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Molecular evolutionary perspectives of amylosucrases : from natural substrate promiscuity to tailored catalysis / Perspectives sur l’évolution moléculaire des amylosaccharases : De la promiscuité de substrat naturelle vers une catalyse contrôléeDaude, David 02 July 2013 (has links)
La promiscuité des enzymes joue un rôle primordial pour l’évolution des protéines et la divergence des fonctions catalytiques. Comprendre les déterminants moléculaires qui régissent cette promiscuité enzymatique représente un enjeu scientifique majeur pour identifier les trajectoires évolutives pouvant entrainer l’émergence de nouvelles fonctions. L’objectif de cette thèse a consisté d’une part à sonder la promiscuité catalytique de l’amylosaccharase de Neisseria polysaccharea, une transglucosidase d’intérêt biotechnologique majeur, dans le but d’identifier des substrats alternatifs et d’autre part à étendre ses capacités naturelles par des techniques d’évolution moléculaire. Une trentaine de molécules ont été testées et ont permis de mettre en évidence la forte spécificité de l’enzyme pour son substrat donneur ainsi que sa large promiscuité vers les substrats accepteurs. Le rôle des résidus impliqués dans la reconnaissance des substrats a par la suite été considéré au travers d’une stratégie rationnelle basée sur des prévisions de stabilité thermodynamique. Deux histidines (H187 et H392), ont ainsi été ciblées par mutagénèse à saturation. La stabilité de ces mutants a été étudiée ainsi que ainsi que leur activité envers différents substrats. Des enzymes à la stabilité améliorée ou montrant des changements de spécificité de produits ont ainsi été identifiées. Afin d’étudier plus amplement la promiscuité de cette amylosaccharase, une deuxième stratégie d’ingénierie a été menée pour mimer in vitro les mécanismes moléculaires de la dérive génétique neutre. Ce phénomène dit de “Neutral-Drift” a préalablement été décrit comme un facteur impliqué dans les changements de promiscuité catalytique. Quatre cycles de mutagénèse ont ainsi été réalisés et 440 clones ont été sélectionnés pour avoir conservé leur fonction originelle (i.e. leur activité sur saccharose). Des variants aux propriétés catalytiques améliorées envers des substrats alternatifs ont été caractérisés et des groupes de positions corrélées ont été identifiés. L’effet des mutations neutres sur la thermostabilité a également été étudié. Enfin, de façon remarquable, une nouvelle activité envers un substrat non reconnu par l’enzyme native, le méthyl-α-L-rhamnopyranoside, a été détectée. Ce variant possédant quatre substitutions a été caractérisé et la résolution de sa structure tridimensionnelle par cristallographie aux rayons-X permettra d’approfondir les relations unissant séquence, structure et activité de l’enzyme / Investigation of substrate promiscuity is of prime interest to understand the way enzymes evolve. Understanding the molecular determinants involved in substrate promiscuity is challenging to determine the evolutionary trajectories that lead to the emergence of catalytic functions and to take further advantage of their evolvability to develop original biocatalysts. The objective of this thesis aimed to investigate the substrate promiscuity of the amylosucrase from Neisseria polysaccharea, a transglucosidase of prime biotechnological interest, to identify alternative donor and acceptor molecules and further extend its catalytic properties through enzyme engineering. About thirty molecules were assayed and the strong specificity for the natural donor sucrose was emphasized, as well as the broad acceptor promiscuity. The rational engineering of active site residues responsible for substrate recognition was undertaken through thermodynamic stability predictions. Two residues, namely H187 and H392, were rationally targeted for site-directed mutagenesis. The stability of these variants was investigated as well as their activity toward both natural and promiscuous substrates. Variants with enhanced stability or altered product distribution were identified. These results highlighted that mutations responsible for stability changes may also lead to substrate promiscuity or product specificity changes. To further investigate the promiscuity of amylosucrase, we considered another engineering strategy to mimic in vitro the neutral enzyme evolution. Neutral genetic drift was previously shown to be related to promiscuity changes. On this basis, four repeated round of mutagenesis were performed and 440 clones were selected because they maintained the protein original function (i.e. the activity on sucrose). Variants with enhanced properties towards promiscuous donors and acceptors were characterized and clusters of correlated amino acid substitutions were identified. The impact of neutral mutations on thermodynamic stability was also discussed. Remarkably, a totally new activity towards methyl-α-L-rhamnopyranoside, an acceptor not recognized by the parental wild-type enzyme, was detected. The variant harboring four amino acid substitutions was characterized and the determination of its three-dimensional structure by X-ray crystallography will be useful to further investigate the structure-sequence-activity relationships of this enzyme
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Sur les origines, l'histoire évolutive et biogéographique du palmier-dattier (Phoenix dactylifera L.) : l'apport de la génétique et de la morphométrie / Origins, evolutionary and biogeographical history of the date palm (Phoenix dactylifera L.) : the contribution of genetics and morphometricsGros-Balthazard, Muriel 20 December 2012 (has links)
Les objectifs de ce travail visent à appréhender l'histoire évolutive et biogéographique du palmier dattier (Phoenix dactylifera L.), espèce d'une importance capitale pour les populations humaines des régions chaudes et arides d'Afrique du Nord et du Moyen-Orient, au moyen d'analyses génétiques et morphométriques. En effet, les origines de la domestication du dattier demeurent peu connues malgré les données archéologiques qui semblent attester de sa culture à partir de la fin du 4ème millénaire avant notre ère. L'analyse phylogénétique du genre Phoenix réalisée à partir de séquences chloroplastiques a permis d'identifier les parents proches du dattier. Des populations de dattiers sauvages sont reconnues pour la première fois grâce à des analyses de diversité et de structuration génétiques. De manière congruente, l'analyse morphométrique de contours de la graines s'appuyant sur la méthode des transformées elliptiques de Fourier met en évidence une nette différenciation entre les individus sauvages et cultivés. La caractérisation des changements de traits morphologiques de la graine liés à la domestication est exploitée pour définir le statut sauvage ou domestiqué de matériel mis au jour dans différents sites archéologiques du Pakistan et d'Egypte. En outre, l'étude génétique de dattiers d'origine diverses semble démontrer qu'au moins deux évènements de domestication ont eu lieu : l'un en Afrique et l'autre au Moyen-Orient. Finalement, les études génétiques et morphométriques, menées séparément ou conjointement selon le type et l'ancienneté du matériel analysé, permettent pour la première fois de discuter des origines, de l'histoire biogéographique et de la dynamique de l'agrobiodiversité du palmier dattier, dans le temps et dans l'espace. / The objectives of this work are to understand the evolutionary history and biogeography of the date palm (Phoenix dactylifera L.), a species of importance to human populations in hot, arid regions of North Africa and the Middle East using genetic and morphometric analyzes. Indeed, the origins of the domestication of the date palm remain poorly understood despite the archaeological data that seem to attest its culture from the late 4th millennium BCE.Phylogenetic analysis of the genus Phoenix made from chloroplast sequences identified close relatives of the date palm. Populations of wild date palms are recognized for the first time through analyses of genetic diversity and structure. Congruently, morphometric analysis of the seed outline based on the method of elliptic Fourier transform highlights a clear differentiation between wild and cultivated individuals. Characterization of changes in seed morphological traits related to domestication is used to define the status of wild or domesticated material excavated from various archaeological sites in Pakistan and Egypt. In addition, the date palm genetic study of various origins seems to indicate that at least two domestication events took place: one in Africa and one in the Middle East. Finally, genetic and morphometric studies, conducted separately or together depending on the type and age of the material analyzed, allow for the first time to discuss the origins, history and biogeographic dynamics of date palm agrobiodiversity, in time and space.
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Contribution bioinformatique à l' analyse du transcriptome humainLoe-mie, Yann 25 January 2012 (has links)
Dans la première partie j'ai analysé des jeux de données de RNA-seq de transcriptome de petits ARNs disponibles dans les bases de données publiques. J'y ai observé 2 points intrigants : - une grande partie des lectures (bien que courtes) ne peux pas être alignée sur le génome de référence sans discordance et cette fraction non-alignable est parfois majoritaire. - de nombreuses lectures ont des tailles autours de 15-18nt qui ne correspondent à aucun type de petits ARNs connues, cette fraction est également majoritaires dans certains cas. Ces expériences sont souvent conçues pour la détection des miRNAs et l'analyse bioinformatique de ces données passent toujours par un alignement sur le génome de référence ou sur des séquences connues pour donner des petits ARNs. J'ai donc simplement éliminé la contrainte d'alignement dans l'analyse de ces données et effectué un regroupement des lectures par similarité (à la manière des ESTs). Ce regroupement donne une vision différente des données dans laquelle la notion de position génomique n'est plus centrale et ouvre la possibilité d'y découvrir des phénomènes non-standard. La deuxième partie est tirée d'une collaboration avec le laboratoire U675 INSERM. J'ai fait l'analyse bioinformatique des gènes dérégulés par la répression par RNAi du gène REST dans une lignée de neuroblastome de souris (N18). Ce gène est un facteur de transcription qui réprime les gènes neuronaux dans les cellules non neuronales. Ce répertoire de gènes dérégulés est potentiellement constitué de gènes clefs dans la biologie des neurones. / In first part of this thesis I have analysed small RNA-seq transcriptome data. I have noticed : - a large fraction of reads can't be aligned perfectly on reference genome - lot of reads are very short (15-18 nt) and don't match on previously known functionnal small RNAs. These experiments are designed for miRNA discovery and bioinformatics analysis of these data use alignments on genome or on known small RNA precursors sequences. I have eliminated the alignment and I have clustered these sequences. This clustering let me to observe these data with a new view in wich the genomic location is not central and open the gate to discover unconventional events. The second part is the analysis of deregulate genes by the silencing of the gene REST/NRSF in mouse N18 cell line. This gene is a transcription factor and it works as a repressor of neuronal genes in non neuronal cells. This deregulate genes repertoire potentially contains key genes in neuron biology. We found in this repertoire a network of genes centered on SWI/SNF complex including SMARCA2. This gene was associated to schizophrenia (SZ) in association studies and structural variation studies. In this network we found another genes associated to SZ. We show that these genes exhibit positive evolution in primate compare to rodents.
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Etudes des propriétés physiques des galaxies par HerschelCiesla, Laure 29 November 2012 (has links)
Le Herschel Reference Survey (Boselli et al. 2010) est un programme clé à temps garanti conçu pour étudier les propriétés physiques du milieu interstellaire (MIS) de 323 galaxies proches, dotées de données multi-fréquences. Cet échantillon sélectionné en bande K et limité en volume est composé de galaxies couvrant tous les types de morphologies (des elliptiques aux galaxies spirales) et tous les types d'environnement (des galaxies de champs aux galaxies du centre de l'amas de la Vierge). Mon travail de thèse consiste à effectuer une photométrie submillimétrique précise de ces 323 galaxies, et de conduire une analyse statistique des propriétés du MIS de ces galaxies proches basée sur leur distribution spectrale d'énergie. Dans ce but, j'ai utilisé les modèles de Draine & Li (2007) que j'ai ajusté aux données. Les paramètres de sorties de ces modèles sont l'intensité du champ de radiation, l'abondance des PAH, la contribution des régions de photo-dissociation dans le chauffage de la poussière, et la masse de poussière. J'étudie les relations entre ces paramètres de sorties et les propriétés physiques telles que la masse stellaire, le taux de formation stellaire spécifique, la métallicité ou encore le type morphologique.Je vais présenter les études préliminaires liées à ces relations, entrainant une meilleur compréhension des processus en jeu dans le MIS, et procurer de nouveaux modèles infrarouges et submillimétriques paramétrés par les quantités physiques que je viens de citer. Ces modèles, calibrés sur les galaxies proches, seront déterminant pour l'étude des propriétés du MIS des galaxies à haut redshifts. / The Herschel Reference Survey (Boselli et al. 2010) is a guaranteed time key project aimed at studying the physical properties of the interstellar medium (ISM) of 323 nearby galaxies, covered by multi-wavelength data. This volume limited, K-band selected sample is composed of galaxies spanning the whole range of morphological types (from ellipticals to late-type spirals) and environments (from the field to the centre of the Virgo Cluster). My PhD work consists in performing a precise submillimeter photometry of every galaxies of the survey, and conducting a statistical study on the ISM properties of nearby galaxies based on the analysis of their spectral energy distributions. To achieve this goal I fit the data with the models of Draine & Li 2007. The output of Draine & Li (2007) models are the intensity of the interstellar radiation field, the PAH abundance, the contribution of photodissociation regions, the total mass of dust. I study the relations between these outputs and the physical properties such as the stellar mass, the specific star formation rate, the metallicity or the morphological type. I will present a preliminary analysis of these relations leading to a better understanding of the processes at play in the ISM and provide new infrared sets of templates from 8 to 500 microns parameterized by all the physical parameters just cited. These templates calibrated on nearby galaxies will be a benchmark for the study of the ISM properties of high redshift galaxies.
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Le critère de démarcation de Karl R. Popper et son applicabilité / The Karl R. Popper's criterion of demarcation and its applicabilityMichel-Bechet, Jacques 13 May 2013 (has links)
La réfutabilité de Karl Popper (1902-1994) définit à la fois la norme de la connaissance scientifique et se présente comme le critère du caractère empirique de toute théorie scientifique. La thèse rend compte de l’ambigüité d’une épistémologie qui s’ancre dans la logique potentielle tout en prétendant à l’effectivité pratique. Il est impossible avec un tel critère de statuer sur la scientificité de disciplines aussi diverses que le marxisme, la psychanalyse, la théorie de l’évolution, l’astrologie, étudiées par Popper et exclues du domaine des sciences pour absence de prédictibilité. La thèse met aussi en évidence que, bien que très influente en biologie, l’épistémologie normative de Popper n’a jamais été vraiment appliquée, même par ses épigones tel Jacques Monod, et n’est pas applicable. Les raisons de ces échecs doivent être recherchées non seulement dans la logique potentielle, mais aussi dans le modèle déductif-nomologique, au fondement du critère et qui deviendra la norme de toute science empirique. Si le modèle D-N d’explication, formalisé plus tard par Carl Hempel, peut servir à la construction du modus operandi de la réfutation en physique, il ne peut prétendre à l’opérabilité dans les disciplines où l’existence de lois demeure problématique et la notion de prédiction plurielle comme en biologie. Enfin la thèse, s’appuyant sur l’analyse critique de l’épistémologie poppérienne, propose une typologie des prédictions, précise la spécificité des énoncés biologiques et envisage un autre critère de scientificité qui prenne davantage en compte la science en action. / Karl Popper's falsifiability (1902-1994) defines at the same time the standard of scientific knowledge, and is presented in the form of a criterion of the empirical character of any scientific theory. The thesis reflects the ambiguity of an epistemology that is grounded in potential logic while aiming practical effectivity. It is impossible with such a criterion to rule on the scientificity of disciplines as diverse as Marxism, psychoanalysis, the theory of the evolution, astrology, studied by Popper and excluded from the field of sciences for lack of predictability. The thesis also highlights that, although very influential in biology, Popper’s normative epistemology has never really been applied, even by his followers like Jacques Monod, and is not applicable. The reasons for these failures must be investigated not only in potential logic, but also in the deductive-nomological model, the basis of the criterion, and which will become the norm in empirical science. If D-N model of explanation, formalized later by Carl Hempel, can be used for the construction of the modus operandi of the falsification in physics, it cannot be applied in the disciplines where the existence of laws remains problematic and where the concept of prediction is plural, live in biology. Finally the thesis, based on a critical analysis of Popper’s epistemology, proposes a typology of predictions, specifies biological statements and tries to look at another criterion of scientificity that takes greater account of science in action.
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Contribution à l'amélioration des techniques de la programmation génétique / Some contributions to improve Genetic ProgrammingEl Gerari, Oussama 08 December 2011 (has links)
Dans le cadre de cette thèse, nous nous intéresseons à l'amélioration des techniques de programmation génétique (PG), en particulier nous avons essayer d'améliorer la performance de la PG en cas d'utilisation de grammaire riche, où l'ensemble de terminaux contient plus que nécessaire pour représenter des solutions optimales. Pour cela, nous avons présenté le problème de la sélection d'attributs en rappelant les principales approches, et nous avons utilisé la technique de mesure de poids des terminaux pour affiner la sélection d'attributs. En second lieu, nous présentons des travaux sur un autre algorithme qui s'inspire de la boucle évolutionnaire : l'évolution différentielle (ED), et nous étudions la performance de cette technique sur la branche de la programmation génétique linéaire. Nous présentons et comparons les performances de cette dernière technique sur un ensemble de "benchmarks" classique de la PG. / This thesis mainly deals with genetic programming. In this work, we are interested in improving the overall performance of genetic programming (GP) when dealing with rich grammar when the terminal set is very large. We introduce the problem of attributes selection and in our work we introduce a scheme based on the weight (based on the frequency) to refine the attribute selection. In the second part of this work, we try to improve the evolution engine with the help of the differential evolution (DE) algorithm. This new engine is applied to linear genetic programming. We then present some experiments and make some comparisons on a set of classical benchmarks.
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Dynamique moléculaire et épidémique du virus de la dengue dans différents écosystèmesDescloux, Elodie 13 December 2011 (has links)
Les facteurs déterminant l’épidémiologie et la sévérité de la Dengue restent mal connus. La compréhension de la dynamique des épidémies est indispensable au management de la lutte anti-vectorielle et des futures stratégies vaccinales. Dans un premier travail, la caractérisation moléculaire de 181 souches de Dengue-1 a permis de déterminer l’origine des épidémies en Polynésie Française (2001, 2006) et d’identifier un phénomène de ré-émergence. La fixation d’une mutation (E-S222T) en période endémique pourrait refléter une adaptation du virus au moustique. A l’échelle intra-hôte, la diversité des populations virales était significativement inférieure en cas de forme sévère suggérant une relation entre diversité génétique virale et clinique.Dans un second travail, cette relation a été confirmée (Bolivie, épidémie de Dengue-1, 2009) et l’importance de la composition des populations virales dans le sang capillaire a été soulignée. Dans un troisième travail, nous avons étudié l’influence du climat sur les épidémies de Dengue (Nouvelle Calédonie, 1971-2010) et développé un modèle prédictif de risque épidémique utilisable par les autorités de santé. / The determinant factors of Dengue epidemiology and severity remain unclear. Understanding the epidemic dynamics is crucial to manage vector control and vaccine strategies in the future. In a first work, the molecular characterization of 181 Dengue-1 strains allowed to determine the origin of Dengue outbreaks in French Polynesia (2001, 2006) and to identify a phenomenom of re-emergence. A mutation (E-S222T) has been fixed during the endemic period that may reflect viral adaptation to the mosquito. At the intra-host scale, the genetic variability was significantly lower in patients experiencing severe forms. This suggests a relationship between the diversity of viral populations within hosts and the clinical presentation of the disease.In a second work, this connection has been confirmed (Bolivia, 2009 Dengue-1 outbreak) and the importance of the composition of viral populations in the capillary blood has been underlined.In a third work, the influence of climate on Dengue epidemics has been studied (New Caledonia, 1971-2010) and a predictive model of epidemic risk usable by the health authorities has been developed.
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Caractérisation structurale et enzymatique, cibles potentielles et rôles physiologiques de glutathion transférases à cystéine catalytique de Phanerochaete chrysosporium / Structural and enzymatic characterization, physiological roles of Phanerochaete chrysosporium cysteine containing glutathione transferasesMeux, Edgar 07 December 2012 (has links)
Phanerochaete chrysosporium est un champignon modèle étudié en particulier pour ses capacités ligninolytiques et son aptitude à dégrader un grand nombre de polymères aromatiques toxiques dérivés notamment des hydrocarbures polycycliques. Durant ces processus de dégradation, une multitude de composés hautement réactifs et toxiques pour les cellules vont dans un premier temps être générés puis dégradés ou excrétés hors de la cellule. Le séquençage complet du génome de P. chrysosporium a permis d'identifier plusieurs superfamilles d'enzymes impliquées dans les mécanismes de tolérance à ces composés toxiques. Parmi elles, les glutathion transférases sont présentes au sein de tous les règnes du vivant et constituent une superfamille multigénique jouant un rôle dans la protection cellulaire, le métabolisme secondaire et la détoxication. Cependant, en dépit de nombreuses études réalisées en particulier chez les vertébrés, le rôle joué par ces enzymes dans la détoxication des dérivés aromatiques toxiques est encore inconnu chez les basidiomycètes. L'analyse comparative des séquences de GST présentes au sein des différents règnes du vivant révèle que les GST fongiques ont évolué différemment de leurs orthologues, notamment via l'extension de sous-classes très peu représentées chez les vertébrés. Parmi elles, les GST à cystéine catalytique représentent 30 % de cette superfamille d'enzymes chez P. chrysosporium. Trois isoformes fongiques ainsi qu'une protéine orthologue exprimée chez une bactérie lignivore ont été caractérisées in vitro tant au niveau biochimique que structural. Ces enzymes sont impliquées dans la déglutathionylation d'une grande variété de molécules électrophiles potentiellement toxiques et issues notamment de la dégradation de polymères aromatiques halogénés. La recherche de substrats a permis d'identifier plusieurs classes fonctionnelles, néanmoins l'activité des quatre isoformes s'effectue via l'attaque directe du conjugué glutathionylé par la cystéine catalytique, qui est dans un deuxième temps régénérée par un réducteur. L'analyse comparée prouve également l'existence d'une nouvelle classe structurale et fonctionnelle appelée glutathionyl hydroquinone réductase absente chez les vertébrés. Ces protéines présentent un mode de dimérisation original ainsi que la capacité tout à fait particulière de déglutathionyler les quinones. Ces résultats suggèrent que les champignons ont développé des mécanismes de résistance en réponse à des contraintes environnementales, notamment via l'évolution de familles multigéniques telles que les GST à cystéine catalytique qui sont impliquées dans le métabolisme et la tolérance vis-à-vis d'une grande variété de composés d'origine exogène ou endogène / Phanerochaete chrysosporium is a model fungus well studied for its lignolytic properties towards wood compounds and various toxic aromatic derivatives such as polycyclic aromatic hydrocarbons. These degradation processes lead first to the formation of highly reactive and toxic compounds, which are then catabolized or excreted outside the cell. Genomic data allowed the identification of genes coding for superfamilies of enzymes putatively involved in these tolerance mechanisms. Among them, glutathione transferases are present in all kingdoms and constitute a multigenic superfamily of enzymes involved in cell protection and detoxification. However, although numerous studies have been performed on vertebrate enzymes, the role of these enzymes in the detoxication of toxic aromatic compounds is still unknown in basidiomycetes. The comparative analysis of GST sequences from various kingdoms of life reveals that fungal GSTs have evolved differently from their orthologs, in particular through the expansion of sub-classes poorly represented in vertebrates. Among them, GSTs with a catalytic cysteine represent 30% of this superfamily of enzymes in P. chrysosporium. Three Cys containing fungal isoforms have been characterized at the biochemical and structural levels, including an orthologue from lignolytic bacteria. All these enzymes are involved in deglutathionylation processes using a wide range of aromatic halogenated electrophilic compounds, including potentially toxic derivatives arising from the degradation of halogenated aromatic polymers. This GSTs family can be organized in various functional groups based on their substrate specificities, but still the catalytic process remains the same with the direct attack of the glutathionylated compound by the catalytic cysteine which is then reduced and regenerated. The comparative analysis of three isoforms revealed a new structural and functional class called glutathionyl hydroquinone reductase absent in vertebrates. These proteins exhibit a new mode of dimerization as well as the ability to deglutathionylate quinones. These results suggest that fungi have developed resistance mechanisms in response to environmental stresses, notably through the evolution of multigenic families such as catalytic cysteine bearing GSTs which are likely involved in the metabolism and tolerance towards a wide range of exogenous or endogenous compounds
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Evolution moléculaire et structurale des membres de la famille génique des lipases pancréatique / Structural and functional evolution within the pancreatic lipases gene familyDridi, Kaouther 29 May 2013 (has links)
Helicoverpa armigera et Epiphyas postvittana, deux insectes nuisibles pour l'agriculture, ont développé des résistances contre la plupart des insecticides connus. Les lipides étant les constituants majeurs de leur régime alimentaire, les fonctions digestives des lipases deviennent alors une cible privilégiée pour l'élaboration de nouveaux insecticides. L'identification récente de gènes codant pour l'expression de protéines potentiellement actives et inactives apparentées aux lipases pancréatiques (PLRP) dans le tractus digestif de ces deux insectes et dont le niveau de transcription varie en fonction de leur régime alimentaire a ouvert un nouveau champ de recherche. Dans le but de contribuer à cette thématique, nous avons construit cinq lipases recombinantes d'E. postvittana (EpLIPs) et testé leur expression dans trois systèmes différents (E.coli, P.pastoris et bacculovirus). Le tractus digestif de Helicoverpa armigera a été étudié par chromatographie échangeuse d'ions et les différentes protéines séparées ont été testées en spectrométrie de masse et sur pHstat pour l'activité. Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence, pour la première fois, la présence à la fois d'une lipase active et d'une lipase inactive dans le tractus digestif d'un lépidoptère. Par ailleurs, la caractérisation biochimique d'un mutant GPLRP2-Δ β9 a été faite dans le but de comprendre l'effet de cette boucle, partiellement délétée dans les lipases d'insectes, dans la spécificité du substrat. Nous avons pu montrer que cette boucle β9 est essentielle pour la stabilisation de la chaîne acyle durant la réaction de lipolyse. / Helicoverpa armigera and Epiphyas postvittana, two major pest crops, have developed resistances against most of the known insecticides. Lipids being a major component of insect diet, digestive function of lipase are a target of choice for new insecticide design. The recent identification of active and inactive pancreatic lipase related protein (PLRP) genes in those two insects midgut, with a level of transcription depending on the diet, opened the field of insect digestive lipase study. In order to contribute to this thematic, we built five recombinants lipase from E. postvittana (EpLIPs) and tested their expression in three different systems (E.coli, P.pastoris and bacculovirus). Protein structure prediction of EpLIPs allowed us to develop some functional hypothesis enlightening the role of inactive lipase in lipid transport. H. armigera midgut contents were separated through a one step purification chromatography and the different fractions were tested for activity and mass spectrometry. The results obtained gave the first evidence of the presence of both an active and an inactive lipase in lepidopteran midgut. In addition to this work, a biochemical characterisation of a β9 GPLRP2 mutant was carried out to understand the effect of this loop, partially deleted in insect lipase, in substrate specificity. The result shows that β9 loop is essential for stabilizing the leaving acyl chain during the lipolysis reaction.
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Comment le X vient-il à la rescousse du Y ? : évolution de la compensation de dosage des XY humains et autres questions sur l'évolution des chromosomes sexuels eucaryotes / The Y rescued by the X ? : evolution of dosage compensation in humans and other questions on sex chromosome evolution in eukaryotesPessia, Eugénie 12 December 2013 (has links)
Un premier pan de ma thèse concerne deux différents mécanismes de sauvetage du Y par le X. Premièrement, j'ai participé à une controverse sur la compensation de dosage chez les mammifères. Une hypothèse avait été proposée dans les années 60 par Susumo Ohno, proposant un mécanisme de compensation en deux temps. Chez les mâles, la perte de nombreux gènes sur le Y entraîne un déséquilibre de dosage car ces gènes qui étaient précédemment présents en deux copies sont devenus unicopie, soit une division d'expression par deux. Selon l'hypothèse d'Ohno, chez les mammifères en réponse à cela le X aurait doublé son expression, mais dans les deux sexes menant ainsi à une expression trop élevée chez les femelles. Ce deuxième problème de dosage aurait alors été résolu par la mise en place d'une inactivation aléatoire de l'un des deux X chez les femelles. Tandis que la deuxième partie de l'hypothèse d'Ohno, l'inactivation du X, a été très étudiée, la première partie est restée spéculative jusqu'aux années 2000. En étudiant des données d'expression du X humain j'ai pu montrer, de manière concomitante avec d'autres auteurs, que la première partie de l'hypothèse d'Ohno n'est pas totalement vraie car seule une partie des gènes sont sur-exprimés. J'ai ensuite participé à l'écriture d'une revue visant à donner une explication alternative à la compensation de dosage pour l'évolution de l'inactivation du X chez les femelles mammifères. Deuxièmement, j'ai étudié la présence de conversion génique X-Y dans plusieurs gènes, au sein de nombreuses espèces de primates. Mes travaux me mènent à discuter le fait que ce type d'évènement soit effectivement favorisé par la sélection. Je pose l'hypothèse que ces conversions géniques ont été maintenues de manière neutre. Ces deux travaux ne vont pas dans le sens d'un chromosome X sauvant le Y avec beaucoup de zèle. Dans un dernier temps, m'éloignant des espèces modèles, j'ai étudié les chromosomes sexuels particuliers d'une algue brune : Ectocarpus siliculosus. Cela m'a permis de vérifier si le scénario évolutif actuel des chromosomes sexuels est toujours valide dans un groupe d'eucaryotes séparé des animaux depuis plus d'un milliard d'années / The first part of my thesis concerns two different mechanisms of the Y being rescued by the X. Firstly, I contributed to a controversy on mammalian dosage compensation. During the 60s Susumo Ohno hypothesized a two-step dosage compensation mechanism. In males, the high loss of Y-linked genes led to a dosage imbalance: these genes were previously present in two allelic copies and became unicopy, meaning that their expression has been halved. According to Ohno’s hypothesis, in response to this imbalance the mammalian X would have doubled its expression in the two sexes, resulting in a to high expression in females. This second dosage imbalance would have been resolved by the random inactivation of one of the two Xs in females. Whereas the second part of Ohno’s hypothesis, the X-chromosome inactivation, has been well studied, the first part remained speculative until the 2000s. I studied human X-linked expression data and was able to show, concomitantly with other authors, that the first part of Ohno’s hypothesis is not totally true as only some of the X-linked genes are hyperexpressed. I later participated in the writing of a review aiming to give an alternative hypothesis for the evolution of X-chromosome inactivation in mammalian females than dosage compensation. Secondly, I studied signatures of X-Y gene conversion in several genes within numerous primate species. Myresults led me to discuss if these events were indeed selected for. I hypothesize that these gene conversion events occurred in a neutral manner. These two different studies suggest that the X chromosome may not be as much a help for the Y as has been suggested. Lastly, moving away from model species, I studied the peculiar sex chromosomes of a brown alga: Ectocarpus siliculosus. This work allowed me to test if the current hypotheses on sex chromosome evolution still hold in a eukaryotic group that diverged from animals more than one billion years ago
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