A elucidação dos mecanismos moleculares pelos quais tratamentos hormonais alteram o início da puberdade é de fundamental importância para o desenvolvimento de estratégias que reduzam a idade ao primeiro parto, e consequentemente a taxa de desfrute do rebanho Nelore. Foram investigados os efeitos do uso de dispositivos de progesterona, e do estradiol endógeno, sobre mecanismos moleculares controlando a obtenção da puberdade de novilhas Nelore peripúberes. Especificamente, como as diferenças na expressão de genes relativos à reprodução em duas áreas do hipotálamo. Trinta e cinco novilhas Nelores não púberes, e com idade entre 13 e 14 meses, foram divididas em quatro tratamentos experimentais (nove ou oito por tratamento): dispositivo de P4 sem estradiol (SP); dispositivo de P4 com estradiol (PE); sem dispositivo de P4 e sem estradiol (SS); e sem dispositivo de P4 e com estradiol (SE). As novilhas foram alimentadas no cocho pós desmame até atingirem 295 ± 11 kg, com fornecimento de água à vontade. Ao término do tratamento hormonal as novilhas foram abatidas e as porções de hipotálamo colhidas para processamento e armazenagem a -80 ºC. O RNA total do tecido hipotalâmico foi extraído, tratado com DNAse I e submetido à síntese de cDNA para estudo da expressão gênica por PCR em tempo real (qRT-PCR). Foram formados pools de RNA para a realização de um estudo abrangente da administração de progesterona e do efeito do estradiol endógeno e das diferenças entre áreas do hipotálamo, realizado por sequenciamento de nova geração (RNA-Seq), de forma a identificar possíveis genes candidatos no hipotálamo. Foram encontrados genes diferencialmente expressos alterados pelos tratamentos e entre as áreas do hipotálamo relativos à obtenção da puberdade. / The understanding of the molecular mechanisms by which nutrition, genetics and hormonal treatments affect the beginning of puberty is of great importance for developing strategies aiming to reduce the age at first calving, and therefore increase the slaughter rate in Nellore cattle. The effects of progesterone device and of endogenous estradiol on the molecular mechanisms controlling the attainment of puberty in Nellore heifers were investigated. Specifically, the molecular pathways of progesterone and estradiol were studied in the hypothalamus. Thirty five non-pubertal heifers, between 13 and 14 months of age, were divided into four treatment (nine or eight per treatment): P4 device without estradiol (SP), P4 device with estradiol (PE), without P4 device and without estradiol (SS), and without P4 device and with estradiol (SE). The heifers were fed after weaning until reach 295 ± 11 Kg, with water access. At the end of the hormonal treatments all heifers were slaughtered and the hypothalamus areas were harvested, processed and then also stored at -80°C. Total RNA of hypothalamus were extracted, treated with DNase I and submitted to cDNA synthesis for gene expression quantification by real time PCR (qRT-PCR). RNA samples were pooling to realize a comprehensive study of the effects of progesterone administration and endogenous estrogen on attainment of puberty by next-generation sequencing (RNA-Seq), in order to identify possible candidate genes in the hypothalamus. Genes diffentially expressed between hypothalamic areas and affected by treatments were found.

A ferrugem alaranjada é uma doença foliar que afeta a cana-de-açúcar, tendo ganho destaque como uma das principais doenças da cultura. Causada pelo fitopatógeno biotrófico Puccinia kuehnii, foi relatada em diversos países da América do Sul, incluindo o Brasil. Entender o comportamento desta doença é importante na compreensão de seus mecanismos de infecção. Para isso, o propósito deste trabalho é avaliar o transcriptoma, por sequenciamento de RNA, da resposta da cana-de-açúcar à infecção por P. kuehnii durante o estabelecimento da doença. O material biológico utilizado correspondeu a folhas de cana-de-açúcar do cultivar suscetível SP89-1115, amostrados no momento da inoculação dos esporos (0 h), 12 horas após a inoculação (hai), 24 hai, 48 hai, 5 dias e 12 dias após a inoculação da ferrugem alaranjada. Após o pré-processamento das leituras, foi realizado o mapeamento de aproximadamente 800 milhões de leituras, utilizando como referência um transcriptoma de cana-de-açúcar obtido a partir do sequenciamento de seis genótipos distintos. Posteriormente, foi realizada a análise de expressão diferencial: i) em um teste do tipo Análise de Variância, ii) entre a comparação de cada tempo após a infecção contra 0 h e iii) pela comparação de tempos adjacentes. Por essa última estratégia, a maioria dos transcritos diferencialmente expressos ocorreu em 12 hai, 48 hai e 12 dai. Através do enriquecimento funcional foram evidenciados processos relacionados principalmente à fotossíntese e oxirredução, importantes na manutenção do metabolismo e sinalização celular sob perturbação. Os perfis de expressão gênica temporal dos transcritos anotados de acordo com termos da base Gene Ontology, por sua vez, mostraram ondas invertidas de repressão e estímulo entre as comparações 12 hai vs 0 h e 48 hai vs 24 hai. Através da segunda análise de expressão diferencial houve indícios de que os níveis de expressão dos transcritos eram similares entre 0 h e 48 hai. Portanto, P. kuehnii pode ter agido no sentido de repressão das vias de resposta de defesa nas primeiras horas seguidas da inoculação, desfavorecendo mecanismos de acúmulo de fitormônios e deposição de lignina na parede celular. O cultivar de cana-de-açúcar pode ter sido prejudicado pela ausência de sistemas de reconhecimento e/ou no combate às proteínas efetoras do patógeno, de modo a ter sido modulado para o estabelecimento fúngico, havendo evidências do restabelecimento parcial da homeostase celular em 48 hai. / Orange rust is a foliar disease that affects sugarcane, gaining importance among the main diseases of this crop. Caused by the biotrophic phytopathogen Puccinia kuehnii, it has been reported in several countries in South America, including Brazil. Understanding the behavior of this disease is very important in comprehending its mechanisms of infection. The purpose of this work is to evaluate the transcriptome, by RNA sequencing, of the sugarcane response to infection by P. kuehnii during the establishment of the disease. The biological material used corresponds to sugarcane leaves from susceptible cultivar SP89-1115, sampled at the time of spore inoculation (0 h), 12 hours post inoculation (hpi), 24 hpi, 48 hpi, 5 days and 12 days post inoculation of orange rust. After pre-processing the reads, we mapped approximately 800 million reads to a reference sugarcane transcriptome obtained from sequencing six different genotypes. Subsequently, we performed differential expression analysis: i) in an Analysis of Variance type test; ii) comparing each time after inoculation against 0 h and iii) by comparing adjacent times. By the latter strategy, most of the differentially expressed transcripts occurred at 12 hpi, 48 hpi and 12 dpi. Through functional enrichment analysis, processes related mainly to photosynthesis and oxidation were evidenced, which are important in metabolic maintenance and cellular signaling under perturbation. The temporal gene expression profiles of Gene Ontology-annotated transcripts, in turn, showed reverse repression and stimulus waves between the comparisons 12 hpi vs 0 h and 48 hpi vs 24 hpi. Through the second differential expression analysis we found evidence that the expression levels of the transcripts were similar between 0 h and 48 hpi. Therefore, P. kuehnni may have acted in the sense of repressing defense response pathways in the first hours following inoculation, disfavoring mechanisms of phytohormones signaling and lignin deposition in the cell wall. This sugarcane cultivar may have been harmed by the absence of recognition systems and/or in the control of pathogen effector proteins in order to have been modulated for fungal establishment, with evidence of partial reestablishment of cellular homeostasis at 48 hpi.

O corpo lúteo (CL) canino apresenta períodos regulares de formação, atividade e regressão, marcados por intensa remodelação tecidual, o que depende diretamente de aporte energético, em alguns casos mediado pela insulina. Além de seu papel metabólico, a insulina, através de diferentes genes, pode desempenhar um papel fundamental na regulação da esteroidogênese, e consequentemente nas funções do CL de cadelas cíclicas. Nosso objetivo na primeira parte experimental foi mapear os genes diferencialmente expressos no CL, em diferentes estágios do diestro, diretamente relacionados à sinalização insulínica e a esteroidogênese no CL canino, caracterizando sua expressão gênica e proteica. A via secundária de captação de glicose também decorrente da sinalização insulínica foi abordada. Cadelas não gestantes foram submetidas à ovariosalpingohisterectomia a cada 10 dias entre os dias 10 e 60 (n=5/grupo) após a ovulação. Os CL coletados foram utilizados para sequenciamento de RNA (RNA-Seq) e validação por PCR em tempo real, e proteica por Western blotting e imunofluorescência. Na segunda parte experimental, através de cultivo celular, quantificamos a expressão dos genes relacionados à esteroidogênese após estímulo insulínico, e realizamos o bloqueio das vias phosphoinositide 3-kinase (PI3K), mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14) e mitogen-activated protein kinase 1(MAP2K1) para mensuração da produção de esteroides (n=4/grupo). Foram identificados sete genes diferencialmente expressos relacionados à sinalização insulínica: insulin receptor substrate (IRS1), phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 3 (PI3KR3), phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma (PI3KCG), mitogen-activated protein kinase 9 (MAPK9), mitogen-activated protein kinase 13 (MAPK13), mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14) e suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1), e dois genes, cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1 (CYP19A1) e hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta (HSD3B), identificados como envolvidos com a esteroidogênese. A via secundária de captação de glicose mostrou que adenylyl cyclase-associated protein (CAP1), CRK proto-oncogene, adaptor protein (CRKII) apresentaram aumento de sua expressão no período em que ocorre o aumento da produção de progesterona (P4), diferente de member of RAS oncogene family (RAP) e ras homolog family member Q (RHOQ) que apresentaram menor expressão gênica nos dias 40, coincidindo com o aumento de estradiol (E2) no diestro. Nos experimentos em cultivo celular, sob estímulo insulínico, a expressão de CYP19A1 não apresentou diferença quando as células eram provenientes do dia 20, diferentemente do dia 40, no qual houve aumento de expressão no grupo tratado com insulina. Em relação à expressão de HSD3B, houve aumento de expressão no dia 20 e 40. A produção de P4 apresentou diminuição com o bloqueio de PI3K, MAPK14 e MAP2K1, enquanto que a produção do E2 apresentou diminuição nos bloqueios com PI3K e MAPK14, e não houve diferença de produção com o bloqueio de MAP2K1. Em conjunto, estes dados sugerem que MAPK e PI3K podem modular a esteroidogênese no CL canino, provavelmente via expressão de HSD3B e CYP19A1. A ativação da via CAP-CrKII-RHOQ-RAP, não esta envolvida neste processo. Concluímos que a insulina é capaz de modular a esteroidogênese no CL canino e que a resposta hormonal ao estímulo insulínico depende do dia do diestro. / The canine corpus luteum (CL) has regular periods of formation, activity and regression marked by intense tissue remodeling, which depends directly on energy supply in some cases mediated by insulin. In addition to its metabolic role, insulin, through different genes, may play a key role in the regulation of steroidogenesis, and consequently in the CL functions of cyclic bitches. Our objective in the first experimental part was to map the differentially expressed genes in CL, at different stages of the diestrus, directly related to insulin signaling and steroidogenesis in canine CL, characterizing their gene and protein expression. The secondary pathway of glucose uptake also resulting from insulin signaling was addressed. Non-pregnant dogs were submitted to ovariosalpingohisterectomy every 10 days between days 10 and 60 (n=5/group) post- ovulation. The collected CL was used for RNA sequencing (RNA-Seq), validation by real-time PCR and protein for Western blotting and immunofluorescence. In the second experimental part, through cell culture we identified different responses of luteal cells after insulin stimulation under the expression of differentially expressed steroidogenesis genes. We also performed phosphoinositide 3-kinase (PI3K), Mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14) and mitogen-activated protein kina 1 (MAP2K1) pathway blockade to measure steroids production (n = 4/group). Seven differentially expressed genes related to insulin signaling were identified: insulin receptor substrate IRS1), phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 3 (PI3KR3), phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma (PI3KCG), mitogen-activated protein kinase 9 (MAPK9), mitogen-activated protein kinase 13 (MAPK13), mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14) and suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1), in addition to two genes, cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1 (CYP19A1) and hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta (HSD3B), identified as being involved with steroidogenesis. The secondary glucose uptake pathway showed that adenylyl cyclase-associated protein 1 (CAP1) and CRK Proto-Oncogene, Adaptor Protein (CRKII) increased expression in the period of increased production of progesterone (P4). different than member Of RAS Oncogene Family (RAP) and ras homolog family member Q (RHOQ) showed less gene expression on days 40 p.o., coinciding with the increase of estradiol (E2). In the cell culture experiments under insulin stimulation, the expression of CYP19A1 did not present difference when the cells were coming from day 20, unlike day 40, in which there was increased expression in the group treated with insulin.. HSD3B expression increased on days 20 and 40. The production of P4 presented a decrease with PI3K, MAPK14 and MAP2K1, while that production of E2 decreased with PI3K and MAPK14 blockade, and did not alter with MAP2K1 blockade. Together, these data suggest that MAPK and PI3K can modulate steroidogenesis in the canine CL, probably via HSD3B and CYP19A1 expression. The activation of the CAP-CrKII-RHOQ-RAP pathway is not involved in this process. We conclude that insulin is able modulate steroidogenesis in canine CL and that hormonal response to insulin stimulus depends on the day of the diestrus.

A glândula de veneno da serpente Bothrops jararaca é uma glândula exócrina relacionada a glândula salivar dos mamíferos. Diferentemente de outras glândulas exócrinas, esta possui um lúmen central no qual o veneno produzido fica estocado. Os mecanismos envolvidos na regulação da síntese e secreção de toxinas pela glândula de veneno são pouco conhecidos. Sabe-se que a inervação noradrenérgica possui um papel essencial no ciclo de produção de veneno, pois serpentes Bothrops jararaca tratadas com reserpina, um potente bloqueador da atividade simpática, não acumulam veneno no lúmen. Porém a ativação direta dos adrenoceptores α e β, através da ação de agonistas, tem a capacidade de reverter a ação da reserpina. No presente trabalho utilizamos métodos combinados de análise de expressão gênica em larga escala a fim de identificar os processos celulares sob controle do sistema simpático durante o ciclo de produção de veneno da glândula de veneno de Bothrops jararaca. Foi construído um array de cDNA em membrana da náilon contendo 4608 clones provenientes da biblioteca de cDNA construída a partir das glândulas de veneno de um macho e uma fêmea, adultos, de Bothrops jararaca. Para a análise temporal da expressão gênica foram utilizados machos adultos de B. jararaca. As glândulas de veneno foram extraídas em diferentes dias do ciclo de produção de veneno (0, 1, 2, 4 e 15 dias). Através da análise do perfil de expressão gênica identificamos que os transcritos de toxinas e de não toxinas (celulares) possuem perfil semelhante de expressão ao longo do ciclo, sendo que no 2° dia do ciclo ocorre o pico de expressão desses transcritos. Para identificar os processos celulares sob controle da inervação noradrenérgica machos adultos de B. jararaca foram submetidos a tratamento farmacológico com reserpina (glândula 4dR) e com reserpina e agonistas dos adrenoceptores α e β (glândula 4dA). Na análise da expressão gênica utilizando macroarranjos, entre os clones com expressão aumentada na glândula 4dR, aproximadamente 51% eram de toxinas, indicando que a inibição da atividade simpática não interfere na transcrição das toxinas. A análise dos transcritos celulares confirmou que os processos de transcrição e tradução não são afetados pelo tratamento com reserpina. A análise da expressão por PCR quantitativo em tempo real, confirmou que as toxinas são expressas normalmente na glândula 4dR. Além disso, a análise da expressão de genes envolvidos nos processos de enovelamento protéico e secreção revelou que genes responsivos a estresse de retículo endoplasmático apresentam aumento na expressão na glândula 4dR. Também realizamos a análise transcriptômica por sequenciamento em larga escala (RNA-seq) da glândula 4d e da glândula 4dR. Entre os contigs identificados como toxinas não houve diferenças quantitativas nem qualitativas significativas entre as glândulas 4d e 4dR, confirmando que o processo de transcrição de toxinas ocorre independentemente da ativação dos adrenoceptores α e β. A análise de enriquecimento de termos do gene ontology revelou predominância de processos biológicos relacionados a resposta a estresse de retículo endoplasmático entre os transcritos mais expressos na glândula 4dR e de processos envolvendo a formação de vesículas de transporte entre os transcritos menos expressos na glândula 4dR. Na análise dos transcritos exclusivos da glândula 4d e exclusivos da glândula 4dR identificamos diversas isoformas de small GTPases da família Ras (Rab) que possuem papel fundamental na regulação da formação de vesículas. Assim, nesse trabalho mostramos que o processo de transcrição de toxinas ocorre independentemente da ativação dos adrenoceptores α e β e que a ativação dos adrenoceptores parece ser necessária para que ocorra a formação de vesículas secretoras. Já a inibição do processo pela ação da reserpina possivelmente provoca a ativação da resposta UPR (unfolded protein response), o que pode estar associado com o acúmulo de proteínas no lúmen do retículo endoplasmático. / The venom gland of the Brazilian venomous snake Bothrops jararaca (Crotalinae, Viperidae) is an exocrine tissue related to the salivary gland. The venom gland has a central lumen where the venom is stored. When the venom is released, the production of new venom is triggered by the activation of noradrenaline on both α1- and β-adrenoceptors. But the genes involved and the regulation of venom production cycle are poorly known. When the Bothrops jararaca is treated with reserpine, a depletor of catecholamine, the venom production is inhibited. At present work we used combined methods of high throughput analysis of gene expression to identify cellular process controlled by the sympathetic system during the cycle of venom production in the venom glands of Bothrops jararaca. Was constructed a cDNA array with 4608 clones from a cDNA library of the venom glands of one male and one female of B.jararaca. In order to get a time series analysis adult males of B.jararaca were used. The venom gland was extracted at different time points of the venom production cycle (0, 1, 2, 4 and 15 days). The resulting profile of the gene expression of toxins and non-toxins during the cycle was shown to be similar, and the higher level of gene expression was found at the 2nd day of the venom production cycle. A differential gene expression analysis was performed also with venom glands of B.jararaca treated with reserpine. Although previous results reported that venom glands under effect of reserpine are not able to produce venom, we found that 51% of upregulated clones of the venom gland treated with reserpine (4dR) are toxins. Moreover, most of the non-toxins clones were involved with transcription and translation processes, showing that these processes are not affected by the inhibition of the sympathetic system. The analysis of gene expression by quantitative real-time PCR confirmed that in the venom gland treated with reserpine (4dR) the toxins are normally produced, and the genes responsive for unfolded protein response (UPR) are upregulated. We also performed the next generation sequencing to produce a transcriptomic profile (RNA-seq) of normal venom gland (4d) and venom gland treated with reserpine (4dR). The comparison between the transcripts of toxins found at 4d and 4dR transcriptomes revealed no qualitative or quantitative differences, confirming that the toxins transcription are independent of the activation of α1- and β-adrenoceptors. The enrichment analysis of Gene Ontology terms revealed that the unfolded protein response are activated at 4dR venom gland and the membrane trafficking are possibly inhibited. We also identify many isoforms of Ras family small GTPases (Rab proteins) that has a key role ate regulation of membrane trafficking. At present work we showed that the transcriptional control of the toxins in the venom gland are independent of the activation by α1- and β-adrenoceptors, however, the adrenoceptors seems to be necessary to activate the secretory pathway. The inhibition of the activation of α1- and β-adrenoceptor by reserpine seems to be recruiting an unfolded protein response, probably due to the accumulation of proteins at the lumen of the endoplasmic reticulum.

O corpo lúteo (CL) canino apresenta períodos regulares de formação, atividade e regressão, marcados por intensa remodelação tecidual, o que depende diretamente de aporte energético, em alguns casos mediado pela insulina. Além de seu papel metabólico, a insulina, através de diferentes genes, pode desempenhar um papel fundamental na regulação da esteroidogênese, e consequentemente nas funções do CL de cadelas cíclicas. Nosso objetivo na primeira parte experimental foi mapear os genes diferencialmente expressos no CL, em diferentes estágios do diestro, diretamente relacionados à sinalização insulínica e a esteroidogênese no CL canino, caracterizando sua expressão gênica e proteica. A via secundária de captação de glicose também decorrente da sinalização insulínica foi abordada. Cadelas não gestantes foram submetidas à ovariosalpingohisterectomia a cada 10 dias entre os dias 10 e 60 (n=5/grupo) após a ovulação. Os CL coletados foram utilizados para sequenciamento de RNA (RNA-Seq) e validação por PCR em tempo real, e proteica por Western blotting e imunofluorescência. Na segunda parte experimental, através de cultivo celular, quantificamos a expressão dos genes relacionados à esteroidogênese após estímulo insulínico, e realizamos o bloqueio das vias phosphoinositide 3-kinase (PI3K), mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14) e mitogen-activated protein kinase 1(MAP2K1) para mensuração da produção de esteroides (n=4/grupo). Foram identificados sete genes diferencialmente expressos relacionados à sinalização insulínica: insulin receptor substrate (IRS1), phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 3 (PI3KR3), phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma (PI3KCG), mitogen-activated protein kinase 9 (MAPK9), mitogen-activated protein kinase 13 (MAPK13), mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14) e suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1), e dois genes, cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1 (CYP19A1) e hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta (HSD3B), identificados como envolvidos com a esteroidogênese. A via secundária de captação de glicose mostrou que adenylyl cyclase-associated protein (CAP1), CRK proto-oncogene, adaptor protein (CRKII) apresentaram aumento de sua expressão no período em que ocorre o aumento da produção de progesterona (P4), diferente de member of RAS oncogene family (RAP) e ras homolog family member Q (RHOQ) que apresentaram menor expressão gênica nos dias 40, coincidindo com o aumento de estradiol (E2) no diestro. Nos experimentos em cultivo celular, sob estímulo insulínico, a expressão de CYP19A1 não apresentou diferença quando as células eram provenientes do dia 20, diferentemente do dia 40, no qual houve aumento de expressão no grupo tratado com insulina. Em relação à expressão de HSD3B, houve aumento de expressão no dia 20 e 40. A produção de P4 apresentou diminuição com o bloqueio de PI3K, MAPK14 e MAP2K1, enquanto que a produção do E2 apresentou diminuição nos bloqueios com PI3K e MAPK14, e não houve diferença de produção com o bloqueio de MAP2K1. Em conjunto, estes dados sugerem que MAPK e PI3K podem modular a esteroidogênese no CL canino, provavelmente via expressão de HSD3B e CYP19A1. A ativação da via CAP-CrKII-RHOQ-RAP, não esta envolvida neste processo. Concluímos que a insulina é capaz de modular a esteroidogênese no CL canino e que a resposta hormonal ao estímulo insulínico depende do dia do diestro. / The canine corpus luteum (CL) has regular periods of formation, activity and regression marked by intense tissue remodeling, which depends directly on energy supply in some cases mediated by insulin. In addition to its metabolic role, insulin, through different genes, may play a key role in the regulation of steroidogenesis, and consequently in the CL functions of cyclic bitches. Our objective in the first experimental part was to map the differentially expressed genes in CL, at different stages of the diestrus, directly related to insulin signaling and steroidogenesis in canine CL, characterizing their gene and protein expression. The secondary pathway of glucose uptake also resulting from insulin signaling was addressed. Non-pregnant dogs were submitted to ovariosalpingohisterectomy every 10 days between days 10 and 60 (n=5/group) post- ovulation. The collected CL was used for RNA sequencing (RNA-Seq), validation by real-time PCR and protein for Western blotting and immunofluorescence. In the second experimental part, through cell culture we identified different responses of luteal cells after insulin stimulation under the expression of differentially expressed steroidogenesis genes. We also performed phosphoinositide 3-kinase (PI3K), Mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14) and mitogen-activated protein kina 1 (MAP2K1) pathway blockade to measure steroids production (n = 4/group). Seven differentially expressed genes related to insulin signaling were identified: insulin receptor substrate IRS1), phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 3 (PI3KR3), phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma (PI3KCG), mitogen-activated protein kinase 9 (MAPK9), mitogen-activated protein kinase 13 (MAPK13), mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14) and suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1), in addition to two genes, cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1 (CYP19A1) and hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta (HSD3B), identified as being involved with steroidogenesis. The secondary glucose uptake pathway showed that adenylyl cyclase-associated protein 1 (CAP1) and CRK Proto-Oncogene, Adaptor Protein (CRKII) increased expression in the period of increased production of progesterone (P4). different than member Of RAS Oncogene Family (RAP) and ras homolog family member Q (RHOQ) showed less gene expression on days 40 p.o., coinciding with the increase of estradiol (E2). In the cell culture experiments under insulin stimulation, the expression of CYP19A1 did not present difference when the cells were coming from day 20, unlike day 40, in which there was increased expression in the group treated with insulin.. HSD3B expression increased on days 20 and 40. The production of P4 presented a decrease with PI3K, MAPK14 and MAP2K1, while that production of E2 decreased with PI3K and MAPK14 blockade, and did not alter with MAP2K1 blockade. Together, these data suggest that MAPK and PI3K can modulate steroidogenesis in the canine CL, probably via HSD3B and CYP19A1 expression. The activation of the CAP-CrKII-RHOQ-RAP pathway is not involved in this process. We conclude that insulin is able modulate steroidogenesis in canine CL and that hormonal response to insulin stimulus depends on the day of the diestrus.

De par sa taille (17 Gb), la complexité de son génome (allohexaploïde) ainsi que la forte proportion d’éléments répétés (>80%), l’étude du génome de blé tendre est une tâche particulièrement complexe et s’est souvent retrouvée confrontée aux limites technologies. Grâce une approche de tri de chromosomes, le chromosome 3B (995 Mb) a pu être isolé et séquencé. Ces données ont permis la construction d’une pseudomolécule. Mes travaux de thèse se sont basés sur des données de transcriptomique produites avec une approche RNA-Seq, afin d’investiguer l’impact de la taille de ce chromosome sur l’organisation de l’espace génique. L’annotation du chromosome 3B a permis de mettre en évidence : 5 326 gènes et 1 938 pseudogènes. L’analyse des librairies RNA-Seq pour 15 conditions de développement a permis de mettre en évidence l’expression de 71 % des gènes annotés, ainsi que 3 692 régions nouvellement transcrites (NTR). Nous avons aussi pu détecter des transcrits alternatifs pour 61% des gènes exprimés (en moyenne 6 isoformes). Nous avons donc pu mettre en évidence une structuration de l’espace génique pour le chromosome 3B. En effet, la transcription est répartie sur tout le chromosome, cependant les gènes sont organisés selon un gradient de densité croissant sur l’axe centromère-télomère. En nous basant sur le profil des données de recombinaison, nous avons divisé le chromosome en 3 régions : R1, R2 et R3. La région R2 correspondant à la région centrale du chromosome (647 Mb) où le taux de recombinaison est très faible voir absent. Les régions R1 (58 Mb) et R3 (69 Mb) correspondent respectivement aux parties distales du bras court et du bras long du chromosome, où le taux de recombinaison est le plus fort. Ces trois régions diffèrent par leur niveau et leur spécificité d'expression, ainsi que par leur structure génique (nombre d'exons, taille des introns …). En effet, les gènes ayant une expression tissu-spécifique, ainsi qu’un faible nombre de transcrits alternatifs sont retrouvés dans les régions R1 et R3. Deux modèles peuvent expliquer le lien observé entre la structure des gènes et leur niveau/spécificité d’expression : le modèle de la sélection pour l’économie et le modèle dessin génomique. En conclusion, ce travail a montré et ce, pour la première fois à l’échelle d’un chromosome entier de blé, l’impact de la taille du chromosome sur l’organisation ; mettant en relation la structure des gènes, leur niveau d’expression, leur spécificité d’expression, ainsi que leur nature évolutive. L’assemblage ainsi que l’annotation de pseudomolécules des autres chromosomes permettra de mettre en évidence si cette structure est conservée. Afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans la régulation de l’expression des gènes, une étude du paysage épigénomique a été engagée. / Genome-wide studies of the bread wheat are a complicated task due to its large size (17 Gb), its allohexaploidy and its high content in repeat sequences (>80%). Using a chromosome-specific approach, the chromosome 3B (995 Mb) was successfully isolated and sequenced leading to the assembly of one pseudomolecule. The work presented in this thesis investigated the impact of the 3B chromosome size on the gene space organization. Production of transcriptomic data was achieved using RNA-Seq approach. The chromosome 3B was annotated and we predicted 7 264 features, including 5 326 full genes and 1 938 pseudogenes. We constructed RNA-Seq libraries for 15 developmental wheat conditions. Using this data we detected expression of 71.4% of the predictions, and 3 692 novel transcribed regions (NTR). We also detected alternative transcripts for 61% of the expressed genes, with 5.8 isoforms on average for one gene. Using these transcriptional data, we highlighted a partitioning of the chromosome 3B gene space. Indeed, transcription was found all along the chromosome, but genes were organized according to an increasing density gradient along the centromere-telomere axis. Based on recombination profile, we segmented the chromosome in 3 major regions: R1, R2 and R3. The region R2 was identified with low or no recombination rate corresponding to the centromeric and peri-centromeric regions (647 Mb). The regions R1 and R3 were associated with a higher recombination rate, both localized on the distal part of the short arm (58 Mb) and the long arm (69 Mb) respectively, where the recombination rate is higher. All three regions showed distinct level and specificity of gene expression as well as unique gene structure (variation size, exon number, intron size). Indeed, genes expressed in a specific condition and with a small number of alternatives transcripts were localized on regions R1 and R3. We showed that two evolutionary model could explain the link between gene structure and the level/specificity of expression : “selection for economy” and “genome design”. In conclusion, a transcriptomic studies was achieved along the 3B chromosome for the first time. This study demonstrated a relationship between gene characteristics (structure, expression level, expression specificity and evolution) and the chromosome 3B organization. Future pseudomolecule assemblies will help us to assess the structural organization of these chromosomes. In order to better understand the cellular mechanisms of gene expression, an epigenomic study of the 3B chromosome was started.

The Nelore breed represents the vast majority of Brazilian Zebuine cattle (Bos taurus indicus). The great adaptability of the Nelore breed to Brazilian tropical climate, however, is not associated with meat tenderness (MT). It is known that MT is influenced by several environmental factors, but also genetic composition. In the first chapter, we report a genome-wide analysis of copy number variation (CNV) inferred from Illumina® Bovine High Density SNP-chip data for a Nelore population of 723 males including 30 sires. We detected >2600 CNV regions (CNVRs) representing ≈6.5% of the Bos taurus genome. The CNVR size was 65 kb on average, ranging from 5 kb to 4.3 Mb. A total of 1155 CNVRs (43.6%) overlapped 2750 genes. They are enriched for important functions such as immune response, olfactory reception and processes involving guanosine triphosphate (GTP). The GTP processes have known influence in skeletal muscle physiology and morphology. Quantitative trait loci for MT, partly specific for Nelore, overlapped a substantial fraction of CNVRs and two CNVRs were found proximal to glutathione metabolism genes that are associated with MT as well. Comparing our results with previous studies revealed an overlap in ≈1400 CNVRs (>50%). We selected 9 CNVRs that overlapped regions associated with MT and we validated them in all 30 sires by qPCR. There was identified many genomic regions of structural variation in Nelore with important implications on the MT phenotype. In the second chapter, a total of 34 animals of the population were subjected to transcriptome analysis and meat tenderness (MT) phenotyping. We identified 170 CNV fragments (CNVFs) residing in 20 CNVRs, which occurred in different frequencies between animals with tougher and softer meat genetic potential. A considerable fraction of the identified CNVFs affected gene expression of the MT genes, which play important roles in glycogen metabolism, connective tissue turnover, membrane transporters and glutathione pathways. We also detected that several CNVRs substantially influenced the expression of overlapped and nearby genes, where the increase or decrease of copy number correlated well with the change in gene expression. Among them are two CNVRs at chromosomes 12 and 23, which are in the vicinity of previously described QTLs for MT in Nelore breed. Several CNVFs, which are more frequent in animals with genetic potential for softer or tougher MT, showed significant differences in gene expression. Those regions are linked to important biological functions with highly relevant influences on MT and skeletal muscle physiology. / A raça Nelore é predominante no rebanho zebuíno brasileiro (Bos taurus indicus). A grande adaptabilidade da raça Nelore ao clima tropical brasileiro, no entanto, não está associada à maciez de carne (MT). Sabe-se que MT é influenciada por vários fatores ambientais e pela composição genética. Foi realizada uma análise de todo o genoma para inferir Variação no Número de Cópias de Segmentos Genômicos (Copy Number Variation - CNV) a partir de dados oriundos de chip de SNP (Illumina® Bovine High Density), para uma população de 723 machos Nelore, incluindo 30 ancentrais da população. Foram detectadas >2600 regiões de CNV (CNVRs) representando ≈6.5% do genoma bovino. O tamanho médio do CNVR foi de 65 kb, variando de 5 kb até 43 Mb. Um total de 1155 CNVRs (43.6%) obtiveram sobreposição com 2750 genes. Estes genes foram enriquecidos para as funções importantes, tais como resposta imunológica, recepção olfativa e processos que envolvem o trifosfato de guanosina (GTP). As vias metabólicas do GTP conhecidamente influenciam a fisiologia e a morfologia do músculo esquelético. Loci de características quantitativas (QTLs) para MT, alguns específicos para Nelore, sobrepuseram uma fração substancial das CNVRs encontradas. Dois CNVRs foram encontrados em região proximal à genes do metabolismo da glutationa os quais também são associados com MT. Comparando os resultados com estudos anteriores ≈1400 CNVRs (>50%) foram sobrepostos. Nove CNVRs em regiões associadas com MT foram validados nos 30 ancentrais por qPCR. Em conclusão, foram identificadas regiões genômicas de variação estrutural no Nelore, com potenciais implicações sobre o fenótipo MT. No segundo capítulo, um total de 34 animais da população foi submetido à análise do transcriptoma e análise de potencial genético para MT. Foram identificados 170 fragmentos de CNV (CNVFs) mapeados em 20 CNVRs, os quais mostraram frequências significativamente diferentes entre animais com potencial genético para carne mais dura ou mais macia. Uma fração considerável dos CNVFs identificados afetaram a expressão gênica de genes MT (anteriormente descritos como associados à MT ou fisiologia do músculo esquelético), os quais desempenham um papel importante no metabolismo de glicogênio, volume do tecido conjuntivo, transportadores de membrana e vias metabólicas da glutationa. Um número considerável de CNVRs foram associados à expressão de genes sobrepostos e nas proximidades, onde o aumento ou diminuição do número de cópias foi associado com a mudança na expressão gênica. Dois CNVRs associados foram mapeados para os cromossomo 12 e 23, estando próximos a QTLs anteriormente descritos para MT na raça Nelore. Vários CNVFs, entre animais com potencial genético para carne mais macia ou dura, mostraram diferenças significativas na expressão gênica. Essas regiões estão ligadas a importantes funções biológicas com influências altamente relevantes para MT e para a fisiologia do músculo esquelético.

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Assim, o estudo dos mecanismos utilizados pela Xac durante o processo infeccioso pode revelar novos alvos para o desenvolvimento de compostos farmacológicos que possam eliminar ou controlar o patógeno. Neste estudo, a técnica de RNA-Seq foi utilizada para a identificação de genes diferencialmente expressos (GDE) na Xac em condições in vivo e in vitro. Para isso, cinco variedades de citros com níveis diferentes de suscetibilidade ao cancro cítrico, e meios de cultura indutores de fatores de virulência foram utilizados. Muitos dos genes que codificam para proteínas relacionadas ao sistema de secreção tipo 3 (T3SS), enzimas extracelulares, resposta ao estresse oxidativo, transportadores de ferro e fósforo foram induzidos pela Xac nas condições in vivo. No entanto, in vitro, os perfis de expressão para estes mesmos genes foram diferentes. Estes dados permitiram compreender melhor o ambiente intracelular do hospedeiro, e como este se relaciona com os mecanismos de ativação dos fatores de virulência e patogenicidade de Xac. Neste sentido, os dados apresentados neste estudo mostraram que o T3SS é o principal fator de virulência expresso por esta bactéria em condições in vivo. Além disso, nossos resultados sugerem também que as baixas concentrações de fósforo inorgânico (Pi) e nitrogênio que a bactéria percebe no apoplasto das plantas, são interpretadas como sinais para a ativação do T3SS. Mutações realizadas em genes relacionados com o transporte de Pi (∆phoR e ∆pstB) em Xac demostraram a perda de virulência por alteração na expressão dos genes do T3SS. Assim, estes dados demostram pela primeira vez em Xac um possível mecanismo de regulação entre o sistema de transporte de Pi e o T3SS. Este estudo revelou diferentes fatores de virulência e patogenicidade utilizados pela Xac para vencer as defesas da planta, o que permitirá levantar hipóteses sobre a identificação de possíveis alvos quimioterapêuticos para o tratamento do cancro. / Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is the causal agent of citrus canker, a major disease affecting citrus worldwide. Currently there is no effective way of cancer control, and new methods must be developed for the treatment of this disease. Thus, the study of the mechanisms used by Xac during the infectious process can reveal new targets for the development of pharmacologic compounds that can eliminate or control the pathogen. In this study, RNA-Seq technique was used to identify Xac differentially expressed genes (DEG) in vivo and in vitro conditions. For this purpose, five citrus varieties with different levels of susceptibility to citrus canker and culture mediums inducing virulence factors were used. Many of the genes encoding proteins of the type 3 protein secretion system (T3SS), extracellular enzymes, oxidative stress response, iron and phosphorus transport were induced in Xac in vivo conditions. However, the expression profiles for these same genes were different than observed in vitro conditions. These data allowed us to better understand the intracellular environment of the host, and how this relates to the activation mechanisms of pathogenicity and virulence factors in Xac. In this context, the data presented in this study show the T3SS as the main virulence factor expressed by the bacteria in vivo conditions. Furthermore, our results also suggest that low concentrations of inorganic phosphorus (Pi) and nitrogen, that bacteria sense in the plant apoplast, are interpreted as signals to activation of the T3SS. In this respect, mutations carried out in genes related to the transport of Pi (ΔphoR and ΔpstB) in Xac demonstrated loss of virulence by altering the expression of T3SS genes. Thus, these data identifies for the first time in Xac a possible regulatory mechanism between Pi transport system and T3SS. This study revealed different virulence and pathogenicity factors used by Xac to overcome the plant defenses. These discoveries allow raise hypotheses about the identification of potential chemotherapeutic targets to canker treatment.

A melatonina é um antioxidante muito eficaz e protege as células contra o estresse oxidativo causado pelas espécies reativas, e indiretamente, modula a expressão de genes associados ao ciclo celular, metabolismo oxidativo e apoptose celular. Deste modo, a suplementação da melatonina ao meio de maturação in vitro, a torna uma alternativa para promover melhorias na viabilidade das células germinativas e embrionárias. O estudo 1 avaliou o efeito da adição de melatonina ao meio de maturação por meio da maturação nuclear (progressão meiótica) e citoplasmática (migração de grânulos corticais) e dos níveis de ROS em oócitos suínos maturados in vitro. A suplementação do meio de maturação com melatonina estimulou a progressão da meiose, a migração de grânulos corticais e reduziu os níveis intracelulares de ROS nos oócitos. O estudo 2 avaliou o efeito da melatonina na expressão de genes antioxidantes (Catalase, SOD1, SOD2 e GPX) envolvidos na proteção celular de oócitos e células do cumulus. A adição da melatonina ao meio de maturação influenciou positivamente a expressão dos genes antioxidantes nos oócitos e células do cumulus. O estudo 3 avaliou o efeito da melatonina nos processos biológicos por meio do perfil de trascriptomas, via RNA-Seq, em células do cumulus oriundas de oócitos suínos maturados in vitro. A partir da análise de expressão diferencial foi possível identificar que a adição da melatonina ao meio de maturação influenciou 80 genes associados a nove processos biológicos (ciclo celular; proteólise; organização de citoesqueleto; via energética; adesão e transporte celular; via de sinalização; fator de transcrição; metabolismo oxidativo e apoptose; e componente celular). A suplementação do meio de maturação com melatonina potencialmente influencia a viabilidade e o funcionamento celular, uma vez que modulou a expressão de genes associados à processos fisiológicos essenciais, tais como: divisão celular, metabolismo energético e oxidativo, vias de sinalização e apoptose. O estudo 4, avaliou o efeito da melatonina sobre os genes associados à viabilidade oocitária e o subsequente desenvolvimento embrionário por meio do perfil de trascriptomas, via RNA-Seq, de células do cumulus oriundas de oócitos suínos. A adição da melatonina ao meio de maturação influenciou 59 genes associados a nove funções biológicas (expansão do cumulus, comunicação em COCs, maturação nuclear, maturação citoplasmática, reparo e integridade do DNA, viabilidade oocitária, esteroidogênese, fertilização e embriogênese). Em conclusão, a suplementação do meio de maturação com melatonina influencia positivamente a maturação oócitária, reduz os níveis intracelulares de ROS, aumenta a expressão de genes antioxidantes, em adição, interfere no transcriptoma de um número expressivo de genes associados à aquisição da competência oócitária, da viabilidade embrionária e desenvolvimento subsequente. / Melatonin is a very effective antioxidant and protects cells against oxidative stress caused by reactive species, and indirectly modulates expression of genes associated with cell cycle, oxidative metabolism, and apoptosis. Thus, melatonin supplementation to in vitro maturation media becomes an alternative to improve the viability of germ and embryonic cells. The first study assessed the effects of adding melatonin to the maturation medium on nuclear (meiotic progression) and cytoplasmic (cortical granules migration) maturation and ROS levels in in vitro matured porcine cumulus-oocyte complexes (COCs). Melatonin supplementation stimulated meiosis progression and cortical granules migration, and reduced intracellular ROS levels in oocytes. The second study evaluated the effects of melatonin on the expression of antioxidant genes (Catalase, SOD1, SOD2, and GPX) involved in cellular protection in oocytes and cumulus cells. The addition of melatonin to the maturation medium positivity influence the expression of antioxidant genes in oocytes and cumulus cells. The third study evaluated the effect of melatonin on genes associated with biological processes through transcriptomic profile via RNA-Seq in cumulus cells derived from porcine COCs in vitro matured. Melatonin addition to maturation medium differentially affected expression of 80 genes associated with nine biological processes (cell cycle, proteolysis, cytoskeletal organization, energy pathaway, cell adhesion and transport, signalling pathway, transcription factor, oxidative metabolism and apoptosis, and cell components). The fourth study assessed the effect of melatonin on genes associated with oocyte viability and subsequent embryo development through transcriptomic profile via RNA-Seq in cumulus cells derived from porcine COCs. Melatonin in the maturation medium affected 59 genes associated with nine biological functions related with oocyte viability and embryo development (cumulus expansion, communication between cumulus cells and oocytes, nuclear maturation, cytoplasmic maturation, DNA repair and integrity, oocyte viability, steroidogenesis, fertilization and embryogenesis). In conclusion, supplementation of melatonin to maturation environment influences oocyte nuclear and cytoplasmic maturation, reduces intracellular ROS levels, positivity influence the expression of antioxidant and also interferes in the transcriptome of a significant number of genes associated with oocyte competence acquisition, embryo viability and subsequent development.

As leishmanioses são um conjunto de doenças causadas pela infecção com protozoários do gênero Leishmania. No Brasil, o parasita L. infantum provoca a manifestação de uma doença sistêmica e crônica, conhecida como leishmaniose visceral (VL), que, quando não tratada, pode levar o indivíduo à óbito. A gravidade da leishmaniose visceral vem sendo associada ao aumento do nível sistêmico de IL- 6 em pacientes sintomáticos. Ainda não está claro como o aumento dessa citocina coordena a progressão da doença. Nós demonstramos durante a infecção por L. infantum experimental há produção dessa citocina nos órgãos alvos. Em decorrência dessa via, animais deficientes para IL-6 (IL-6-/-) são suscetíveis a infecção por apresentar maior número de parasitos nos órgãos alvo e por desenvolverem uma fraca resposta inflamatória em função da diminuição do infiltrado inflamatório. Como consequência, há o aumento de CXCL2 que medeia o recrutamento de neutrófilos no baço. Apesar de aumentada em animais IL-6-/- os neutrófilos apresentam um estado menos ativado. A produção dos principais mediadores de morte dos parasitos, como espécies reativas de oxigênio (ROS) e o óxido nítrico (NO), estão comprometidas e favorecem a disseminação do parasito em animais IL-6-/-. Por outro lado, a Il-6 não interfere na produção de citocinas pró-inflamatórias e na proliferação de linfócitos Th1, atuando somente em linfócitos Th17 no início da infecção, sugerindo que o controle da resposta inflamatória é dependente de mecanismos inatos. Em humanos, identificamos dois genes modulados pela via de sinalização da IL-6. Os genes Hsbp1 e AR estão up-regulados em pacientes com a doença ativa e são genes associados com a migração e a produção de neutrófilos na medula óssea, possivelmente envolvidos com a neutropenia em pacientes com LV. Juntos, os dados mostram que a via de sinalização da IL-6 tem papel importante na modulação da resposta imune de neutrófilos, e em promover proteção durante a LV. / Leishmaniasis is a group of diseases caused by infection with protozoa of the genus Leishmania. In Brazil, the parasite L. infantum causes the manifestation of a systemic and chronic disease, known as visceral leishmaniasis (VL), which, when left untreated, can lead to death. The severity of visceral leishmaniasis has been associated with an increase in the systemic level of IL-6 in symptomatic patients. It is not yet clear how the increase in this cytokine coordinates the progression of the disease. We demonstrated during the infection by experimental L. infantum there is production of this cytokine in the target organs. As a result of this pathway, IL-6 ( IL- 6-/-) deficient animals are susceptible to infection because they present a higher number of parasites in the target organs and they develop a poor inflammatory response due to the decrease of the inflammatory infiltrate. As a consequence, there is an increase in CXCL2 that mediates the recruitment of neutrophils in the spleen. Although increased in IL-6-/- animals the neutrophils have a less activated state. The production of the main mediators of parasite death, such as reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO), are compromised and favor the spread of the parasite in IL-6-/- animals. On the other hand, IL-6 does not interfere in the production of proInflammatory cytokines and Th1 lymphocyte proliferation, acting only on Th17 lymphocytes at the beginning of the infection, suggesting that the control of the inflammatory response is dependent on innate mechanisms. In humans, we identified two genes modulated by the IL-6 signaling pathway. The Hsbp1 and AR genes are up-regulated in patients with the active disease and are genes associated with the migration and production of neutrophils in the bone marrow, possibly involved with neutropenia in patients with VL. Together, the data show that the IL-6 signaling pathway plays an important role in modulating the neutrophil immune response, and in promoting protection during LV.