Nesta tese, apresentamos estudos experimentais e teóricos realizados com o Ácido orto-Aminobenzóico (o-Abz) e seus derivados 2-amino-benzamida (o-Abz-NH2), 2-amino-metil-benzamida (o-Abz-NH(CH3)) e 2-amino -dimetilbenzamida (o-Abz-N(CH3)2). Foram feitas medidas de absorção óptica, fluorescência estática e resolvida no tempo e anisotropia de fluorescência em solventes com diferentes graus de polaridade e diferentes capacidades de doar e aceitar prótons. Os resultados experimentais foram comparados aos resultados de simulações computacionais que simularam o sistema solventesoluto. Restrições impostas pelas limitações computacionais impedem cálculos totalmente quânticos via métodos ab-initio, porém uma metodologia que tem apresentado resultados satisfatórios é o método híbrido que envolve a mecânica quântica associada à mecânica molecular (QM/MM). No presente trabalho, foram combinados cálculos quânticos ab-initio e semi-empíricos na otimização de geometrias de moléculas isoladas e no cálculo de energias de transições respectivamente. Foram simulados os sistemas soluto+solvente via Método de Monte Carlo. Os espectros de absorção ótica obtidos via simulação demonstraram boa concordância com os resultados experimentais, identificando-se as bandas como oriundas das transições p-p*. Verificamos que a forma ácida aniônica do o-Abz é responsável pelo deslocamento para o azul, observado em solvente aquoso. A forma aniônica incrementa a eletronegatividade dos átomos de Oxigênio, aumentando a energia das ligações de hidrogênio. Essas ligações mais intensas estabilizam o estado excitado do o- Abz, e isso se reflete no deslocamento para azul. Da simulação, verificou-se também que na forma aniônica há uma inibição das ligações de hidrogênio do tipo doadoras por parte do grupo amina. Os derivados do o-Abz apresentam aumento na capacidade do grupo amina atuar como doador em ligações de hidrogênio e diminuição na soma de todas as ligações de hidrogênio entre soluto-solvente. Os derivados amida e monometilamida mantiveram elevado rendimento quântico e sensibilidade à polaridade ambiente. Por outro lado, o derivado o-Abz-N(CH3)2 mostra sensibilidade à presença de metilas que incrementam as vias de desexcitação não radiativa. / In the present, we report experimental and theoretical studies on orthoaminobenzoic acid (o-Abz) and its derivatives 2 amino-benzamide (o-Abz-NH2), 2 amino-monomethyl-benzamide (o-Abz-NH(CH3)) and 2 amino-dimethyl-benzamide (o-Abz-N(CH3)2. We measured optical absorption, steady state and time-resolved fluorescence and fluorescence anisotropy of the compounds in solvents with different donor/acceptor character. The experimental results were compared with results of computational calculations which simulated solvent-solute systems. Due to the restrictions imposed by the computer limitations, it was not possible to do entire quantum calculations by ab-initio methods. We used then QM/MM methods, which involves quantum calculation with molecular mechanics simulations. In this work, ab-initio and semi-empiric quantum calculations were combined in the single molecule geometry optimization and energy transitions calculus, respectively. The solute-solvent system was simulated by Monte Carlo method. The optical absorption spectra obtained from simulations showed good agreement with experimental results, identifying the bands relative to p-p* transitions. It was observed that the anionic acid form of the o-Abz is responsible for the blue shift when it is in aqueous solution. Anionic form increases the electronegativity of Oxygen atoms, rising the energy of the hidrogen bonds. These strong bonds stabilize the fundamental state of o-Abz, resulting in a blue shift in absorption spetrum. From simulation, it was verified that in the anionic form of o-Abz there is also an inhibition of hidrogen bonds of the donor type by the amine group. Compared to o-Abz alone, the derivatives present an increase in the amine group capacity to act as a hidrogen bond donor. The o-Abz-NH2 and o-Abz- NH(CH3) derivatives preserved the high quantum yield and the sensitivity for the environment polarity, while in the dimethyl amide derivative, the presence of methyl groups increases the deexcitation by non-radiactive pathways.

Este estudo teve como objetivo desenvolver e validar micrométodo simples e sensível para quantificação de cefuroxima plasmática utilizando CLAE-UV com a finalidade de aplicação no monitoramento das concentrações de cefuroxima de pacientes submetidos à cirurgia de revascularização do miocárdio (RM) com CEC no esquema de doses administradas em bolus. Os tempos de retenção para o fármaco e padrão interno (guaifenesina) foram 5,3 e 8,7 minutos respectivamente, com um tempo de corrida de 15 minutos, utilizando coluna de fase reversa C18 (25 cmX4,6 mm, 5 micra) e fase móvel binária constituída de tampão acetato de amônio e trietilamina 0,025 M pH 4,2 e acetonitrila (80:20, v/v), fluxo de 1,0 mL/min, detecção no ultravioleta, λ=274nm em sistema isocrático de eluição. A validação deste método analítico investigada através dos limites de confiança apresentou sensibilidade de 0,1 µg/mL (LD) e limite inferior de quantificação (LIQ) de 0,20 µg/mL, linearidade na faixa compreendida 0,2 µg/mL a 200 µg/mL e 4,37% e 2,95% para precisão intra- e inter-dias, respectivamente. Boa exatidão (98,75%) e alta seletividade foram registradas para o método. Através de um protocolo de estudo para antibioticoprofilaxia das infecções cirúrgicas investigaram-se dez pacientes com indicação de cirurgia eletiva de revascularização do miocárdio com circulação extracorpórea. Realizou-se o monitoramento das concentrações plasmáticas após a dose de ataque de 1,5 g, seguido da manutenção realizada através de bolus em tres doses de 0,75 g 6/6 horas. Uma vez que as concentrações plasmáticas de cefuroxima obtidas na sexta hora (vale) foram inferiores à recomendada 16 µg/mL (4x MIC), recomenda-se o aumento de 0,75 g 6/6 horas para 1,5 g mantendo-se o intervalo entre doses de forma a atingir aquela requerida na antibioticoprofilaxia das cirurugias cardíacas. / The objective of the study was to validate na analytical method to determine cefuroxime in plasma by high performance liquid chromatography (HPLC - UV) for clinical purposes in surgical patients submitted to elective cardiac surgery of myocardial revascularization with cardiopulmonary bypass after drug administration as IV boluses. Retention times for the analite and its internal standard (guaifenesin) were 5.3 and 8.7 minutes, respectively; run time was 15 minutes, using a reversed phase colunm C18 (250X4.6 mm, 5 micron) and a binary mobile phase of ammonium acetate/trietilamine 0.025 M pH 4.2 and acetonitrile (80:20, v/v), flow rate 1 mL/min, ultraviolet detector, λ=274nm isocratic elution system. Validation of confidence limits presented 0.1 µg/mL sensitivity (LD) and lower limit of quantification (LLOQ) of 0.20 µg/mL, linearity in the range 0.2 µg/mL to 200 µg/mL and 4.37% e 2.95% for intra- / interday precisions, respectively. Good accuracy (98.75%) and high selectivity were obtained. The study protocol for antibiotic prophylaxis of surgical infections was designed for ten patients with indication of elective cardiac surgery of myocardial revascularization with cardiopulmonary bypass. Loading dose of 1.5 g followed by maintenance dose of 0.75 g every six hours by IV boluses were applied and plasma drug monitoring was done. Based on data obtained cefuroxime plasma concentrations at time dose interval were lower than 16 µg/mL (4x MIC) at the trough, consequently it is recommended to increase the maintainance dose from 0.75 g 6/6 h up to 1.5 g 6/6h, to reach the minimum required for the antibiotic prophylaxis of cardiac surgeries.

Copaifera langsdorffii (Fabaceae, Caesalpinioideae), conhecida popularmente como \"copaíba\", \"copaibeira\" ou \"pau d\'óleo\", é uma árvore de grande porte que se encontra amplamente distribuída pelo Brasil, desde a floresta amazônica até a vegetação do cerrado. A oleorresina, constituída principalmente por sesquiterpenos e diterpenos, é utilizada na medicina popular no tratamento de desordens infecciosas e inflamatórias. Por outro lado, estudos sobre suas folhas, as quais são constituídas majoritariamente por flavonoides e derivados galoilquínicos, são escassos. Assim, foi proposto o isolamento de marcadores químicos, desenvolvimento e validação de método analítico por CLAE-UV-DAD, bem como o estudo sazonal. O extrato bruto obtido das folhas foi particionado com solventes de polaridade crescente: diclorometano, acetato de etila e n-butanol. As frações em n-butanol e aquosa apresentaram, majoritariamente, compostos polares, dentre os quais se destacaram os derivados galoilquínicos. Para isolamento desses compostos utilizaram-se a cromatografia de permeação em gel de Sephadex LH-20 e a cromatografia líquida de alta eficiência preparativa. Nas análises por CLAE-UV-DAD empregou-se coluna analítica Synergi Polar-RP (100 mm x 3,0 mm, 2,5 ?m) e fase móvel composta por ácido fórmico-água (0,1:99,9, solvente A) e isopropanol- metanol-acetonitrila (0,5:4:6, solvente B). O gradiente de eluição foi A:B (90:10 para 85:15) em 8,33 minutos, seguido por A:B (85:15 para 64:36) até 29,17 minutos, utilizando vazão de 0,68 mL/min. Os estudos de sazonalidade foram realizados com 10 acessos de C. langsdorffii cultivados no Sítio Beija-Flor (Cajuru/SP). A partir da fração aquosa foram isolados e identificados 16 derivados galoilquínicos: ácido 5\'-O-metil-3-Ogaloilquínico (AGQ-1), ácido 5\'\'-O-metil-3,4-di-O-galoilquínico (AGQ-2), ácido 5\',5\'\'-di-Ometil- 3,4-di-O-galoilquínico (AGQ-3), ácido 3,4-di-O-galoilquínico (AGQ-4), ácido 5\'\'-Ometil- 3,5-di-O-galoilquínico (AGQ-5), ácido 5\'-O-metil-3,5-di-O-galoilquínico (AGQ-6), ácido 5\'-O-metil-3,4-di-O-galoilquínico (AGQ-7), ácido 5\',5\'\'-di-O-metil-3,5-di-Ogaloilquínico (AGQ-8), ácido 5\',5\'\'-di-O-metil-4,5-di-O-galoilquínico (AGQ-9), ácido 3,5-di- O-galoilquínico (AGQ-10), ácido 4,5-di-O-galoilquínico (AGQ-11), ácido 5\'-O-metil-4,5-di- O-galoilquínico (AGQ-12), ácido 5\'\'-O-metil-4,5-di-O-galoilquínico (AGQ-13), ácido 3,4,5- tri-O-galoilquínico (AGQ-14), ácido 5\'\'-O-metil-3,4,5-tri-O-galoilquínico (AGQ-15), ácido 5\',5\'\',5\'\'\'-tri-O-metil-3,4,5-tri-O-galoilquínico (AGQ-16). Além disso, por meio das análises realizadas por CLAE-EM foi possível constatar a presença de outros 10 derivados galoilquínicos: ácido 3-O-galoilquínico, ácido 4-O-galoilquínico, ácido 5-O-galoilquínico, ácido 5\'-O-metil-4-O-galoilquínico, ácido 5\'-O-metil-5-O-galoilquínico, ácido 5\'-O-metil- 3,4,5-tri-O-galoilquínico, ácido 5\'\'\'-O-metil-3,4,5-tri-O-galoilquínico, ácido 5\',5\'\'-di-Ometil- 3,4,5-tri-O-galoilquínico, ácido 5\',5\'\'\'-di-O-metil-3,4,5-tri-O-galoilquínico, ácido 5\'\',5\'\'\'-di-O-metil-3,4,5-tri-O-galoilquínico. O método analítico mostrou-se adequado para quantificação de nove derivados galoilquínicos (AGQ-1, AGQ-5, AGQ-6, AGQ-7, AGQ-8, AGQ-9, AGQ-10, AGQ-15, AGQ-16) e dois flavonoides, quercitrina e afzelina, frente aos parâmetros seletividade, linearidade, sensibilidade, precisão e exatidão. Por meio de análise estatística multivariada dos estudos sazonais concluiu-se que os acessos apresentaram perfis químicos qualitativos e quantitativos semelhantes nas coletas isoladas e perfis quantitativos diferentes ao longo dos meses. / Copaifera langsdorffii (Fabaceae, Caesalpinioideae), popularly known as \"copaíba\", \"copaibeira\" or \"pau d\'oleo\", is a large tree widely distributed in Brazil, from Amazon rainforest to savannah vegetation. Its oleoresin, composed mainly of sesquiterpenes and diterpenes, is widely used in folk medicine to treat inflammatory and infectious disorders. On the other hand, studies about its leaves, composed mainly of flavonoids and galloylquinic acid derivatives, are scarce. Therefore, it was proposed to isolate leaves major compounds, to develop and validate an analytical method by HPLC-UV-DAD, as well as to udertake seasonal studies. The crude extract of the leaves was partitioned with solvents of increasing polarity: dichloromethane, ethyl acetate and n-buthanol, in sequence. Chemical profiles of n-buthanol and aqueous fractions showed to be composed of polar compounds, especially galloylquinic acid derivatives. These compounds were isolated by gel permeation chromatography using Sephadex LH-20 and preparative high-performance liquid chromatography. The HPLC-UV-DAD analyses were carried out on a Synergi Polar-RP (100 x 3.0 mm, 2.5 ?m) column. The mobile phase was made up of formic acid-water (0.1:99.9, solvent A), and isopropanol-methanol-acetonitrile (0.5:4:6, solvent B). The elution gradient was A:B (90:10 to 85:15) in 8.33 minutes, followed by A:B (85:15 to 64:36) up to 29.17 minutes using a flow rate of 0.68 mL/ min. The seasonal studies were performed from 10 C. langsdorffii accesses grown on Beija-Flor farm (Cajuru/SP). From the aqueous fraction it was isolated and identified 16 galloylquinic acid derivatives: 5\'-O-methyl-3-Ogalloylquinic acid (GQA-1), 5\'\'-O-methyl-3,4-di-O-galloylquinic acid (GQA-2), 5\',5\'\'-di-Omethyl- 3,4-di-O-galloylquinic acid (GQA-3), 3,4-di-O-galloylquinic acid (GQA-4), 5\'\'-Omethyl- 3,5-di-O-galloylquinic acid (AGQ-5), 5\'-O-methyl-3,5-di-O-galloylquinic acid (GQA-6), 5\'-O-methyl-3,4-di-O-galloylquinic acid (AGQ-7), 5\',5\'\'-di-O-methyl-3,5-di-Ogalloylquinic acid (GQA-8), 5\',5\'\'-di-O-methyl-4,5-di-O-galloylquinic acid (GQA-9), 3,5-di- O-galloylquinic acid (GQA-10), 4,5-di-O-galloylquinic acid (GQA-11), 5\'-O-methyl-4,5-di- O-galloylquinic acid (GQA-12), 5\'\'-O-methyl-4,5-di-O-galloylquinic acid (GQA-13), 3,4,5- tri-O-galloylquinic acid (GQA-14), 5\'\'-O-methyl-3,4,5-tri-O-galloylquinic acid (GQA-15), 5\',5\'\',5\'\'\'-tri-O-methyl-3,4,5-tri-O-galloylquinic acid (GQA-16). Furthermore, through HPLC-MS analysis it was identified additional 10 galloylquinic acid derivatives: 3-Ogalloylquinic acid, 4-O-galloylquinic acid, 5-O-galloylquinic acid, 5\'-O-methyl-4-Ogalloylquinic acid, 5\'-O-methyl-5-O-galloylquinic acid, 5\'-O-methyl-3,4,5-tri-Ogalloylquinic acid, 5\'\'\'-O-methyl-3,4,5-tri-O-galloylquinic acid, 5\',5\'\'-di-O-methyl-3,4,5-tri- O-galloylquinic acid, 5\',5\'\'\'-di-O-methyl-3,4,5-tri-O-galloylquinic acid, 5\'\',5\'\'\'-di-O-methyl- 3,4,5-tri-O- galloylquinic acid. The HPLC developed method was suitable to quantify nine galloylquinic derivatives (GQA-1, GQA-5, GQA-6, GQA-7, GQA-8, GQA-9, GQA-10, GQA-15, GQA-16) and two flavonoids, quercitrin and afzelin, related to the selectivity, linearity, sensitivity, precision and accuracy parameters. Through multivariate statistical analysis, it was possible to conclude that all ten diferrent populations of C. langsdorffii cultivated displayed similar qualitative and quantitative chemical profiles among isolated months and different quantitative profiles among different months.

Medidas de transmitância em óculos de sol fazem parte de alguns dos testes propostos pela norma NBR15111, porém, observou-se que não há no país um sistema preciso para medidas de transmitância que não seja com o uso de espectrofotômetros e pessoas qualificadas para utilizar o equipamento, aplicar as funções de ponderação e fornecer laudos técnicos sobre a lente testada. Assim, o trabalho propõe métodos que utilize componentes simples e resulte na construção de um equipamento que possa fornecer a informação sobre as transmitâncias dos filtros de óculos de sol de forma automática, de acordo com a NBR15111. Foi feita a espectrofotometria de 45 lentes de óculos de uso geral, e calculadas suas respectivas transmitâncias (luminosa, ultravioleta, semafórica), como amostras de comparação com as metodologias testadas. Os testes incluíram lâmpadas e LEDs como fontes de emissão para a região do espectro visível e lâmpadas fluorescentes para a região ultravioleta, além de sensores específicos para cada região espectral, e eletrônica de controle e aquisição dos sinais. Foram usadas ferramentas de análise estatística, como erro RMS, coeficiente de aderência (GFC) e análise de Bland-Altman. Aproximadamente 62% dos óculos testados foram reprovados para a direção no trânsito e nenhum foi reprovado para a proteção UV. Os métodos RMS e GFC apontaram combinações entre fonte e sensor que conseguem fazer a ponderação com os menores desvios-padrão das medidas espectrométricas. O sistema para teste UV mostrou melhoria significativa em relação aos desenvolvidos anteriormente, com um desvio padrão de 4,45 pontos percentuais e o sistema para testes na região visível utilizou o sensor TCS, no qual a regressão polinomial mostrou melhores resultados que as redes neurais artificiais, com os menores limites de concordância para as transmitâncias. Um número maior de amostras pode melhorar os métodos para que se obtenha uma aproximação ideal para todos os óculos de sol. Uma montagem com LEDs se apresenta como uma alternativa interessante quanto ao custo, tamanho e baixo consumo para medidores de transmitância portáteis. Desenvolveu-se um sistema com módulos para teste UV, Visível e Semafórico, para uso público no campus da USP de São Carlos, proporcionando conscientização e extensão dos estudos em relação aos óculos solares, contribuindo efetivamente com a população brasileira. / Transmittance measurements in sunglasses are a part of the standard tests proposed by NBR15111, however, it was observed that there is no accurate system for measuring transmittance different than using spectrophotometers and skilled practitioner to manage the equipment, apply the weighting functions and provide technical reports on the lens tested. Therefore, this study proposes methodologies using simple components and that can result a device that can provide information about sunglass filters automatically, according to NBR15111. Spectrophotometry was calculated in 45 lenses of sunglasses for general use, and their respective transmittance (visible, ultraviolet, traffic light), used as samples for testing the methodologies. The tests included lamps and LEDs as light sources for the visible region spectrum and fluorescent lamps for ultraviolet region, specific sensors for each spectral region, and electronic for control and signal acquisition. Statistical analysis tools were used, such as RMS error, goodness-of-fit coefficient (GFC) and the Bland - Altman analysis. Approximately 62% of the tested lenses failed in the test for signal light recognition and none has failed for UV protection. The RMS and GFC methods indicated combinations between source and sensor that calculated transmittance with the lowest standard deviations of the spectrometric measurements. The system for testing UV showed improvement compared to other previously equipment, with a standard deviation of 4.45 and the system for testing the visible region used the TCS sensor, in which the polynomial regression showed better results than artificial neural networks. A larger number of samples can improve the methods in order to obtain an optimal calibration that includes all sunglasses. LEDs seem to be a good alternative in terms of cost, size and low power consumption for portable transmittance meters. We developed a system with modules for testing UV, Visible and Traffic Light transmittance for public use on the USP São Carlos campus, providing awareness and extent of studies about the sunglasses, in order to contribute more effectively to the Brazilian population.

A luz solar apresenta ondas eletromagnéticas em ampla faixa espectral, incluindo as regiões do ultravioleta (UV-C, UV-B, UV-A), visível e infravermelho. Cada região interage com a pele de forma dependente da fotofísica e da fotoquímica dos seus respectivos compostos absorvedores. A luz UV-A causa a geração de espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio (EROs e ERNs) através da fotossensibilização de moléculas endógenas (co-enzimas de flavina, porfirinas, melaninas). Quando fotossensibilizadores produzem quantidades de EROs e ERNs maiores do que a capacidade celular de supressão destas espécies, caracteriza-se um quadro de desbalanço redox, que causa lesão em biomoléculas como os ácidos nucleicos, lipídeos e as proteínas. Essas lesões podem levar à morte celular ou a outras transformações fenotípicas e genotípicas e também estimulam a liberação de citocinas pró-inflamatórias. Com a finalidade de melhor compreender a dinâmica dos mecanismos de resposta celular após exposição ao UV-A e ao visível, nós caracterizamos inicialmente as propriedades fotofísicas da melanina e detectamos a produção de oxigênio singlete (1O2) pela fotossensibilização no visível e a supressão desta espécie excitada pela reação do oxigênio singlete com a dupla ligação reativa dos grupos indóis presentes na melanina. Estes processos também foram observados no cabelo e levaram-nos a propor um modelo que explica o efeito da luz visível na estrutura e cor dos cabelos. Demonstramos também que a feomelanina produz mais (30%) 1O2 do que a eumelanina, que sofre maior modificação na sua estrutura por fotodegradação. O efeito destes processos na pele foi estudado a nível celular. Demonstramos que células epiteliais com maior teor de melanina apresentaram maior geração de 1O2 que causa lesão no DNA e morte necro-apoptótica após irradiação com luz visível. A foto-oxidação da melanina pela luz visível nos motivou a estudar um pigmento que fosse foto-protetor não somente contra luz UV-B mas também contra luz visível. A pigmentação com Acetil-Tirosina se mostrou atóxica e protetora contra luz UV-B e visível ao contrário do pigmento com tirosina, que se mostrou protetor do UV-B mas tóxico no visível. Este efeito foi relacionado com a localização celular do polímero e não com a estrutura do mesmo. A luz UV-A, por sua vez, promove o acúmulo de lipofuscina dentro dos vacúolos autofágicos de queratinócitos da pele e que também ativa a fototoxicidade pela luz visível. A lipofuscina dentro dos vacúolos autofágicos é foto-oxidada pela luz visível, causando lesão no DNA e morte celular programada tipo II. Doses UV-A que desencadeiam a liberação de citocinas também foram caracterizados. / Sunlight presents electromagnetic radiation over a wide spectral range, including the regions of ultraviolet (UV-C, UV-B, UV-A), visible and infrared. Each region interacts with skin dependending on the photophysics and photochemistry of the respective absorbing compounds. UV-A light causes the generation of reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS) by photosensitization of endogenous molecules (flavin coenzymes, porphyrins, melanins). When photosensitizers produce amounts of ROS and RNS larger than the cell capacity to suppress these species, a set of redox imbalance, which damages biomolecules such as nucleic acids, lipids and proteins. This damage cause cell death and to other phenotypic and genotypic changes and also stimulates the release of proinflammatory cytokines. In order to better understand the dynamics of the mechanisms of cellular responses after exposure to UV-A and visible light, we initially characterized the photophysical properties of melanin and detected the production of singlet oxygen (1O2) by photosensitization in the visible, as well as the suppression of these excited species by reaction of singlet oxygen with the double bonds of the reactive groups presented in the melanin indols. These processes were also observed in hair and led us to propose a model that explains the effects of visible light on the structure and color of hair. We also demonstrated that pheomelanin produces more (30%) 1O2 than eumelanin, which undergoes a quick change on its structure by photodegradation. The effect of these processes in the skin was studied at the cellular level. We demonstrated that epithelial cells with larger melanin content have stronger generation of 1O2, which causes DNA damage and necro-apoptotic death after irradiation with visible light. The photo-oxidation of melanin by visible light has motivated us to study a pigment that was not only able to protect against UV-B but also against visible. Pigmentation with Acetyl-Tyrosine proved nontoxic and protective against UV-B and visible light instead of pigmentation with Tyrosine, which shielded against UV-B but showed toxicity in the visible. This effect was associated with the polymer, cell location and not with its structure. UV-A light, in turn, promotes the accumulation of lipofuscin, within autophagic vacuoles of keratinocytes also enabling phototoxicity in the visible light. The lipofuscin within the autophagic vacuoles is fotooxidized by visible light, causing DNA damage and programmed cell death type II. Linear dose of UV-A that trigger the release of cytokines were also characterized.

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-07-04T14:43:46Z No. of bitstreams: 1 alinecorrearibeiro.pdf: 2333411 bytes, checksum: 7c0df6693f47a6872d99460a06bc865b (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-07-06T14:24:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 alinecorrearibeiro.pdf: 2333411 bytes, checksum: 7c0df6693f47a6872d99460a06bc865b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-06T14:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alinecorrearibeiro.pdf: 2333411 bytes, checksum: 7c0df6693f47a6872d99460a06bc865b (MD5) Previous issue date: 2017-08-29 / Devido à importância que o sistema imune desempenha na doença de Crohn (DC), as tiopurinas são os imunomoduladores mais indicados na terapia. Entretanto, as tiopurinas, como a Azatioprina (AZA) e seus metabólitos intraeritrocitários, levam a uma série de reações adversas ou falha terapêutica, podendo ocasionar em não adesão ou abandono da terapia. A conversão da AZA para os nucleotídeos ativos de 6-tioguanina (6-TGN) é necessária para a eficácia clínica, entretanto, outro metabólito, a 6-metilmercaptopurina (6-MMP), é formado através de uma via concorrente pela tiopurina metil transferase e está relacionado à hepatotoxicidade. Devido à ampla variabilidade interindividual da tiopurina metil transferase e a uma faixa terapêutica estreita, torna-se importante a realização do monitoramento terapêutico do metabólito ativo 6-TGN e da 6-MMP. Neste trabalho, um método cromatográfico (CLAE/HPLC-UV) foi desenvolvido e validado para a quantificação dos metabólitos nos eritrócitos, envolvendo um procedimento de tratamento simples baseado na desproteinização por ácido perclórico seguido de hidrólise ácida e aquecimento para a conversão dos metabólitos em suas respectivas bases livres. A cromatografia foi realizada em coluna C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm). A fase móvel consistiu em mistura de solução tampão fosfato de potássio (0,02 mol/L, pH = 3), acetonitrila e metanol, eluição por gradiente, num fluxo de 1,0 mL/minuto, com detecção de UV em 291 ηm e 342 ηm. Os tempos de retenção foram de 6,2 min (6-TGN); 23,1 min (6-MMP) e 24,7 min (cafeína: padrão interno). A resposta do detector foi linear na concentração de 0,89-29,91 μmol/L (r=0,999) para 6-TGN e entre 0,90-30,08 μmol/L (r=0,999) para 6-MMP. Os limites de detecção foram de 0,29 μmol/L e 0,30 μmol/L e os limites de quantificação foram de 0,89 μmol/L e 0,90 μmol/L, para 6-TGN e 6-MMP respectivamente. As médias das recuperações de 87,9% para 6-TGN e 91,9% para 6-MMP. Os CV da repetibilidade, de 5,48 e 10,48% (intradia) e 9,23 e 10,48% (interdia), enquanto os EPR da reprodutibilidade de 11,36 e 9,85% (intradia) e 10,48 e 7,32% (interdia) para 6-TGN e 6-MMP, respectivamente. As concentrações de 6-TGN e 6-MMP foram determinadas para todos os pacientes do estudo e os resultados encontrados variaram de 4,51 a 1515,27 ρmol/8 x 10⁸ eritrócitos para a 6-TGN e de 169,98 a 53951,53 ρmol/8 x 10⁸ eritrócitos para a 6-MMP. Observou-se uma correlação entre os pacientes em terapia combinada AZA e alopurinol e a diminuição da dosagem de AZA, consequentemente a diminuição significativa dos níveis de 6-MMP (2030,71 ρmol/8 x 10⁸ eritrócitos) em comparação com o grupo de pacientes sob monoterapia (9098,43 ρmol/8 x 10⁸ eritrócitos). Um outro achado foi a diminuição estatisticamente significativa da transaminase TGO/AST (25,03 + 18,62 U/L) no grupo de pacientes que apresentavam a doença em atividade, com os níveis de 6-TGN a 540,51 ρmol/8 x 10⁸ eritrócitos e de 6-MMP a 7952,32 ρmol/8 x 10⁸ eritrócitos, semelhante a relatos anteriores da literatura. O método proposto de quantificação por CLAE-UV mostrou-se preciso, exato e reprodutível, podendo ser utilizado como uma importante ferramenta na rotina de monitorização terapêutica de pacientes com DC, permitindo a individualização da dose, o acompanhamento dos efeitos adversos relacionados com a terapia farmacológica, o monitoramento da adesão ao tratamento e a avaliação da evolução clínica do paciente. / The conversion of azathioprine (AZA) to active nucleotides of 6-thioguanine (6-TGN) is essential for clinical efficacy in Crohn's disease. However, other metabolite, 6-methylmercaptopurine (6-MMP), which is formed through a competitive pathway for thiopurine methyltransferase (TPMT), is related to hepatotoxicity of this drug. Due to the wide interindividual variability of TPMT and a narrow therapeutic range it is important to accomplish the therapeutic monitoring of active metabolite 6-TGN and 6-MMP, which is an unusual procedure in Brazil. In this study, a HPLC-UV method for simultaneous quantification of these metabolites was developed, validated and applied in 37 Crohn's disease patients. The chromatographic process was performed on C18 column (250 x 4.6 mm, 5 μm i.d.), mobile phase consisted of potassium phosphate buffer (0.02 mol/L, pH = 3), acetonitrile and methanol, flow rate at 1.0 ml/min and UV detection at 291 ηm and 342 ηm. Retention times were 6.2 min (6-TGN); 23.1 min (6-MMP) and 24.7 min (caffeine: internal standard). The detector response was linear at 0.89-29.91 μmol/L (r=0.999) for 6-TGN and 0.90-30.08 μmol/L (r=0.999) for 6-MMP. Limits of detection were 0.29 μmol/L and 0.30 μmol/L, while the quantification limits were 0.89 μmol/L and 0.90 μmol/L, for 6-TGN and 6-MMP respectively. Precision, accuracy and recovery, were according FDA and ANVISA guidelines. The concentrations of 6-TGN and 6-MMP were determined in patients’ blood and the results found ranged from 4.51 to 1515 ρmol/8 x 10⁸ erythrocytes for 6-TGN and from 169.98 to 53.951 ρmol/8 x 10⁸ erythrocytes for 6-MMP. It was observed a reduction of levels of 6-MMP in patients using AZA + allopurinol therapy (2030.7 ρmol/8 x 10⁸ erythrocytes) when compared with patients undergoing monotherapy (9098.43 ρmol/8 x 10⁸ erythrocytes). Another finding was the correlation between the decrease in GOT transaminase in the group of patients who had the active disease with the increase in the 6-TGN levels, similar to previous reports in the literature. These results indicate that the method developed was reliable, accurate and reproducible, and can be used as an important tool in the routine monitoring of patients with Crohn's disease, allowing the individualization of the dose, the monitoring of the adverse effects related to the pharmacological therapy, monitoring the adherence to the treatment and the evaluation of the clinical evolution of these patients.

Apesar de ser bem conhecido que a radiação ultravioleta (UV) causa danos na pele, já foram descritos alguns efeitos benéficos desta radiação, como por exemplo a sensação de bem estar proporcionado pela exposição a luz. Na pele, o triptofano (Trp) é metabolizado a compostos biologicamente ativos, e acredita-se que a síntese de serotonina (SER), um dos metabólitos do Trp, na fototerapia seja parte dos mecanismos de remissão da depressão de pacientes com desordem de humor sazonal. Ainda, a radiação UV induz diretamente a expressão e atividade de TDO, enzima que catalisa a transformação de Trp em quinurenina (KYN), em bactérias, efeito que ainda não havia sido estudado em células humanas. Com isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a habilidade da radiação UV-A em modular a expressão de enzimas envolvidas nas rotas catabólicas do Trp em melanócitos e melanomas. Para isso foi realizada a padronização das condições de radiação UV-A através de ensaio de viabilidade celular, e então definimos condições que não levaram a morte das células (1,5 J/cm2 para melanócitos e 3 e 6 J/cm2 para melanomas). A radiação UV-A aumentou a expressão de IDO e TDO nos melanomas, enzimas que favorecem a progressão tumoral, e não só essas enzimas, houve aumento da expressão de KYNU e KMO, que também estão envolvidas na progressão tumoral. Além disso, a expressão de AANAT e HIOMT, responsáveis pela produção de melatonina (MLT), foi maior nos melanomas após 48 horas da radiação, enquanto a enzima INMT teve sua expressão aumentada em todos os tempos. O aumento de INMT em melanomas é muito interessante e podemos relacionar ao bem estar proporcionado pela exposição à luz, já que o produto dessa enzima, DMT, é conhecido por proporcionar essa sensação, porém o aumento observado na expressão de IDO e TDO em melanomas, indica um efeito nocivo da luz associado a produção de moléculas que estão fortemente ligadas aos processos de progressão e imunoescape tumoral. Os melanócitos parecem possuir menor susceptibilidade a radiação UV-A, pois as únicas enzimas que tiveram expressão aumentada após a radiação foram a KMO e a TPH1, e apesar da enzima TPH1 ter a expressão aumentada, esse aumento foi modesto o que nos levou a pensar que outras células da pele possam ter um papel mais relevante na produção de SER ou então outras condições de radiação. / Although it is well known that ultraviolet (UV) radiation causes skin damage, it was already described some benefits to this radiation, for instance the well-being feelings provided by light exposure. In the skin, tryptophan (Trp) is metabolized to biologically active compounds, and it is believed that the synthesis of serotonin, one of tryptophan metabolites, in phototherapy is part of mechanisms of remission of depression in patients with seasonal mood disorder. Moreover, in bacteria the UV radiation directly induces the expression and activity of TDO, the enzyme that catalyzes the metabolization of Trp to kynurenine (KYN). This effect has not been studied in human cells yet. Therefore, the objective of this work was to evaluate if UV-A radiation modulates the expression of enzymes involved in melanocytes and melanoma Trp metabolism. For this aim, we standardized the UV-A radiation conditions through cell viability assay, and then we defined the better conditions to avoid cell death (1,5 J/cm2 to melanocytes and 3 and 6 J/cm2 to melanomas). The UV-A radiation increased the expression of IDO and TDO in melanomas, enzymes that contribute to tumor immune- escape. The expression of KYNU and KMO also increased, and these enzymes are also involved with some types of tumors progression. Furthermore, the expression of AANAT and HIOMT, responsible for melatonin (MLT) production, was higher in melanomas after 48 hours of radiation while INMT had an increased expression at all times. The increase of INMT by melanomas is very interesting and can be related to the well being provided by exposure to light, since the product of this enzyme, DMT, is known to provide this sensation. However, the observed increased of expression of IDO and TDO in melanomas indicates a harmful effect of light associated with the production of molecules linked to tumor progression and immune-escape processes. The melanocytes appear to be less susceptible to UV-A radiation, because only the enzymes KMO and TPH1 had their expression increased after radiation, and for TPH1 this effect was relatively small. Thus, we believe that other skin cells may have a more relevant role in SER production or other radiation conditions.

Dans les expériences modélisant la photosynthèse, une bonne dispersion des molécules de chlorophylle est requise. Afin d'obtenir cette bonne dispersion, une solution consiste à les ancrer à un hôte. Dans cette étude, des nouveaux matériaux hybrides sont synthétisés en utilisant des hydrotalcites et un dérivé de la chlorophylle : la chlorophylline. La chlorophylline est incorporée et dispersée dans les hydrotalcites par co-précipitation ou pendant la reconstruction des hydrotalcites. Dans cette thèse est également discuté l'effet d'une irradiation par micro-onde. Dans tous les cas sont obtenus des matériaux stables, où les molécules de chlorophylline sont isolées et liées aux hydrotaltices par des liaisons avec les groupes hydroxy OH. Dans ce travail, de nouveaux matériaux sont synthétisés en utilisant les hydrotalcites et la chlorophylle a. Dans ce cas là, il est mis en valeur que la stabilisation de la chlorophylle a peut dépendre du support, à la fois par la nature et le rapport des métaux constituants les hydrotalcites. Ces matériaux hybrides obtenus (chlorophylle a/hydrotalcites) sont également stables. Ces matériaux ont été testés par lixiviation à l'acétone. Dans tous les cas, les composés lixiviés sont de la chlorophylle a, montrant ainsi que la nature et la composition des molécules sont préservées même après trente jours, bien qu'il soit à noter que dans le cas des hydrotalcites Ni/Al une faible fraction de la chlorophylle est décomposée en phéophytine. Finalement, bien que les hydrotalcites soient des composés relativement simples, ils s'avèrent tout à fait adaptés pour empêcher la dégradation des molécules de chlorophylle. / In experiments modeling photosynthesis, well dispersed chlorophyll molecules are required. A solution could be to anchor them on some host. In this work, new hybrid materials are synthesized using hydrotalcite and a chlorophyll derivative : chlorophyllin. Chlorophyllin is incorporated and dispersed in hydrotalcite through simultaneous precipitation or during hydrotalcite reconstruction. The effect of microwave irradiation on the crystallization step is discussed. In all cases stable materials are obtained, chlorophyllin molecules are isolated and bonded through hydrotalcite OH groups. Also new hybrid materials are synthesized using hydrotalcites and chlorophyll a. The effect of the support composition on chlorophyll a stabilization is discussed. The stability of the adsorbed chlorophyll a is affected by the support nature and the metal ratio of the hydrotalcite. The obtained hybrid compounds (chlorophyll a on hydrotalcite) are stable. Those hybrids were tested in lixiviation with acetone. In all cases, the lixiviated compound was chlorophyll a showing that the composition and nature of the molecule was preserved even after thirty days, although Ni/Al hydrotalcites decomposed a small fraction of the chlorophyll to pheophytin. Hydrotalcites being basic compounds turn out to be an adequate material to avoid degradation of chlorophyll molecules.

La contamination des vins par des microorganismes non désirés peut entraîner une dégradation importante du produit. Pour lutter contre ces problèmes, le dioxyde de souffre (SO2) est l’additif le plus utilisé actuellement pour ses propriétés antiseptiques et antioxydantes. Cependant, la limitation des intrants chimiques dans les vins est une des préoccupations majeures des consommateurs et producteurs. Les procédés de stabilisation physiques existants (flash pasteurisation, filtration tangentielle) présentent quant à eux des inconvénients, tels que leur cout énergétique ou leur maintenance complexe. Deux procédés innovants permettant d’assurer la stabilisation microbiologique des vins en alternative aux procédés classiques sont étudiés : le rayonnement ultraviolet (UV-C) et le chauffage ohmique. Les rayonnements UV-C (100 à 280 nm) sont connus pour leur effet germicide et déjà appliqués dans le traitement de l’eau et des surfaces. Cependant les liquides absorbants, tels que le vin, limitent fortement la profondeur de pénétration du rayonnement et donc l’efficacité du procédé. Un réacteur UV-C hélicoïdal a été développé, basé sur les propriétés hydrodynamiques des vortex de Dean, pour améliorer l’efficacité et l’homogénéité du traitement. Les performances de stabilisation ont été validées pour la première fois en alternative au mutage par SO2 de mouts liquoreux et avant la mise en bouteille de vins finis. De plus, les analyses chimiques et sensorielles menées sur les vins traités ne montrent aucun impact sur la qualité des vins. Le chauffage ohmique est ici utilisé comme procédé de stabilisation thermique des mouts et des vins. Lors du passage d’un courant à travers un matériau ayant une résistance électrique, l’énergie électrique est transformée en énergie thermique. La chaleur est alors générée à l’intérieur même de la matière à traiter. Les résultats des travaux ont montré pour la première fois que la rapidité et l’homogénéité de chauffe permettent une stabilisation efficace des vins et des mouts sans préjudices sur leur qualité. / Contamination of wines by undesired microorganisms may lead to significant deterioration of the final product. To combat these problems, sulfur dioxide (SO2) is the most widely used additive for its antiseptic and antioxidant properties. However, the limitation of chemical inputs in wines is one of the major concerns of consumers and producers. Existing physical stabilization processes (flash pasteurization, tangential filtration) have disadvantages, such as their energy cost or their complex maintenance. Two innovative processes to ensure the microbiological stabilization of wines as an alternative to conventional processes are studied: ultraviolet radiation (UV-C) and ohmic heating. UV-C radiation (100 to 280 nm) is known for its germicidal effect and already applied in the treatment of water and surfaces. However, absorbent liquids, such as wine, strongly limit the penetration depth of the radiation and hence the efficiency of the process. A helical UV-C reactor was developed, based on the hydrodynamic properties of Dean vortices, to improve the efficiency and homogeneity of the treatment. The stabilization performance was validated for the first time as an alternative to the SO2 mutage of sweet wines and before the bottling of finished wines. Moreover, the chemical and sensory analyzes carried out on the treated wines showed no impact on the quality of wines. Ohmic heating is used in this study as a method of thermal stabilization of musts and wines. During the passage of a current through a material having an electrical resistance, the electrical energy is transformed into thermal energy. The heat is then generated inside the material to be treated. The results of this work showed for the first time that heating rate and homogeneity of ohmic heating allow an effective stabilization of musts and wines without affecting their quality.

Les virus du papillome humain (HPV) sont des virus à ADN double-brin encapsidés appartenant à la famille des Papillomaviridae ayant un tropisme distinct pour les épithéliums squameux de type muqueux ou cutanés. Jusqu'à présent, plus de 200 types de HPV ont été isolés et regroupés dans un arbre phylogénétique composé de 5 genres nommés alpha, beta, gamma, mu et nu. Parmi eux, les types HPV muqueux à haut risque appartenant au genre alpha ont été associés au cancer du col de l'utérus ainsi qu'à des sous-groupes de carcinomes ano-génitaux et de la tête et du cou. Ces virus sont responsables d'environ 5% de tous les cancers viro-induits. Les types bêta du HPV ont un tropisme pour la peau et pourraient être impliqués dans le développement du cancer de la peau non mélanique (NMSC), en association avec la lumière ultraviolette (UV). Ainsi, les modèles expérimentaux in vitro et in vivo ont démontré les propriétés de transformation des oncoprotéines E6 et E7 du type HPV bêta 38. De plus, des études sur le modèle de souris transgénique, où E6 et E7 du HPV38 sont exprimés au niveau de la couche basale non différenciée de l'épithélium sous le contrôle du promoteur du gène humain de la kératine (K14), ont montré une très forte susceptibilité de la peau à la carcinogenèse induite par les UV par rapport aux animaux de type sauvage. Tout aussi important que leur capacité à promouvoir la transformation cellulaire, les virus oncogènes ont développé différentes stratégies pour prendre le dessus sur le système immunitaire de l'hôte, favorisant ainsi l'établissement d'une infection persistante. Par conséquent, savoir si des virus oncogènes potentiels ont la capacité d'interférer avec la réponse immunitaire pourrait fournir des preuves supplémentaires de leur implication dans la cancérogenèse humaine. Ici, nous montrons que les oncoprotéines E6 et E7 de HPV38 suppriment l'expression de Tolllike 9 (TLR9), récepteur des ADN double-brins, en favorisant l'accumulation de ΔNp73α, un antagoniste de p53 et p73. Des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine ont montré que ΔNp73α fait partie d'un complexe de régulation négative transcriptionnelle qui se lie à un élément de réponse NF-kappaB dans le promoteur TLR9. Fait intéressant, l'expression ectopique de TLR9 dans des cellules HPV38 E6E7 a entraîné une accumulation des inhibiteurs du cycle cellulaire p21WAF1/Cip1 et p27kip1, une réduction de l'activité kinase associée à CDK2 et l'inhibition de la prolifération cellulaire. Ensemble, ces données indiquent que TLR9 est impliqué dans d'autres événements, en plus de la réponse immunitaire innée. Par conséquent, nous avons constaté que le traitement des kératinocytes humains primaires (HPK) avec différents stress cellulaires, par exemple l'irradiation aux UV, la doxorubicine et le traitement H2O2, conduisent à une induction de la transcription de TLR9. Cet évènement induit par les UV est arbitré par le recrutement de plusieurs facteurs de transcription sur le promoteur TLR9, tels que p53, NF-kappaB p65 et c-Jun. L'expression de E6 et E7 de HPV38 affecte fortement le recrutement de ces facteurs de transcription sur le promoteur TLR9, avec comme conséquence l'affaiblissement de l'expression du gène TLR9. En résumé, nos données montrent que HPV38, de manière similaire à d'autres virus avec une activité oncogénique bien connue, peut inhiber 'expression de TLR9. Plus important encore, nous mettons en évidence une nouvelle fonction de TLR9 dans le contrôle de la réponse cellulaire aux stress et nous montrons que E6 et E7 de HPV38 sont capables d'interférer avec un tel mécanisme. Ces résultats confirment le rôle des types HPV bêta dans la carcinogenèse de la peau, en fournissant des informations supplémentaires sur leur contribution précise dans le processus multi-étapes de développement du cancer / The human papillomaviruses (HPV) consist of a group of capsid-enclosed double-stranded deoxyribonucleic acid (dsDNA) viruses from the Papillomaviridae family that display a distinct tropism for mucosal or cutaneous squamous epithelia. Until now, more than 200 types of HPV have been isolated and grouped into a phylogenetic tree composed of 5 genera (alpha, beta, gamma, mu and nu papillomaviruses). Among them, the mucosal high-risk HPV types that belong to the genus alpha have been associated with cervical cancer as well as a subset of anogenital and head and neck carcinomas. They are responsible for approximately 5% of all virus-induced cancers. Beta HPV types have a skin tropism and have been suggested to be involved, together with ultraviolet light (UV), in the development of non-melanoma skin cancer (NMSC). For instance, in vitro and in vivo experimental models highlight the transforming properties of beta HPV38 E6 and E7. Specifically, studies of transgenic mouse model, where HPV38 E6 and E7 are expressed in the undifferentiated basal layer of epithelia under the control of the Keratin 14 (K14) promoter, showed a very high susceptibility to UV-induced skin carcinogenesis in comparison to the wild-type animals. Equally important as their ability to promote cellular transformation, oncogenic viruses have different strategies to overtake the host immune system thus guaranteeing persistent infection. Therefore, understanding whether potential oncogenic viruses have the ability to interfere with the immune response could provide additional evidence relating to their involvement in human carcinogenesis. Here, we show that the E6 and E7 oncoproteins from HPV38 suppress the expression of the dsDNA innate immune sensor Toll-like receptor 9 (TLR9) by promoting the accumulation of ΔNp73α, an antagonist of p53 and p73. Chromatin immunoprecipitation experiments showed that ΔNp73α is part of a negative transcriptional regulatory complex that binds to a NF-κB responsive element within the TLR9 promoter. Interestingly, ectopic expression of TLR9 in HPV38 E6E7 cells resulted in an accumulation of the cell cycle inhibitors p21WAF/Cip1 and p27Kip1, reduction of CDK2-associated kinase activity and inhibition of cellular proliferation. Together these data indicate that TLR9 is involved in additional events, besides the innate immune response. Accordingly, we observed that the treatment of human primary keratinocytes (HPKs) with different cellular stresses, e.g. UV irradiation, doxorubicin and H2O2 treatment, results in TLR9 up-regulation. This UVinduced event is mediated by the recruitment of several transcription factors to the TLR9 promoter, such as p53, NF-kB p65 and c-Jun. The expression of HPV38 E6 and E7 strongly affect the recruitment of these transcription factors to the TLR9 promoter, with consequent impairment of TLR9 gene expression. In summary, our data show that HPV38, similarly to other viruses with well-known oncogenic activity, can down-regulate TLR9. Most importantly, we highlight a novel function of TLR9 in controlling the cellular response to stresses and we show that HPV38 E6 and E7 are able to interfere with such mechanism. These findings further support the role of beta HPV types in skin carcinogenesis, providing additional insight into their precise contribution to the multistep process of cancer development