Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-29T00:01:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Beghini_DanielaGois_M.pdf: 6701245 bytes, checksum: f8e5f5c2c65a683c66f0576fe4912f89 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A serpente Crotalus durissus cascavel/a é encontrada no cerrado do nordeste do Brasil (BARRA VI ERA, 1990) e apesar de pouco estudada sua picada constitui um importante problema de saúde pública (MARTINS et aI., 1998). A crotoxina é um complexo heterodimérico com atividade de fosfolipase A2 sendo o principal componente neurotóxico do veneno da Cascavel Sul Americana Crotalus durissus terrificus. A crotoxina atua bloqueando a transmissão de impulsos nervosos na junção neuromuscular causando uma paralisia flácida nas vítimas. O complexo crotoxina consiste em uma fosfolipase A2 (PLA2), componente básico, e um componente ácido, não enzimático conhecido como crotapotina. Acrotoxina do veneno de C. d. terrificus tem sido extensivamente estudada, enquanto que a crotoxina de outros venenos de Crotalus durissus sp tem sido pouco investigada.O objetivo deste trabalho foi a caracterização bioquímica e biológica do veneno e da crotoxina de Crotaus durissus cascavel/a, permitindo também um melhor entendimento do complexo crotoxina (PLA2 e crotapotina). PLA2 e crotapotina, foram purificadas através de dois passos cromatográficos: cromatografia de exclusão molecular em Superdex G-75 e cromatografia em HPLC de fase reversa. A análise cromatográfica em HPLC de fase reversa revelou quatro isoformas de crotapotina (F2, F3, F4 e F5) e apenas uma PLA2 (F6) na crotoxina do veneno de C. d. cascavel/a. A crotoxina de C. d. terrificus, ao contrário, contém três isoformas de PLA2 (Cdt F15, F16 e F17) e somente duas isoformas de crotapotina (Cdt F5 e F7). O grau de pureza das frações foi confirmado pela eletroforese em PAGE-SDS-Tricina onde mostrou que PLA2 e crotapotina migram como uma única banda com massa molecular estimada de 15 kDa e 9 kDa, respectivamente. A composição de aminoácidos da PLA2 mostrou uma grande quantidade de resíduos de meia-cisteína e um alto conteúdo de resíduos básicos, enquanto que as crotapotinas F3 e IF4 mostraram maior quantidade de resíduos carregados negativamente. Para uma melhor caracterização bioquímica avaliou-se a cinética da enzima PLA2 de C. d. cascavel/a. A PLA2 mostrou um comportamento alostérico, com atividade máxima em pH 8,3 e 35-40°C. A PLA2 de C. d. cascavel/a requer Ca2+ para exibir sua atividade, mas foi inibida por Zn2+ e CU2+. Crotapotina e heparina inibiram a atividade catalítica da enzima atuando como inibidores alostéricos. Com o objetivo de estudar a atividade biológica do veneno e da crotoxina de C. d. cascavel/a foi verificado a neurotoxicidade em preparação nervo frênico-diafragma de camundongo e preparação biventer cervicis de pintainho. O veneno de C. d. cascavel/a aqui reportado, bem como seu componente crotoxina, apresentou potente atividade neurotóxica, principalmente em preparação biventer cervicis de pintainho. O estudo miográfico, portanto, revelou que a preparação biventer cervicis de pintainho é mais sensível ao efeito paralisante do veneno e crotoxina quando comparada à preparação nervo frênico-diafragma de camundongo. A principal conclusão deste trabalho é que o veneno de C. d. cascavel/a contém pelo menos quatro isoformas de crotoxina formadas por diferentes combinações das crotapotinas com uma única isoforma de PLA2. Essa situação difere da crotoxina do veneno de C. d. terrificus, onde a heterogeneidade resulta da presença de três ou quatro isoformas de PLA2. Desde que a toxicidade do veneno depende principalmente de seu conteúdo de crotoxina, a presença das isoformas pode contribuir para variações na potência da neurotoxicidade / Abstract: Crotalus durissus cascavel/a is a snake usually found in scrubland of Brazilian Northeast (BARRA VI ERA, 1990) and in spite of little studied its bite constitutes an important public health problem (MARTINS et aI., 1998). The crotoxin is a heterodimeric complex with phospholipase A2 activity and is the main neurotoxic component in venom of the South American rattlesnake Crotalus durissus terrifícus. Crotoxin acts blocking the transmission of nervous pulses in the neuromuscular junction causing a flaccid paralysis in the victims. The crotoxin complex consists of a phospholipase A2 (PLA2), basic component, and an acid component, nonenzymatic known as crotapotin. The crotoxin of the C. d. terrifícus venom has been studied extensively, while crotoxin of others Crotalus durissus sp venoms have been poorly investigated. The objective of this work was the biochemical and biological characterization of the venom and of the crotoxin of Crotaus durissus cascavel/a, also allowing a better understanding of the crotoxin complex (PLA2 and crotapotin). PLA2 and crotapotin, were purified through two chromatography's steps: molecular exclusion chromatography in Superdex G-75 and in HPLC of reverse phase. The chromatographyc analysis in HPLC of reverse phase revealed four crotapotin isoforms (F2, F3, F4 and F5) and just a PLA2 (F6) in the crotoxin of the C. d. cascavel/a venom. Crotoxin from C. d. terrifícus contained three PLA2 isoforms (Cdt F15, F16 and F17), but only two crotapotin isoforms (Cdt F5 e F7). The degree of purity of the fractions was confirmed by the electrophoresis in Page-SDS-Tricina that showed that PLA2 and crotapotin migrated as single band with estimated molecular masses of 15 kDa and 9 kDa, respectively. The composition of amino acids of PLA2 showed a great amount of residues of half-cysteines and a high content of basic residues, while the crotapotins F3 and F4 showed larger amount of residues carried negatively. For a better biochemical characterization, the kinetics of the enzyme PLA2 of C. d cascavella was evaluated. The PLA2 showed allosteric behavior, with maximal activity at pH 8,3 and 35-40°C. The C. d. cascavella PLA2 required Ca2+ for activity, but was inhibited by Cu2+ and Zn2+. Crotapotin and Heparin inhibited the catalytic activity of the enzyme by acting as allosteric inhibitors. Aiming to study the biological activity of the venom and of the crotoxin of C. d. cascavella the neurotoxicity was verified in the mouse phrenic nerve diaphragm preparation and chick biventer cervicis preparation. The C. d. cascavella venom here reported, as well as its crotoxin component, presented potent neurotoxic activity, mainly in chick biventer cervicis preparation. The myographic study also revealed remarkable differences in the sensibility of the mouse phrenic nerve diaphragm preparation and chick biventer cervicis preparation. The preparation mouse nerve-muscle was shown less sensitive to the action neuromuscular blocking of both crotoxin and total venom, when submitted to indirect stimulus. The main conclusion of this work it is that C. d. cascavella venom contains at least four crotoxin isoforms formed by different combinations of crotapotins with the single PLA2 isoform. This situation differs from that of crotoxin in C. d. terrificus venom, where the heterogeneity results from the presence of three or four PLA2 isoforms. Since the toxicity of the venom depends mainly on its content of crotoxin, the presence of isoforms may contribute to variations in neurotoxicity / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Albetiza Lobo de Araujo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:44:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stroka_Alessandra_M.pdf: 5695207 bytes, checksum: 81505eb22e83ba5221b3adf2e6bb373a (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Envenenamentos por serpentes das subfamílias Crotalinae e Viperinae são caracterizados por um complexo quadro fisiopatológico, em que a hemorragia é freqüentemente observada. Neste trabalho, purificamos e caracterizamos uma proteína hemorrágica (BlaH1) da peçonha de Bothrops lanceolatus. A hemorragina foi purificada utilizando-se uma combinação de Cromatografias de gel filtração, afinidade e interação hidrofóbica. Em SDS-PAGE, a enzima apresentou uma massa molecular estimada em 28 kDa, tanto na ausência quanto na presença de j3-mercaptoetanol, indicando assim que a proteína não possui subunidades. A reação da BlaH1 com anticorpo foi confirmada pelos ensaios de imunobloting, ELlSA, imunoeletroforese e imunodifusão, onde o antisoro botrópico comercial foi capaz de reconhecer a proteína hemorrágica. BlaH1 possui atividade hemorrágica e caseinolítica. O uso do agente quelante EDTA inibiu as atividades hemorrágica e caseinolítica, sugerindo que a hemorragina é uma metaloproteinase. O pH ótimo da enzima foi de 8,0 e a temperatura ótima entre 30-40°C. Esses resultados mostram que a hemorragina isolada da peçonha de B. lanceolatus apresenta propriedades semelhantes a outras hemorraginas isoladas de peçonhas ofídicas / Abstract: Bothrops snake venoms contain metalloproteinases that contribute to the local effects seen after envenoming. In this work, a hemorrhagic metalloproteinase (BlaH1) was purified from the venom of the snake Bothrops lanceolatus by a combination of gel filtration, affinity (metal chelating) and hydrophobic interaction chromatographies. The hemorrhagin was homogeneous by SDS-PAGE and had a molecular mass of 28 kDa that was unaltered by treatment with beta-mercaptoethanol. BlaH1 gave a single band in immunodiffusion, immunoelectrophoresis and immunoblotting using commercial bothropic antivenom. This reactivity was confirmed by ELlSA. BlaH1 had hemorrhagic, caseinolytic, fibrinogenolytic, collagenolytic and elastinolytic activities, but no phospholipase A2 activity. The hemorrhagic and caseinolytic activities were inhibited by EDTA, indicating that they were metal ion-dependent. In contrast, aprotinin, benzamidine and PMSF did not affect these activities. The caseinolytic activity of BlaH1 had a pH optimum of 8.0 and was stable in solution at up to 40°C; activity was completely lost at >70°C. The hemorrhagic activity was neutralized by commercial bothropic antivenom. These properties suggest that this new hemorrhagin belongs to class P-I snake venom metalloproteinases / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:37:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8247_1.pdf: 447192 bytes, checksum: 4b02e153ac90ce5c5d312dfed280ea85 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / Visamos a analisar, na presente pesquisa, as obras de Ercília Nogueira Cobra, escritora e pensadora que viveu na virada do século XIX e defendeu, através de seus dois livros Virgindade Inutil Novela de Uma Revoltada (romance) e Virgindade Anti-Higiênica Preconceitos e Convenções Hipócritas (ensaio), baseada numa proposta pedagógica, uma nova maneira de olhar e educar as mulheres para a sua realização profissional e sexual. Pelos títulos já se tem uma idéia do escandâlo que eles provocaram no início do século XX, numa sociedade repressora e conservadora em que a mulher não tinha a menor visibilidade, tendo sua obra sido recolhida pela polícia, motivo pelo qual foi presa e cognominada de pornográfica

Orientador: Marcio Roberto Costa Martins / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T00:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_MarcioSilva_M.pdf: 2306565 bytes, checksum: a315917b668cd211926bc278297768a2 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: As serpentes apresentam os mais elaborados comportamentos defensivos descritos entre os répteis. Os objetivos tio presente estudo foram:- (1) descrever qualitativa e quantitativamente o comportamento defensivo de cinco espécies de Bothrops, B. alternatus, B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni e B. neuwiedi, pertencentes a cinco diferentes grupos de espécies; (2) comparar o comportamento defensivo das cinco espécies; (3) reconstruir a história evolutiva dos caracteres relativos ao comportamento defensivo dos cinco grupos de espécies. Foram observados dez indivíduos recém-capturados de cada espécie, em cativeiro. Foram registradas 11 categorias comportamentais, das quais as mais freqüentes foram "bater rápido da cauda contra o substrato", "bote" e "mordida". O comportamento defensivo de Bothrops spp. em cativeiro mostrou-se semelhante àquele observado no campo em B. jararaca. O comportamento defensivo em Bothrops mostrou-se insuficiente para uma separação clara entre os grupos, com exceção do grupo atrox em relação aos outros grupos, mas foi possível identificar algumas tendências. Boa parte dos comportamentos defensivos em Bothrops constitui de "exibições de advertência", o que indica que este tipo de defesa é eficiente na natureza. A maioria dos caracteres comportamentais observados parece ser ancestral no gênero e alguns deles possuem forte componente filogenético. Em relação ao ancestral do gênero, alternatus foi o grupo mais conservativo, ao passo que atrox foi o menos, o que, de certa forma, corrobora a hipótese filogenética usada. Os botes defensivos em Bothrops spp. Foram semelhantes aos observados em Crotalus viridis. Estes foram bastante conservativos entre as espécies em relação a sua distância e altura, o que pode estar associado a restrições mecânicas impostas pela morfologia. A velocidade de investida no bote defensivo aumenta à medida que a serpente projeta sua cabeça em direção ao seu antagonista. Aparentemente, essas serpentes conseguem modular o ângulo do bote de forma a atingir seu oponente numa altura relativamente constante. A velocidade dos botes verdadeiros foi maior que a dos botes falsos, o que indica que essas serpentes têm a capacidade de modular a velocidade do bote em função de sua intenção de introduzir os dentes ou não / Abstract: Snakes have the most elaborated defensive behavior described among reptiles. The objectives- 9f this study were: (1) describe qualitatively and quantitatively the defensive behavior of five species of Bothrops, B. alternatus, B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni and B. neuwiedi, belonging to five different species groups; (2) compare the defensive behavior of the five species; (3) trace the evolutionary history of the defensive behavior characters for the five species groups. Ten recently captured individuals of each species were analyzed under captivity conditions. Eleven behavioral categories were observed, from which the three most common were "tail vibration", "strike" and "bite". The defensive behavior of Bothrops spp. under captivity conditions was similar to B. jararaca¿s defensive behavior in field conditions. The defensive behavior in Bothrops was insufficient to clearly separate the groups, except for the atrox group in relation to the other groups, but some trends could be identified. Most of the defensive behaviors in Bothrops are "threatening displays", which indicates this type of defense is effective in nature. Most of the observed behavioral characters seem to be ancestral in the genus and some of them have a strong phylogenetic component. 1n relation to the genus ancestor, alternatus was the most conservative group, while atrox was the least one, which, in a certain way, corroborates the phylogenetic hypothesis used. The defensive strikes in Bothrops spp. were similar to those observed in Crotalus viridis. They were very conservative among species in relation to its distance and height, which may be associated to mechanical constraints imposed by morphology. The strike speed increases as the snake's head is projected towards its antagonist. Apparently, these snakes are able to modulate the strike angle in order to hit the antagonist in a relatively constant height. The true strikes' speed was higher than the false strikes' speed, which indicates these snakes can modulate strike speed according to their intention of introducing their teeth or not / Mestrado / Ecologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T23:09:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Toyama_MarcosHikari_D.pdf: 9361968 bytes, checksum: eaf1e7ea3745e2860f46c214010b9739 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: As serpentes do gênero Bothrops incluem várias espécies, que são amplamente distribuídas na América do Sul e do Norte. Entre as proteínas bioativas do veneno de Bothrops, as Fosfolipases Az (PLAz,E.c. 3.1.14) e as miotoxinas PLAz"like" destacam-se como seus componentes majoritários. Fosfolipases Az são enzimas cálcio dependentes que hidrolisam a ligação 2-éster do 1,2 diacil-3sn fosfoglicerídeo (Chang et aI., 1994, Shimohigachi et aI., 1995, Ogawa, et aI., 1996). Estas enzimas são encontradas em muitos tecidos, principalmente no suco pancrácio de mamíferos,no veneno de serpentes e insetos. Enzimas PLAz são classificados dentro de quatro grupos (I, lI, III e IV) de acordo com sua origem extracelular ou intracelular, de acordo com sua estrutura primária e pontes de sulfeto (Denis et aI., 1994). Nesta tese, trabalhos com o veneno total de Bothrops pirajai e suas frações fosfolipases Az miotóxicas. Num primeiro instante, nos desenvolvemos uma nova estratégia de purificaçãodestas miotoxinasem HPLC(HPLCde fase reversa, troca iônicae exclusão molecular) e em cromatografia convencional de baixa pressão (CM-Sepharose). Em nossas condições experimentais, observamos que o HPLCde fase reversa (RP HPLC)tem vantagens sobre o método convencional, em relação ao tempo da corrida cromatográfica, a resolução dos picos e a manutenção da integridade molecular da PLAz. O primeiro trabalho feito por Toyama et aI., (1995) apresenta os resultados da purificação da principal miotoxina PLAz"Iike" (MPI e MPII) do veneno total de Bothrops pirajai, usando uma única etapa cromatográfica em HPLCde fase reversa. Este novo protocolo de purificação restringe a quantidade de proteína a ser colocada na coluna algumas mg. O rendimento final é 35% melhor do que na cromatografia de troca iônica de baixa pressão. Em Soares et aI., (1998), propusemos um uma outra alternativa de purificação das miotoxinas PLAz "like" majoritárias usando coluna convencional, uma vez que o RP HPLC não aceita grandes quantidades de amostras. No procedimento convencional,a eluição das miotoxinasPLAz"like" era eluídausando acetato de amônia em altas concentraçõe se altos valor de pH. Atroca do acetato de amônio por bicarbonato de amônia permitiu o uso de tampões com baixo pH e baixas concentrações salinas. Outros venenos de Bothrops jararacussu, Bothrops asper, Bothrops atrox, Bothrops pirajai, Bothrops moojeni, Bothrops alternatus e Bothrops (Bothriopsis) bilineata foram fracionados usando procedimentos simplificados baseados na cromatografia em CMSepharose a pH 8.0 ou em RP HPLC. O uso de NH4HC03ou de acetonitrila como tampões nestes procedimentos cromatográficosdescritos acima, tem outras vantagens como a omissãode desalificaçãoe facilidadena liofilização. Isto permite uma melhorrecuperação das proteínas eluídas e redução do tempo de corrida. O método em CM-Sepharosee RP-HPLCdescritos aqui são recomendados para escalas preparativas e analíticas, respectivamente. Nos métodos previamente descritos usam dois ou mais passos cromatográficos para o isolamento de miotoxinas. Em adição as colunas preparativas wBondapack C18 mostraram também ser conveniente para a purificação de PLA2S. Ambos os métodos descritos aqui separam os componentes principaisdo veneno usando unicamente passo cromatográfico. Os perfis cromatográficos mostraram importantes diferenças no conteúdo de miotoxinas destes venenos. O veneno de B. alternatus, B. atrox e Bothriopsis bilineata não contem a miotoxina principal encontrada em outros venenos. O sequenciamento de aminoácidos dos primeiros 50 resíduos da região N-terminal destas miotoxinas PLA2"like" mostram uma homologia de 90 a 96% com outras miotoxinas botropicas. Todas as miotoxinas isoladas induzem edema de pata, aumentando o nível de creatinina quinase pancreática e indução da mionecrose junto com a infiltraçãode células polimorfonucleares. Nesta tese, nos apresentamos o isolamento, purificação e a determinação da estrutura primária de três miotoxinas fosfolipase A2"like" do veneno de Bothrops pirajai, denominadas como PrTX-I,PrTX-IIe MP-III4R. PrTX-I ou Piratoxina I foi isolado por Mancuso et ai., (1995), e completamente seqüênciada por Toyama et ai., (1998). PrTX-Ié a principal PLA2 miotóxica encontrado no veneno total de Bothrops pirajai, composto por 121 resíduos de aminoácidos, uma DLso de cerca de 8mg/kg em camundongos e uma dose edematogênica mínima de 39.5 :t 1.8 Ilg. A modificação química da His 48 da PrTX-I pelo p-BPB praticamente aboliu sua atividade biológica. PrTX-II ou Piratoxina II foi a segunda miotoxina importante isolada do veneno de Bothrops pirajai que foi sequenciada por Toyama et aI., (1999, submetido). Tem 121 resíduos de aminoácido de baixa atividade PLA2 devido substituição do Asp49 por Lys49e alteração do "Ioop" de ligação do cálcio pela substituição de Gly32 por Leu32 e outras modificações foram importantes para a perda da flexibilidadedo sítio de ligação do cálcio. PrTX-II tem somente um único amino ácido modificado (D132 para A132) em relação a PrTX-I esta mudança confere a PrTX-II um ligeiro caráter básico. A MP-III 4R foi a terceira miotoxina isolada do veneno de Bothrops pirajai. Esta miotoxina PLA2 "Iike" tem uma atividade PLA2moderada se comparada com outras enzimas encontradas em venenos Crotálicos. MP-III4R é um raro exemplode PLA2 com atividade fosfolipase A2, anticoagulante e miotóxica. Sua atividade PLA2 moderada é devido a substituição do resíduo E53 pelo K53 e seu efeito anticoagulante é devido a atividade PLA2.Amiotoxicidade não é devido a sua atividade catalítica. O alinhamento de amino ácidos da PrTX-I,PrTX-II mostra um alto nível (95%) de homologia sequencial entre esta miotoxina e outras PLA2botropicas. Contudo, estes valores diminuem para 80% para as não botropicas e para 70-75% para as PLA2Asp49. Ambas toxinas foram caracterizadas como miotoxinas potentes e tem um atividade PLA2 residual. MP-III 4R mostra uma homologia seqüencial de mais de 50% com outras PLA2 D-49. Maso alinhamento de aminoácidos da MP-III4R com PLA2K-49diminui para cerca de 60% de homologia. PrTX-II e PrTX-III foram cristalizados e difratados usando uma resulução de 2.04 e 2.7 A. Recentemente, a estrutura tridimensional da PrTX-IIfoi resolvida e mostrou uma estrutura dimérica / Abstract: The genus Bothrops comprises severaI species, which are widely distributed in South and North America. Among the bioactive proteins from Bothrops venoms, the phospholipase A2(PLA2,E.C.3.1.14) and PLA2-likemyotoxin are outstanding as their major components. Phospholipase A2Sare calcium-dependent enzymes which hydrolyze the 2 ester bonds of 1,2 diacyl-3sn phosphoglycerides (Chang et aI., 1994, Shimohigachi et aI., 1995, Ogawa, et aI., 1996). They are found in most tissues, mainly in the pancreatic juice of mammals, venom of snakes and insects. PLA2enzymes are classified onto four groups (I, II, III and IV), according to their extracellular or intracellular origin, their primary structure and disulfide bonding (Denis et aI., 1994). In this thesis, we work with Bothrops pirajai whole venom and its myotoxic phospholipase A2fractions. At first time, we develop a new strategy of purification of this myotoxinon the HPLC(reverse phase, ion exchange, and molecular exclusion) and in the convention low-pressure chromatography (CM-Sepharose). In our experimental condition, we observed that Reverse Phase HPLC(RP HPLC) has advantageous on the conventional method about the time of chromatographic run, the resolution of some proteins and preservation of integrity of PLA2 molecule. The first work made by Toyama et aI., (1995) presents the results of the purification of the main myotoxin PLA2"Iike" (MPI and MPII) from the whole venom of Bothrops piraja.,using only chromatographicstep on the RPHPLC. This novel purification protocol restricts the amount of protein to be loaded on each column in few mg. The final yield is 35% better than to in low-pressure ion exchange chromatography. In the Soares et aI., (1998), we proposed to increase the purification grade of main PLA2 "like" myotoxin using conventional column, because the RP HPLC does not accept great amount of samples. In the conventional procedure, the elution of the PLA2 "like" myotoxin was eluted using ammonium acetate at high salt and pH values. The exchange of the ammonium acetate by ammonium bicarbonate allowed using low pH and ionic salt concentration. PrTX-II or Piratoxin II was a second important myotoxin from Bothrops pirajai that has been sequecianated by Toyama (Submitted). It has 121 amino acid residues and has low PLA2activity arose of the substitution of Asp49 by Lys49and alteration of the calcium binding loop sequence by replacement of Gly32 by Leu32 and other modification were important for 1055of the flexibility the calcium ion binding site. PrTX-II I have only one amino acid change (0132 to A132) to PrTX-I, this change confer to PrTX-II a slight basic character. The MP-III 4R was thirty myotoxin isolated from the Bothrops pirajai venom. This PLA2 like myotoxinhasa moderate PLA2activity if comparedto other enzymesfound in the Crotalic venom. MP-III 4R is a rare example of PLA2 with phospholipase A2, anticoagulant and myotoxic activities. Its moderate PLA2activity is due to the replacement of E53 by K53 and its anticoagulant effects is due to that PLA2activity. The myotoxicity is not due to the catalytic activity. The aminoacid alignment of PrTX-I, PrTX-II shows a high levei(95%) of sequential homology between this myotoxin and other bothropic Lys-49 PLA2. However, these values fali to 80% for nonbothropic and to 70-75% for the Asp 49 PLA2S. 80th toxins were characterized as very potent myotoxin and have a residual PLA2 activity. MP-III 4R 049 exhibit a sequence homology with other 0-49 PLA2up 75%. But the amino acid alignment of MP-III 4R with K-49 PLA2falls to around 60% of homology. PrTX-II and PrTX-III were crystallizedand were diffractedat resolution of 2.04 and 2.7 of resolution, respectively. Recently, the three-dimensional structure of PrTX-II was solved and showed a dimeric structure. Other venoms from Bothropsjararacussu, Bothrops asper, Bothrops atrox, Bothrops pirajai, Bothrops moojeni, Bothrops alternatus and Bothrops (Bothriopsis) bilineata were fractionated using a simplified procedure based on ion-exchange chromatography on CMSepharose at pH 8.0 or reverse phase HPLC. The use of NH4HCO3or acetonitrile as the buffer in these chromatographic procedure described above, has other advantages as omissionof desalting and easy for freeze-drying. This allows a best recoveryof the proteins eluted and reduction of run time. The CM-Sepharose and the RP-HPLC methods described here are recommended for preparative and analytical purpose, respectively. Previous reported methods use two or more chromatographic steps for the isolation of myotoxins. In addition, the preparative WBondapackC18 column was also useful for the purificationof PLA2S. Both methods described here allow separating the major components of the venom using an only one chromatographic step. The resulting elution profiles showed important differences in the myotoxin content of these venoms. The venoms from B. alternatus, B. atrox and Bothriopsis bilineata did not contain the major myotoxin found in the other venoms. The amino acid sequence of the first 50 residues of the N-terminal region of the PLA2-like myotoxins showed a homology of 90-96% with other botropic myotoxins. All of the myotoxins isolated induced rat paw edema, increased the levei of plasma creatine kinase and produced myonecrosis together with polymorphonuclear cell infiltration. In this thesis, we present the isolation; purification and determination of primary structure of three phospholipase A2"like" myotoxin from the Bothrops pirajai snake venom denominated as PrTX-I, PrTX-II and MP-III 4R. PrTX-I or Piratoxin I was firstly isolated by Mancuso et aI., (1995), and full sequenced by Toyama et aI., (1998). PrTX-Iis the main miotoxic PLA2found in the whole Bothrops pirajai venom, composed by 121 amino acid residues, a DLso around 8mg/kg in mice and a minimal edematogenic dose of 39.5 :t 1.8 /.lg. The chemical modification of His-48 of PrTX-I by p-BPB practically destroyed its biological activity / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Julia Prado Francheschi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-14T02:00:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zappellini_Aldete_M.pdf: 1943638 bytes, checksum: d681f5b052540f56a0eb44ceaadfdf0d (MD5) Previous issue date: 1991 / Resumo: A B. erythromelas é uma serpente que habita exclusivamente as regiões quentes do Nordeste brasileiro (Bahia ao Ceará). Nesta Tese avaliaram-se características bioquímicas e farmacológicas de sua peçonha. Verificou-se que o veneno apresenta atividades coagulante, proteolítica (caseinolítica), fosfolipásica e hemorrágica, bem como discreta atividade TAME-esterásica. Os fracionamentos realizados revelaram a presença de três (Sephadex G-75) e quatro (Sephadex G-100) picos distintos. No primeiro pico detectaram-se as atividades proteolítica e coagulante, no segundo, TAME-esterásica (ausente em Sephadex G-75), no terceiro, fosfolipásicae coagulante. Nenhuma atividade foi detectada no último pico. Através do estudo farmacológico, verificou-se que a peçonha de B. elyrhromelas é menos tóxica do que a de B. jararaca para camundongos (via intraperitoneal); no entanto, esta relação se inverteu para pintainhos (via, intramuscular). Estudamos também os efeitos deste veneno sobre,a pressão arterial sistêmica e a respiração, bem como sobre o tempo de coagulação, de cães anestesiados. Observou-se que após administração de 25 fJ.g/kg da peçonha (via endovenosa, "bolus"), os animais apresentaram uma queda da pressão arterial que revelou a presença de dois componentes distintos: o primeiro manifestou-se por uma queda de rápida instalação e de moderada intensidadee o segundo, por uma queda mais acentuada e persistente. Verificou-se também que o veneno determinou a morte de 58,8% dos animais, por parada respiratória precedida por hiperpnéia. Incoagulabilidade sanguínea, após uma breve fase de hipercoagulabilidade (coagulopatiade consumo) foi também observada. O pré-tratamento dos animais, de forma independente, com heparina, sulfato de celulose, NW-nitro-L arginina metil éster (L-NAME) , indometacina, soro antibotrópico (SAB), e sulfato de celulose e indometacina associados, determinou a sobrevida de 100% dos animais experimentados. O primeiro componente hipotensor foi inibido significativamente pelo sulfato de celulose, bem como pela heparina, enquanto que o segundo componente hipotensor foi abolido em 50% dos animais tratados com indometacina. A associação de sulfato de celulose e indometacina inibiu completamente as alterações pressóricas induzidas pelo veneno, bem como as anomalias respiratórias. Estes resultados sugerem que bradicinina seja responsável pela queda inicial da pressão arterial e que eicosanóides com ação vasodilatadora, tais como prostacic1ina e/ou prostaglandina E2 sejam os mediadores da segunda queda pressórica. O estado de choque, por sua vez, seria mantido pela liberação de óxido nítrico pelas células endoteliais, uma vez que o pré-tratamento com L-NAME determinou uma recuperaçãoacelerada dos níveis pressóricos, ainda que não tenha interferido com nenhuma das respostas hipotensoras. As alterações na coagulação somente foram revertidas com o uso do SAB, no entanto em proporção 30 vezes superior àquela recomendada pelo Instituto Butantan / Abstract: B. elythromelas is a snake found exc1usivelyin the Northeast of Brazil (from Bahia to Ceará). In this Thesis, some of the biochemical and pharmacological characteristics of this venom were examined. B. erythromelas venom possesses coagulant activity as well as proteolytic (caseinolytic), phospholipase and TAME-esterase activities. Practionation of the venom yielded either three (Sephadex G-75) or four (Sephadex G-IOO) distinct peaks. The first peak contained primarily proteolytic and clotting activities; in the second one, TAME-esterase activity was detected (this peak was absent in the G-75 fractionation). The third peak contained phospholipase activity and in the last, no activity could be detected. B. erythromelas venom, compared with B. jararaca venom, is less toxic in mice, when given i.p.. However, this potency is inverted when the venoms are given i.m. in chicks. The effects of B. erythromelas venom on arterial blood pressure and respiration, as well as clotting time "in vivo" (anaesthetized dogs), were also examined. A bolus injection of B. Erythromelas venom (25 f-tg/kg,i.v.) induced a biphasic hypotensive response consisting of a rapid initial decrease followed by a partial recovery (early phase) which was then succeeded by a more sustained hypotension (late phase). The dose of venom used caused a 58.8% mortality. The animals died following a period of profound respiratory alterations. Independent pre-treatment of the animaIs with heparin, cellulose sulphate, NW-Nitro-L arginine methyl ester (L-NAME), indomethacin, antibothropic serum, or a combination of cellulose sulphate and indomethacin, abolished the lethality. The ear1yphase of hypotension was inhibited by cellulose sulphate as well as by heparin, while the late phase was partially inhibited (50%) by indomethacin. Pre-treatment with cellulose sulphate and indomethacin abolished the venom-induced alterations in blood pressure and respiration. These results suggest that bradykinin may be responsible for the initial hypotensive response and that vasodilatory eicosanoids, such as prostacyclin and/or prostaglandin E2 may mediate the late phase. Pre-treatment with L-NAME led to a more rapid recovery from the sustained late phase of hypotension although there was no effect on the immediate hypotensive response. This observation suggests that nitric oxide release, from endothelial cells, may contribute to the maintenance of the venom-induced shock. On the other hand, the hemostatic alterations were prevented only by pre-treatment with antibothropic serum, however in a dose 30 fold above that recommended by the Butantan Institute / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Aldo Focesi Junior / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-15T00:37:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ogo_SatieHatsushika_M.pdf: 3604800 bytes, checksum: a83266aebdf715f91042e9ed20d3c188 (MD5) Previous issue date: 1977 / Resumo: Algumas propriedades estruturais e funcionais em duas espécies de serpentes de hábitos semo-aquáticos, H. modestus e L. miliaris que apresentam diferentes graus de adaptação a esse ambiente foram examinados. Os hemolisados totais de ambos os ofícios apresentaram três componentes tanto por eletroforese com por cromatografia. O estudo das propriedades funcionais de suas hemoglobinas revelou diferenças fundamentais: a afinidade pelo oxigênio foi maior na H. modestus enquanto que o efeito Bohr da L. miliaris exibiu valores mais elevados entre pH 7,0 e 8,0. O coeficiente de Hill, n. que reflete a interação heme-heme não se modificou em grande proporção, em função do pH em ambas as espécies e seus valores foram relativamente pequenos quando comparados com os de outras serpentes (SULLIVAN, 1974). Os fosfatos orgânicos interagiram com as hemoglobinas de ambas as serpentes diminuindo sua afinidade pelo oxigênio, aumentando o efeito Bohr e alteranto a interação heme-heme. A concentração saturante da ATP/heme foi aproximadamente 2,2 (mol/mol) em ambas as espécies embora o efeito do ATP na concentração maior que a saturante sobre a afinidade pelo oxigênio fosse mais acentuado em L. miliaris. Os dois ofídios recorreram a anaerobiose quando estimulados, e nessas condições, o nível de lactato no sangue circulante foi maior em L. miliaris. Finalmente foram discutidos os diferentes graus de adaptação funcional das hemoglobinas correlacionados ao habitat e atividade das espécies em estudo / Abstract: Some structural and funcitional properties of two kind of water snakes H. modestus and L. miliaris, which show different degree of adaptation to the environment were analysed. The hemolysate of both kind of snake showed three components when analysed by either electrophoresis or chromatography. Important points came out from the study functional properties of their hemoglobin: thus, the oxygen affinity of H.modestus, the aquatic specie presented higher values than that of L. miliaris, although concerning the Bohr effect this specie showed low value close to zero between pH 7,0 and 8,0. The Hill coefitient did not show considerable variations with the pH in the snakes and their values were small compared with other species of snakes. Organic phosphates interacted with hemoglobin of both kind of snakes decreasing their oxygen affinity, increasing the Bohr effect and changing the Hill coefficient values. The ATP/ species of snake thought the effect of excess ATP on the oxygen affinity was more pronounced in L. miliaris. Upon stumulation both snakes increased their anaerobic metabolism according to the high blood lactate level found which was more pronounced in L. miliaris. Finally the different degree of functional adaptation of hemoglobin related to the habitat and the activity of both kind of snakes were discussed. / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Albetiza Lobo de Araujo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-20T12:08:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_AnaOliviade_M.pdf: 3133175 bytes, checksum: 172111dae3c3965d6a48fe7907c481cf (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: A capacidade que os venenos de serpentes possuem de aumentarem a permeabilidade vascular e induzirem edema, através da liberação de substâncias farmacologicamente ativas, é bem conhecida. Investigamos a resposta inflamatória (edema e permeabilidade vascular) induzida pelo veneno de Bothrops lanceolatus (VBL) em camundongos Swiss machos. O edema de pata foi induzido pela injeção subplantar do VBL (125 a 1000 ng/pata) e quantificado pelo aumento do peso da pata. A permeabifidade vascular foi determinada pela quantidade de azul de Evans extravasado. O edema e o aumento de permeabilidade foram máximos dentro de duas horas e estatisticamente insignificantes a partir de 24 horas. A administração de iloprost (20 ng/pata) após a do VBL potencializou o edema e o aumento de permeabilidade vascular aproximadamente em 400%. O tratamento dos camundongos com indometacina (5 mg/kg), dexametasona (1 mg/kg), NDGA (100 mg/kg) ou BW A4C (50 mg/kg) inibiu o edema induzido pelo VBL (43%, 59%, 28% e 43%, respectivamente) e o a(Jmento da permeabilidade vascular (0%, 66%, 48% e 44%, respectivamente). Ao contrário, os antagonistas de histamina, serotonina, e PAF [mepiramina (6 mg/kg), ciproheptadina (5 mg/kg), e WEB 2086 (50 mg/kg), respectivamente não foram efetivos. Estes resultados indicam que os dois fenômenos anteriormente citados são mediados principalmente por produtos da ação de ciclooxigenase e lipoxigenase. A nível histológico, as patas que sofreram injeção de 250 e 500 ng do VBL apresentaram um aumento na região dérmica com espaços intercelulares que são indícios de edema. Houve a presença de infiltrado celular, principalmente neutrófilos, entre as fibras musculares, as quais, morfologicamente não foram afetadas, pelo menos durante as três primeiras horas de observação. Com a dose de 500 ng ocorreu intensa hemorragia registrando grande número de hemácias extravasculares / Abstract: The ability of snake venoms to increase vascular permeability and to induce oedema through the release of pharmacologically active substances is well known. This thesis investigates the inflammatory response (oedema and , vascular permeability) induced by the venom of Bothrops lanceolatus (BL V) in male Swiss white mice (20-30g). Paw oedema was induced by the subplantar injection of BLV (125-1000 ng/paw) and was quantified as the increase in paw weighí. Changes in vascular permeability were assessed by measuring the amount of Evans blue dye extravasation. Oedema and the increase in vascular permeability were maximal within two hours and had resolved afier 24h. The administration of iloprost (20 ng/paw) immediately afier BLV potentiated the oedema and increased the vascular permeability by approximately 400%. Pre¬treating the mice with indomethacin (5 mg/kg), dexamethasone (1 mg/kg), NDGA (100 mg/kg), or BW A4C (50 mg/kg) inhibited the BLV-induced oedema (by 43%, 59%, 28% and 43%, respectively) and the increase in vascular permeability (by 0%, 66%, 48%, and 44%, respectively). In contrast, histamine, serotonin, and PAF-acether antagonists [mepyramine (6 mglkg) , cyproheptadine (5 mg/kg), and WEB 2086 (50 mg/kg), respectively)] were not effective. In histological sections,the venom (250 and 500 ng) was observed to cause thickening of the innerdermal layers which was accompanied by the presence of large intercellular spaces indicative of oedema. In addition, there was a marked infiltration of inflammatory cells, particularly neutrophils, into the underlying muscle layer. The latter, however, remained morphologically unaffected during the three hours of observation. Venom doses of 500 ng or more produced intense hemorrhage in the paw. These results indicate that BL V-induces oedema and increases vascular permeability in the mouse paw as confirmed by histological examination of the injected paws. The principal mediators of this inflammation response are cyclooxygenase and lipoxygenase products / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientadores : Julia Prado Franceschi, Lea Rodrigues Simioni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-13T22:56:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cogo_JoseCarlos_M.pdf: 5956920 bytes, checksum: a9419c9c9c555fbca0bd2d0f8cedeeae (MD5) Previous issue date: 1991 / Resumo: A peçonha da Bothrops insularis (jararaca-ilhôa) foi estudada em aves in vitro (toxicidade e estudo morfológico) e in vitro (estudo miográfico, eletrofisiológico e morfológico acompanhado de dosagem de CK), comparando seus efeitos com aqueles da peçonha Bothrops jararaca. Os resultados obtidos levam às seguintes conclusões: 1) A toxicidade da peçonha Bothrops insularis é superior à da peçonha de Bothrops jararaca cerca de 5 vezes, mostrando-se as aves muito mais sensíveis à peçonha de Bothrops insularis do que os mamíferos. 2) A peçonha da Bothrops insularis age na junção neuromuscular possuindo ações tanto pré (ação facilitadora da transmissão neuromuscular) como pós juncionais (Contratura e bloqueio da transmissão neuromuscular). 3) A peçonha de Bothrops insularis mostrou-se mais potente també, nas preparações musculares in vitro de aves quando comparada com as preparações musculares in vitro de mamíferos, sendo esta atividade dose-dependente. O mesmo pode-se dizer quando comparada com a peçonha de Bothrops jararaca nas preparações in vitro. 4) Existe também uma ação direta da peçonha na fibra muscular detectada através da degeneração muscular observada tanto nos músculos de pintainhos que foram injetados com a peçonha como nos músculos de pintainhos incubados com a mesma. 5) Devido à degeneração muscular, verifica-se nos músculos tratados in vitro, um aumento nos níveis de liberação de CK o qual é dose-dependente. A liberação de CK in vitro é também verificada com a peçonha de Bothrops jararaca sendo entretanto essa liberação de menor intensidade do que aquela causada pela Bothrops insularis...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstracts: The effects of Bothrops insularis (jararaca-ilhôa) venom were examined , in vitro in birds (toxicity and morphological studies) and in vitro (myographical electrophysiological ans morphological studies together with the measurement of CK levels). Tese effects were compared to those of Bothrops jararaca. The results obtained allow the followings conclusions to be drawn. 1) The toxicity of Bothrops insularis venom is about fice times greater than that of Bothrops jararaca. Birds are much more sensitive to Bothrops insularis venom than are mammals. 2) Bothrops insularis venom acts on the neuromuscular junction both presynaptically, to cacilitate neuromuscular transmission, and postnaptically, to induce contracture and blockage of neuromuscular transmission. 3) Bothrops insularis venom is more potent in in vitro muscle preparations of birds than of mammals. Theis venom is also more potent in ptese preparations than that of Bothrops jararaca.4) The venom of Bothrops insularis has a direct action on muscle fibers as demonstrated by the muscle degeneration observed in vitro in chicks injectd with the venom and in vitro in muscle incubated with venom. 5) The muscle degeneration observed in vitro resuloted in a dose-dependent release of CK. Bothrops jararaca. Venom also caused the release of CK in vitro, although this effect was less marked than that observed with Bothrops insularis venom¿. Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores : Julia Prado Franceschi, François Radvanyi / Tese (doutorado) - Universidade Estadualde Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-13T22:57:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_AlbetizaLobode_D.pdf: 9308594 bytes, checksum: 5d373ae25e509c651bc76131bf282c5e (MD5) Previous issue date: 1990 / Resumo: No presente trabalho procuramos inicialmente obter informações gerais sobre o veneno total de Bothrops lanceolatust comparando suas atividades enzimaticas com aquelas das Bothrops brasileiras, encontrando valores medios entre B. jararaca e B. jararacussu para atividade litica sobre caseina e TAME, como tambem em relação a atividade hemorragica. Apesar de não exibir efeito coagulante sobre o plasma, o veneno total coagula o fibrinogênio, apresenta atividade hemolitica indireta e prolonga o tempo de tromboplastina parcial ativada. Como esses dois ultimos efeitos foram mais evidentes com a fração F32 podemos caracteriza-la como uma fosfolipase A2 acida e anticoagulante. ... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: In the presente work we initially obtained some information on the crude venom of Bothrops lanceolatus comparing its enzymatic activities with those of Brazilian Bothrops species. Caseinolytic, TAMEesterase and "hemorrhagic activities were intermediate to those of B. jararaca and B. jararacussu. Despite having no coagulant effect on plasma, crude venom clotted fibrinogen, possessed indirect hemolytic activity and prolonged the partial thromboplastin time. Since these last two activities were most marked with fraction F32, this fraction may be characterized anticoagulant acidic phospholipase A2'. ... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas