Les patients fibrose kystique (FK) souffrent de complications digestives qui incluent une inflammation intestinale modérée dont l’étiologie est méconnue. Les personnes atteintes de FK présentent également une malabsorption des vitamines liposolubles, telles la vitamine D. Or, la vitamine D possède des propriétés immunomodulatrices et anti-inflammatoires. Le présent projet vise à investiguer le rôle du CFTR, dont le gène est muté dans la FK, dans l’étiologie de cette inflammation intestinale et à étudier le potentiel anti-inflammatoire de la vitamine D sur celle-ci. Le CFTR a été invalidé génétiquement par la méthode des ARN interférents (shRNAi) et/ou inhibé pharmacologiquement par l’utilisation d’un antagoniste inhibiteur spécifique (CFTRinh-172). Un état inflammatoire a été induit par les cytokines pro-inflammatoires TNF-α et IL-1β. Afin d’évaluer le rôle anti-inflammatoire de la vitamine D, les cellules ont été pré-traitées avec la forme bioactive de la vitamine D, la 1,25(OH)2D3. La sécrétion et l’expression génique d’interleukine-8, ainsi que l’activation de la voie de signalisation p38MAPK et du facteur de transcription NFκB ont été évaluées. Pour explorer la voie par laquelle la vitamine D exerce ses actions anti-inflammatoires, les cellules ont été pré-incubées avec le BIRB796 pour inhiber la voie p38MAPK. Finalement l’expression génique du récepteur nucléaire de la vitamine D et des hydroxylases intestinales impliquées dans son métabolisme a été déterminée. Nos résultats suggèrent que le CFTR a un rôle dans l’étiologie de l’inflammation intestinale associée à la FK. De plus, la vitamine D semble moduler à la baisse la réponse inflammatoire de la cellule intestinale dont le CFTR a été génétiquement invalidé. / Cystic fibrosis (CF) patients suffer from various digestive complications including moderate intestinal inflammation which etiology is unknown. Individuals with CF also display malabsorption of fat-soluble vitamins; including vitamin D. Vitamin D is a hormone that has immunomodulatory and anti-inflammatory properties. This project aims to investigate the role of CFTR, the mutated gene in CF, in the etiology of CF-related intestinal inflammation and to study the anti-inflammatory potential of vitamin D at this level. CFTR was genetically depleted by means of short hairpin RNA interference (shRNAi) and/or pharmacologically inhibited by the use of a specific inhibitor (CFTRinh-172). An inflammatory state was induced by pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-1β. To evaluate the anti-inflammatory role of vitamin D, cells have been pre-treated with the bioactive form of vitamin D, 1,25(OH)2D3. The secretion and gene expression of interleukin-8, as well as the activation of the p38MAPK signaling pathway and the NFκB transcription factor were assessed. To explore how vitamin D exerts its anti-inflammatory actions, cells were incubated with the BIRB796 to inhibit the p38MAPK pathway. Finally, gene expression of the vitamin D nuclear receptor and the intestinal hydroxylases involved in vitamin D metabolism were assessed. Our results suggest that CFTR plays a role in the etiology of intestinal inflammation associated with CF and that vitamin D reduces the inflammatory responses of CFTR knockdown cells.

Le transport de Na+ par ENaC et de Cl- par CFTR, dans l’épithélium des voies aériennes (VA), contrôle la clairance mucociliaire en modulant le volume du liquide de surface (ASL). L’expression et la fonction de ces canaux peuvent être modifiées au cours des maladies inflammatoires chroniques des VA. Dans un modèle de culture primaire de cellules épithéliales nasales humaines (CENH), nous avons démontré l’existence, au cours de la polypose nasosinusienne, d’une chute de la sécrétion de Cl- par CFTR dont l’expression est diminuée par le TGFß1, cytokine de l’inflammation. Nous avons ensuite étudié l’effet de l’élastase, et de son inhibiteur l’EPIhNE4 sur la fonction d’ENaC dans des CENH de patients atteints ou non de mucoviscidose (CF) où l’hyperactivité d’ENaC provoque une déshydratation de l’ASL. Nous avons démontré l’existence d’une activité sérine protéase endogène dans les CENH (patients CF ou non CF) qui, après inhibition, permet de révéler une augmentation de la fonction d’ENaC induite par l’élastase alors inhibable par l’EPI-hNE4. Enfin, nous avons analysé l’effet du 4 phenylbutyrate (4PBA), traitement proposé chez les patients CF, sur le canal ENaC. Le 4- PBA entraîne une augmentation de la fonction d’ENaC dans les CENH de patients CF ou non en adressant des sous-unités du canal à la membrane apicale via la régulation d’une molécule chaperone Hsc70. Le 4-PBA pourrait donc être utilisé dans des pathologies respiratoires avec défaut d’expression d’ENaC mais son usage pourrait être délétère chez les patients CF. La régulation des transports ioniques au cours des maladies inflammatoires chroniques des VA représente donc une cible thérapeutique intéressante / Na+ and Cl- transport by ENaC and CFTR respectively in airway epithelium (AE) control mucociliary clearance by regulating the airway surface liquid (ASL). Ion channel expression and function could be altered by chronic inflammation in AE. In primary cultures from human nasal epithelial cells (HNEC) we demonstrated, in nasal polyposis, a decrease of CFTR expression and Cl- secretion induced by TGFß1, an inflammatory cytokine. We also evaluated the effects of elastase, and its inhibitor EPI-hNE4, on ENaC function in HNEC from cystic fibrosis (CF where ENaC hyperactivity contributes to ASL dehydration) and non CF patients. We detected an endogenous serine protease activity in HNEC (CF or non CF) which, after inhibition, unmask an increase in ENaC function induced by elastase, this increase being then inhibited by EPI-hNE4. Finally, we investigated the effects of a drug now tested in CF patients treatment, the 4-phenylbutyrate (4PBA). 4-PBA promoted ENaC cell surface expression and activity in CF or non CF HNEC by increasing ENaC subunits translocation to plasma membrane via the regulation of Heat Shock Protein 70. 4-PBA treatment could therefore be of interest in the treatment of airway diseases when ENaC trafficking is disrupted but should be used with caution when treating CF patients where ENaC function is already upregulated. All together these results highlight the role of ion transport regulation during chronic inflammatory airway diseases and could lead to new therapeutic strategies

La mucoviscidose est la maladie génétique récessive la plus fréquente dans les populations caucasiennes. Elle est dûe à des mutations dans le gène CFTR qui code pour une protéine qui a une fonction canal chlorure et qui est exprimée au pôle apical des épithéliums sécrétoires. La mutation la plus fréquente F508del altère le repliement de la protéine, induisant sa dégradation précoce par le protéasome et son absence à la membrane plasmique. La recherche fondamentale se focalise sur la protéine mutée et cherche à découvrir des molécules capables d’adresser celle-ci au pôle apical des cellules épithéliales où elle pourra remplir sa fonction de canal chlorure. Au sein du laboratoire, nous nous intéressons aux interactions de la protéine CFTR/ F508del-CFTR avec d’autres protéines. Nous avons déjà montré l’existence d’une interaction non voulue entre F508del-CFTR et un filament intermédiaire, la cytokératine 8. En combinant une approche in-silico et du criblage haut débit, nous avons identifié des molécules capables d’interrompre ces interactions. Des tests fonctionnels sur des lignées cellulaires ainsi que sur des modèles murins ont montré une restauration de la fonction canal chlorure après traitements avec ces molécules. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à l’une d’entre elles qui est la molécule « c407 ». L’objectif de ma thèse était de comprendre les mécanismes d’action de cette molécule. J’ai également évalué l’efficacité des traitements actuels dans le contexte des allèles complexes de F508del-CFTR. Dans une seconde partie de ma thèse, j’ai étudié l’effet d’une cytokine (TNFα) sur la protéine mutée F508del-CFTR. De façon inattendue, j’ai observé que le TNFα, à des concentrations physiologiques, corrige le défaut de routage de la protéine F508del-CFTR. Cette observation pourrait expliquer une fonction résiduelle de la F508del-CFTR chez certains patients atteints de mucoviscidose. En conclusion, mes travaux ont permis de préciser les mécanismes d’action d’un correcteur et de découvrir un effet inattendu d’une cytokine pro-inflammatoire. Ces travaux permettent de relier la correction d’un défaut de routage au processus inflammatoire ouvrant ainsi un nouveau champ d’investigation. / Cystic fibrosis is due to the loss of epithelial chloride transport caused by mutations in the CFTR gene, the most frequent mutation being F508del. One of the strategies developed to find new treatment for Cystic fibrosis (CF) is to discover compounds that correct the trafficking of F508del-CFTR to the plasma membrane. Using hypothesis-driven approach and combining modeling of NBD1, molecular docking and functional assays, we identified 4 compounds that correct F508del-CFTR function in cells (including human primary bronchial cells in culture) and F508del mice. New correctors probably act by interrupting the interaction between F508del-CFTR with keratin 8 (Odolczyk et al EMBO Mol Med 2013). During my PhD, I focused on one of those molecules, the "c407" molecule. The aim of my thesis was to investigate the mechanisms of action of this molecule. I have also evaluated the effectiveness of current treatments in the context of complex alleles F508del-CFTR. In the second part of my thesis, I studied the effect of a cytokine (TNFα) on the protein F508del-CFTR. Unexpectedly, I observed that the TNFα at physiological concentrations, corrects the trafficking of F508del-CFTR protein. This observation could explain a residual function of F508del-CFTR in some CF patients. In conclusion, my thesis helped to clarify the mechanisms of action of new correctors of F508del-CFTR.

La mucoviscidose est la maladie génétique autosomique récessive létale la plus fréquente dans la population caucasienne. Le gène muté code pour la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). CFTR est un canal anionique localisé dans la membrane apicale des épithélia. Il permet notamment le transport d’ions chlorure (Cl-) et bicarbonates (HCO3-). La délétion de la phénylalanine en position 508 (F508del) de CFTR est la mutation la plus fréquente et entraîne un défaut d’adressage de CFTR à la membrane plasmique. L’atteinte respiratoire réalise une bronchopathie obstructive surinfectée qui détermine le pronostic vital de la maladie. Deux mécanismes délétères présents dès la période néonatale vont notamment contribuer à la destruction du tissu pulmonaire : une inflammation exacerbée et auto-entretenue, et une colonisation bactérienne chronique du mucus notamment à Pseudomonas aerugonisa et Staphylococcus aureus. Les mécanismes à l’origine de l'initiation de ce double processus demeurent inconnus. De plus en plus d'arguments plaident pour l'implication des ions HCO3-, donc du pH, dans l'initiation de l'atteinte pulmonaire de la mucoviscidose. En effet, le défaut de CFTR entraîne une diminution de leur sécrétion dans le liquide de surface bronchique (ou Airway Surface Liquid : ASL), ce qui conduit à un pH local anormalement bas. Les ions HCO3- jouent un rôle important dans la physiopathologie bronchique pulmonaire. En effet, ils régulent la rhéologie du mucus et sont impliqués dans l’activité des peptides antimicrobiens, principaux facteurs de la bactéricidie locale et dont l'activité est pH dépendante. Cela a été démontré dans un modèle porcin de mucoviscidose. Ainsi une altération du transport de HCO3- pourrait contribuer à l'hyperviscosité des sécrétions muqueuses, initier la colonisation bactérienne en diminuant le pouvoir bactéricide du liquide de surface respiratoire. Cette hypothèse est la base de mon projet visant à étudier le rôle du transport transépithélial des ions bicarbonates dans la bactéricidie au sein de l’épithélium respiratoire dans la mucoviscidose. La mesure du pH de l’ASL a nécessité la conception d’une enceinte à atmosphère contrôlée. Cet outil a permis la mise en évidence d’une acidité de l’ASL F508del en comparaison du Wild Type (WT), due à un défaut de sécrétion des ions HCO3- dans l’ASL, lui-même induit par une inhibition fonctionnelle du transporteur Cl-/HCO3- SLC26A4 ou pendrine majoritairement et du canal CFTR minoritairement. L’évaluation de la bactéricidie de l’ASL après infection au Staphylococcus aureus révèle une déficience de bactéricidie chez les cellules épithéliales F508del, reliée à l’activité anormale de la pendrine. L’investigation des capacités d’adhésion et d’invasion du Staphylococcus aureus dans nos modèles montre que le défaut de bactéricidie épithélial observé se restreint à l’ASL et incite à poursuivre les recherches sur le rôle du pH de l’ASL dans l’activité de ses peptides antimicrobiens, principale ligne de défense de l’immunité innée respiratoire. Notre travail de restauration du pH de l’ASL avant infection de l’épithélium respiratoire démontre d’ores et déjà l’impact significatif du pH de l’ASL dans la modulation de sa bactéricidie, où la restauration du pH est corrélée à une amélioration de la bactéricidie. Ce travail met en lumière le rôle crucial du pH de l’ASL dans l’appréhension de la physiopathologie de la maladie et sensibilise à de nouvelles voies thérapeutiques, basées sur une restauration du pH de l’ASL et/ou l’utilisation de peptides antimicrobiens pH-indépendant. / Cystic fibrosis (CF) is a lethal autosomal recessive disorder caused by mutations in the CF Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) gene encoding for a cAMP-activated anionic channel, secreting mainly chloride (Cl-) and bicarbonate (HCO3-) at the apical surface of the epithelia. Most patients are homozygous for the p.PHe508del mutation (F508del). The main cause of morbidity and mortality is obstructive lung disease characterized by exacerbated inflammation and bacterial infection of the airway surface liquid (ASL), a thin layer coating the luminal face of the airway epithelium. ASL bacterial colonization begins from the first hours of life with evidence of Staphylococcus aureus in airway secretions pointing to impaired local defense. However, the defect responsible for this defective bacterial clearance is not clearly understood. It was proposed to be related to decreased mucociliary clearance and abnormal inflammatory responses, but recent studies also show the contribution of ASL in the reduced antimicrobial capacity of ASL in CF airways. An abnormally low ASL pH impairs mucin hydration and solubilization, resulting in hyperviscous mucus, which impedes muco-ciliary clearance. It also reduces the activity of antimicrobial peptides by modulating their native charges and the bactericidal activity of antibiotics. This was supported by studies in newborn CF pigs, which highlighted an abnormally low ASL pH, in association with a defective short-term S. aureus antimicrobial activity. Restoring normal pH in the ASL of CF pigs improved ability to eradicate the bacteria, showing that reduced ASL pH is central to disease pathogenesis. However, there is still controversy about the value of ASL pH in humans. Very recently, a study in young CF children, based on in vivo measurements, showed similar ASL pH values in children with CF to that in children without CF. The mechanisms underlying the ASL pH homeostasis and in particular the balance between HCO3- and proton (H+) secretion are still not known. Shah et al highlighted the role of persistent H+ secretion by ATP12A concomitant to a CFTR-mediated reduced bicarbonate transport, but recent work overexpressing ATP12A in respiratory cells failed to find any pH modification in physiological conditions. Most importantly, there is no clear understanding of the initial host response, when S. aureus bacteria land on the pristine surface of a newborn airway, with a prolonged time of contact and continuous reseeding from infected mucus plugs. This is however crucial to clarify pathogenesis of this early steps to counteract pro-infectious vicious circle and define optimal therapeutic strategy in newborns. We focused on human airways and hypothesized that S. aureus clearance during the first hours of infection was impaired in human airway CF ASL because of lowered ASL pH. To test this hypothesis, we designed bacterial infection experiments within human airway epithelium to mirror the onset of initial S. aureus infection. We then studied the relationship between local bacterial clearance and ASL pH regulation in WT and F508del homozygous human bronchial epithelial cells, with special emphasis on physiologically relevant HCO3- and H+ transporters.

La mucoviscidose (CF, Cystic Fibrosis), maladie autosomique récessive la plus fréquente dans la population caucasienne, se manifeste par l’atteinte de plusieurs organes due à l’absence ou au dysfonctionnement du canal CFTR. Au niveau des poumons, la perte de l’activité du canal se traduit par une déshydration du mucus, des cycles d’infections et d’inflammation aboutissant à terme à la destruction du parenchyme pulmonaire. Les thérapeutiques proposées à l’heure actuelle, sont principalement symptomatiques et l’exploration de nouvelles pistes reste nécessaire. De récents travaux émanant de notre équipe ont révélé qu’une intervention au niveau de la stabilisation des transcrits pourrait être bénéfique pour améliorer la quantité de protéines nécessaires pour restaurer une activité suffisante du canal CFTR. Une autre piste qui pourrait être explorée serait de cibler, en plus de l’expression du gène CFTR, des régulateurs clés qui participent aux processus de réparation cellulaire ou à la réponse inflammatoire. Dans cet objectif, nous nous sommes focalisés sur des régulateurs clés comme les miARN et les ARE-BP (protéines de liaison à l’ARN) qui sont dérégulés dans les tissus CF et qui peuvent agir ensemble dans le contrôle de l’expression de nombreux gènes.Les travaux que nous avons réalisés nous ont permis d’une part, de montrer la dérégulation de miARN dans des échantillons CF ainsi que des isoformes de certains miARN. Deux miARN ont retenu notre attention, le miR-101 dont la distribution de ses séquences isomiR varient dans des cultures CF et le miR-181a-5p qui présente une dérégulation de son expression dans trois modèles ex-vivo CF que nous avons utilisés. Ces miARN ont la particularité de moduler l’expression de gènes clés dans les voies de signalisation PI3K-Akt/MAPK-Erk et Wnt. D’autre part, nos travaux ont révélé la dérégulation de la protéine ARE-BP TTP (Tristétraproline ou ZFP36) en contexte CF. Cette protéine est d’autant plus intéressante qu’elle est connue pour être un régulateur clé de l’inflammation. La suite de ce travail a donc été d’étudier sa régulation et son impact sur ses ARNm cibles. L’activité de cette ARE-BP a été principalement décrite pour être contrôlée par la voie p38-MAPK. Nous montrons l’implication de la voie p42/p44-MAPK (Erk1/2) dans la régulation de la phosphorylation de TTP dans des cultures bronchiques. La recherche des interactions entre TTP et ses cibles a également révélé que cette protéine agissait sur ses propres régulateurs ainsi que sur l’ARNm CFTR. Nous montrons ainsi pour la première fois que TTP se fixe au niveau de la région 3’UTR du transcrit CFTR et joue un rôle de stabilisateur sur ce transcrit.Identifier de nouveaux acteurs de la régulation du gène CFTR mais également des régulateurs centraux des processus altérés en contexte CF offre de nouvelles opportunités pour concevoir des outils ciblés pour combattre cette maladie. / Cystic fibrosis (CF), the most common life-shortening genetic disorder in Caucasians, affects many organs but chronic lung disease is the main cause of morbidity and mortality. This disease, characterized by CFTR gene alterations, results in ions transport dysfunctions that contribute to impair mucociliary clearance, favoring bacterial colonization and inflammation, and ultimately leading to lung destruction. Nowadays, therapeutic drugs have limited benefit, so development of new alternatives or complementary molecules remains essential. Recently, our team demonstrated that the intervention on CFTR mRNA stability leads to an increase in CFTR protein level and an improvement of the CFTR channel activity. An alternative way would be to target key actors such as miRNA and ARE-BP (RNA binding protein), deregulated in CF tissues, that display a pleiotropic activity and act together to control expression of several genes.Our findings led to the identification of dysregulated miRNA in CF samples and revealed multiple isoforms relative to miRNA of reference (i.e. isomiRs). We focused on two miRNA, miR-101, that displays a modification in isomiR distribution and miR-181a-5p that is highly deregulated, in three CF airways models. These miRNA modulate expression of key genes or related genes in PI3K-Akt/MAPK-Erk and Wnt signaling pathways.Our work also revealed the deregulation of an ARE-BP protein, TTP (Tristetraprolin, ZFP36), in CF context. This protein is a master regulator in inflammatory resolution. We next investigated the mechanism whereby this ARE-BP is regulated in bronchial cells and showed that TTP phosphorylation is regulated by MK2 through ERK activation. We also determined for the first time that TTP binds to the 3’UTR of CFTR mRNA where TTP binding stabilizes CFTR mRNA level.These data bring new insights into CF physiopathology and open new research opportunities in CF.

Le stress oxydatif définit un phénomène cellulaire particulier caractérisé par un niveau élevé de molécules hautement réactives, essentiellement lié à l’utilisation de l’oxygène par les systèmes biologiques via la respiration. La dérégulation de l’état oxydatif de la cellule est à l’origine soit de processus d’adaptations efficaces (adaptation à l’altitude) soit de pathologies (AVC, infarctus). Ce travail de thèse s’est porté sur l’étude de deux nouvelles cibles pouvant induire une résistance/tolérance à la variation du stress oxydatif : la première est la protéine canal CFTR («Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator») et la seconde la voie d’activation d’eIF5A («eukaryotic Initiation translation Factor 5A»). Nous avons pu mettre en évidence que la protéine CFTR grâce à sa perméabilité au glutathion (l’antioxydant majoritaire cellulaire) est un modulateur de l’état oxydatif de la cellule, que ce soit lors de l’exposition à des agents cytotoxiques (cisplatine) ou lors de l’adaptation à des conditions hypoxiques chroniques. La deuxième cible identifiée est le facteur eIF5A qui est la seule protéine activée par la fixation d’un résidu hypusine. L’inhibition de cette modification post-traductionnelle protège les cellules d’une production d’espèces réactives induite par l’anoxie. Cette résistance à l’anoxie est accompagnée d’un profond remodelage métabolique et mitochondrial. Sur des modèles animaux d’ischémie (rein et cerveau), l’inhibition de l’activation d’eIF5A conduit à une protection des organes face à un manque d’oxygène. Ces études fondamentales ont des applications cliniques potentielles dans des pathologies humaines (infarctus, AVC, transplantation). / Oxidative stress represents a particular cellular condition, characterized by an intracellular increase in thereactive species level. These species are highly reactive towards biomolecules and result of oxygenconsumption by biological systems essentially through respiration. Deregulation of the cellular oxidativestate can initiate adaptive processes (as elevation adaptation) or several human pathologies (stroke,infarct). This thesis work has been devoted to the study of two news potential targets allowing atolerance/resistance towards disequilibrium of oxidative stress; the first one is CFTR, a channel protein(«Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator»), and the second one is the activation pathwayof the translation factor eIF5A («eukaryotic Initiation translation Factor 5A»). Based on the peculiaractivity of CFTR, consisting in the transport of glutathione, the major antioxidant of the cell, weevidenced the role of CFTR in the management of cellular oxidative state during cytotoxic drugexposure (cisplatin) or during adaptation to chronical hypoxia. The second target, eIF5A is the only oneprotein described as post-translationally modified by fixation of a hypusine residue. We demonstratedthat inhibition of eiF5A activation protect cells from reactive oxygen species generated during anoxia. Atcellular level, this protection is accompanied with deep metabolic and mitochondrial changes. Usinganimal models, we showed that inhibition of this eiF5A activation allows a tolerance against ischemicaccident in different organs (kidney and brain). These fundamentals results can have extensiveapplication in human clinical use (infarct, stroke, graft).

La protéine TAT1 (Testis Anion Transporter 1 ; SLC26A8) appartient à la famille des SLC26, une famille de transporteurs d’anions qui contribuent dans différents épithelia à l’homéostasie cellulaire. La protéine TAT1 s’exprime exclusivement dans les cellules germinales mâles, chez l’homme et chez la souris. Sur le spermatozoïde mature, la protéine TAT1 est localisée à la jonction des pièces intermédiaire (PI) et principale (PP) du flagelle, au niveau de l’annulus, une structure en forme d’anneau composée de différents polymères de Septines (1, 4, 6, 7 et 12).Le modèle murin d’invalidation du gène Tat1 présente une infertilité mâle par asthénozoospermie totale (absence de mobilité des spermatozoïdes) et des défauts de capacitation associés à des anomalies structurales du flagelle (plicature du flagelle, disjonction entre la PI et la PP, atrophie de l’annulus). Ce modèle indique que la protéine TAT1 pourrait avoir un rôle structural dans le maintien de l’annulus et dans la mise en place du flagelle. Par ailleurs, la protéine TAT1 possédant une activité de transport d’anions, il est vraisemblable qu’elle puisse influer directement sur la régulation de la mobilité et de la capacitation puisqu’il est bien établi que les échanges ioniques sont essentiels au contrôle de ces deux processus.En effet, les ions chlorure, bicarbonate et calcium participent à l’activation de la voie de signalisation AMPc/PKA, au cours des processus de mobilité et de capacitation (i.e. processus de maturation ayant lieu dans le tractus génital féminin et conférant au spermatozoïde un mouvement hyperactivé et la capacité à interagir avec l’ovocyte).Plusieurs travaux ont montré une interaction physique et fonctionnelle des membres de la famille SLC26 avec le canal chlorure/bicarbonate CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) dont les mutations sont responsables de la mucoviscidose. De manière intéressante des données récentes ont montré l’expression de CFTR dans le spermatozoïde et son rôle dans la régulation des flux de chlorure au cours de la capacitation. Au cours de ma thèse, nous avons testé la coopération entre les protéines TAT1 et CFTR ; nous avons pu montrer que la protéine TAT1 est capable d’interagir physiquement avec CFTR et de stimuler son activité de transport d’anions, suggérant qu’in vivo les deux protéines forment un complexe moléculaire impliqué dans la régulation des flux de chlorure et de bicarbonate dans le spermatozoïde.Tout comme TAT1, plusieurs membres de la famille SLC26 ont une expression tissulaire spécifique. Par ailleurs, les mutations génétiques de certains SLC26 sont associées à des pathologies humaines (surdité, diarrhée chlorurée congénitale et chondrodysplasie). De par le phénotype du modèle murin Tat1 et l’importance des SLC26 en pathologie humaine, TAT1 constitue un bon candidat dans la recherche des causes génétiques des asthénozoospermies humaines.Le laboratoire a mis en place au cours de ma thèse, un projet de recherche de mutations du gène TAT1 dans les asthénozoospermies humaines. Le séquençage des régions codantes du gène TAT1 dans une cohorte de 147 hommes infertiles par asthénozoospermie a ainsi permis d’identifier des variations de séquence inédites du gène chez 7 sujets. L’étude in vitro de certains variants indique pour trois d’entre eux une instabilité des formes mutantes associée à un défaut de stimulation du canal CFTR, in vitro. Par ailleurs, les spermatozoïdes de ces patients présentent d’importantes anomalies flagellaires dans la mise en place de la pièce intermédiaire, compatible avec un rôle de la protéine TAT1 et de ses partenaires (les septines) dans la genèse du flagelle / TAT1 (Testis Anion Transporter 1 ; SLC26A8) belongs to the SLC26 family of anion transporters, which is implicated in cellular homeostasis of different epithelia. TAT1 is exclusively expressed in male germ cells, in human and mouse. On mature spermatozoa, TAT1 is located at the annulus, a ring-shaped structure composed of different septins polymers (1, 4, 6, 7 and 12), at the junction of the midpiece (MP) and principal piece (PP) of the flagellum.The knock-out mouse model of Tat1 gene shows a male infertility by complete asthenozoospermia (lack of sperm motility) and capacitation defects combined with flagellar structural abnormalities (flagella bending, MP and PP disjunction and atrophy of the annulus). This model suggests that the TAT1 protein could fulfill structural roles in the annulus and during flagellum biogenesis. Moreover TAT1 displayind an anion transport activity, it could also be implicated in the control of sperm motility and capacitation by regulating anions exchannges, which are well known to be essential for both processes.Indeed, chloride, bicarbonate and calcium ions are involved in the activation of the cAMP/PKA pathway, controlling sperm motility and capacitation processes (i.e. maturation events occuring in the female genital tract and providing the spermatozoa an hyperactivation movement and the ability to interact with oocyte).Several publications have reported a physical and functionnal interaction between SLC26 family members and the chloride/bicarbonate CFTR channel (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), which mutations are responsible of cystic fibrosis. Interestingly, recent data showed CFTR expression in spermatozoa and its role in the regulation of chloride fluxes during capacitation. During my thesis, we tested TAT1 and CFTR cooperation; we showed that TAT1 can interact physically with CFTR and stimulate its anion transport activity, suggesting that in vivo they form a molecular complex involved in the regulation of chloride and bicarbonate fluxes during sperm capacitation.Like TAT1, several SLC26 family members have a tissue specific expression. Furthermore genetic mutations in several SLC26 members result in human pathology such as deafness, congenital chloride diarrhea and chondrodysplasia. According to the phenotype of the KO Tat1 mouse model and the role of SLC26 members in human pathology, TAT1 constitutes a good candidate for the search of genetic causes of human asthenozoospermia.During my thesis, the laboratory has set up, a research project aiming at identifying mutations in the TAT1 gene that are responsible for human asthenozoospermia.Sequencing of the TAT1 gene coding regions in a cohort of 147 infertile men presenting with asthenozoospermia allowed us to identify several new sequence variations in in the TAT1 gene. In vitro study of these variants shows that 3 of them are associated with protein instability and abrogate CFTR stimulation. Besides, patients sperm show important flagellar abnormalities in the midpiece, consistent with a role of TAT1 and its partners (septins) in flagellum biogenesis.

La mucoviscidose est causée par des mutations du gène CFTR (p.Phe508del étant la plus fréquente). Celui-ci code pour la protéine CFTR qui constitue un canal chlorure exprimé à la face apicale des cellules épithéliales. Au niveau du reticulum endoplasmique (RE), le contrôle de qualité conformationnelle oriente la majorité du CFTR en cours de repliement vers une voie de dégradation. Une fraction limitée du WT-CFTR parvient cependant à se replier correctement et peut ensuite progresservers la surface cellulaire, contrairement au Phe508del-CFTR (qui est néanmoins fonctionnel). Lorsque des formes mutées sont exportées à partir du RE, grâce à des traitements correcteurs, elles sont alors instables à la membrane plasmique. Par ailleurs, il a été montré que l'organisation des microfilaments d'actine participe à l'ancrage du canal au cytosquelette et à sa stabilité. Or, la petite GTPase Cdc42 influence la dynamique de nucléation de l'actine fibrillaire. Au cours de nos travaux, nous avons testé l'implication de Cdc42 et de certains de ses effecteurs dans la régulation de WT-CFTR dans des cellules épithéliales bronchiques. Dans ce cadre, la fonction de la voie Cdc42 a été perturbée par des traitements pharmacologiques et par ARN interférence. Les résultats obtenus, principalement par biotinylation de surface, ont permis de proposer que (1) la protéine Cdc42 participe à ladégradation de formes mal repliées de CFTR dans les étapes précoces et tardives de la voie de sécrétion et (2) la voie Cdc42, par son implication dans l'organisation de l'actine F corticale, affecte l’ancrage du canal chlorure au cytosquelette et régule ainsi son recrutement dans des vésicules d'internalisation. / Cystic Fibrosis is caused by CFTR gene mutations (p.Phe508del being the most frequently encountered). The CFTR protein functions as a chloride channel expressed at the plasma membrane of epithelial cells. Its productive folding in the endoplasmicreticulum (ER) is poorly efficient and unfolded proteins are therefore targeted to degradation. Nevertheless, a limited fraction of WT-CFTR acquires a native conformation and then progesses into the secretory pathway. In the case of Phe508del-CFTR, virtually all channels are degraded at this step except through corrector treatments. Under these conditions the mutant remains unstable at the plasma membrane (although it is functionnaly competent). Furthermore, it has been shown that fibrillar actin organization is involved in CFTR tethering to the cytoskeleton and channel stability. Moreover, the small GTPase Cdc42 promotes F actin nucleation. In the present study, we aimed at testing the involvement of Cdc42, and of some of its effectors, in WT-CFTR regulation in epithelial airway cells. In this context, Cdc42 pathway function was altered through pharmacological treatments or siRNAmediated depletions. Our results, mainly obtained via cell surface biotinylation assays, led us to propose that (1) Cdc42 is involved in misfolded CFTR degradation at early and late steps of the secretory pathway, and (2) Cdc42 pathway, through its F actin organization function, affects CFTR anchoring to the cytoskeleton and thus regulates its endocytosis.

La mucoviscidose est la plus fréquente des maladies rares chez la population caucasienne. Cette maladie héréditaire récessive est causée par des mutations du gène Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) qui code pour une protéine localisée au niveau de la membrane apicale des cellules épithéliales. La sévérité du phénotype est déterminée par les classes des mutations et leurs combinaisons en trans, ainsi que par la présence d'allèles complexes. La détermination des effets d'une mutation est essentielle pour avoir une corrélation génotype/phénotype correcte, donner un diagnostic prénatal adapté et permettre aux cliniciens de prescrire le traitement approprié à chaque mutation quand celui-ci sera disponible. Pour cela, nous avons étudié aux niveaux cellulaire et moléculaire les effets de plusieurs mutations qui intéressent le laboratoire : c.1392G>T (p.Lys464Asn), c.3909C>G (p.Asn1303Lys) et c.965T>C (p.Val322Ala). L'effet de ces mutations sur la protéine a été évalué. De plus, l'impact sur l'épissage aberrant des deux premières mutations, seules et dans le cadre de leurs allèles complexes, a été déterminé. Nous avons montré que : 1) la mutation c.1392G>T est de classe V et II et son allèle complexe aggrave l'épissage aberrant, 2) la mutation c.3909C>G appartient à la classe II et l'effet sur l'épissage résulte de son allèle complexe et 3) la mutation familiale c.965T>C est un simple polymorphisme. Ces travaux montrent l'importance de l'étude d'une mutation à différents niveaux cellulaires par l'intermédiaire des analyses in silico, in cellulo et in vivo et soulignent l'effet des allèles complexes qui peuvent moduler l'impact de la mutation seule. / Cystic Fibrosis is the most frequent rare disease in the Caucasian population. This hereditary recessive disease is caused by mutations in the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator gene (CFTR) that encodes for a protein expressed on the apical membrane of epithelial cells. The mutations classes, their associations in trans and the presence of complex alleles define the phenotype severity. The determination of mutations effects is essential to have a correct genotype/phenotype correlation to give an adapted prenatal diagnosis and to help the clinicians in providing an appropriate treatment when available. In this respect, we have studied on the cellular and molecular levels the effects of several mutations of interest for the laboratory: c.1392G>T (p.Lys464Asn), c.3909C>G (p.Asn1303Lys) et c.965T>C (p.Val322Ala). The effects of these mutations were evaluated on the protein level. Moreover, the impact on aberrant splicing of these first two mutations solely and in the context of their complex alleles was determined. We have demonstrated that: 1) the c.1392G>T mutations belongs to class V and II and its complex allele aggravates the aberrant splicing, 2) the c.3909C>G is a class II mutation and the effect on splicing is due to its complex allele, and 3) the familial c.965T>C mutation is a simple polymorphism. This work highlights the importance to study the CFTR mutation at different cellular levels using in silico, in cellulo and in vivo analyses and emphasizes on the effect of complex allele in modulating the basal impact of a single mutation.

La mucoviscidose est la maladie héréditaire autosomique récessive, rare, létale, la plus fréquente dans la population caucasienne. Cette maladie est causée par des mutations du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) codant la protéine CFTR. Cette protéine est principalement un canal chlorure (Cl-) AMPc-dépendant localisé dans la membrane apicale des cellules épithéliales. La mutation F508del entraîne un défaut de maturation de la protéine qui est retenue dans le réticulum endoplasmique avant d’être dégradée. Cependant, une faible quantité de protéines malformées échappe à ce système de contrôle et parvient à la membrane plasmique.Des travaux de notre équipe ont montré une augmentation des efflux ioniques dépendants du CFTR dans des lignées cellulaires épithéliales bronchiques (CFBE41o-), exprimant le CFTR sauvage ou le CFTR muté F508del, après un traitement par une hormone: la gonadolibérine (GnRH, Gonadotropin releasing hormone, 1h, 10-9M). Cette augmentation est vraisemblablement due à un nombre plus important de canaux CFTR à la membrane plasmique.L’objectif de cette thèse a été de tester un analogue de la GnRH comme modulateur de l’exportation membranaire et/ou de l’activité canal du CFTR muté, sur des cultures primaires de cellules épithéliales nasales humaines homozygotes pour la mutation F508del. Dans un premier temps, nous avons vérifié la présence du récepteur à la GnRH (R-GnRH) dans notre modèle cellulaire. Puis, nous avons étudié l’effet de l’analogue sur la fonction du CFTR par des techniques d’électrophysiologie. Nous avons observé une augmentation des efflux d’ions Cl- médiés par le canal CFTR après un traitement à l’analogue (2h, 10-12M). Enfin, une étude protéomique nous a permis d’identifier des protéines différentiellement exprimées après traitement. Certaines protéines mises en évidence pourraient appartenir à des voies de signalisation intracellulaires ayant un rôle dans la régulation de la protéine CFTR et être des cibles thérapeutiques.Par ailleurs, le canal CFTR est régulé par le Mg2+ intracellulaire ([Mg2+]i). Le canal TRPM7 est le principal régulateur du [Mg2+]i. La [Mg2+]i a été mesurée et l’expression de TRPM7 vérifiée dans des cellules Hela transfectées avec le CFTR sauvage (wt) ou mutés (G551D et F508del). Nous avons étudié la localisation, la fonction et la régulation de TRPM7 dans nos modèles cellulaires avant de rechercher un possible lien fonctionnel entre le CFTR et TRPM7. Dans les modèles CF, l’expression, la fonction et la localisation du canal TRPM7 sont altérées. Il existerait un lien fonctionnel entre TRPM7 et le CFTR par l’intermédiaire de la diminution du [Mg2+]i impliquant TRPM7 dans la physiopathologie de la mucoviscidose. / Cystic fibrosis is the most common lethal autosomal recessive disease in the Caucasian population. This disease is caused by mutations in the gene encoding the CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) protein. This protein is a cAMP-regulated chloride channel expressed at the apical membrane of epithelial cells. The F508del mutation causes a defect in CFTR protein folding preventing its maturation. Some misfolded proteins escape the control system and reach the plasma membrane.We previously showed a rise of CFTR-dependent ion efflux in wt- and F508del-CFTR human bronchial epithelial expressing cells (CFBE41o-) after incubation with GnRH (Gonadotropin releasing hormone; 1h, 10-9M). This increase was probably due to an increased cell surface expression of CFTR.The aim of the present study was to test a GnRH analog as a modulator of CFTR delivery to the plasma membrane and/or activity of CFTR on primary culture of human nasal epithelial cells (F508del/F508del).We checked the GnRH receptor expression in our model. Then, we studied the GnRH effect on CFTR’s function by electrophysiology. We found a significant increase of CFTR dependent chloride efflux in cells pretreated with analogue (2h, 10-12M). Proteomic study enabled us to identify differentially expressed proteins after treatment. Some highlighted proteins could be part of signalling pathways regulating CFTR and could be therapeutic targets.Moreover, CFTR is regulated by intracellular Mg2+ ([Mg2+]i). TRPM7 (Transient Receptor Potential Melastatin 7) is the main channel regulating [Mg2+]i. [Mg2+]i and TRPM7 expression were measured in Hela cells stably expressing wildtype and two CFTR mutants (F508del-CFTR and G551D-CFTR). We studied TRPM7 expression, function and regulation in our cell models before examining a functional link between TRPM7 and CFTR. In CF models, TRPM7 expression, localization and function are altered. There should be a functional link between TRPM7 and CFTR through the decreased [Mg2+]i involving TRPM7 in cystic fibrosis physiopathology.