Submitted by Milena Rubi (milenarubi@ufscar.br) on 2017-08-16T16:46:54Z No. of bitstreams: 1 ANUNCIACAO_Eduardo_2017.pdf: 22889091 bytes, checksum: eaec97b1dbf9de44c126b87bb16c49c5 (MD5) / Approved for entry into archive by Milena Rubi (milenarubi@ufscar.br) on 2017-08-16T16:47:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ANUNCIACAO_Eduardo_2017.pdf: 22889091 bytes, checksum: eaec97b1dbf9de44c126b87bb16c49c5 (MD5) / Approved for entry into archive by Milena Rubi (milenarubi@ufscar.br) on 2017-08-16T16:47:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ANUNCIACAO_Eduardo_2017.pdf: 22889091 bytes, checksum: eaec97b1dbf9de44c126b87bb16c49c5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-16T16:47:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ANUNCIACAO_Eduardo_2017.pdf: 22889091 bytes, checksum: eaec97b1dbf9de44c126b87bb16c49c5 (MD5) Previous issue date: 2017-03-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Uric acid is an endogenous substance produced from the metabolism of purines. The concentration of serum uric acid in the human body considered normal is between 0.24 - 0.52 mmol.L-1 . High levels of uric acid in the body lead to a condition known as hyperuricemia. Therefore, the monitoring of uric acid in the body is of great importance. In this work we present amperometric biosensors based on the association of the enzyme UOx with platinum nanoparticles to detect uric acid. The technique used to assemble the films that compose the biosensor was the Layer-by-Layer (LbL). Two techniques were used for the synthesis of nanoparticles for the construction of two different film architectures. In the first architecture, the nanoparticles were deposited in situ on a polyethyleneimine (PEI) and sodium polyvinyl sulfate (PVS) film - by reducing hexachloroplatinic acid hexahydrate with sodium borohydride. The bilayers composed of (PEI/UOx)n were deposited on a film containing platinum nanoparticles deposited in situ. In the second architecture, the nanoparticles were synthesized by mixing PEI solution with hexachloroplatinic acid solution and sodium borohydride solution. This solution was deposited alternating with enzymatic solution. The amperometric analyses were performed at +0.347 V potential, with successive additions of 2 mmol.L-1 of uric acid in an electrochemical cell containing phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4. For the first architecture, the limit of detection found by the amperometric method was 5.17 µmol.L-1 with the linear detection range comprised in the range between 3.92 - 11.3 µmol.L-1 . For the second architecture, the limit of detection found by the amperometric method was 4.68 µmol.L-1 with a linear detection range between 14.18 - 55.56 µmol.L-1 . For the same architecture an using the differential pulse voltammetry method the values of limit of detection and linear detection range were 0.11 µmol.L-1 and particles / mL, respectively. The biosensors presented limits of detection close to the values found in the literature for other biosensor proving to be efficient for the detection of uric acid. / O ácido úrico é uma substância endógena produzida a partir do metabolismo das purinas. A concentração de ácido úrico sérico no organismo humano considerado normal é entre 0,24 - 0,52 mmol.L-1 . Altos níveis de ácido úrico no organismo levam a um quadro conhecido como hiperuricemia. Portanto, o monitoramento de ácido úrico no organismo é de grande importância. Neste trabalho apresentamos biossensores amperométricos baseados na associação da enzima UOx com nanopartículas de platina para detecção de ácido úrico. A técnica utilizada para a fabricação dos filmes que compõem o biossensor foi a Layer-by-Layer (LbL). Duas técnicas foram utilizadas para a síntese de nanopartículas para a construção de duas arquiteturas diferentes na construção dos filmes. Na primeira arquitetura, as nanopartículas foram depositadas in situ sobre um colchão de polieletrólitos – polietilenoimina (PEI) e polivinil sulfato de sódio (PVS) – pela redução do ácido hexacloroplatínico hexaidratado com boroidreto de sódio. As bicamadas compostas por (PEI/UOx)n foram depositadas sobre colchão contendo nanopartículas de platina depositadas in situ. Na segunda arquitetura, as nanopartículas foram sintetizadas misturando-se solução de PEI com solução de ácido hexacloroplatínico e solução de borohidreto de sódio. Esta solução foi depositada alternando-se com solução enzimática. As análises amperométricas foram realizadas em potencial +0,347 V, com adições sucessivas de ácido úrico de concentração 2 mmol.L-1 em uma célula eletroquímica contendo tampão fosfato salino (PBS) pH 7,4. Para a primeira arquitetura, o limite de detecção encontrado pelo método amperométrico foi de 5,17 µmol.L-1 com a faixa linear de detecção compreendido no intervalo entre 3,92 - 11,3 µmol.L-1 . Para a segunda arquitetura, o limite de detecção encontrado pelo método amperométrico foi de 4,68 µmol.L-1 com a faixa linear de detecção compreendido no intervalo entre 14,18 – 55,56 µmol.L-1 , e para o método DPV os valores de LD e faixa linear de detecção encontrados foram 0,11 µmol.L-1 e 1,8×10& ± 0,2×10& partículas/mL, respectivamente. Os biossensores apresentaram limites de detecção próximos aos valores encontrados na literatura, mostrando-se eficientes para detecção de ácido úrico.

Submitted by ANDRESSA TRECENTI DAMACENA null (dretrecenti@hotmail.com) on 2016-05-04T11:16:43Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Andressa - Repositório.pdf: 2946507 bytes, checksum: 9abbfaa6ae7910659e2f50cdfcba9757 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-05-04T20:44:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 damacena_at_me_bot.pdf: 2946507 bytes, checksum: 9abbfaa6ae7910659e2f50cdfcba9757 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-04T20:44:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 damacena_at_me_bot.pdf: 2946507 bytes, checksum: 9abbfaa6ae7910659e2f50cdfcba9757 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Introdução: Pré-eclâmpsia é uma síndrome sistêmica específica da gestação com etiopatogenia ainda não esclarecida, porém acredita -se ser decorrente de alterações no processo de invasão trofoblástica, com consequente inadequado suprimento sanguíneo uterino e estresse oxidativo do tecido placentário. O aumento da concentração de ácido úrico sérico materno (AU) em mulheres com pré-eclâmpsia tem sido associado com a gravidade da hipertensão, proteinúria e prognóstico materno e perinatal na gestação. Objetivos: Identificar a associação entre a concentração sérica de ácido úrico e resultados maternos e perinatais adversos e correlacionar a concentração sérica do ácido úrico materno com recémnascidos pequenos para idade gestacional e proteinúria materna. Sujeitos e Métodos: Foi realizado estudo retrospectivo, em gestantes com pré-eclâmpsia, as quais foram estratificadas de acordo com a dosagem de ácido úrico sérico em dois grupos: I (inferior a 6 mg/dL) e II (igual ou superior a 6 mg/dL) e avaliados resultados adversos maternos e perinatais. Resultados: No grupo II houve maior frequência de crise hipertensiva(25%), eclampsia(6,9%), síndrome HELPP parcial (7,8%) e síndrome HELLP(6,9%), maior número de recém-nascidos pequenos para idade gestacional(47%), menor peso do recém-nascido, maior porcentagem de óbito fetal(1,8%), de prematuridade(68%) e de índice de Apgar no 1º minuto(38%). Conclusões: Os resultados demonstram que as paciente com ácido úrico elevado apresentam piores resultados adversos tanto maternos quanto perinatais, sendo assim a dosagem de ácido úrico sérico materna associadas a outros exames clínicos e laboratoriais, pode auxiliar nos processos de decisão na prática obstétrica. / Introduction: Preeclampsia is a specific systemic disease of pregnancy with unknown etiology, but it is believed to be due to changes in the process of trophoblastic invasion, leading to an inadequate uterine blood supply and oxidative stress of the placental tissue. Increasing of maternal uric acid serum concentration (UA) in women with pre-eclampsia has been associated with the severity of hypertension, proteinuria and maternal and perinatal outcome on pregnancy. Objectives: Identify the association between serum uric acid and adverse maternal and perinatal outcomes. More specifically, the correlation of maternal UA serum concentration with newborn size for gestational age and maternal proteinuria. Subjects and Methods: Cross observational study in pregnant women with preeclampsia, which were stratified according to dose of serum uric acid into two groups, as follow: I (below 6 mg/dL) and II (greater or equal to 6 mg/dL). Maternal and perinatal adverse outcomes were examined. Results were analyzed by T - Student and chi-square tests and correlations were evaluated by Pearson test. The level of significance used was 5%. Results: In group II there were a greater frequency of hypertensive crisis, eclampsia, partial HELPP syndrome and HELLP syndrome. Also it were observed an increased number of small newborns for gestational age, lower weight of the newborn, the higher percentage of fetal death, prematurity and index Apgar at 1 minute. Conclusions: The results suggest that patients with higher uric acid have worse adverse outcomes both for maternal and perinatal. In conclusion, the dosage of maternal serum uric acid associated with other clinical and laboratory tests can help in the decision on obstetrical practice.

Submitted by Tony Rogerio de Lima Dadamos null (tonyrlrl@yahoo.com.br) on 2018-02-20T16:25:35Z No. of bitstreams: 1 Tese_AU_TRLD_2018.pdf: 2071412 bytes, checksum: ba59227c90cba94171f8548d07346f1a (MD5) / Approved for entry into archive by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br) on 2018-02-21T19:00:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dadamos_trl_dr_sjrp.pdf: 2071412 bytes, checksum: ba59227c90cba94171f8548d07346f1a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-21T19:00:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dadamos_trl_dr_sjrp.pdf: 2071412 bytes, checksum: ba59227c90cba94171f8548d07346f1a (MD5) Previous issue date: 2018-01-24 / Este trabalho apresenta metodologias de desenvolvimento, otimização, e validação de procedimentos de medição eletroquímica de parâmetros bioquímicos em fluidos biológicos. As ferramentas desenvolvidas foram aplicadas à medição voltamétrica, simples e de baixo custo de ácido úrico (AU) em soro humano que se apresenta como uma alternativa confiável às medições realizadas pelo método de referência espectrofométrico. Foi estudada a medição de AU no soro visto a ser utilizada no diagnóstico de várias doenças, tais como gota, doenças cardiovasculares e neoplasias. O eletrodo de trabalho modificado desenvolvido e otimizado é composto por 25 % de lignina, 60 % de nanografite, 15 % de óleo mineral e cobre metálico eletrodepositado. As medições foram realizadas por um método de adição cumulativa de padrão (MAP-C), recorrendo a um novo tratamento estatístico dos dados de calibração, que permite a calibração da instrumentação num pequeno volume de soro. A incerteza da medição foi estimada recorrendo a diversas abordagens bottom-up desenvolvidas e usando abordagens pragmáticas top-down apresentadas na bibliografia. As componentes de incerteza foram combinadas usando a Lei de Propagação de Incertezas ou os métodos numéricos de Kragten e Monte Carlo. Procedeu-se igualmente a uma avaliação bayesiana da incerteza da medição que envolve a atualização de dados da prevalência de ácido úrico na população com o resultado da medição do soro específico analisado. Os modelos metrológicos desenvolvidos foram implementados em folhas de cálculo MSExcel de fácil utilização pelo analista. As avaliações bottom-up da incerteza da medição recorreram a estimativas da incerteza de extrapolação produzidas pelo modelo de regressão ou usando simulações de Monte Carlo aplicáveis quando os pressupostos do modelo de regressão não são cumpridos. O método de adição cumulativa de padrão foi aplicado com sucesso à análise de soro humano pela adição de 1,0, 3,0, 5,0, 7,0 e 9,0 mg dL-1 de AU a 5 mL de soro. A adequação da qualidade das medições eletroquímicas foi avaliada comparando sua incerteza com um valor alvo de 0,56 mg dL-1 (uma oitava parte das faixas de AU de indivíduos saudáveis) e avaliado a compatibilidades das medições com determinações realizadas pelo procedimento de referência. As medições realizadas revelaram-se válidas e com menor custo do que as produzidas pelo método de referência. As ferramentas desenvolvidas para a construção e otimização de eletrodos de trabalho são aplicáveis à medição de outras espécies de análise e em outras matrizes. O método de adição cumulativa de padrão desenvolvido, bem como os modelos de medição respectivos desenvolvidos, são aplicáveis a qualquer tipo de medição instrumental não destrutiva de soluções. / This work presents methodologies for the development, optimization and validation of procedures for the electrochemical measurement of biochemical parameters in biological fluids. The developed tools were applied to voltammetric, simple and low-cost measurements of uric acid (AU) in human serum, which proved to be a reliable alternative to the spectrophotometric reference method. It was studied the measurement of AU in serum since it is used in the diagnosis of various diseases, such as gout, cardiovascular diseases and neoplasms. The developed and optimized modified working electrode is composed of 25 % lignin, 60 % nanocarbon, 15 % mineral oil and electrodeposited copper. The measurements were performed using a cumulative standard addition method (MAP-C), using a new statistical treatment of the calibration data, which allows the calibration of the instrumentation in a small volume of serum. The measurement uncertainty was estimated using developed bottom-up approaches and using pragmatic top-down approaches presented in the literature. The uncertainty components were combined using the Uncertainty Propagation Law or the numerical Kragten and Monte Carlo methods. A bayesian evaluation of the measurement uncertainty was performed, involving the updating of uric acid prevalence in the population with the result of the measurement of AU in the specific serum sample. The developed metrological models were implemented in user-friendly MS-Excel spreadsheets. The bottom-up assessments of measurements uncertainty involve the estimation of the extrapolation uncertainty from the regression model or using Monte Carlo simulations applicable to when the assumptions of the regression model are not valid. The cumulative standard addition method was successfully applied to the analysis of human serum by adding 1.0, 3.0, 5.0, 7.0 and 9.0 mg dL-1 of AU to 5 mL of serum. The adequacy of the electrochemical measurements was assessed by comparing their uncertainty with a target value of 0.56 mg dL-1 (one-eighth of the range of AU in healthy individuals) and by evaluating the compatibility of measurements with determinations performed by the reference procedure. The performed measurements are valid and significantly cheaper than those produced by the reference method. The tools developed for the construction and optimization of working electrodes are applicable to the measurement of other analytes and matrices. The developed cumulative standard addition method and respective measurement models, are applicable to any kind of non-destructive chemical measurement of a solution.

Orientador: Iguatemy Lourenço Brunetti / Banca: Mariza Pires de Melo / Banca: Eduardo Maffud Cilli / Resumo: Em pacientes com doença renal crônica é observado à presença de estresse oxidativo e a exacerbação desse estresse com o tratamento hemodialítico, bem como tem se postulado a ação antioxidante de alguns solutos urêmicos. Esse contexto instigou-nos explorar, a ação antioxidante dos solutos urêmicos: L-arginina, Ácido Úrico, Ácido Hipúrico, Creatinina, Fenol, Metilguanidina, p-Cresol, L-tirosina e Uréia, utilizando sistemas-modelo in vitro. Quatro desses solutos mostraram eficiência (expressa via o IC50 em µmol/L) para os sistemas-modelo: Capacidade de captura sobre o ABTS + , p-Cresol (3,99 ± 0,01), L-tirosina (5,23 ± 0,02), Fenol (12,98 ± 0,09) e o Ácido Úrico (16,75 ± 0,14); Capacidade de captura sobre o HOCl / OCl -, L-tirosina (2,83 ± 0,04), Ácido Úrico (5,75 ± 0,13), Fenol (8,95 ± 0,10) e p- Cresol (15,75 ± 0,12), e o bleaching da crocina (lipoperoxidação), Ácido Úrico (6,90), Fenol (1125,81) e p-Cresol (1162,31). Em relação à capacidade de captura sobre o Ânion Radical Superóxido e o Peróxido de Hidrogênio nenhum dos solutos apresentou atividade significativa. Em todos os ensaios onde não foi observada atividade antioxidante, investigou-se desde concentrações fisiológicas, urêmicas e até 10 vezes maior que as concentrações urêmicas médias. Como os solutos urêmicos, Ácido Úrico, p-Cresol, Fenol e L-tirosina capturaram significativamente as espécies reativas, ABTS + , HOCl / OCl - e ROO  , estudou-se o comportamento da mistura desses solutos, tendo como referência o IC50 de cada soluto. Obteve-se nos ensaios de captura do ABTS + e do HOCl / OCl - os IC50, como uma fração de concentração de 26 e 27%, respectivamente, para cada soluto na mistura, o que demonstrou um efeito aditivo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Patients with chronic kidney disease suffer from oxidative stress and this stress is exacerbated by hemodialysis. It has been postulated that some uremic solutes have antioxidant effects. This context prompted us to explore the antioxidant action of the uremic solutes: L-arginine, uric acid, hippuric acid, creatinine, phenol, methylguanidine, p-cresol, L-tyrosine and urea, by means of 5 in vitro model systems. Only four of these solutes were effective antioxidants (assessed by their IC50 in µmol/L) in 3 model systems: ABTS + scavenging: p-cresol (3.99±0.01), L-tyrosine (5.23±0.02), phenol (12.98±0.09) and uric acid (16.75±0.14); hypochlorous acid scavenging: L-tyrosine (2.83±0.04), uric acid (5.75±0.13), phenol (8.95±0.10) and p-cresol (15.75±0.12); and crocin bleaching (lipoperoxidation): uric acid (6.90), phenol (1,125.81) and p-cresol (1,162.31). In tests with the superoxide radical anion and hydrogen peroxide, none of the solutes showed antioxidant activity. In each of the assays in which no activity was detected, tests were carried out over a range of solute concentrations, from normal physiological levels, through typical uremic up to ten times higher than mean uremic concentrations. As the 4 uremic solutes, uric acid, p-cresol, phenol and L-tyrosine showed significant scavenging activity for 3 reactive species, ABTS + , HOCl / OCl - and ROO  , the behavior of mixture of these solutes was investigated, with reference to the IC50 of each solute. In the ABTS + and HOCl / OCl - scavenging assays, the IC50 involved a concentration of 26% and 27%, respectively, of each solute in the mixture, demonstrating... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Vera Terezinha Medeiros Borges / Resumo: Introdução: Pré-eclâmpsia é uma síndrome sistêmica específica da gestação com etiopatogenia ainda não esclarecida, porém acredita -se ser decorrente de alterações no processo de invasão trofoblástica, com consequente inadequado suprimento sanguíneo uterino e estresse oxidativo do tecido placentário. O aumento da concentração de ácido úrico sérico materno (AU) em mulheres com pré-eclâmpsia tem sido associado com a gravidade da hipertensão, proteinúria e prognóstico materno e perinatal na gestação. Objetivos: Identificar a associação entre a concentração sérica de ácido úrico e resultados maternos e perinatais adversos e correlacionar a concentração sérica do ácido úrico materno com recémnascidos pequenos para idade gestacional e proteinúria materna. Sujeitos e Métodos: Foi realizado estudo retrospectivo, em gestantes com pré-eclâmpsia, as quais foram estratificadas de acordo com a dosagem de ácido úrico sérico em dois grupos: I (inferior a 6 mg/dL) e II (igual ou superior a 6 mg/dL) e avaliados resultados adversos maternos e perinatais. Resultados: No grupo II houve maior frequência de crise hipertensiva(25%), eclampsia(6,9%), síndrome HELPP parcial (7,8%) e síndrome HELLP(6,9%), maior número de recém-nascidos pequenos para idade gestacional(47%), menor peso do recém-nascido, maior porcentagem de óbito fetal(1,8%), de prematuridade(68%) e de índice de Apgar no 1º minuto(38%). Conclusões: Os resultados demonstram que as paciente com ácido úrico elevado apresentam piores resulta... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Introduction: Preeclampsia is a specific systemic disease of pregnancy with unknown etiology, but it is believed to be due to changes in the process of trophoblastic invasion, leading to an inadequate uterine blood supply and oxidative stress of the placental tissue. Increasing of maternal uric acid serum concentration (UA) in women with pre-eclampsia has been associated with the severity of hypertension, proteinuria and maternal and perinatal outcome on pregnancy. Objectives: Identify the association between serum uric acid and adverse maternal and perinatal outcomes. More specifically, the correlation of maternal UA serum concentration with newborn size for gestational age and maternal proteinuria. Subjects and Methods: Cross observational study in pregnant women with preeclampsia, which were stratified according to dose of serum uric acid into two groups, as follow: I (below 6 mg/dL) and II (greater or equal to 6 mg/dL). Maternal and perinatal adverse outcomes were examined. Results were analyzed by T - Student and chi-square tests and correlations were evaluated by Pearson test. The level of significance used was 5%. Results: In group II there were a greater frequency of hypertensive crisis, eclampsia, partial HELPP syndrome and HELLP syndrome. Also it were observed an increased number of small newborns for gestational age, lower weight of the newborn, the higher percentage of fetal death, prematurity and index Apgar at 1 minute. Conclusions: The results suggest that pati... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A oxidação do ácido úrico (7,9-diidro-1H-purina-2,6,8(3H)-triona) pela mieloperoxidase (MPO) gera o radical de urato que, em presença do radical ânion superóxido combinam para formar o hidroperóxido de urato (HOOU). Considerando os altos níveis de MPO, ácido úrico e superóxido na placa de ateroma espera-se que o ácido úrico seja oxidado a HOOU neste microambiente inflamatório. O HOOU é um oxidante mais forte que o peróxido de hidrogênio e pode oxidar grupos tiólicos de proteínas como a proteína dissulfeto isomerase (PDI). Como consequência à oxidação da PDI, ocorre uma modulação positiva sobre a NADPH oxidase (Nox) com aumento da produção de superóxido por neutrófilos. Sendo assim, a formação do HOOU no leito vascular poderia elucidar os mecanismos moleculares pelos quais o urato colabora para a progressão da aterosclerose em pacientes com hiperuricemia. Para investigar a interação do HOOU com a PDI, padronizou-se a síntese química do HOOU através de um sistema de fotooxidação do tipo I, utilizando urato, riboflavina (fotossensibilizador) e luz UVA. Inicialmente padronizou-se o tipo de irradiação e tempo de reação com o melhor rendimento para a síntese do HOOU. O HOOU formado e seu produto de redução o álcool 5-hidroxiisourato foram separados, identificados e caracterizados através de cromatografia liquida acoplada à espectrometria de massa (LC/MS). Após a purificação, determinou-se o coeficiente de absortividade molar em 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1) e o tempo de meia-vida, aproximadamente 41 minutos à 22°C do HOOU. O HOOU foi capaz de reagir seletivamente com o aminoácido metionina e com o tripeptídeo glutationa. Além disso, o HOOU não forma adutos estáveis com a glutationa, sendo que toda glutationa consumida foi transformada em glutationa dissulfeto. Quando incubado com a PDI (10 µM), cerca de 70 e 100% do total de HOOU (3 µM) foi consumido após 30 e 120 segundos, respectivamente, enquanto que a PDI (23 µM) teve seus grupos tiólicos oxidados após a incubação com 140 µM HOOU por 30 min a 22°C. O HOOU oxidou os resíduos de cisteína dos dois sítios catalíticos da PDI com uma constante de velocidade da reação de 1,5 ± 0,04 x 103 M-1.s-1, demonstrando uma interação favorável com essa proteína no meio biológico e um possível papel modulatório do HOOU sobre a via PDI-Nox. Interessantemente, o ácido úrico aumentou a produção de superóxido e o consumo de oxigênio de células HL-60 diferenciadas em neutrófilos (dHL-60) e ativadas com acetato de miristato de forbol (PMA). Essa regulação poderia ser mediada através da formação do HOOU durante o \"burst\" oxidativo dos neutrófilos que oxidaria a enzima PDI induzindo um consequente aumento da atividade da Nox. / The oxidation of the uric acid (7,9-dihidro-1H-purine-2,6,8(3H)-trione) by myeloperoxidase (MPO) generates the urate radical. In inflammatory conditions the superoxide reacts with urate radical to form the urate hydroperoxide (HOOU). Taking into account the high amount of MPO, urate and superoxide in the atheroma plaque, it is likely that HOOU is being formed in this inflammatory environment. The HOOU is a strong oxidizing agent and can react with thiol groups from proteins, like the protein disulfide isomerase (PDI). As a consequence of its oxidation, PDI positively modulates NADPH oxidase (Nox) and increases superoxide production by neutrophils. Therefore, the formation of HOOU in the vascular sheet would contribute to tissue damage and would explain the positive correlation between hyperuricemia and the risk for cardiovascular disease. To investigate the interaction of HOOU with PDI, we performed the chemical synthesis of the compound by the Type I photooxidation, using UVA irradiation and riboflavin as a photosensitizer. Initially, we standardized the irradiation light and the time of the reaction that produced the highest income. The HOOU and its reduced product 5-hydroxiisourate were separate, identified and characterized by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC/MS). We also determine the molar extinction coefficient of HOOU at 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1). The half-life of the compound was 41 min at 22°C. The HOOU selectively oxidized methionine and glutathione. The reaction of HOOU with glutathione did not form any stable adducts. Thus, all consumed glutathione generated glutathione disulfide. When incubated with PDI (10 µM), 70 and 100% of the total amount of HOOU (3 µM) was consumed within 30 and 120 seconds, respectively. Besides, the PDI (23 µM) had its thiol groups oxidized after incubation with 140 µM HOOU for 30 min at 22°C. The HOOU oxidized the cysteine residues from the catalytical sites of PDI with a second order rate constant of 1.5 ± 0.04 x 103 M-1.s-1. This result suggests a favorable interaction of HOOU with this protein in the biological system, as well as a possible modulatory role of HOOU on the PDI-Nox pathway. Interestingly, urate increased superoxide production and oxygen consumption by neutrophil-like cells (differentiated HL-60 cells). This effect could be mediated by the formation of HOOU during the neutrophil oxidative burst, followed by the oxidation of PDI, a positive regulation of Nox and an increase in superoxide production.

Made available in DSpace on 2017-07-20T12:40:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cleverson Santos.pdf: 2904178 bytes, checksum: 85140c2fc4cb486fe6c03e6a011296a3 (MD5) Previous issue date: 2016-05-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This thesis describes the preparation, characterization and application of electrochemical sensors and biosensors, using different modification techniques, based on Au as transducer. The enzymatic biosensor applied on the detection of pesticide carbaryl was built on a gold electrode functionalized with a monolayer of polyamidoamine dendrimer of fourth generation with a cystamine core (PAMAM-G4) on which it was immobilized the acetylcholinesterase enzyme (AChE), with the aid of glutaraldehyde. After evaluate and determine the best conditions for immobilization of the AChE enzyme (glutaraldehyde concentration of 1% (v/v) and the concentration of enzyme units 496 U. mL-1) on the monolayer of PAMAM, the catalytic activity of the enzyme was evaluated by chronoamperometry in presence of enzymatic substrate AChI obtaining = 2.9 . −1 . The biosensor response for carbaryl detection was based on the inhibition of the enzymatic activity caused by the pesticide. It was verified that 5 min in the pesticide solution is sufficient to block the enzyme active sites. After determining the best conditions for the construction of the biosensor, it was applied for carbaryl detection in the concentration range from 1.0 to 9.0 mol. L-1. The detection and quantification limits were found to be 0.0108 mol. L-1 and 0.032 mol. L-1, respectively. In the second chapter, it is reported the development of an immunosensor applied to qualitative detection of antibodies (AB) T. cruzi. The sensor was built on gold electrode modified with the thiol 3-mercaptopropionic acid (MPA) and the antigens (AG) T. cruzi were covalently immobilized on this surface by the reaction with EDC and NHS. The influence of concentration and of immersion time in the AG solution were evaluated using the techniques of cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy in presence of [Fe(CN)6]3-/4- and the results showed that the best conditions were immersion time of 15 minutes and AG concentration of 0.5 g. L-1.The possible sites of non-specific binding were blocked with bovine serum albumin (BSA). The immersion time in the solution (AB) was also evaluated and the results showed that 30 minutes are sufficient for all specific bonds sites were occupied by AB T. cruzi. Selectivity tests in the absence of AB, only in the serum sample, and in the presence of AB Toxoplasma were performed. The results demonstrated that the immunosensor is selective, since it presented charge transfer resistance (Rct) values in the presence of AB T. cruzi 70% higher than the Rct values in presence of possible interferences.Therefore, the immunosensor presents itself as an alternative to qualitative diagnosis of american trypanosomiasis. In the third chapter, it is reported the modification of carbon graphite electrodes (CG) obtained from dry batteries zinc/carbon with Au microparticles obtained by potentiostatic electrodeposition. The variables involved in the electrodeposition process, such as the gold salt concentration, time and deposition potential were evaluated and optimized using cyclic voltammetry technique in the presence of redox couple [Fe(CN)6]3-/4-. The best conditions for the Au deposition were electrodeposition time of 700 s, potential of +0.3 V and concentration of 10.0 mmol. L-1. In these conditions, Au spherical particles were obtained with an average size of 420 nm, which were homogeneously deposited on the surface of GC electrode and promoted the increase of the electroactive area (GC electrode showed an area of 0.12 cm2 and GC/Au electrode presented an area of 0.25 cm2). The GC/Au electrode was applied for the separation and quantification of dopamine and uric acid present in a mixture. The voltammetric results showed that the GC/Au sensor is selective, once the potential peak separation between the DA and UA species was 370 mV. The detection and quantification limits were found to be 1.86 mol. L-1 and 6.09 mol. L-1 for dopamine and uric acid 17.5 mol. L-1 and 58.5 mol. L-1, respectively. In the development of the three electrochemical devices gold electrodes were used. From the results obtained for the three developed electrochemical devices it can be concluded that high electric conductivity, chemical stability, biocompatibility, ability to miniaturization in the form of microstructures and ease of functionalization of Au electrodes make them suitable conductive matrixes for construction of electrochemical sensors and particularly biosensors. / Esta tese descreve a preparação, caracterização e aplicação de sensores e biossensores eletroquímicos, utilizando diferentes técnicas de modificação baseadas no Au como transdutor. O biossensor enzimático aplicado na detecção do pesticida carbaril foi construído sobre um eletrodo de ouro funcionalizado com uma monocamada do dendrímero poliamidoamina de quarta geração com núcleo de cistamina (PAMAMG4),sobre o qual foi imobilizada com o auxílio de glutaraldeído a enzima acetilcolinesterase (AChE).Após avaliar e determinar as melhores condições de imobilização da enzima AChE (concentração de GLUT 1% (v/v) e concentração de unidades enzimáticas 496 U. mL-1) sobre a monocamada de PAMAM,a atividade catalítica da enzima AChE imobilizada foi avaliada por cronoamperometria na presença do substrato enzimático (AChI) obtendo-se o = 2,9 . −1. A resposta do biossensor na detecção de carbaril foi baseada na inibição da atividade enzimática causada pelo pesticida. Foi constatado que 5 min de imersão na solução do pesticida foram suficientes para que os sítios ativos da enzima fossem bloqueados. Após determinar as melhores condições de construção do biossensor, este foi aplicado na detecção de carbaril na faixa de 1,0 a 9,0 mol. L-1. Os limites de detecção e quantificação encontrados foram de 0,0108 mol. L-1 e 0,032 mol. L-1, respectivamente. No segundo capítulo é relatado o desenvolvimento de um imunossensor aplicado na detecção qualitativa de anticorpos (AB) T. cruzi. O sensor foi construído sobre eletrodo de ouro modificado com o tiol ácido 3-mercaptopropiônico (MPA) e sobre esta superfície foram imobilizados covalentemente pela reação com EDC e NHS, os antígenos (AG) T. cruzi. A influência da concentração da solução de AG e do tempo de imersão nesta solução para a construção do imunossensor foram avaliadas utilizando as técnicas de voltametria cíclica e espectroscopia de impedância eletroquímica na presença de [Fe(CN)6]3-/4- e os resultados demonstraram que as melhores condições foram: tempo de 15 min e concentração de 0,5 g. L-1. Os possíveis sítios de ligações não específicas foram bloqueados com albumina de soro bovino (BSA). O tempo de imersão na solução de AB também foi avaliado. Os resultados mostraram que 30 min são suficientes para que todos os sítios de ligações específicos fossem ocupados pelos AB T. cruzi. Testes de seletividade na ausência de AB,apenas em amostra de soro e também na presença de AB de Toxoplasma foram realizados. Os resultados demonstraram que o imunossensor é seletivo, pois este apresentou valores de resistência de transferência de carga (Rct) na detecção de AB T. cruzi 70% maiores do que na detecção dos possíveis interferentes. Portanto, o imunossensor apresenta-se como uma alternativa no diagnóstico qualitativo de tripanossomíase americana. No terceiro capítulo é descrito a modificação de eletrodos de carbono grafite (CG) obtidos de pilhas secas de zinco/carbono com micropartículas de Au obtidas pela eletrodeposição potenciostática. As variáveis envolvidas no processo de eletrodeposição, tais como concentração do sal de ouro, potencial e tempo de deposição foram avaliadas e otimizadas utilizando a técnica de voltametria cíclica na presença do par redox [Fe(CN)6]3-/4-. As melhores condições foram: tempo de 700 s, potencial de +0,3 V e concentração de 10,0 mmol. L-1. Nestas condições, foram obtidas partículas de Au esféricas com tamanho médio de 420 nm, as quais se apresentaram homogeneamente dispersas sobre toda a superfície do eletrodo de CG e promoveram o aumento da área eletroativa, (o eletrodo CG apresentou uma área de 0,12 cm2 e o eletrodo CG/Au uma área 0,25 cm2). O desempenho do eletrodo CG/Au foi avaliado na separação e quantificação de dopamina e ácido úrico presentes em uma mistura. Os resultados voltamétricos demonstraram que o sensor CG/Au é seletivo, pois apresentou separação de potencial pico de 370 mV entre as duas espécies. Os limites de detecção e quantificação encontrados foram de 1,86 mol. L-1 e 6,09 mol. L-1 para dopamina, e 17,5 mol. L-1 e 58,5 mol. L-1 para ácido úrico, respectivamente. A partir dos resultados obtidos para os três dispositivos eletroquímicos desenvolvidos pode-se concluir que a elevada condutividade elétrica, estabilidade química, biocompatibilidade, possibilidade de miniaturização na forma de microestruturas e a facilidade de funcionalização dos eletrodos de Au fazem destes matrizes condutoras apropriadas para construção de sensores e particularmente biossensores eletroquímicos.

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:38:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cleverson S Santos.pdf: 2872449 bytes, checksum: 6d5838a843155793c2eb115ea3d233c4 (MD5) Previous issue date: 2012-03-13 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The research focused on the development of electrochemical sensors based on LBL films have grown exponentially in recent years. In this context, this paper reports the development of an electrochemical sensor using the Layer-by-layer (LbL) technique, which enables the construction of ultrathin films from electrostatic interactions between oppositely charged polyelectrolytes. For this purpose, the tetrasulfonated nickel phthalocyanine (NiTsPc) was used as polyanion molecule and the 3-n-propilpyridinium silsesquioxane chloride (SiPy+Cl-) as the polycation. This silsesquioxane polyelectrolyte is an excellent ion exchange and has high ability to form stable films on the surface of solid substrates. The LbL films were built using two different architectures: one with an outer layer of phthalocyanine designated as (SiPy+Cl-/NiTsPc)n and another with the phthalocyanine as the inner layer, (NiTsPc/SiPy+Cl-)n with different bilayers, (where n = number of bilayers). The deposition of the bilayers was monitored using the UV-VIS spectroscopy in the region from 500 to 800 nm, where the phthalocyanines exhibit two absorption bands, one related to the dimeric species at 630 nm and another at 669 nm related to monomeric form. It was observed that the parameters:immersion time, pH and concentration directly influenced the construction of these films and therefore they were optimized. The optimized parameters were: immersion time of 280 s, pH = 8 and concentrations of polyeletrolytes solutions of 2 mg mL-1, which provided stable and homogeneous films, with higher concentrations of monomeric species. Monitoring the bilayers deposition in the UV-VIS region, a linear relationship was obtained between the absorbance and the number of bilayers deposited. FTIR and Raman spectra showed that the interactions between the polyelectrolytes occurs by the SO3 groups in the structure of tetrasulfonated phthalocyanines with the pyridinium groups present in the structure of the SiPy+Cl-. Using the AFM technique, it was observed that the average roughness of the films decreased with the increase of bilayers. On the other hand, the thickness of the films increased with the number of bilayers, and the average thickness of each bilayer was 22 nm for the architecture (SiPy+Cl-/NiTsPc)n, and 19.2 nm for the opposite configuration. The electrodes were applied for simultaneous determination of dopamine (DA) in the presence of the interfering species, such as ascorbic acid (AA) and uric (UA). It was observed that the architecture as well as the thickness of the films has influenced significantly the electrochemical response in the presence of analytes. The film with the highest current density and less positive potential values for these analytes was (SiPy+Cl-/NiTsPc)2. For this electrode, f om the cyclic voltammetry technique, anodic peaks were observed at 0.30 V,0.68 V and 0.74 V in the presence of DA, AA and UA, respectively. Studies in different scan rates in presence of dopamine showed that the kinetics of electron transfer is controlled by diffusion of species to the electrode surface. Using the square wave voltammetry, DA was detected in presence of AA with a peak separation potential of 350 mV. However, for a fixed concentration of DA, it was observed an increase of the intensity of peak current with increasing of AA concentration, which is an indication that the AA electrocatalyzes the oxidation reaction of DA to dopaminequinone, causing an increase in the current, which prevents the accurate determination of these analytes simultaneously. On the other hand, in the presence of UA in a fixed concentration of 4.7 x 10-4 mol L-1, it was possible to quantify DA in the range of 1.0 x 10-5 to 9.9 x 10-5 mol L-1 with a detection limit of 2.37 x 10-6 mol L-1 and quantification limit of 7.9 x 10-6 mol L-1 with peak separation Ep= 500 mV. By varying both the concentration of DA and UA, in the range of 1.0 x 10-4 to 9.0 x 10-4 mol L-1 for DA and 1.0 x 10-5 to 9.9 x 10-5 mol L-1 for UA, it was obtained a correlation coefficient of R = 0.997 and R = 0.988 for AU and DA respectively. The results showed that the electrode (SiPy+Cl-/NiTsPc)2 is selective and sensitive for DA determination in presence of interfering species AA and UA. / As pesquisas voltadas para o desenvolvimento de sensores eletroquímicos a base de filmes LbL têm crescido exponencialmente nos últimos anos. Neste âmbito, este trabalho relata o desenvolvimento de um sensor eletroquímico, utilizando a técnica Layer-by-Layer (LbL), a qual possibilita a construção de filmes ultrafinos a partir de interações eletrostáticas entre polieletrólitos de cargas opostas. Para tanto foi utilizado como poliânion a molécula ftalocianina tetrassulfonada de níquel (NiTsPc), e como policátion o cloreto de 3-npropilpiridínio silsesquioxano (SiPy+Cl-). Tal composto constitui um excelente trocador iônico, além de apresentar alta capacidade de formação de filmes estáveis sobre a superfície de substratos sólidos. Foram construídos filmes em duas arquiteturas: uma com a ftalocianina na camada mais externa designada como (SiPy+Cl-/NiTsPc)n e outra com esta na camada mais interna, (NiTsPc/SiPy+Cl-)n com diferentes bicamadas, (onde n= número de bicamadas). A deposição das bicamadas foi monitorada utilizando-se a técnica de espectroscopia de absorção na região do UV-VIS, mais precisamente na região de 500 a 800 nm, onde as ftalocianinas apresentam duas bandas de absorção, uma referente a forma agregada em 630 nm e outra referente a forma monomérica em 669 nm. Foi observado que as variáveis: tempo de imersão, pH e concentração dos polieletrólito influenciam diretamente na construção dos filmes e portanto estas foram otimizadas. Os parâmetros otimizados foram: tempo de imersão de 280 s, pH = 8 e concentrações de 2 mg mL-1 obtendo-se filmes estáveis e homogêneos, com maiores concentrações de espécies monoméricas em relação a espécies agregadas. O monitoramento da deposição das bicamadas na região do UV-VIS mostrou uma relação linear entre absorbância e o número de bicamadas depositadas. Os espectros de FTIR e Raman, evidenciaram as interações entre os grupos SO3 presentes na estrutura das ftalocianinas tetrassulfonadas com os grupos piridínios presentes na estrutura do SiPy+Cl-. Utilizando a técnica de microscopia de força atômica foi possível verificar que a rugosidade média dos filmes diminuiu em função do aumento do número de bicamadas. Por outro lado, a espessura dos filmes aumentou com o número de bicamadas, sendo que a espessura média de cada bicamada foi de 22 nm para a configuração (SiPy+Cl-/NiTsPc)n, e de 19,2 nm para a configuração oposta. Os eletrodos foram aplicados na determinação simultânea de dopamina (DA) em meio aos interferentes ácido ascórbico (AA) e úrico (AU). Observou-se que a arquitetura assim como a espessura dos filmes influenciaram de maneira significativa na resposta eletroquímica na presença dos analitos. O filme que apresentou maior intensidade de corrente e valores de potencial de pico menos positivos foi (SiPy+Cl-/NiTsPc)2. Para este eletrodo, a partir da técnica de voltametria cíclica, foram observados picos anódicos em 0,30 V, 0,68 V e 0,74 V, na presença de DA, AA e AU, respectivamente. Estudos da variação da velocidade de varredura para dopamina mostraram que a cinética de transferência eletrônica é controlada pela difusão de espécies a superfície do eletrodo. Utilizando a técnica de voltametria de onda quadrada, detectou-se DA na presença de AA, com separação de potenciais de pico de 350 mV. No entanto, para uma concentração fixa de DA, foi observado um aumento da intensidade de corrente de pico com o aumento da concentração de AA, o que é um indicativo de que o AA eletrocatalisa a reação de oxidação de dopaminaquinona a DA novamente, o que impossibilita a determinação precisa destes analitos simultaneamente. Por outro lado, na presença de AU com concentração fixa de 4,7 x 10-4 mol L-1, foi possível quantificar DA na faixa de 1,0 x 10-5 a 9,9 x 10-5 mol L-1 com limite de detecção de 2,4 x 10-6 mol L-1 e quantificação de 7,9 x 10-6 mol L-1 com separação de potencial de pico de 500 mV. Variando-se simultaneamente a concentração das duas espécies, DA e AU, na faixa de 1,0 x 10-4 a 9,0 x 10-4 mol L-1 para DA e 1,0 x 10-5 a 9,9 x 10-5 mol L-1 para AU, obteve-se coeficiente de correlação iguais a R = 0,997 e R = 0,988, para AU e DA respectivamente. Os resultados mostram que o eletrodo é seletivo e sensível a determinação de DA em meio aos interferentes AA e AU.