Chez les vertébrés, le battement coordonné des cils motiles présents par centaines à la surface apicale des cellules multiciliées (MCC) est requis pour propulser directionnellement les fluides biologiques à l'intérieur de certains organes (voies respiratoires, ventricules cérébraux, trompes utérines ou certaines structures embryonnaires). De nombreuses pathologies humaines sont associées à des défauts ciliaires ou à une perte des MCC (dyskinésies ciliaires, mucoviscidose, asthme,...). Dans ce contexte, mon travail de thèse a consisté à élucider les mécanismes complexes contrôlant la différenciation des MCC et donc la formation des cils motiles (multiciliogenèse). Par des approches de génomiques fonctionnelles à partir de deux modèles d'épithéliums multiciliés évolutivement éloignés (épithélium respiratoire humain et épiderme d'embryon de Xénope) nous avons identifié la famille des microARN (petits ARN non-codants régulateurs de l'expression génique) miR-449 comme majoritairement exprimée dans les MCC. Nous avons montré que miR-449 contrôle la multiciliogenèse i) en bloquant le cycle cellulaire, ii) en réprimant directement la voie de signalisation Notch et iii) en inhibant l'expression de la petite GTPase R-Ras. Enfin, nos travaux montrent que l'ensemble de ces mécanismes est conservé chez les vertébrés. En conclusion, miR-449 est un nouveau régulateur clé de la multiciliogenèse conservé au cours de l'évolution. Nos résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant des petits ARN régulateurs dans le traitement de certaines pathologies associées à des défauts ciliaires.

Les cellules épithéliales forment un tissu de cellules étroitement juxtaposées qui assure une barrière physique et chimique entre les compartiments internes et externes du corps. L’intégrité de ces tissus est donc essentielle. Au cours du développement et de la vie adulte, le tissu doit grandir ou se régénérer, ce qui implique de nombreuses divisions cellulaires. La dernière étape de la division, la cytodiérèse, met en jeu la formation d’un anneau contractile qui, en se fermant, va séparer les cellules sœurs. Une fois complètement fermé, il donne naissance au midbody, juste sous le niveau des jonctions adhérentes, au sein des jonctions septées, chez la drosophile. L’ultime étape, l’abscission, permet la séparation physique définitive et l’isolation cytoplasmique des cellules sœurs. Si de nombreuses études ont décrit ces processus dans les cellules isolées, peu de choses sont connues quant à la cytodiérèse des cellules épithéliales. Ce travail de thèse a permis de mettre en évidence que malgré le recrutement de tous les effecteurs et régulateurs de l’abscission, celle-ci est retardée dans les cellules épithéliales. Des expériences de photo-conversion de KAEDE ont montré que l’abscission est liée à l’entrée en mitose des cellules épithéliales. La question de l’intégrité du tissu et notamment de la barrière de perméabilité a ensuite été investigué. Nous avons montré que les cellules voisines formaient des protrusions de membrane restant connectées au midbody tout au long de sa lente migration vers le pôle basal des cellules. Les expériences de FRAP menées sur les jonctions bicellulaires et tri-cellulaires des jonctions septées ont permis de montrer que celles-ci se formaient juste sous les jonctions adhérentes et toujours au-dessus du midbody, participant ainsi à la migration de ce dernier vers le pôle basal. Les contacts maintenus avec les voisines ainsi que l’assemblage polarisé des jonctions septées participent au maintien de l’intégrité du tissu au cours des divisions de cellules épithéliales. / Epithelial cells are closely juxtaposed to form a tissue playing a physical and chemical barrier between external and internal body compartments. Thus, tissue integrity is essential. During development and adult life, epithelia has to growth and regenerate meaning a lot of divisions. At the end of cell division, cytokinesis occurs, implying the formation of a contractile ring which contracts to separate daughter cells. In Drosophila, once totally closed, the contractile ring gives rise to the midbody, just below adherens junctions, in the septate junctions layer. Last step of cytokinesis, abscission, permits the final cut and the cytoplasmic isolation of daughter cells. If cytokinesis is well described in isolated cells, little is known about epithelial cells cytokinesis. This work shows that whereas all abscission regulators and effectors are recruited, abscission is delayed in epithelial cells. KAEDE photo-conversion assays show that abscission is linked to epithelial cells mitosis entry. Then we investigate how permeability barrier is maintained during cell division. We show that neighboring cells present finger-like protrusions contacting the midbody all along the midbody is moving basally across septate junctions. FRAP experiments on bicellular and tricellular septate junctions show that they form just below adherens junctions and always above the midbody, leading to its basal migration. Contacts maintained with neighbors and polarized assembly of septate junctions participate to the maintenance of tissue integrity throughout epithelial cells divisions.

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Ces travaux de thèse s’inscrivent dans le cadre du projet ANR NEMRO, visant à étudier le lien entre déficience olfactive et maladies neurodégénératives. A cet effet, une biopsie optique de l’épithélium olfactif doit être réalisée. Son accès est cependant impossible, aujourd’hui, avec les outils conventionnels. Pour résoudre ce problème, nous proposons l’utilisation d’un robot à tubes concentriques (RTC). Sa synthèse est réalisée à partir d’images médicales. Elle prend en compte les critères de stabilité, la variabilité inter-sujet, et est associée à un déploiement ALFI (A La File Indienne). Le dispositif étant porté par le sujet, il doit être léger et compact. Une séquence de déploiement spécifique simplifie alors l’unité d’actionnement, et une implémentation est réalisée par fabrication additive multimatériaux. L’évaluation préliminaire d’un déploiement ALFI et des éléments de technologie clés a permis de valider l’approche retenue dans le projet NEMRO, ainsi que sa faisabilité. / This PhD thesis is part of the ANR NEMRO project, whose goal is to study the hypothetical correlation between olfactory deficiency and neurodegenerative diseases. For this purpose, an optical biopsy of the olfactory epithelium must be performed. However, this area is not accessible today with conventional tools. To go beyond this limitation, we propose to investigate the use a concentric tube robot (CTR). Its synthesis is performed from medical images. It takes into account the stability criteria, inter-subject variability, and is associated to a FTL (Follow-The-Leader) deployment. As the device is mounted on the subject, it has to be compact and lightweight. Thus, a specific deployment sequence simplifies the actuation unit, and an implementation is proposed using multimaterial additive manufacturing. Preliminary evaluations of the FTL deployment capabilities and the key components of the device allowed to validate the approach chosen for the NEMRO project, and its feasibility.

Objectifs : Ce travail a pour but de développer un larynx artificiel composé de 2 structures : 1) une structure inamovible en titane poreux prolongeant la trachée; 2) une double valve remplissant la fonction de sphincter. Matériels et Méthodes : L’intégration de la prothèse en remplacement trachéal a été testée in vitro et in vivo sur les modèles animaux rats, lapins et brebis. Suite à l’ensemble de ces résultats, nous avons réalisé la première application clinique du larynx artificiel. Résultats : 1) L’ajout d’un tube de silicone endoprothétique améliore la survie chez le gros animal; 2) l’intégration tissulaire de la prothèse de trachée associée à un matériel polymérique biodégradable était supérieure à celle des prothèses en titane poreux nu; 3) la vitesse de colonisation des prothèses en titane poreux était accélérée lorsque l’on diminuait la taille des billes. Un premier patient a été implanté avec une prothèse de larynx artificiel avec des résultats satisfaisants à 9 mois. Conclusions : Nos études concernant l’intégration de prothèses de trachées in vitro et in vivo ont permis de contribuer à l’aboutissement de la première application clinique de larynx artificiel. / Background: The aim of this work is the design of an artificial larynx made of 2 elements: 1) a non-removable bio-integrable structure designed to provide a connection with the remaining trachea; 2) a double valve that fulfills the sphincter function. Materials and Methods: In vitro and in vivo tests (rat, rabbit and sheep model) were performed to achieve the tracheal prosthesis integration. Following all these results, we carried out the first clinical application of an artificial larynx. Results: i) The long-term survival of the animals was improved when an endoprosthetic silicon calibration tube was used; ii) tissue integration of the prostheses in porous titanium filled with biodegradable polymer was better than the bare porous titanium; iii) prosthesis integration was improved when pore size was decreased. A first patient was implanted with an artificial functional larynx with satisfactory results after 9 months of implantation. Conclusion: The whole in vivo and in vitro studies concerning the integration of the tracheal prosthesis has contributed to the success of the first clinical application of the artificial larynx.

Les molécules HLA de class Ib ou nonclassiques, HLA-G, -E et -F, sont impliqués dans la régulation de la tolérance immunologique. En particulier, les polymorphismes génétiques ainsi que l’expression différentielle de HLA-G sont corrélés à l’évolution clinique des pathologies inflammatoires et des greffes d’organe. Notre premier travail a permis de montrer que la structure génétique de HLA-G était conservée dans des populations au patrimoine génétique différent (Mali et Sud de la France) et que, les haplotypes résultants (UTR), étaient corrélés à l’expression différentielle d’HLA-G soluble. Dans une deuxième étude on a pu montrer l’association différentielle des haplotypes HLA-G UTR avec certain allèles HLA-E, -A, -H, -G et -F suggérant une interaction privilégiée et/ou un effet tolérant synergique entre ces molécules. Une troisième étude a mis en évidence que deux haplotypes HLA-G UTR étaient corrélé à une évolution clinique péjorative dans la mucoviscidose et dans la transplantation pulmonaire. En fin, on a pu montrer une expression différentielle des isoformes de HLA-G dans les cellules épithéliales bronchiques (CEB), redifférencié in vitro, de témoins sains et patients atteints d’asthme avec une expression diminuée chez les asthmatiques. Finalement, l’ensemble de ces données suggèrent que la molécule HLA-G peut être un biomarqueur génétique et/ou sérologique attrayant et une cible thérapeutique potentielle via la modulation de son effet tolérogène dans un contexte de pathologies inflammatoires ou de conflit immunologique, tel que la transplantation d’organe et la transfusion. / HLA nonclassical class Ib genes HLA-G, -E and -F are involved in managing immune tolerance. Particularly for HLA-G, both its genetic polymorphism and its expression are correlated to clinical outcome in different pathologies, particularly in inflammatory disease and organ transplantation. In our first work we have shown that HLA-G genetic structure was conserved in distant healthy populations (Mali and South France) and that, the resulting haplotypes (UTR) were correlated to sHLA-G differential expression. In another study we observed a differential association between HLA-G UTR haplotypes and specific HLA-E, -A, -H, -F alleles that might reflect a privileged interaction and/or a synergistic tolerant effect between these molecules In a third study we showed that two different HLA UTR haplotypes were respectively associated with a worse evolution of cystic fibrosis and an impaired survival in lung transplant recipients. Afterwards, the analysis HLA-G isoforms expression in normal, mild and severe asthmatic human bronchial epithelial cells redifferentiated in vitro showed that the level of these transcripts was significantly reduced in asthmatics compared to controls. In conclusion, these results suggest that HLA-G molecule might be an attractive genetic and/or serologic biomarker and a potential therapeutic target, via the modulation of its tolerogenic effect, in specific allogenic and inflammatory contexts, such as solid organ transplantation or blood transfusion.

Dans la mucoviscidose (CF), Pseudomonas aeruginosa colonise les voies respiratoires, conduisant à une inflammation chronique de l’épithélium bronchique. Une analyse transcriptomique antérieure nous a permis d’identifier CHAC1 comme un gène différentiellement exprimé entre les cellules épithéliales bronchiques primaires de patients CF et non-CF, au niveau basal et au cours de l’infection à P. aeruginosa. CHAC1 est une protéine dégradant le glutathion et associée au stress du réticulum endoplasmique et à l’apoptose. L’objectif principal de ce travail était de comprendre la contribution de CHAC1, en particulier dans la réponse inflammatoire et l’apoptose des cellules épithéliales pulmonaires. Nous avons donc, dans un premier temps, confirmé que CHAC1 est surexprimé au niveau ARNm dans les cellules épithéliales bronchiques primaires non-CF par rapport aux cellules CF. Nous avons observé que P. aeruginosa et deux de ses facteurs de virulence, le LPS et la flagelline, induisent l’expression de CHAC1 dans les cellules non-CF. L’expression de CHAC1 induite par le LPS est indépendante de PERK mais implique ATF4. De plus, nous avons observé qu’une réduction de l’expression de CHAC1 est associée, après stimulation par du LPS et de la flagelline, à une modulation des marqueurs inflammatoires notamment l’IL-8, l’IL-6, CCL2 et PGE2. Enfin, nous avons montré que P. aeruginosa n’est pas capable d’induire de l’apoptose dans la lignée de cellules épithéliales bronchiques NCI-H292. Ces résultats suggèrent que la régulation de l’expression de CHAC1 dans les cellules CF pourrait contribuer à la réponse inflammatoire excessive et chronique observée chez les patients atteints de mucoviscidose. / In cystic fibrosis (CF), Pseudomonas aeruginosa colonizes the airways, leading to chronic inflammation of the bronchial epithelium. A previous transcriptomic analysis allowed us to identify CHAC1 as a gene differentially expressed between primary bronchial epithelial cells of CF and non-CF patients at the basal level and during P. aeruginosa infection. CHAC1 is a glutathione-degrading protein associated with endoplasmic reticulum stress and apoptosis. The main objective of this work was to understand the contribution of CHAC1, particularly in the inflammatory response and apoptosis of pulmonary epithelial cells. We therefore first confirmed that CHAC1 is overexpressed at the mRNA level in non-CF primary bronchial epithelial cells relative to CF cells. We observed that P. aeruginosa and two of its virulence factors, LPS and flagellin, induce CHAC1 expression in non-CF cells. The expression of CHAC1 induced by LPS is independent of PERK but involves ATF4. Moreover, we have observed that a reduction in the expression of CHAC1 is associated, after stimulation by LPS and flagellin, with a modulation of the inflammatory markers, in particular IL-8, IL-6, CCL2 and PGE2. Finally, we have shown that P. aeruginosa is not capable of inducing apoptosis in the NCI-H292 bronchial epithelial cell line. These results suggest that CHAC1 is involved in the regulation of bronchial cell inflammation during P. aeruginosa infection and the regulation of CHAC1 expression in CF cells may contribute to the observed excessive and chronic inflammatory response in patients with cystic fibrosis.

La rhinosinusite chronique (RSC) est une maladie inflammatoire des sinus suffisamment prévalente au Canada et pouvant avoir un impact significatif sur la qualité de vie des patients. Depuis plusieurs années, cette maladie complexe constitue un terrain fertile pour la recherche scientifique. Bien qu’elle soit bien comprise au niveau syndromique, plusieurs mystères persistent quant aux mécanismes physiopathologiques sous-jacents. Ces questionnements pourraient potentiellement expliquer les différences cliniques observées, particulièrement dans les réponses thérapeutiques. Considérant les lacunes persistantes dans la compréhension entière de la maladie, le présent mémoire tente de faire le point sur les endotypes épithéliaux ainsi que sur le pathobiome de la RSC. Dans un premier temps, l’analyse transcriptomique de cellules épithéliales cultivées en laboratoire de patients avec RSC a permis d’identifier deux groupes distincts en termes de marqueurs inflammatoires et de signature épithéliale. Ceci laisse supposer que ces mécanismes physiopathologiques seraient grandement impliqués dans la maladie. Dans un deuxième temps, et dans un objectif exploratoire et de faisabilité, le séquençage d’échantillons de RSC a permis de détecter la présence de virus, laissant présager que ceux-ci pourraient avoir un rôle dans la physiopathologie de la maladie et combler les mystères résiduels dans sa compréhension globale. En conclusion, les endotypes déterminés par le profil d’expression génique permettraient une meilleure classification de la RSC et une meilleure personnalisation des thérapies. De plus, la présence tangible de virus dans la RSC est certainement prometteuse et ouvre une grande porte de recherche. Toutefois, d’autres études seront nécessaires pour mieux caractériser leur nature et leur rôle. / Chronic rhinosinusitis (CRS) is a complex inflammatory disease of the sinuses that is prevalent in Canada and that can significantly affect patients’ quality of life. For several years now, this heterogenous disease have been in the scope of many scientific research. While CRS is clinically well understood, much remains unknown concerning the underlying pathophysiological mechanisms. This could potentially explain the notable clinical differences observed between patients, especially in terms of therapeutic responses. In hope of bridging the gaps in understanding CRS, the present thesis aims to discuss epithelial endotypes as well as the feasibility and potential role of viruses in CRS. Firstly, gene expression profiling revealed two distinct clusters of CRS patients: a group with severe non-Type 2 inflammation and epithelial dysfunction, and a group characterised by moderate non-Type 2 inflammation and epithelial dysfunction. This highlights that these two different mechanisms are involved in the development of CRS. Secondly, and with an exploratory intent, next-generation sequencing and transcriptomic assembly of CRS samples have confirmed the presence of viruses, suggesting that viruses are present in CRS and could possibly play a role in the pathogenesis of this disease, potentially addressing the shortcomings in CRS. To summarize, epithelial endotypes identified by gene expression profiling could aid in better classifying CRS to provide a tailored therapeutic option. The presence of viruses in CRS samples unfolds an interesting chapter in this field. However, larger populations will be required to better characterize the nature of these viruses and to assess their intrinsic role in CRS.

Objectifs : Ce travail a pour but de développer un larynx artificiel composé de 2 structures : 1) une structure inamovible en titane poreux prolongeant la trachée; 2) une double valve remplissant la fonction de sphincter. Matériels et Méthodes : L'intégration de la prothèse en remplacement trachéal a été testée in vitro et in vivo sur les modèles animaux rats, lapins et brebis. Suite à l'ensemble de ces résultats, nous avons réalisé la première application clinique du larynx artificiel. Résultats : 1) L'ajout d'un tube de silicone endoprothétique améliore la survie chez le gros animal; 2) l'intégration tissulaire de la prothèse de trachée associée à un matériel polymérique biodégradable était supérieure à celle des prothèses en titane poreux nu; 3) la vitesse de colonisation des prothèses en titane poreux était accélérée lorsque l'on diminuait la taille des billes. Un premier patient a été implanté avec une prothèse de larynx artificiel avec des résultats satisfaisants à 9 mois. Conclusions : Nos études concernant l'intégration de prothèses de trachées in vitro et in vivo ont permis de contribuer à l'aboutissement de la première application clinique de larynx artificiel.

Certaines brûlures oculaires graves ou d'autres pathologies oculaires rares peuvent être associées à une perte totale de cellules souches épithéliales de la cornée (DCSL), ce qui conduit à une opacification de la cornée par invasion de la conjonctive. Lorsque la DCSL est totale et bilatérale, le limbe controlatéral n'est pas disponible pour la greffe de limbe autologue ou la culture de cellules souches autologues limbiques et la transplantation allogénique de la cornée est impossible car toujours rejetée en raison de la néovascularisation. Une thérapie innovante testée avec succès au sein de notre laboratoire, en collaboration avec le service d'ophtalmologie des HCL, consiste en une greffe autologue de Feuillet Epithélial (FE) dérivé de Muqueuse Orale (MO). Cette approche permet de restaurer la transparence et autorise, si nécessaire, une greffe cornéenne complémentaire. Cette technique a montré son efficacité lors d'un essai clinique conduit dans notre hôpital mais le dispositif breveté permettant le détachement non enzymatique des feuillets cultivés n'est plus disponible en Europe. Nous avons donc mis au point un nouveau procédé de production de FE dérivant de la MO dont la preuve de concept a été obtenue à partir d'études in-vitro et ex-vivo. En effet, un détachement avec 0,5 mg / mL de collagénase n'endommage pas le FE de MO et les protéines de la membrane basale, et, dans un modèle de stroma porcin exvivo, ces feuillets adhérents au stroma, continuent à se renouveler sous la forme d'épithélium différencié. De plus, dans le cas d'une opacité stromale associée à une DCSL, une greffe secondaire de cornée est nécessaire pour améliorer l'Acuité Visuelle (AV), c'est pourquoi nous avons cherché à développer pour ces patients à haut risque de rejet, un stroma décellularisé. Ce stroma pourrait également répondre à la pénurie de cornées dans les pays en voie de développement grâce à sa conservation longue et facile. La lyophilisation a été combinée à la décellularisation des cornées au SDS à 0,1 %, validée sur les cornées humaines sur le maintien de leur transparence et de l'ultrastructure du stroma associé à l'absence des antigènes HLA-ABC et HLA-DR. Enfin, dans un modèle de Kératoplastie Lamellaire Antérieure Profonde (KLAP) ex-vivo, nous avons montré que les cellules épithéliales et stromales de la cornée humaine receveuse colonise le stroma décellularisé. Ainsi, nos travaux permettent de proposer un traitement des DSCL totales et bilatérales associées ou non à une atteinte du stroma / Some severe ocular burns or other rare ocular pathologies may be associated with a complete loss of corneal epithelial stem cells (LSCD), leading to an opacification of the cornea by invasion of the conjunctiva. When DCSL is total and bilateral, contralateral limbus is not available for autologous limb transplant or limbal autologous stem cell culture, and allogeneic transplantation of the cornea is not an option since neovascularization is constantly responsible for graft rejection. An innovative therapy tested with success in our laboratory, in collaboration with the ophthalmology department of the HCL, consists in an autologous Epithelial Cell Sheet (ECS) graft derived from Oral Mucosa (MO). This approach restores transparency and allows in a second step a complementary corneal graft when necessary. This technique has been shown to be effective in a clinical trial conducted in our hospital, but the patented device for the non-enzymatic detachment of cultivated ECS is no longer available in Europe. We have therefore developed a new method for the production of ECS from OM, the proof of concept of which has been obtained from in-vitro and ex-vivo studies. Indeed, detachment with 0.5 mg / mL of collagenase does not damage ECS from OM and basement membrane proteins, and in an ex-vivo porcine stroma model, these cell sheets adhered on corneal stroma, continued to self-renew and generated a differentiated epithelium. Since stromal opacity associated with DCSL requires a secondary corneal graft to improve Visual Acuity (VA), we also sought to develop for these patients with high rejection risk, a new approach for the generation of decellularized stroma. Such a procedure for the production of decellularized stroma was also aimed at allowing a money-saving and reliable long-term storage for stromal grafts and thus circumventing the shortage of corneas in developing countries. Our process, combining lyophilization with decellularization of the corneas at 0.1 % SDS, was validated on human corneas regarding the maintenance of stroma transparency, the stromal ultrastructure associated with the absence of HLA-ABC and HLA-DR antigens. Finally, in an ex-vivo model of Deep Anterior Lamellar Keratoplasty (DALK), we have shown that the epithelial and stromal cells of the recipient human cornea colonized efficiently the decellularised stroma. Overall, our work makes it possible to propose a treatment for total and bilateral LSCD associated or not with lesions of the stroma