Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Heme pathway enzyme δ-aminolevulinate dehydratase (δ-ALA-D) is a good marker for oxidative stress and metal intoxication. This sulfhydrylic enzyme is inhibited in several oxidative pathologies like lead, mercury and aluminum intoxication, selenium organic species exposition and diabetes. Oxidative stress is one of cause of diabetes complications. This occurs due non-enzymatic glucose-mediated reaction, which can change structure of proteins and impair enzymes function. In our study, influences of high glucose, fructose and ribose concentrations on δ-ALA-D activity were evaluated in vitro. The possible mechanism, which underlies δ-ALA-D inhibition, was investigated using lysine, DTT, and t-butylamine. Reducing sugars (glucose, fructose and ribose) inhibit δ-ALA-D and inhibition order was fructose>ribose=glucose. Enzyme inhibition did not involve oxidation of its critical sulfhydryl groups because DTT and sodium borohydride did not modify enzyme inhibition. Furthermore, medium TBARS were not modified by exposition to monosaccharide. Authors diverge to mechanism inhibition of δ-ALA-D by glucose. Either glycosilation or oxidative stress are implicated in model of enzyme impairment. We concluded that δ-ALA-D inhibition caused by high concentrations of reducing sugar is mediated by enzyme glycosilation that lead to conformational changes, which can impair enzyme catalytic function. / A metaloenzima δ-aminolevulinato desidratase (δ-ALA-D) participa da rota biossintética dos compostos tetrapirrólicos como o heme. Ela é considerada um bom marcador de estresse oxidativo e de intoxicação por metais. Essa enzima sulfidrílica encontra-se inibida em várias patologias como a intoxicação por chumbo, mercúrio e alumínio, a exposição a alguns compostos orgânicos de selênio e no diabetes. O estresse oxidativo é apontado como um dos causadores das chamadas complicações crônicas ou tardias da síndrome diabética. Segundo a literatura, uma das causas centrais responsáveis pelo desenvolvimento do estresse oxidativo no diabetes é o aumento dos níveis sangüíneos de glicose. Esse monossacarídeo sofre reações não-enzimáticas, as quais provocam produção de radicais livres, modificação da estrutura de proteínas e prejuízos ao funcionamento de algumas enzimas. Neste estudo, a enzima δ-ALA-D de eritrócitos humanos foi exposta a altas concentrações de glicose, frutose e ribose in vitro para avaliar o papel desses açúcares redutores na inibição da enzima. Esses monossacarídeos inibiram a δ-ALA-D e a ordem de inibição foi frutose > ribose = glicose. A inibição não foi modificada pelo uso de compostos com grupamentos aminas tais como lisina e t-butilamina. Além disso, a inibição não foi revertida com uso de zinco e ditiotreitol (DTT) nem tão pouco ocorreu um aumento significativo dos níveis de espécies reativas de oxigênio (TBARS). De acordo com a literatura, de maneira geral existem dois mecanismos para a inibição da enzima δ-ALA-D por concentrações anormais de glicose. O primeiro baseia-se na existência de estresse oxidativo e oxidação dos grupamentos tiólicos da enzima enquanto que o segundo é devido à glicosilação dos resíduos de lisina do sitio ativo da enzima. Nós concluímos então que a inibição da δ-aminolevulinato desidratase não é mediada pela oxidação dos grupamentos tiólicos do sitio ativo da enzima, pois o emprego de zinco e DTT no meio reacional não preveniu a inibição. Além disso, no curto período de pré-incubação e incubação, não houve aumento de espécies reativas de oxigênio. O mecanismo da inibição envolve, provavelmente, glicosilação do sítio ativo da enzima, o que causa uma modificação conformacional deletéria impedindo a sua ação catalítica.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Mercury is a divalent metal found in the liquid state at room temperature without biological function. Occupational exposure to this metal occurs mainly in industrial activities and agriculture. Its toxicity seems to be due to affinity for sulfhydryl groups and oxidative stress induction. Studies show that mercury causes physiological and biochemical changes in animals and humans. Zinc also is a divalent metal, but in contrast, is an essential element for living beings with important metabolic functions. Studies have indicated beneficial effects of this metal against oxidative damage caused by many toxic substances, including mercury. The objective of this study was to investigate the effect of ZnCl2 and HgCl2 on effect markers and oxidative damage of lactating rats (LR) and non-lactating rats (NLR). Adults LR and NLR received one dose of 27 mg/kg of ZnCl2 (subcutaneously) and after 24 hours received one dose of 5 mg/kg HgCl2 (subcutaneously). The animals were killed 24 hours after the last administration. Kidneys, liver, brain and blood were collected to perform the biochemical test. δ-aminolevulinate dehydratase (δ-ALA-D) activity were analyzed in kidney, liver, brain, and blood; non-protein, total thiols ascorbic acid levels in kidney, liver and brain; catalase activity in kidney and liver; serum urea and creatinine levels; and alanine aminotranferase (ALT) activity in serum and liver. The weights of animals and organs were also analyzed. No alterations were observed in the brains of LR and NLR; ascorbic acid levels also was not changed in tissues analyze. LR and NLR exposed to mercury showed a decrease of kidney total SH levels and an increase of urea and creatinine levels. NLR exposed to mercury showed an inhibition of kidney, liver and blood δ-ALA-D activity, and liver catalase activity. LR exposed to mercury showed an inhibition of blood δ-ALA-D activity and serum ALT activity. LR showed a decrease of liver absolute weight and an increase of kidney relative weight. NLR showed no changes in body and organs weights. Zinc per se increased liver non-protein thiols levels in LR and NLR and decreased liver absolute weight in LR. The pre-treatment with zinc prevented the inhibition of kidney (partially), liver and blood δ-ALA-D and liver catalase activity in NLR. Zinc also prevented the inhibition of blood δ-ALA-D, serum ALT (partially), the decrease in non-protein SH levels (partially) and increase relative weight of kidneys in LR. Thus, we suggest that LR and NLR differ as the toxicity caused by mercury, and the NLR are more sensitive to these toxic effects than the LR. Zinc shows promising effects against the toxic effects on analyzed parameters. / O mercúrio é um metal divalente, encontrado no estado líquido à temperatura ambiente e sem funções biológicas. A exposição ocupacional a esse metal ocorre principalmente em atividades industriais e na agricultura. Sugere-se que sua toxicidade é devida, principalmente, à afinidade por grupamentos sulfidrílicos e indução de estresse oxidativo. Estudos demonstram que o mercúrio causa alterações fisiológicas e bioquímicas em animais e humanos. O zinco também é um metal divalente, mas, em contra partida, é um elemento essencial para os seres vivos com importantes funções metabólicas. Estudos tem apontado efeitos benéficos desse metal contra danos oxidativos causados por muitas substâncias tóxicas, inclusive o mercúrio. Assim, o objetivo desse trabalho foi investigar o efeito do ZnCl2 e do HgCl2 sobre marcadores de efeitos e de dano oxidativo em ratas lactantes (RL) e não lactantes (RNL). RL e RNL adultas receberam subcutaneamente uma dose de 27 mg/kg de ZnCl2 e após 24 horas receberam uma dose de 5 mg/kg de HgCl2. Os animais foram mortos 24 horas após a última administração. Rins, fígado, cérebro e sangue foram coletados para realização dos testes bioquímicos. Foram analisados: a atividade da δ-aminolevulinato desidratase (δ-ALA-D) renal, hepática, cerebral e sanguínea; os níveis de tióis totais e não protéicos e ácido ascórbico de rins, fígado e cérebro; atividade da catalase renal e hepática; os níveis séricos de ureia e creatinina; e a atividade da alanina aminotranferase (ALT) de soro e fígado. Os pesos dos animais e órgãos também foram analisados. Não se observou qualquer alteração nos parâmetros de cérebro das RL e RNL, e nos níveis de ácido ascórbico nos tecidos analisados. RL e RNL expostas ao mercúrio apresentaram uma diminuição nos níveis de SH total de rins e um aumento nos níveis de ureia e creatinina. RNL expostas ao mercúrio apresentaram uma inibição da atividade da δ-ALA-D de rins, fígado e sangue e da catalase hepática. RL expostas ao mercúrio tiveram uma inibição da atividade da δ-ALA-D sanguínea e da ALT sérica. Ainda, as RL apresentaram uma diminuição no peso absoluto de fígado e um aumento no peso relativo de rins. RNL não apresentaram alterações do peso corporal e dos órgãos. O zinco per se aumentou os níveis de tióis não protéicos de fígado nas RL e RNL e diminuiu o peso absoluto de fígado nas RL. O pré-tratamento com zinco preveniu a inibição da δ-ALA-D renal (parcialmente), hepática e sanguínea e da catalase hepática nas RNL. O zinco também preveniu a inibição da δ-ALA-D sanguínea, da ALT sérica (parcialmente), a diminuição nos níveis de SH não protéicos (parcialmente) e aumento do peso relativo de rins nas RL. Dessa forma, podemos sugerir que RL e RNL diferem quanto à toxicidade causada pelo mercúrio, visto que as RNL são mais sensíveis a esses efeitos tóxicos do que as RL, e que o zinco apresenta efeitos promissores contra essa ação tóxica na maioria dos parâmetros analisados.

The acid aminolevulinato dehydratase (δ-ALA-D) is a thiol enzyme involved in tetrapirrólicos composite biosynthesis, as heme. This enzyme is inhibited by some metals, having been also its inhibition a pointer of poisoning for lead (Pb). Additionally, many studies suggest its inhibition as a marker of it oxidative stress, due the high affinity of groups - SH of the enzyme to the pró-oxidantes agents. Patients with chronic renal insufficience (IRC) under treatment of hemodialysis have oxidative stress amplified, as well as increased aluminum levels. The objectives of this study had been to evaluate in patients IRC under treatment of hemodialysis (HD) and healthly individuals, the effect of the levels of reactive species to the acid tiobarbitúrico (TBARS) in the plasma, a marker of comumente estresse it oxidativo used, and aluminum levels (Al) on the activity of blood δ-ALA-D. Also the envolvement of groups - SH in the activity of the enzyme was evaluated, through the incubation in vitro with dithiothreitol (DTT), a reducing agent. The joined results had been, activity of diminished δ-ALA-D, the increased of TBARS levels and Al (p<0.05) in hemodialisados patients compared with the group of healthly individuals. The activity of the enzyme after incubation with DTT significantly was increased in the hemodialisados ones, but it did not reach the levels found in the healthly individuals. Moreover, the activity of the enzyme was correlated negative with the TBARS levels and Al, however, the partial correlation only showed influence of the TBARS in the activity of the enzyme. It is concluded that in HD patients the activity of δ-ALA-Dsignificantly is diminished, that its groups - SH are inhibited, provalmente had to oxidative stress. However the inhibition of the groups - SH is not the only cause of reduction of the enzymatic activity, since the DTT did not revert its activity the normal levels. / A ácido delta aminolevulinato desidratase (δ-ALA-D) é uma enzima tiólica, envolvida na biossíntese de compostos tetrapirrólicos, como o heme. Essa enzima é inibida por vários metais, sendo inclusive sua inibição um indicador de intoxicação por chumbo (Pb). Adicionalmente, muitos estudos sugerem sua inibição como um marcador do estresse oxidativo, devido a alta afinidade dos grupos SH da enzima aos agentes pró-oxidantes. Pacientes com insuficiência renal crônica (IRC) sob tratamento de hemodiálise têm o estresse oxidativo amplificado, bem como níveis de alumínio aumentados. Os objetivos deste estudo foram avaliar em pacientes com IRC sob tratamento de hemodiálise e indivíduos saudáveis, os efeitos dos níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) no plasma, um marcador do estresse oxidativo comumente utilizado, e níveis de alumínio (Al) sobre a atividade da δ-ALA-D sangüínea. Também foi verificado o envolvimento dos grupos SH na atividade da enzima, através da incubação in vitro com dithiothreitol (DTT), um agente redutor. Os resultados encontrados foram, atividade da δ-ALA-D diminuída, os níveis de TBARS e Al aumentados (p<0,05) em pacientes hemodialisados comparados ao grupo de indivíduos saudáveis. A atividade da enzima após incubação com DTT foi significativamente aumentada nos hemodialisados, mas não atingiu os níveis encontrados nos indivíduos saudáveis. Além disso, a atividade da enzima correlacionou-se negativamente com os níveis de TBARS e Al, no entanto, a correlação parcial mostrou influência somente do TBARS na atividade da enzima.Conclui-se que em pacientes hemodialisados a atividade da δ-ALA-D é significa-tivamente diminuída, que seus grupos SH estão inibidos, provalmente devido ao estresse oxidativo. No entanto, a inibição dos grupos SH não é provavelmente a única causa de diminuição da atividade enzimática, já que o DTT não reverteu sua atividade a níveis normais.

Aerobic exercise of sufficient intensity and duration can result in increased generation of reactive oxygen species and exercise of extreme endurance may cause oxidative stress with a concomitant decreased activity of antioxidant defense systems. The aim of this study was to investigate the possible effect of a peak of oxidative stress exposition on the activity of blood d-ALA-D, an enzyme sensitive to pro-oxidant situations. The protocol of exercise (treadmill) was divided in rest, submaximal exercise, maximal exercise, and recovery. Oxidative stress biomarkers (TBARS production and δ-ALA-D activity), antioxidant defenses systems (catalase activity, -SH and ascorbic acid) were measured in human blood. The maximal exercise induced an increase in TBARS production and -SH levels during submaximal exercise, maximal exercise and recovery when compared with resting. δ-ALA-D activity increased at maximal exercise and recovery when compared with resting. Catalase activity increased during submaximal exercise and recovery when compared to the rest period. The results described here suggest that d-ALA-D was modulated in a way similar to that observed for other biomarkers of oxidative stress. Complementary investigations analyzing the functional role of d-ALA-D activity need to be performed. Additionally, the results suggest that during the test stages the stimulation of antioxidant defense systems (observed by the increase in thiol group levels) were not sufficient to prevent lipid peroxidation even in trained individuals. / O exercício aeróbico realizado em determinada intensidade e duração pode resultar no aumento da geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) sendo que o exercício de extrema resistência pode causar estresse oxidativo com a concomitante diminuição na atividade do sistema de defesa antioxidante. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito na atividade da enzima δ-ALA-D e de outros biomarcadores de estresse oxidativo e defesas antioxidantes em corredores de longa distância submetidos a exercício agudo de curta duração. O protocolo de exercício (realizado em uma esteira ergométrica) foi dividido em repouso, submáximo, máximo e recuperação. Foram avaliados, em sangue humano, os biomarcadores de estresse oxidativo (produção de TBARS e atividade da d-ALAD) sistema de defesa antioxidante (atividade da catalase, -SH e ácido ascórbico). Como resultados, o exercício máximo induziu o aumento na produção de TBARS e níveis de -SH durante o exercício submáximo, máximo e recuperação quando comparados ao repouso. A atividade da d-ALA-D aumentou no exercício máximo e recuperação quando comparada ao período de repouso. Quando comparado ao período de repouso a atividade da catalase aumentou no exercício submáximo e na recuperação. Os resultados deste estudo sugerem que a enzima d-ALAD foi modulada em uma via similar as observadas para outros biomarcadores de estresse oxidativo. Investigações complementares analisando a papel funcional da atividade da d-ALAD necessitam ser realizadas. Ainda, os resultados deste estudo sugerem que durante o protocolo de exercício a estimulação do sistema de defesa antioxidante (observada pelo aumento nos níveis de grupos tióis) não foi suficiente para prevenir a peroxidação lipídica mesmo nos indivíduos treinados.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Mercury is a metal without any biological function. The exposure to mercury in any of different chemical forms can induce toxic effects on living organisms. This toxicity is commonly attributed to the high affinity that this metal has for sulfhydryl groups (SH) and oxidative stress induction. Zinc is an essential metal important in many biochemical and cellular functions, and stands out among the compounds studied for preventing the damage caused by toxic metals such as mercury. Recently we verify the effectiveness of pre-treatment with zinc against the effects caused by mercury in rats sacrificed 24 hours after administration of the toxic metal. However, despite the zinc to prevent some alterations, many questions remain. Thus, we sought to evaluate the toxic effects of mercury in rats analyzed 12 and 48 hours after exposure, and the possible preventive effect of zinc. For this, Wistar rats were injected (s.c.) with 0.9% NaCl (saline) or ZnCl2 (27 mg/kg) and 24 hours later, saline or HgCl2 (5 mg/kg). The animals were sacrificed 12 or 48 hours after administration of mercury. We evaluated the activity of enzymes δ- aminolevulinic acid dehydratase and alanine aminotransferase, and levels of total and nonprotein thiols, ascorbic acid, urea and creatinine, besides analyze metal content in liver, kidney and blood. Body and organs weight were also evaluated. In animals sacrificed 12 hours after treatment with mercury was verified: decrease of ascorbic acid levels and increase of kidney weight, as well as accumulation of mercury and zinc in the kidneys and liver. The zinc pretreatment prevented completely the mercury effect on renal weight of these animals. In 48 hours after mercury exposure, these effects were observed: decrease of weight gain and increase of renal weight, increase of urea and creatinine levels, and reduction of the δ-ALA-D activity and kidney total thiols levels. Furthermore, the treatment with mercury increased levels of this metal in the kidneys and liver. Zinc partially prevented the changes in gain weight and creatinine levels. In conclusion, these results show that mercury caused different modifications in both periods studied and the zinc pretreatment prevented some of the parameters altered by mercury exposure. / O mercúrio é um metal sem qualquer função biológica. A exposição ao mercúrio em qualquer uma de suas diferentes formas químicas pode induzir efeitos tóxicos aos organismos vivos. Esta toxicidade é comumente atribuída à alta afinidade que esse metal possui por grupamentos sulfidrílicos (-SH) e a indução de estresse oxidativo. O zinco é um metal essencial importante em muitas funções bioquímicas e celulares, e destaca-se dentre os compostos estudados, pela prevenção dos danos causados por metais tóxicos como o mercúrio. Recentemente verificamos a eficácia do pré-tratamento com zinco contra os efeitos causados pelo mercúrio em ratas sacrificadas 24 horas após a administração do metal tóxico. Contudo, apesar do zinco prevenir algumas alterações, muitas questões permanecem. Assim, buscamos avaliar os efeitos tóxicos do mercúrio em ratas analisados 12 e 48 horas após a exposição, e o possível efeito preventivo do zinco. Para isso, ratas Wistar foram injetadas (s.c.) com NaCl 0,9% (salina) ou ZnCl2 (27 mg/kg) e 24 horas mais tarde, com salina ou HgCl2 (5 mg/kg). Os animais foram mortos 12 ou 48 horas após a administração de mercúrio. Avaliamos a atividade das enzimas δ-aminolevulinato desidratase e alanina aminotransferase, assim como níveis de tióis totais e não proteicos, níveis de ácido ascórbico, ureia e creatinina, além de analisarmos o conteúdo de metal em fígado, rins e sangue. O peso corporal e de órgãos também foram avaliados. Nos animais mortos 12 horas após o tratamento com mercúrio verificou-se: diminuição dos níveis de ácido ascórbico e aumento do peso renal, assim como acúmulo dos metais mercúrio e zinco em rins e fígado. O pré-tratamento com zinco preveniu totalmente o efeito do mercúrio sobre o peso renal. Em 48 horas após a exposição ao mercúrio, os efeitos observados foram: diminuição do ganho de peso e aumento do peso renal, aumento nos níveis de ureia e creatinina, e diminuição da atividade da δ-ALA-D e dos níveis de tióis totais renal. Ainda, o tratamento com mercúrio aumentou os níveis desse metal em rins e fígado. O zinco preveniu parcialmente as alterações no ganho de peso e nos níveis de creatinina. Em conclusão, estes resultados mostram que o mercúrio provocou diferentes modificações nos dois períodos estudados e que o pré-tratamento com zinco preveniu alguns dos parâmetros alterados pela exposição ao mercúrio.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Mercury (Hg) is a divalent metal found liquid at room temperature without biological functions and anthropogenically released in industrial, agricultural activities and burning of fossil fuels. Toxic effects caused by exposure to this metal are related to the interaction of different biochemical processes due to its affinity for sulfhydryl groups (SH). This damage depends on the time of exposure and the development period in which the individuals are exposed. Thus, the aim of this study was to evaluate the effects of a single subcutaneous dose of inorganic Hg in virgin, pregnant and lactating rats, as well as the protective effect of zinc (Zn) and N-acetylcysteine (NAC). For this, three experimental protocols were used: I) Virgin female rats were treated with ZnCl2 (27 mg/kg) and/or NAC (5 mg/kg) or saline (0.9%) and 24 hours after with HgCl2 (5 mg/kg) or saline (Article 1). II) Pregnant or lactating rats were treated with ZnCl2 (27 mg/kg) and/or NAC (5 mg/kg) or saline (0.9%) and 24 hours after with HgCl2 (10 mg/kg) or saline (manuscript I). III) Renal and hepatic analysis of virgin, pregnant and lactating rats exposed to a dose of HgCl2 (5 mg/kg) or saline (manuscript II). In all protocols euthanasia was performed 24 hours after the last treatment and the tissues removed and prepared for analysis. Protocols I and II focused primarily on biochemical parameters in different tissues and protocol III in morphological evaluations and protein expression in the kidneys and liver. Virgin rats exposed to Hg showed inhibition of the δ-aminolevulinic acid dehydratase (δ-ALA-D) activity in all tissues analyzed, changes in serum markers of hepatic (alanine aminotransferase [ALT] and aspartate aminotransferase [AST]) and renal (creatinine and urea) damage, morphological damage, and changes in proteins related to oxidative stress expression, for instance, mitofusin 2 (MFN2), inducible nitric oxide synthase (iNOS), heat shock protein 27 (HSP27) and glucose regulated protein 75 (GRP75). Pregnant and lactating rats exposed to mercury showed milder changes than virgin rats, including no inhibition of hepatic δ-ALA-D or alterations of proteins related to oxidative stress and few morphological damage. Pregnant and lactating rats still showed physiologically higher levels of metallothionein (MT) in the liver and larger glomerulus diameter than virgin rats. The results suggest greater resistance of pregnant and lactating rats to Hg compared with virgin rats. This difference may be related to increase of hepatic MT levels induced by pregnancy and lactation. This protein is synthesized in the liver and plays an important chelator role,. making substances, such as Hg, less harmful. The treatment with Zn and NAC showed promising results against damage caused by Hg, probably by induction of MT synthesis caused by Zn and by chelating action of NAC. In both situations occur the capture of Hg. The metal bound to MT or NAC is neutralized and consequently has lower toxicity effects. / O mercúrio (Hg) é um metal bivalente encontrado líquido a temperatura ambiente, sem funções biológicas e antropogenicamente liberado em atividades industriais, agricultura e queima de combustíveis fósseis. Os efeitos tóxicos causados pela exposição a esse metal estão relacionados à sua interação com diferentes processos bioquímicos devido a sua afinidade por grupos sulfidrílicos (SH). Estes danos dependem do tempo de exposição e do período de desenvolvimento em que os indivíduos são expostos. Com isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do Hg inorgânico, em dose única subcutânea, em ratas virgens, gestantes e lactantes, bem como, a capacidade protetora do zinco (Zn) e da N-acetilcisteína (NAC). Para isso, adotamos três protocolos experimentais: I) Ratas virgens foram tratadas com ZnCl2 (27 mg/kg) e/ou NAC (5 mg/kg) ou salina (0,9%) e 24 horas após com HgCl2 (5 mg/kg) ou salina (artigo 1). II) Ratas gestantes e lactantes tratadas com ZnCl2 (27 mg/kg) e/ou NAC (5 mg/kg) ou salina (0,9%) e 24 horas após com HgCl2 (10 mg/kg) ou salina (manuscrito I). III) Análise renal e hepática de ratas virgens, gestantes e lactantes expostas a uma dose de HgCl2 (5 mg/kg) ou salina (manuscrito II). Em todos os protocolos a eutanásia foi realizada 24 horas após o último tratamento e os tecidos retirados e preparados para as análises. Os protocolos I e II tiveram como foco principal parâmetros bioquímicos em diferentes tecidos e o protocolo III em avaliações morfológicas, expressão proteica em rins e fígado. Ratas virgens expostas ao Hg apresentaram inibição da atividade da δ-aminolevulinato desidratase (δ-ALA-D) em todos os tecidos analisados, alterações em marcadores hepáticos (alanina aminotransferase [ALT] e aspartato aminotransferase [AST]) e renais (creatinina e ureia), além de danos morfológicos e alteração na expressão de proteínas relacionadas ao estresse oxidativo, como a mitofusina 2 (MFN2), óxido nítrico sintetase induzível (iNOS), proteína de choque térmico 27 (HSP27) e proteína reguladora de glicose 75 (GRP75). Ratas gestantes e lactantes expostas ao Hg apresentaram alterações mais brandas que ratas virgens, inclusive sem inibição da δ-ALA-D hepática ou distúrbios em proteínas relacionadas com dano oxidativo, bem como poucos danos morfológicos em rins e fígado. Ratas gestantes e lactantes apresentaram altos níveis hepáticos de metalotioneínas (MT) e aumento no diâmetro glomerular em relação as ratas virgens. Os resultados sugerem maior resistência de ratas gestantes e lactantes ao Hg quando comparadas com ratas virgens. Esta diferença pode ser relacionada ao aumento nos níveis hepáticos de MT induzidos pela gestação e lactação. Essa proteína é sintetizada principalmente no fígado e desempenha importante função quelante, tornando substâncias como o Hg, menos nocivas. Os tratamentos com Zn e NAC, mostraram resultados promissores contra os danos causados pelo Hg, provavelmente pela indução da síntese de MT causada pelo Zn, e pela ação quelante da NAC. Em ambas as situações ocorre a captura do Hg. O metal ligado a MT ou a NAC é neutralizado e consequentemente apresenta menor toxicidade.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The use of medicinal plants for the treatment and prevention of disease is a common practice, despite their effects are few studied scientifically. Solanum guaraniticum, also known as false jurubeba, is a medicinal plant widely distributed in Rio Grande do Sul and used for the treatment of gastric and hepatic disorders. Similarly, Syzygium jambos has its leaves, seeds and fruits used for the treatment of diabetes mellitus. Therefore, considering the popularity of the species mentioned above and the lack of data on their pharmacological and toxicological profiles, the aim of this study was to evaluate the effect of leaf extracts of S. jambos and S. guaraniticum on biochemical and oxidative stress parameters in in vitro and in vivo models.The extracts showed vitamin C and phenolic compounds, among which were identified gallic, chlorogenic and ellagic acids, catechin, epicatechin, rutin, quercitrin, isoquercitrin, quercetin and kaempferol in both extracts and caffeic acid only in S. jambos extract. In models of oxidative stress induction, both extracts exhibited anti-hemolytic effect on human erythrocytes and were capable of decrease the process of lipid peroxidation, and this last effect was also observed in kidney, liver and brain tissues of rats, in vitro. In these tissues, both extracts were also able to protect the thiol groups. The extracts showed H2O2 and NO scavenging ability, Fe2+ chelating activity and reducing capacity, proving its antioxidant action. In all assays, the extract of S. jambos was more potent as an antioxidant and also showed tiol-peroxidase - like activity. We observed an inhibition of the activity of δ-aminolevulinic acid dehydratase (δ-ALA-D) in human erythrocytes by both extracts, and the S. guaraniticum was more potent in this assay. It is possible to suggest an involvement of zinc ions of the active site of this enzyme in this inhibition mechanism. The extract of S. guaraniticum administered in vivo, was not able to cause changes in the activity of the enzyme δ-ALA-D, as well as enzymes acetilcholinesterase and N-acetyl-b-D-glucosaminidase. The Artemia salina lethality test showed that both extracts are biologically active. In lymphocytes, in vitro, the extract of S. jambos altered mitochondrial activity and inhibit AChE activity, suggesting an immunomodulatory effect, while the extract of S. guaranticium shows cytotoxic effects. In the acute toxicity evaluation of the extract of S. guaraniticum was possible to identify that the LD50 is greater than 5000 mg/kg and, therefore, this extract can be considered non-toxic for human consumption. Furthermore, although the animals did not show significant bodily, hematological and biochemical changes, the treatment with the extract of S. guaraniticum was able to cause an alteration in the open field test. The reduction in the number of crossing and rearing may indicate a depressant effect, which seems to be delayed and short-lasting. Therefore, the vegetal species studied can be recognized as sources of natural antioxidants and have prospective use in preventive medicine against oxidative stress related diseases, although its popular use should be done with caution until further studies regarding the toxicological profile of the extracts is performed. / O uso de plantas medicinais no tratamento e prevenção de doenças é pratica comum, apesar de poucas terem seus efeitos estudados cientificamente. A Solanum guaraniticum, conhecida também como falsa jurubeba, é uma planta amplamente distribuída no Rio Grande do Sul e utilizada para o tratamento de distúrbios gástricos e hepáticos. Já o Syzygium jambos,conhecido popularmente como jambolão , tem suas folhas, sementes e frutos utilizados para o tratamento do diabetes mellitus. Assim, considerando a popularidade das espécies acima citadas e a escassez de dados sobre os seus perfis farmacológico e toxicológico, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito dos extratos de folhas de S. jambos e S. guaraniticum sobre parâmetros bioquímicos e de estresse oxidativo em modelos in vitro e in vivo. Os extratos apresentaram vitamina C e compostos fenólicos, dentre os quais foram identificados: ácido gálico, elágico e clorogênico, catequina e epicatequina, rutina, quercitina quercitrina, isoquercitrina e canferol em ambos os extratos, e ácido cafeico somente no extrato de S. jambos. Em modelos de indução de estresse oxidativo, os extratos apresentaram efeito anti-hemolítico em eritrócitos humanos, e foram capazes de diminuir o processo de lipoperoxidação, efeito também observado em tecido renal, cerebral e hepático de ratos, in vitro. Nesses tecidos, ambos os extratos também foram capazes de proteger os grupos tióis. Os extratos apresentaram capacidade removedora de H2O2 e NO, atividade quelante de íons Fe2+ e capacidade redutora, comprovando sua ação antioxidante. Em todos os testes realizados, o extrato de S. jambos se mostrou mais potente como antioxidante e ainda apresentou atividade mimética às enzimas tiolperoxidades. Observou-se uma inibição da atividade da δ-aminolevulinato desidratase (δ-ALA-D) em eritrócitos humanos por ambos os extratos, sendo que o de S. guaraniticum foi mais potente nesses ensaios. É possível sugerir um envolvimento dos íons zinco do sítio ativo da enzima nesse mecanismo de inibição. O extrato de S. guaraniticum administrado in vivo, não foi capaz de provocar alterações na atividade da enzima δ-ALA-D, assim como nas enzimas aceticolinesterase (AChE) e N-acetyl-b-D-glucosaminidase. O teste de letalidade da Artemia salina demonstrou que ambos os extratos são bilogicamente ativos. Em linfócitos, in vitro, o extrato de S. jambos alterou a atividade mitocondrial e inibiu a atividade da AChE, sugerindo um efeito imunomodulatório enquanto que o extrato de S. guaranticium apresentou efeitos citotóxicos. Na avaliação da toxicidade aguda do extrato de S. guaraniticum foi possível identificar que a DL50 é superior a 5000 mg/kg e, portanto, esse extrato pode ser considerado não tóxico para o consumo humano. Além disso, apesar de os animais não terem apresentado alterações corporais, hematológicas e bioquímicas significativas, o tratamento com o extrato de S. guaraniticum foi capaz de causar uma alteração no teste do campo aberto. A redução no número de cruzamentos e levantadas pode indicar um efeito depressor, que parece ser tardio e não permanente. Portanto, as espécies vegetais estudadas podem ser reconhecidas como fonte de antioxidantes naturais e tem uso prospectivo na medicina preventiva contra doenças relacionadas ao estresse oxidativo, mas seu uso popular deve ser feito com cautela até que uma maior investigação em relação ao perfil toxicológico dos extratos seja realizada.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Lead is a heavy metal that accumulates primarily in kidney, where exerts its nephrotoxic effects. Several studies suggest that the oxidative stress is an important molecular mechanism for the toxic effects of lead in kidney and in other organs. Cytosolic thioredoxin reductase (TrxR1) is a selenoflavoprotein involved in many processes modulating intracellular reactive oxygen species levels. The aims of this study were to evaluate the effects of acute and chronic exposure to lead acetate on renal TrxR1 activity and on other oxidative stress parameters (d-aminolevulinic acid dehydratase activity, glutathione Stransferase, non-protein thiol groups, lipid peroxidation, and antioxidant enzymes in kidneys), as well as on plasmatic indicators of renal function (creatinine, uric acid and phosphate) in rats. In acute exposure, rats received a single intraperitoneal injection of 25 or 50 mg/kg lead acetate and were killed 6, 24 or 48 h later. In chronic exposure, rats received a daily intraperitoneal injection of lead acetate (5 or 25 mg/kg) during 30 days and were killed at 31st day. In our study, acute exposure to 25 mg/kg lead acetate increased superoxide dismutase (SOD) and TrxR-1 activity (after 6, 24, and 48 h), while exposure to 50 mg/kg lead acetate increased catalase (CAT) activity (after 48h) and inhibited d-aminolevulinic acid dehydratase (δ-ALA-D) activity (after 6, 24, and 48 hs) in kidneys (P < 0.05). Chronic exposure to 5 mg/kg lead acetate inhibited δ-ALA-D and increased glutathione S-transferase (GST), non protein sulfhydryl groups (NPSH), CAT, TrxR-1, and uric acid plasma levels, while exposure to 25 mg/kg lead acetate reduced body weight and δ -ALA-D, but increased GST, NPSH, and uric acid plasma levels (P < 0.05). No changes were observed in thiobarbituric acid reactive substances, glutathione peroxidase, creatinine or inorganic phosphate levels after either acute or chronic exposure. In conclusion, lead exposure caused a marked increase in the TrxR1 activity in the kidney of rats and this change may be an early indicator of acute exposure to low lead doses. However, further studies are needed to clarify the biological meaning of this induction as well as the mechanism involved in such effect. / O chumbo é um metal pesado que acumula-se preferencialmente nos rins, onde exerce seus efeitos nefrotóxicos. Muitos estudos sugerem que o estresse oxidativo seja um importante mecanismo molecular para os efeitos tóxicos do chumbo no rim e em outros órgãos. A tioredoxina redutase citosólica (TrxR1) é uma selenoflavoproteína envolvida em muitos processos reguladores dos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio. Os objetivos deste estudo foram avaliar os efeitos da exposição aguda e crônica ao acetato de chumbo sobre a atividade da TrxR1 renal e sobre outros parâmetros de estresse oxidativo (atividade da δ-aminolevulinato desidratase, glutationa S-transferase, grupos tiólicos nãoprotéicos, peroxidação lipídica e enzimas antioxidantes nos rins), bem como sobre os indicadores plasmáticos da função renal (creatinina, ácido úrico e fosfato) em ratos. Na exposição aguda, os ratos receberam uma única injeção intraperitoneal de 25 ou 50 mg/kg de acetato de chumbo e foram mortos 6, 24 ou 48 horas mais tarde. Na exposição crônica, os ratos receberam uma injeção intraperitoneal diária de acetato de chumbo (5 ou 25 mg/kg) durante 30 dias e foram mortos no 31° dia. Em nosso estudo, a exposição aguda a 25 mg/kg de acetato de chumbo aumentou a atividade da superóxido dismutase (SOD) e da TrxR1 (após 6, 24 e 48 h), enquanto que a exposição a 50 mg/kg de acetato de chumbo aumentou a atividade da catalase (CAT) (após 48 h) e inibiu a atividade da δ-aminolevulinato desidratase (δ-ALA-D) (após 6, 24, 48 h) nos rins (p<0,05). A exposição crônica a 5 mg/kg de acetato de chumbo inibiu a δ-ALA-D e aumentou a glutationa S-transferase (GST), níveis de grupos tiólicos não-protéicos (SHNP), CAT, TrxR1 e níveis plasmáticos de ácido úrico (p<0,05), enquanto que a exposição a 25 mg/kg de acetato de chumbo reduziu o peso corporal e a δ-ALA-D, mas aumentou a GST, SHNP e os níveis plasmáticos de ácido de ácido úrico (p<0,05). Não houve alterações nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), na atividade da glutationa peroxidase (GPx) e nos níveis plasmáticos de creatinina e fosfato inorgânico tanto após a exposição aguda como após a exposição crônica. Conclui-se que a exposição ao chumbo causou um aumento significativo na atividade da TrxR1 renal de ratos e esta alteração pode ser um indicador primário da exposição aguda a baixas doses de chumbo. Entretanto, será necessária a realização de mais estudos para elucidar o significado biológico desta indução, bem como o mecanismo envolvido em tal efeito.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Mercury is a heavy metal toxic for any living tissue, being kidneys the first target for the inorganic form. Oxidative stress has been pointed as an important molecular mechanism for kidney injury in inorganic mercury poisoning and the interaction of the metal with endogenous thiol-containing molecules, such as δ-aminolevulinate desidratase (δ-ALA-D), seems to contribute to this process. Lycopene and astaxanthin are plentiful carotenoids in tomatoes and algaes and seafoods, respectively. They have been widely studied because of their large antioxidant properties. This work evaluated the ability of lycopene and astaxanthin to prevent HgCl2 toxicity, assessing parameters like δ-ALA-D and glutathione S-transferase (GST) activities, non-protein sulfhydrylic groups content (NPSH), production of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and activities of antioxidant enzymes like superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), and catalase (CAT), besides creatinine and uric acid plasma levels and histopathological analyses. Adult Wistar rats received lycopene or astaxanthin, by gavage, on doses of 0, 10, 25, or 50 mg/kg, six hours prior to the administration of 0 or 5 mg/kg HgCl2, yielding 8 experimental groups. After twelve hours of exposure to HgCl2 animals were killed. HgCl2 inhibited renal δ-ALA-D activity and increased TBARS levels in kidney and creatinine levels in plasma along with renal tubular necrosis. Lycopene prevented HgCl2-induced inhibition of δ-ALA-D activity and increase of lipid peroxidation in kidney, but not the increase in plasma creatinine levels or renal tubular necrosis caused by HgCl2. Although astaxanthin have not prevented HgCl2-induced inhibition of δ-ALA-D and increase in plasma creatinine levels, this carotenoid prevented lipid peroxidation and attenuated renal tubular necrosis caused by HgCl2. GPx and CAT activities were enhanced, while SOD activity was depressed, in mercury-treated rats when compared to control and these effects were prevented by some lycopene doses and by all astaxanthin doses evaluated. Some doses of lycopene negativelly affected antioxidant enzymes activities per se and the mechanism involved in this response has not been elucidated yet. Neither HgCl2 nor carotenoids treatment changed the content of NPSH groups or GST activity in kidney or uric acid levels in plasma. Our results indicate that although lycopene and astaxanthin did not prevent HgCl2-induced creatinine increase in plasma, changes in the activity of antioxidant enzymes might be limited by the use of these car / O mercúrio é um metal pesado com toxicidade comprovada, capaz de causar danos em qualquer tecido com o qual tenha contato, sendo o rim o principal alvo para sua forma inorgânica. O estresse oxidativo tem sido apontado como um importante mecanismo molecular para a injúria renal induzida por mercúrio inorgânico e a interação desse metal com moléculas contendo grupos sulfidrílicos, tais como a enzima δ-aminolevulinato desidratase (δ-ALA-D), parece contribuir para esse processo. Licopeno e astaxantina são carotenóides abundantes em tomates e em algas e frutos do mar, respectivamente. Ambos têm sido amplamente estudados por suas propriedades antioxidantes. No presente estudo foi avaliado o efeito do licopeno e da astaxantina sobre a toxicidade do HgCl2 em rins de ratos, utilizando-se como parâmetros a atividade das enzimas δ-ALA-D e glutationa Stransferase (GST), quantidade de grupos sulfidrílicos não protéicos (NPSH), produção de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GSH-Px) e catalase (CAT), além dos níveis plasmáticos de creatinina e ácido úrico e análise histopatológica. Ratos Wistar adultos receberam, por gavage, licopeno ou astaxantina nas doses de 0, 10, 25 ou 50 mg/kg, seis horas antes de receberem uma injeção subcutânea de HgCl2 (0 ou 5 mg/kg), resultando assim, em 8 grupos experimentais. Após doze horas da exposição ao HgCl2, os animais foram sacrificados. O HgCl2 inibiu a δ-ALA-D renal, aumentou a produção de TBARS e níveis plasmáticos de creatinina, além de causar necrose tubular. O licopeno preveniu a inibição da δ-ALA-D e a peroxidação lipídica, mas não preveniu o aumento de creatinina no plasma nem a ocorrência de necrose tubular induzidos pelo HgCl2. Embora a astaxantina não tenha prevenido a inibição da δ-ALA-D e o aumento nos níveis plasmáticos de creatinina, este carotenóide preveniu a ocorrência da peroxidação lipídica e atenuou a necrose tubular causada pelo HgCl2. As atividades das enzimas GSH-Px e CAT aumentaram, enquanto a atividade da SOD diminuiu nos animais tratados com HgCl2 e esses efeitos foram prevenidos por algumas doses de licopeno e por todas as doses de astaxantina avaliadas. Algumas doses de licopeno tiveram efeito negativo sobre as enzimas antioxidantes per se e o mecanismo envolvido nessa resposta ainda não foi elucidado. O tratamento com HgCl2 ou carotenóides não alterou o conteúdo de NPSH ou a atividade da GST no tecido renal, nem os níveis plasmáticos de ácido úrico. Os resultados indicam que embora licopeno e astaxantina não tenham prevenido o aumento nos níveis plasmáticos de creatinina induzido por HgCl2, as alterações nas enzimas antioxidantes podem ser limitadas pelo uso destes carotenóides.