-in-water emulsion models stabilized by sodium caseinate or by β lactoglobulin through the following studies: i/ increase of primary and secondary products of oxidation, ii/ change of the properties of the oil/water interface (tension and interfacial rheology), iii/ the stability of the chelate iron (Fe-bisglycinate) in the aqueous phase with β lactoglobulin at different pH (pH 2, 3.5 and 6.5). The oil/water interface stabilized by proteins with phosphate groups has induced peroxidation, which was not observed with proteins containing no phosphate residue. These results demonstrate also that the type of iron salts plays a crucial role in the oxidative stability of emulsions. The ability of the complex to retain iron ion and to avoid “free” ferrous ion is the first important factor to be controlled. The affinity of milk proteins to bind these free iron ions is the second factor that controls the transfer to oil/water interface. To sum up, the competition for iron ions between functional groups of protein and salt counter ions (glycinate, sulfate or EDTA) governs the oxidation state of the system in neutral conditions. In acidic medium, the oxidation is mainly governed by the stability of the complex and the possibility to free iron in bulk.

Les nanoémulsions (NEs) huile/eau peuvent être utilisées en tant que systèmes de délivrance des médicaments pour l’encapsulation des substances actives hydrophobes afin d’améliorer leur stabilité et leur biodisponibilité. Néanmoins, leur stabilisation nécessite l’utilisation de concentrations plus importantes de tensioactifs par rapport aux émulsions conventionnelles en raison de l’augmentation de la surface spécifique. La plupart des tensioactifs synthétiques couramment utilisés dans la formulation des émulsions sont potentiellement irritants, voire toxiques. Cela entrave l'application thérapeutique des NEs en particulier pour les traitements à long terme. L'objectif de cette thèse est alors de formuler des NEs pharmaceutiques huile/eau stabilisées par un biopolymère, la beta-lactoglobuline (beta-lg), à la place des tensioactifs synthétiques.Les NEs ont été préparées par homogénéisation à haute pression (HHP). La composition de la formulation et les conditions du procédé ont été optimisées afin d’obtenir des gouttelettes nanométriques dans des NEs stables. Les résultats ont montré que les NEs les plus stables, avec une taille de gouttelettes < 200 nm, ont été obtenues quand 5 m/m% de l’huile ayant la viscosité la plus faible ont été utilisés en tant que phase huileuse, 95 m/m% de la solution de beta-lg à une concentration de 1 m/m% ont été utilisés en tant que phase aqueuse et 4 cycles d’HPH de 100 MPa ont été appliqués. Cette formulation a été stable contre les phénomènes de croissance de gouttelettes pendant au moins 30 jours grâce à un film interfacial quasiment purement élastique. La gomme xanthane, un polysaccaride naturel, a été ajoutée à la formulation optimale à une concentration de 0,5 m/m% en tant qu’agent épaississant. Cela a permis d’obtenir une texture crémeuse avec un comportement rhéofluidifiant. Dans cette dernière formulation, la vitesse de migration des gouttelettes a été considérablement réduite et la stabilité des NEs a été améliorée.Les effets du procédé d’HPH sur les différents niveaux de structure de la protéine ont été évalués à l’aide de méthodes spectroscopiques, chromatographiques et électrophorétiques. L’influence de ce traitement sur ses propriétés interfaciales et émulsionnantes a également été étudiée. L’efficacité émulsionnante optimale a été obtenue quand les conditions d’HPH n’ont pas altéré la structure de la beta-lg, ni ses propriétés interfaciales. Néanmoins, un traitement d’HHP excessif (300 MPa/5 cycles) a induit des modifications structurelles, principalement une transformation des feuillets beta en structures désordonnées, une large perte dans le cœur hydrophobe, et une agrégation importante par des liaisons disulfure intermoléculaires. La beta-lg modifiée par l’HHP a montré une hydrophobie de surface plus importante conduisant à une vitesse d’adsorption à l’interface huile/eau plus élevée et une formation plus précoce d’un film interfacial. La dénaturation de la protéine par ce traitement à haute pression, qui a été effectuée avant le processus d’émulsification, n'a pas modifié de façon significative l'efficacité émulsionnante. La réduction de l’efficacité a été probablement plutôt induite par la dénaturation simultanée avec l’émulsification sous conditions d’écoulement très turbulent.L’intérêt de la formulation développée en tant que véhicule pour un modèle de substance active hydrophobe a été étudié avec l’isotrétinoïne (IT), usuellement utilisé pour le traitement de l’acné sévère. La formulation développée a permis d’encapsuler 0,033 m/m% d’IT sans aucune modification de la stabilité du système. Environ 10 % de l’IT ajoutée ont été solubilisés dans la phase aqueuse en association avec la protéine libre en excès. L’IT encapsulée dans les gouttelettes huileuses a été plus stable contre la photo-isomérisation que celle associée à la protéine libre. La formulation développée apparait prometteuse en tant que système de délivrance de l’IT pour une application cutanée. / Oil-in-water nanoemulsions can be used as drug delivery systems for the encapsulation of hydrophobic active substances in order to increase their solubility and their bioavailability. However, due to their higher specific area, their stabilization requires higher surfactant concentrations compared to conventional emulsions. Most of the synthetic surfactants commonly used in emulsion formulation are potentially irritant and even toxic, which hinders the therapeutic application of nanoemulsions especially during long-term treatment. The objective of this thesis is thus to formulate pharmaceutical oil/water nanoemulsions stabilized by a biopolymer, beta-lactoglobulin (beta-lg), instead of synthetic surfactants. Nanoemulsions were prepared by high pressure homogenization (HPH). The formulation composition and the process conditions were optimized in order to obtain nanometric droplets within stable nanoemulsions. The results showed that the most stable nanoemulsions, with droplet size inférieure à 200 nm, were obtained when 5 w/w% of the oil with the lowest viscosity value was used as the oily phase, 95 w/w% of beta-lg solution at a concentration of 1 w/w% was used as the aqueous phase, and 100 MPa of homogenization pressure was applied for 4 cycles. This formulation was stable against droplet growth phenomena during 30 days at least, thanks to a quasi purely elastic interfacial film. Xanthan gum, a natural polysaccharide, was added to the optimal formulation as a texturizing agent at a concentration of 0.5 w/w%. This allowed obtaining a cream texture with a shear thinning behavior. In this formulation, the migration rate of droplets was considerably reduced and the nanoemulsions stability was enhanced.The effects of the homogenization process on the different levels of the protein structure were assessed by spectroscopic, chromatographic and electrophoretic methods. The influence of this treatment on its interfacial and emulsifying properties was also investigated. The optimal emulsifying efficiency was obtained when the homogenization conditions did alter neither the structure of beta-lg nor its interfacial properties. However, an excessive HPH treatment (300 MPa/5 cycles) introduced structural modifications, mainly from beta-sheets into random coils, wide loss in lipocalin core, and protein aggregation by intermolecular disulfide bridges. HPH modified beta-lg displayed higher surface hydrophobicity inducing a higher adsorption rate at the O/W interface and an earlier formation of an elastic interfacial film. Structural and interfacial properties modifications by HPH denaturation appeared qualitatively similar to that of the heat denaturation with, however, differences in extent. Protein denaturation by a high pressure treatment that was performed before the emulsification process did not alter significantly its emulsifying efficiency. The reduction in the efficiency was rather induced by the simultaneous denaturation with the emulsification under high turbulent flow.The efficiency of the developed formulation as a vehicle for a model hydrophobic active substance was studied using isotretinoin, usually used for the treatment of severe acne. The developed formulation was able to encapsulate 0.033 w/w of isotretinoin without any modification on the system stability. About 10 % of the added isotretinoin was solubilized in the aqueous phase associated with the free protein in excess. Isotretinoin encapsulated in the oily droplets was more stable against photo isomerization than the one associated to the excess protein in the aqueous phase. The developed formulation seems promising as a drug delivery system of isotretinoin for a dermal application.

Résumé : L'interaction entre la β-Lactoglobuline (β-Lg) et le rétinol ou entre les micelles de phosphocaséines (PC) et le rétinol à un pH proche de la neutralité, a été étudiée à pression atmosphérique et sous pression isostatique jusqu'à 400 MPa. Les constantes de dissociation et le nombre de sites de liaison ont été calculés indiquant des différences d'affinité en fonction de la structure protéique. A 25°C, des pressions inférieures à 150 MPa favorisent l'association β-Lgrétinol (rapport molaire β-Lg/rétinol : 1/1). A ≥ 150 MPa le complexe se dissocie. A 350 MPa, la β-Lg est dénaturée et le complexe irréversiblement dissocié. Le complexe PCrétinol (rapport molaire PC/rétinol : 1/1) reste au contraire formé après un traitement à 400 MPa et 25°C, bien que la pression induise des phénomènes de dissociation/réassociation des assemblages micellaires à ≥ 100 MPa. L'interaction PCrétinol stabiliserait plutôt les micelles de PC vis-à-vis de la pression, de même qu'une température de pressurisation modérée (35°C) comparativement à une température plus basse (15°C). Un isolat protéique de lactosérum (IPL) en dispersion dans l'eau à 10% (p/p) de protéines (pH 6,5) et en présence d'acétate de rétinol (AcRet) (rapport molaire β-Lg/AcRet : 10/1) a été traité par (i) haute-pression isostatique (HP) (350 MPa, 25°C, 15 min), (ii) traitement thermique de courte durée (TTCD) (75°C, 4 s) ou (iii) homogénéisation à ultra-haute pression (UHPH) (300 MPa, Tin = 24°C). Les trois traitements permettent de former des agrégats de β-Lg capables de retenir l'acétate de rétinol, mais avec une efficacité différente dépendant probablement des mécanismes d'agrégation induit par le chauffage (TTCD), la pression isostatique (HP) ou dynamique (UHPH). Des dispersions à 2,38% (p/p) en phosphocaséines (pH 6,6) en présence d'acétate de rétinol (rapport molaire PC/AcRet : 5/1) ont été traitées par (i) HP (300 MPa, 14°C ou 34°C, 15 min), ou (ii) UHPH (300 MPa, Tin = 14°C). Ces deux traitements favorisent la rétention de l'acétate de rétinol par les micelles de PC pouvant ainsi servir de cargo pour véhiculer des molécules bioactives. Mots clefs : haute pression isostatique, haute pression dynamique, homogénéisation à ultra-haute pression, fluorescence, β-Lactoglobuline, micelles de phosphocaséines, rétinol, acétate de rétinol, agrégats protéiques, interaction protéine-ligand. / Abstract: The binding of retinol to native β-Lactoglobulin (β-Lg) or phosphocasein (PC) micelles at pH close to neutral was studied at atmospheric pressure or under isostatic high-pressure. The dissociation constants and number of binding sites were calculated indicating that difference in retinol affinity depended on protein structure. At 25°C, pressure level < 150 MPa promoted β-Lgretinol association (β-Lg/retinol molar ratio: 1/1). At ≥ 150 MPa, the complex dissociated. At 350 MPa, β-Lg was denatured and the complex irreversibly dissociated. PC and retinol (PC/retinol molar ratio: 1/1) remained associated after pressurisation at 400 MPa and 25°C, while pressure induced dissociation/reassociation phenomena of micelle assemblies. The binding of retinol to PC stabilised micelles towards pressure, as well as moderate temperature of pressurisation (35°C) compared to lower temperature (15°C).A whey protein isolate (WPI) dispersed in water at 10% (w/w) proteins (pH 6.5) in the presence of retinyl acetate (RetAc) (β-Lg/RetAc molar ratio: 10/1) was processed by (i) isostatic high-pressure (HP) (350 MPa, 25°C, 15 min), (ii) short-time thermal treatment (STTT) (75°C, 4 s) or (iii) ultra-high pressure homogenisation (UHPH) (300 MPa, Tin = 24°C). All processing produced β-Lg aggregates able to retain RetAc, but with different efficiency depending on aggregation mechanisms induced by heating (STTT), isostatic high-pressure (HP) or dynamic high-pressure (UHPH). Phosphocaseins dispersed at 2.38% (w/w) proteins (pH 6.6) in the presence of RetAc (PC/RetAc molar ratio: 5/1) were processed by (i) HP (300 MPa, 14°C or 34°C, 15 min), or (ii) UHPH (300 MPa, Tin = 14°C). Both treatments promoted RetAc retention by phosphocasein micelles that can be used as cargoes to transport bioactive molecules.Keywords: isostatic high-pressure, dynamic high-pressure, ultra-high pressure homogenisation, fluorescence, β-Lactoglobulin, phosphocasein micelles, retinol, retinyl acetate, protein aggregates, protein-ligand binding.Discipline: Biochimie, Chimie et Technologie des Aliments.Thèse préparée à : Université Montpellier 2 – Equipe de Biochimie et Technologie Alimentaire – UMR IATE 1208 – Pôle EVAP – Place E. Bataillon, 34095 Montpellier, France.

Under flera månaders tid har ett kandidatexamensarbete utförts med syftet att optimera produktionen av protein-nanofibrer av vassleproteinisolat. Vassleproteinisolat består till stor del av proteinet β-laktoglobulin. Detta protein kan under upphettning bilda nanofibrer i sur miljö. Det var därför med avseende på parametrarna värme, koncentration och inkubationstid som processen optimerades eftersom det redan existerar ett pH-optimum vid pH-värdet 2. Lösningar av vassleproteinisolat med olika koncentrationer inkuberades under 24 timmar vid fyra olika temperaturer. Samtliga lösningar hade pH-värdet 2. För varje temperatur och inkubering togs proverna ut en åt gången för att sedan analyseras. De olika proverna analyserades sedan med Thioflavin T fluorescens för att se indikationer på fibrillering. De erhållna ThT spektrumen visade på fibrillbildning och resultaten för detta experiment visar på att utbytet av fibrilleringsreaktionen blir högre i takt med att hydrolysens hastighetskonstant blir lägre samt att lägre temperaturer kan gynna fibrillbildning . Ytterligare försök, tid och resurser bör läggas ner på detta område för att med säkerhet kunna optimera produktionen av nanofibrer av vassleproteinisolat. / This bachelor’s degree project’s aim was to optimize the production of protein nanofibrils originating from whey protein isolate. Whey protein isolate largely consists of the protein β-lactoglobulin, which can form nanofibrils while immersed in an acidic environment when heated. Therefore, the process was attempted to be optimized with regards to the yield of the final product of protein nanofibrils by varying parameters such as incubation time, initial concentration and temperature, with a constant pH-value of 2. Solutions of the whey protein isolate at different concentrations were incubated during a time interval of 24 hours and at different temperatures. For every temperature and time period of incubation, one sample at a time was taken out to be measured and analyzed, a total of four samples per initial concentration. The samples were analyzed with Thioflavin T fluorescence to see indications of the existence of fibrillation. The obtained ThT spectra showed intensity diagrams that can be related to the amount of formed nanofibrils, and this experiment shows that the yield of fibrils increases while the rate constant of the hydrolysis decreases, and that the fibrillation is favoured by lower temperatures. To optimize the production of nanofibrils of whey protein with certainty, further experiments, time and resources should be invested in this area.

Le lait écrémé est utilisé depuis plus d’un demi-siècle comme diluant protecteur des spermatozoïdes de mammifères. Depuis quelques années, il existe une demande grandissante pour des diluants exempts de produits d’origine animale. Toutefois, le mécanisme par lequel le lait protège les spermatozoïdes n’est pas connu, ce qui rend difficile de lui trouver un substitut. Les protéines majeures du plasma séminal de taureau, les protéines « Binder of SPerm » (BSP), sont néfastes lors de la conservation de la semence. Les spermatozoïdes sont en contact avec une grande concentration de protéines BSP qui stimulent une extraction continuelle de cholestérol/phospholipides de leur membrane plasmique. Les lipoprotéines de faible densité (LDL) du jaune d’oeuf, un autre composé utilisé dans les diluants, empêcheraient les protéines BSP de se lier à la membrane des spermatozoïdes de taureaux et de stimuler un efflux des lipides membranaires, ce qui les protégerait durant la conservation. Notre hypothèse était que les protéines du lait protègent les spermatozoïdes durant la conservation en séquestrant les protéines BSP. Premièrement, nous avons démontré par filtration sur gel qu’il y a une interaction entre les protéines BSP bovines et les protéines du lait. Le lait écrémé a été fractionné en trois fractions : F1 (alpha-lactalbumine, bêta-lactoglobuline et caséine kappa), F2 (toutes les protéines du lait) et F3 (sels, sucres et petits peptides). Les protéines BSP1 et BSP5 ont une affinité plus grande pour F1 que BSP3, tandis que toutes les protéines BSP ont une affinité pour F2. Le titrage calorimétrique isotherme a permis de confirmer l’interaction entre les protéines BSP et les protéines du lait. L’association entre la protéine BSP1 bovine et les micelles de caséines est caractérisée par une constante d’affinité (Ka) de 3.5 × 10^5 M-1 et un paramètre stoichiométrique (n) de 4,5 BSP1 pour une caséine. L’association entre la protéine BSP1 bovine et l’alpha-lactalbumine (une protéine du sérum principale), est caractérisée par un Ka de 2.4 × 10^5 M-1 et une valeur “n” de 0,8. Ces résultats indiquent que le lait protège les spermatozoïdes bovins en séquestrant les protéines BSP grâce à une interaction protéine : protéine, tandis que le jaune d’oeuf les protège grâce à une interaction protéine : lipoprotéine. Deuxièmement, nous avons démontré par filtration sur gel que les protéines homologues aux BSP bovines retrouvées dans le plasma séminal de porc, d’étalon et de bélier ont une affinité avec les protéines du lait, ce qui suggère que le mécanisme de protection des spermatozoïdes par le lait pourrait être le même chez ces espèces. Troisièmement, nous avons caractérisé l’interaction entre BSP1 bovine et les LDL du jaune d’oeuf qui a un Ka de 3.4 ± 0.4 × 10^6 M-1 et une valeur de « n » de 104 BSP1 pour une particule de LDL, indiquant qu’il existe des différences entre le mécanisme de protection des spermatozoïdes par le lait et le jaune d’oeuf. Nous croyons que les résultats présentés dans cette thèse aideront à créer de nouveaux diluants ne contenant pas de produits d’origine animale afin de cryoconserver les spermatozoïdes des mammifères. / Skim milk is being used as a protective agent for mammalian semen conservation over half a century. Recently, there has been increased interest in developing extenders free of animal products. However, it is difficult to find suitable component in order to replace milk as an extender, because the mechanisms by which milk protect sperm against cooling and freezing damages during the storage is unknown. The Binder of SPerm (BSP) proteins are the major proteins of bull seminal plasma and they are harmful during sperm storage. In fact, sperm would be in contact with a large quantity of BSP proteins that induce a continuous cholesterol and phospholipids efflux from the sperm membrane during storage. When bull sperm is diluted with an extender containing egg yolk, another compound frequently used in extender, the low-density lipoproteins (LDL) present in the egg yolk prevent the binding of the BSP proteins to the sperm membrane, thus, preventing the lipid efflux from the sperm membrane induced by the BSP proteins. Our hypothesis was that milk proteins would protect sperm during storage by binding BSP proteins. First, we demonstrated by gel filtration that bovine BSP proteins could bind the milk proteins. Skim milk was fractionated into three fractions: F1 (alpha-lactalbumin and beta- lactoglobulin, the major whey proteins and kappa-casein), F2 (mainly caseins and all other milk proteins in small amounts) and F3 (salts, sugars and small peptides). Bovine BSP1 and BSP5 have more affinity for F1 as compared to BSP3 and all the BSP proteins have affinity for F2. We confirmed the interaction between bovine BSP proteins and milk proteins by isothermal titration calorimetry. The binding of BSP1 to casein micelles is characterized by an affinity constant (Ka) of 3.5 × 10^5 M-1 and of a stoichiometric parameter for the association (n) of 4.5 BSP1 per casein. The association between BSP1 and alpha-lactalbumin (one of the major whey proteins) is characterized by a Ka of 2.4 × 10^5 M-1 and a “n” value of 0.8. These results support our contention that milk can protect sperm by preventing the BSP proteins’ binding to the sperm membrane attributable to a protein : protein interaction, while egg yolk sperm protection is attributable to a protein : lipoprotein interaction. Second, our studies showed that the homologous BSP proteins found in the boar, stallion and ram seminal plasma can bind the milk proteins. These results indicate that the mechanism of sperm protection by milk in these species should be similar to the one in bovine species. Third, we characterized the interaction between bovine BSP1 protein and LDL from hen’s egg yolk. The binding was characterized by a Ka of 3.4 ± 0.4 × 10^6 M-1 and a « n » value of 104 BSP1 per LDL particle. Our results indicated that there is difference between the mechanism of sperm protection by milk and egg yolk. We believe that the results presented in this thesis may help to create new extenders free of animal product for mammal sperm preservation in liquid or frozen state.

Le lait écrémé est utilisé depuis plus d’un demi-siècle comme diluant protecteur des spermatozoïdes de mammifères. Depuis quelques années, il existe une demande grandissante pour des diluants exempts de produits d’origine animale. Toutefois, le mécanisme par lequel le lait protège les spermatozoïdes n’est pas connu, ce qui rend difficile de lui trouver un substitut. Les protéines majeures du plasma séminal de taureau, les protéines « Binder of SPerm » (BSP), sont néfastes lors de la conservation de la semence. Les spermatozoïdes sont en contact avec une grande concentration de protéines BSP qui stimulent une extraction continuelle de cholestérol/phospholipides de leur membrane plasmique. Les lipoprotéines de faible densité (LDL) du jaune d’oeuf, un autre composé utilisé dans les diluants, empêcheraient les protéines BSP de se lier à la membrane des spermatozoïdes de taureaux et de stimuler un efflux des lipides membranaires, ce qui les protégerait durant la conservation. Notre hypothèse était que les protéines du lait protègent les spermatozoïdes durant la conservation en séquestrant les protéines BSP. Premièrement, nous avons démontré par filtration sur gel qu’il y a une interaction entre les protéines BSP bovines et les protéines du lait. Le lait écrémé a été fractionné en trois fractions : F1 (alpha-lactalbumine, bêta-lactoglobuline et caséine kappa), F2 (toutes les protéines du lait) et F3 (sels, sucres et petits peptides). Les protéines BSP1 et BSP5 ont une affinité plus grande pour F1 que BSP3, tandis que toutes les protéines BSP ont une affinité pour F2. Le titrage calorimétrique isotherme a permis de confirmer l’interaction entre les protéines BSP et les protéines du lait. L’association entre la protéine BSP1 bovine et les micelles de caséines est caractérisée par une constante d’affinité (Ka) de 3.5 × 10^5 M-1 et un paramètre stoichiométrique (n) de 4,5 BSP1 pour une caséine. L’association entre la protéine BSP1 bovine et l’alpha-lactalbumine (une protéine du sérum principale), est caractérisée par un Ka de 2.4 × 10^5 M-1 et une valeur “n” de 0,8. Ces résultats indiquent que le lait protège les spermatozoïdes bovins en séquestrant les protéines BSP grâce à une interaction protéine : protéine, tandis que le jaune d’oeuf les protège grâce à une interaction protéine : lipoprotéine. Deuxièmement, nous avons démontré par filtration sur gel que les protéines homologues aux BSP bovines retrouvées dans le plasma séminal de porc, d’étalon et de bélier ont une affinité avec les protéines du lait, ce qui suggère que le mécanisme de protection des spermatozoïdes par le lait pourrait être le même chez ces espèces. Troisièmement, nous avons caractérisé l’interaction entre BSP1 bovine et les LDL du jaune d’oeuf qui a un Ka de 3.4 ± 0.4 × 10^6 M-1 et une valeur de « n » de 104 BSP1 pour une particule de LDL, indiquant qu’il existe des différences entre le mécanisme de protection des spermatozoïdes par le lait et le jaune d’oeuf. Nous croyons que les résultats présentés dans cette thèse aideront à créer de nouveaux diluants ne contenant pas de produits d’origine animale afin de cryoconserver les spermatozoïdes des mammifères. / Skim milk is being used as a protective agent for mammalian semen conservation over half a century. Recently, there has been increased interest in developing extenders free of animal products. However, it is difficult to find suitable component in order to replace milk as an extender, because the mechanisms by which milk protect sperm against cooling and freezing damages during the storage is unknown. The Binder of SPerm (BSP) proteins are the major proteins of bull seminal plasma and they are harmful during sperm storage. In fact, sperm would be in contact with a large quantity of BSP proteins that induce a continuous cholesterol and phospholipids efflux from the sperm membrane during storage. When bull sperm is diluted with an extender containing egg yolk, another compound frequently used in extender, the low-density lipoproteins (LDL) present in the egg yolk prevent the binding of the BSP proteins to the sperm membrane, thus, preventing the lipid efflux from the sperm membrane induced by the BSP proteins. Our hypothesis was that milk proteins would protect sperm during storage by binding BSP proteins. First, we demonstrated by gel filtration that bovine BSP proteins could bind the milk proteins. Skim milk was fractionated into three fractions: F1 (alpha-lactalbumin and beta- lactoglobulin, the major whey proteins and kappa-casein), F2 (mainly caseins and all other milk proteins in small amounts) and F3 (salts, sugars and small peptides). Bovine BSP1 and BSP5 have more affinity for F1 as compared to BSP3 and all the BSP proteins have affinity for F2. We confirmed the interaction between bovine BSP proteins and milk proteins by isothermal titration calorimetry. The binding of BSP1 to casein micelles is characterized by an affinity constant (Ka) of 3.5 × 10^5 M-1 and of a stoichiometric parameter for the association (n) of 4.5 BSP1 per casein. The association between BSP1 and alpha-lactalbumin (one of the major whey proteins) is characterized by a Ka of 2.4 × 10^5 M-1 and a “n” value of 0.8. These results support our contention that milk can protect sperm by preventing the BSP proteins’ binding to the sperm membrane attributable to a protein : protein interaction, while egg yolk sperm protection is attributable to a protein : lipoprotein interaction. Second, our studies showed that the homologous BSP proteins found in the boar, stallion and ram seminal plasma can bind the milk proteins. These results indicate that the mechanism of sperm protection by milk in these species should be similar to the one in bovine species. Third, we characterized the interaction between bovine BSP1 protein and LDL from hen’s egg yolk. The binding was characterized by a Ka of 3.4 ± 0.4 × 10^6 M-1 and a « n » value of 104 BSP1 per LDL particle. Our results indicated that there is difference between the mechanism of sperm protection by milk and egg yolk. We believe that the results presented in this thesis may help to create new extenders free of animal product for mammal sperm preservation in liquid or frozen state.