Η απορρύθμιση του συστήματος αδειοδότησης της αντιγραφής εμπλέκεται στη γονιδιωματική αστάθεια, η οποία αποτελεί χαρακτηριστικό γνώρισμα των καρκινικών κυττάρων. Η απορρύθμιση των επιπέδων έκφρασης των Cdt1 και Geminin, είτε λόγω υπερέκφρασης του Cdt1, είτε λόγω αποσιώπησης της Geminin, οδηγεί σε εκτοπική επανέναρξη της αντιγραφής και υπερδιπλασιασμό του DNA, θέτοντας έτσι σε κίνδυνο τη γονιδιωματική ακεραιότητα του κυττάρου. Υπερέκφραση των δύο πρωτεϊνών έχει παρατηρηθεί τόσο σε καρκινικές κυτταρικές σειρές όσο και σε περιπτώσεις καρκίνου στον άνθρωπο. Ιδιαίτερη σημασία έχει επίσης το γεγονός ότι η διαταραχή της ισορροπίας των Cdt1 και Geminin, μέσω της απορρύθμισης της έκφρασής τους, μπορεί να προκαλέσει διαφορετική απόκριση στα καρκινικά κύτταρα έναντι των φυσιολογικών. / Misregulation of the replication licensing system is involved in genomic instability, which is a whole-mark of cancer cells. Particularly, Cdt1 overexpression or silencing of Geminin can lead to DNA over-replication and thus jeopardize the genomic integrity of the cell. Both proteins have been found to be over-expressed in cancer-derived cell lines and human tumor specimens. Notably, cancer and normal cells respond differently to the disturbance of Geminin-Cdt1 balance, caused by misregulation of their expression.

Το σύστημα του συμπληρώματος περιλαμβάνει περισσότερες από 30 πρωτεΐνες του ορού και της κυτταρικής επιφάνειας και αποτελεί έναν από τους αρχαιότερους φυλογενετικά μηχανισμούς ανοσίας του ξενιστή. Η ενεργοποίησή του, μέσω της κλασικής, της εναλλακτικής ή της λεκτινικής οδού, οδηγεί σε έναν καταρράκτη αντιδράσεων. Οι αντιδράσεις αυτές συγκλίνουν στην τελική λυτική οδό, οδηγώντας στη δημιουργία του συμπλόκου MAC, με αποτέλεσμα την ωσμωτική λύση του κυττάρου στόχου. Στην παρούσα εργασία, σχετικά με τη μελέτη της μοριακής εξέλιξης των γονιδίων της τελικής λυτικής οδού του συμπληρώματος, κλωνοποίηθηκε η αλληλουχία του cDNA του έκτου συστατικού του συμπληρώματος (C6). Στη συνέχεια, προκειμένου να εξαχθούν συμπεράσματα σχετικά με τη συντήρηση όλων των δομικών γονιδίων του συμπλόκου MAC κατά τη διάρκεια της φυλογενετικής εξέλιξης, δημιουργήθηκε φυλογενετικό δέντρο, στο οποίο συγκρίνονται τα παραπάνω γονίδια με τα αντίστοιχα ορθόλογα, σε διάφορους οργανισμούς. Από τη φυλογενετική ανάλυση φαίνεται ότι το C6 της όρνιθας ομαδοποιείται με τα αντίστοιχα ορθόλογα των θηλαστικών και του βατράχου, δημιουργώντας μια καλά καθορισμένη υποομάδα μέσα στην οικογένεια των πρωτεϊνών MACPF. Σύμφωνα με την υπάρχουσα βιβλιογραφία, εκτός από το ρόλο που διαδραματίζει το σύστημα του συμπληρώματος στην ανοσία, έχει δειχθεί η εμπλοκή του, μεταξύ άλλων, σε διαδικασίες αναγέννησης ιστών, ενεργοποίησης και πολλαπλασιασμού κυττάρων και ρύθμισης της απόπτωσης. Προκειμένου λοιπόν να διερευνηθεί περαιτέρω η πιθανότητα εμπλοκής του συστήματος του συμπληρώματος σε διαδικασίες που σχετίζονται με την ανάπτυξη, μελετήθηκε το αναπτυξιακό και ιστικό πρότυπο έκφρασης συστατικών του στην όρνιθα. Η ιστική μελέτη περιελάμβανε τη διερεύνηση και ημι-ποσοτική ανάλυση της έκφρασης, σε επίπεδο mRNA, σε οκτώ ιστούς της ενήλικης όρνιθας: εγκέφαλο, καρδιά, έντερο, νεφρό, ήπαρ, πνεύμονα, σπλήνα και στόμαχο. Η αναπτυξιακή μελέτη, περιελάμβανε τη διερεύνηση και ημι-ποσοτική ανάλυση της έκφρασης, σε επίπεδο mRNA, σε ολικό ομογενοποιημένο έμβρυο 4 και 6 ημερών, σε ήπαρ εμβρύου 12 και 17 ημερών και σε ήπαρ νεογένητου ατόμου 2 και 5 ημερών. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η έκφρασή του γονιδίου C3 σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια, όπου και πιστοποιήθηκε η παρουσία του μορίου σε όλα τα στάδια. Επίσης, μελετήθηκε η ιστική και η αναπτυξιακή έκφραση των δομικών γονιδίων του συμπλόκου MAC (C6, C7, C8α, C8β, C8γ) και η αναπτυξιακή των ρυθμιστικών γονιδίων του (CD59, CLU,VTN). Η μελέτη του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης για τα δομικά συστατικά του συμπλόκου, έδειξε ότι τα διάφορα συστατικά παρουσιάζουν ποικίλη έκφραση στους υπό μελέτη ιστούς, ενώ κύρια πηγή έκφρασής τους αποτελεί το ήπαρ. Κατά τη μελέτη του αναπτυξιακού προτύπου έκφρασης, δείχθηκε ότι τα δομικά συστατικά του συμπλόκου πρωτοεμφανίζονται τη 12η εμβρυική μέρα ενώ δεν παρατηρείται έκφρασή τους σε νεογέννητο άτομο 2 ημερών. Αντίθετα, η μελέτη του αναπτυξιακού προτύπου έκφρασης των ρυθμιστικών μορίων του συμπλόκου, έδειξε έκφραση όλων των συστατικών σε όλα τα υπό μελέτη στάδια. Το γεγονός αυτό αντανακλά πιθανώς την πλειοτροπική δράση των ρυθμιστικών αυτών πρωτεϊνών, καθώς εμπλέκονται σε πρόσθετες λειτουργίες οι οποίες δε σχετίζονται με τη δράση του συμπληρώματος, όπως είναι η ανάπτυξη και ωρίμανση οργάνων. Ανάλογα συμπεράσματα θα μπορούσαν να εξαχθούν και στην περίπτωση του μορίου C3, λόγω της έκφρασής του σε πρώιμα στάδια ανάπτυξης της όρνιθας, παρά την απουσία έκφρασης των γονιδίων του συμπλόκου MAC στα αντίστοιχα αναπτυξιακά στάδια. Συμπερασματικά, η παραπάνω εργασία αποτελεί την πρώτη αναφορά στη χωρική και χρονική μελέτη της έκφρασης γονιδίων του συμπληρώματος στην όρνιθα. Βάσει των παραπάνω, περαιτέρω διερεύνηση αναφορικά με τη συμμετοχή των συστατικών του συμπληρώματος σε αναπτυξιακές διεργασίες, παρουσιάζει πλέον ιδιαίτερο ενδιαφέρον. / The complement system includes more than 30 serum and membrane proteins and constitutes one of the most phylogenetically ancient immune mechanisms of the host. Its activation, via the classic, alternative or lectin pathway, leads to a cascade of reactions. All these reactions converge to the terminal lytic pathway, leading to the MAC complex creation, which results in osmotic lysis of the targeted cells. In the present work, concerning the study of the molecular evolution of the terminal complement pathway genes, the sixth complement component (C6) of the chicken (Gallus gallus) was cloned. Afterwards, a phylogenetic tree was created, in which the above genes are compared with the respective orthologs, in various organisms. As it seems from the phylogenetic analysis, chicken’s C6 clusters with the respective mammalian and frog orthologs, creating a well defined subgroup in the MACPF gene family. According to literature, besides the complement system’s role in immunity, it has been shown that it is also involved, in tissue regeneration, cell activation, proliferation and regulation of apoptosis. In order to further investigate the hypothesis of complement system’s involvement in developmental procedures, the developmental and tissue expression profile of complement components were studied in the chicken. The tissue study involved the investigation and semi-quantitative expression analysis, at the mRNA level, in eight tissues deriving from one adult chicken: brain, heart, intestine, kidney, liver, lung, spleen and stomach. The developmental study included the investigation and semi-quantitative expression analysis, at the mRNA level, of the whole homogenized 4 and 6 day embryo, in the liver from a 12 and 17 day embryo and the liver from a neonate chicken, 2 and 5 days old. In particular, the expression of C3 gene was studied in various developmental stages where the gene expression was certified in all stages. Moreover, the tissue and developmental expression of MAC complex structural genes (C6, C7, C8α, C8β, C8γ) was studied, as well as the developmental expression of the regulatory genes of MAC complex (CD59, CLU,VTN). The study of the tissue expression profile for the structural MAC components was shown that the various components exhibit a variable expression, with the liver being the major source of expression. In the developmental expression 117 profile study, it was shown that all structural MAC components initially appear in the 12th embryonic day, while no expression of them was detected in the 2 day old neonate chicken. On the contrary, the developmental expression profile study of the regulatory MAC genes was shown that they expressed throughout the developmental stages. This fact possibly reflects the regulatory proteins pleiotropic action, as they are involved in additional functions, which are not related to complement functions, such as development and organs maturation. Analogous conclusions could be drawn in the case of C3 gene, because of its expression in stages of chicken early development, despite the absence of expression of structural MAC genes in the respective developmental stages. Concluding, the above study is the first reference to the spatial and temporal expression of complement genes in the chicken. In accordance with the above mentioned, further investigation concerning the involvement of complement components in developmental procedures, appears to be of great interest.

Υπάρχει ένα συνεχές επιστημονικό ενδιαφέρον για τη σύνθεση και το χαρακτηρισμό συμπλόκων των στοιχείων μετάπτωσης (μεταβατικών μετάλλων) του Περιοδικού Πίνακα. Έχουν λάβει χώρα ενδιαφέρουσες μελέτες πάνω στη χημεία ένταξης διαφόρων μετάλλων με υποκαταστάτες βενζοτριαζόλια. Το ενδιαφέρον αυτό οφείλεται κυρίως στην αντιδιαβρωτική δραστικότητα του βενζοτριαζολίου (btaH) έναντι ορισμένων μετάλλων, κυρίως του Cu και των κραμάτων του. Οι μοριακοί μηχανισμοί της παρεμπόδισης της διάβρωσης των μετάλλων από τα βενζοτριαζόλια δεν έχουν διερευνηθεί πλήρως. Στην παρούσα Διπλωματική Εργασία αναπτύσσεται ένα μοντέλο παρεμπόδισης της διάβρωσης του Fe από το btaH, και σχηματισμού συμπλόκων του σιδήρου με ουδέτερα βενζοτριαζόλια (btaH), καθώς και με αποπρωτονιωμένα βενζοτριαζόλια (bta-) με τη χρησιμοποίηση ιδεών της Χημείας Ένταξης. Παρασκευάσθηκε το σύμπλοκο [FeBr3(btaH)2] (1) καθώς και το σύμπλοκο [Fe14O8(OH)(OMe)9Br9(bta)7(MeOH)2(H2O)2] (2), τα οποία χαρακτηρίσθηκαν με μικροαναλύσεις και φασματοσκοπία IR. Οι μοριακές και κρυσταλλικές δομές των ενώσεων προσδιορίστηκαν με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ επί μονοκρυστάλλων. Το σύμπλοκο 1 είναι μονοπυρηνικό με πέντε μονοδοντικούς υποκαταστάτες [τρεις αλόγονο (βρώμο) και δύο Ν-δότες]. Το ιόν του FeIII βρίσκεται σε ένα τριγωνικό διπυραμιδικό περιβάλλον ένταξης με τους τρεις βρώμο υποκαταστάτες να ορίζουν το ισημερινό επίπεδο. Το πολυπυρηνικό μόριο της ένωσης 2.2MeOH έχει δεκατέσσερα τρισθενή ιόντα σιδήρου τα οποία συγκρατούνται μέσω πέντε μ3-όξο (O2-), τριών μ4-όξο (O2-), ενός μ3-υδρόξο (ΟΗ-), εννέα μ2-μεθόξο (OMe-), πέντε η1:η1:η1:μ3 βενζοτριαζολάτο (bta-) και δύο η1:η1:μ2 βενζοτριαζολάτο (bta-) υποκαταστατών. Τα εννέα ιόντα Br-, τα δύο μόρια Η2Ο καθώς και οι δύο MeOH συμπεριφέρονται ως τερματικοί υποκαταστάτες. Τα κέντρα FeIII υιοθετούν τρεις διαφορετικές γεωμετρίες ένταξης (οκταεδρική, τριγωνική διπυραμιδική και τετραεδρική). Τέλος, τα δεκατέσσερα κέντρα του FeIII ορίζουν μία εξαεπιστεγασμένη εξαγωνική διπυραμίδα. Το σύμπλοκο 2 μπορεί να θεωρηθεί ως μοντέλο παρεμπόδισης της διάβρωσης του Fe σε ουδέτερα pH. / There is a continuing scientific interest in the synthesis and characterization of metal complexes of the d block elements of the Periodic Table. Interesting studies have taken place to investigate the ability of various metals to create complexes with benzotriazole as a ligand. This is primarily due to the anticorrosion activity of benzotriazole (btaH) towards certain metals, particularly Cu and its alloys. The molecular mechanisms of the corrosion inhibition of metals by benzotriazoles have not been completely elucidated. An inorganic chemistry model approach to the corrosion inhibition of the Fe by btaH and to the formation of iron complexes with neutral benzotriazole (btaH) and with deprotonated benzotriazole (bta-), using the Coordination Chemistry approach, has been developed in the present Diploma Thesis. We have prepared complexes [FeBr3(btaH)2] (1) and [Fe14O8(OH)(OMe)9Br9(bta)7(MeOH)2(H2O)2] (2), which have been characterized using microanalyses and IR spectroscopy. The molecular and crystal structures of the compounds were determined by X-ray crystallography. Complex 1 is mononuclear with five monodentate ligands [three halogenido (bromido) and two N-donors]. The FeIII ion is in a trigonal bipyramidal coordination environment with the three halogenido ligands defining the equatorial plane. The cluster molecule of 2.2MeOH has fourteen FeIII ions which are held together by five μ3-O2-, three μ3- O2-, one μ3-OH-, nine μ2-OMe-, five η1:η1:η1:μ3 bta- and two η1:η1:μ2 bta- ligands. Nine Br- ions, two molecules of H2O and two molecules of MeOH are terminal ligands. The FeIII centres adopt three different coordination geometries (octahedral, trigonal bipyramidal and tetrahedral). Finally, the fourteen FeIII centres define a hexacapped hexagonal bipyramid. Cluster 2 may be considered as model for the corrosion inhibition of Fe by benzotriazoles at neutral pHs.

Η ριβονουκλεάση Ρ (RNase P) είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό ένζυμο, απολύτως απαραίτητο για την βιωσιμότητα του κυττάρου, καθώς είναι υπεύθυνο για την ωρίμανση του 5΄ άκρου των προδρόμων μορίων tRNA. Δραστικότητα RNase P έχει απομονωθεί από όλους τους οργανισμούς που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα και από τις τρεις φυλογενετικές περιοχές (Βακτήρια, Αρχαία και Ευκαρυώτες), όπως επίσης και από τα ημιαυτόνομα υποκυτταρικά οργανίδια, μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες [Frank και Pace 1998, Xiao et al. 2002]. Το ένζυμο αυτό διαθέτει μια RNA υπομονάδα απαραίτητη για την κατάλυση ενώ ο αριθμός των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο ποικίλλει από μια στα βακτήρια έως και δέκα στην RNase P του ανθρώπου [Frank και Pace 1998, Chamberlain et al. 1998, Jarrous 2002]. Η RNA υπομονάδα από τα Βακτήρια και ορισμένα Αρχαία παρουσιάζει καταλυτική δραστικότητα απουσία πρωτεϊνών in vitro, σε υψηλή ιοντική ισχύ [Guerrier-Takada et al. 1983, Pannucci et al. 1999]. Παρότι μέχρι στιγμής καμία τέτοια ιδιότητα δεν έχει εντοπιστεί σε ευκαρυωτική RNA υπομονάδα, πιστεύεται ότι στην πραγματικότητα πρόκειται για ένα ριβοένζυμο [Frank et al. 2000]. Η RNase P από το Dictyostelium discoideum είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο που αποτελείται από RNA και πρωτεϊνικές υπομονάδες οι οποίες είναι απαραίτητες για την δραστικότητα του ολοενζύμου. Η πυκνότητα επιπολής που υπολογίσθηκε για την RNase P από το D. discoideum είναι πολύ χαμηλή σε σχέση με τα χαρακτηρισμένα ολοένζυμα ευκαρυωτικής προέλευσης και είναι παρόμοια με αυτή ενός πρωτεϊνικού μορίου [Stathopoulos et al. 1995]. Παρότι έχει αποδειχθεί ότι το ολοένζυμο αποτελείται από RNA και πρωτεΐνες, πολύ λίγα είναι γνωστά για την ακριβή σύσταση του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου. Πρόσφατα εντοπίστηκε το γονίδιο της RNA υπομονάδας της RNase P από το D. discoideum μέσω συγκριτικής φυλογενετικής ανάλυσης, μήκους 369 νουκλεοτιδίων [Marquez et al. 2005]. Χρησιμοποιώντας τις πρωτεϊνικές υπομονάδες Rpp20 και Rpp40 της RNase P του ανθρώπου πραγματοποιήθηκε αναζήτηση στη τράπεζα δεδομένων της αλληλούχισης του γενωμικού DNA του D. discoideum. Το αποτέλεσμα της αναζήτησης ήταν η εύρεση δύο ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης (drpp20 και drpp40) που κωδικοποιούν δύο πρωτεΐνες (DRpp20 και DRpp40) οι οποίες παρουσιάζουν σημαντική ομολογία με τις υπομονάδες. Η επαγόμενη πρωτεΐνη DRpp20 έχει προβλεπόμενο μοριακό βάρος 26,4 KD, pI 5,6 και επιδεικνύει σημαντική ομοιότητα με την χαρακτηρισμένη πρωτεϊνική υπομονάδα Rpp20 του ανθρώπου (34% ταυτότητα, 56% ομοιότητα σε μήκος 140 αμινοξέων). Όμοια, η πρωτεΐνη DRpp40 έχει προβλεπόμενο μοριακό βάρος 48,2 KD, pI 5,5 και παρουσιάζει σημαντική ομοιότητα με την πρωτεϊνική υπομονάδα Rpp40 (26% ταυτότητα, 45% ομοιότητα σε μήκος 302 αμινοξέων). Παρά την συνολική ομοιότητα, τα μοριακά βάρη των DRpp20 και DRpp40 διαφέρουν σημαντικά σε σχέση με αυτά των ομόλογων πρωτεϊνών τους. Η DRpp20 διαθέτει μια περιοχή χαμηλής πολυπλοκότητας, πλούσια σε κατάλοιπα θρεονίνης, γλουταμίνης και λυσίνης που πιθανόν να συνεισφέρει στο επιπλέον μοριακό βάρος όπως φαίνεται από την στοίχιση με το Clustal W. Τόσο οι επαναλήψεις τρινουκλεοτιδίων γενωμικών περιοχών όσο και οι περιοχές χαμηλής πολυπλοκότητας σε επίπεδο πρωτεΐνης υπάρχουν σε αφθονία στο D. discoideum [Eichinger et al. 2005] και παραμένει να αποδειχτεί εάν αυτά τα χαρακτηριστικά συνεισφέρουν δομικά ή λειτουργικά στις DRpp. Από βιοπληροφορική ανάλυση προκύπτει ότι καμία από τις υπομονάδες των Αρχαίων ή τις εννέα υπομονάδες της ζύμης δεν παρουσιάζει ομοιότητα με τις DRpp20 και DRpp40. Επιπρόσθετα, με την βοήθεια του Pfam αλλά και των προγραμμάτων που συνδέονται με τον MetaServer εντοπίσαμε στην περιοχή 56-126 αμινοξέα της πρωτεΐνης DRpp20 το δομικό μοτίβο των Alba πρωτεϊνών. Η μελέτη των δύο πρωτεϊνών με βάση τον αλγόριθμο PSORT υποδεικνύει ότι και οι δύο πρωτεΐνες έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα για χωροθέτηση στον πυρήνα παρά σε οποιοδήποτε άλλο υποκυτταρικό διαμέρισμα. Στην παρούσα εργασία τα υπό μελέτη γονίδια drpp20 και drpp40 κλωνοποιούνται σε φορέα υπερέκφρασης pET-29 και εισάγονται σε δεκτικά κύτταρα BL21(DE3)pLysS. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες απομονώνονται από το κυτταρικό εκχύλισμα με χρωματογραφία συγγενείας σε στήλη νικελίου. Οι πρωτεΐνες DRpp20 και DRpp40 με την μέθοδο που απομονώνονται παραλαμβάνονται σχεδόν στην φυσική τους μορφή όπως προκύπτει και από τα φάσματα του κυκλικού διχρωϊσμού. Οι πρωτεΐνες αυτές χρησιμοποιούνται για την παραγωγή πολυκλωνικών αντισωμάτων καθώς επίσης και για λειτουργικές μελέτες οι οποίες περιγράφονται παρακάτω. Όπως αποδεικνύεται οι πρωτεΐνες DRpp20 και DRpp40 αποτελούν τμήματα του μακρομοριακού συμπλόκου της RNase P. Πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των συγκεκριμένων πρωτεϊνών ανιχνεύουν μία ζώνη που συνεκλούεται με την δραστικότητα του ολοενζύμου σε ανάλυση κατά Western. Επιπρόσθετα, η ισχύς αυτής της αλληλεπίδρασης επιτρέπει την κατακρήμνιση καταλυτικά δραστικού ενζύμου με την χρήση των πολυκλωνικών αντισωματών anti-DRpp20 και anti-DRpp40. Μεταξύ των πρωτεϊνών και της RNA υπομονάδας καθώς επίσης του tRNA υποστρώματος αναμένεται να υπάρχουν αλληλεπιδράσεις RNA πρωτεϊνών. Για το λόγο αυτό ελέγχθηκε η ικανότητα των πρωτεϊνών DRpp20 και DRpp40 να αλληλεπιδρούν με μόρια RNA και ιδιαίτερα με μόρια tRNA. Σε μία σειρά πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν δοκιμάστηκαν μόρια tRNA, ολικό RNA αλλά και πλασμιδιακό DNA χωρίς όμως κάποιο αποτέλεσμα στις συνθήκες που πραγματοποιήθηκε η αντίδραση, παρότι άλλες πρωτεΐνες που φέρουν το μοτίβο των Alba πρωτεϊνών έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με μόρια DNA ή δίκλωνα τμήματα RNA. Τέλος, για τις DRpp20, DRpp40 αλλά και το ολοένζυμο, πραγματοποιήθηκε έλεγχος για δραστικότητα ΑΤΡασης κυρίως εξαιτίας της ομολογίας της πρώτης με την Rpp20 του ανθρώπου που διαθέτει τέτοια ιδιότητα, χωρίς να ανιχνεύεται μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης σημαντική ομολογία με αντίστοιχα ένζυμα. Στις συνθήκες που δοκιμάστηκαν δεν ανιχνεύτηκε δραστικότητα ΑΤΡασης που να σχετίζεται με κάποια από τις δύο πρωτεΐνες ή το ολοένζυμο. Ο απώτερος στόχος μας είναι ο προσδιορισμός της ελάχιστης λειτουργικής δομής καθώς και η χαρτογράφηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και RNA-πρωτεΐνης στο ολοένζυμο της RNase P. Η ολοκλήρωση της μελέτης θα συμβάλλει στην κατανόηση του καταλυτικού μηχανισμού και της εξέλιξης της ριβονουκλεάσης Ρ από ένα αρχέγονο ριβοένζυμο σε ένα υψηλά οργανωμένο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο. / Ribonuclease P (RNase P) is a ubiquitous and essential ribonucleoprotein enzyme that matures the 5´ end of all primary tRNA transcripts. It has been studied from a variety of organisms, representing the three domains of life (Bacteria, Archaea and Eukarya), as well as from the major subcellular organelles, mitochondria and chloroplasts [Frank and Pace 1998, Xiao et al. 2002]. RNase P enzymes contain a similar in size RNA subunit which is absolutely required for catalysis. However, the size and number of protein subunits of the holoenzyme varies significantly, from one small subunit in bacteria to ten subunits in human RNase P [Frank and Pace 1998, Chamberlain et al. 1998, Jarrous 2002]. The RNA subunit from bacteria and some archaea is catalytically active in vitro in high ionic strength and in the absence of the protein fraction of RNase P [Guerrier-Takada et al.1983, Pannucci et al. 1999]. No such activity has been proven yet for eukaryotic RNA subunit but is still considered to be intrinsically a ribozyme [Frank et al. 2000]. Dictyostelium discoideum RNase P holoenzyme is a ribonucleoprotein complex, consisted of RNA and proteins essential for catalytic activity. Considering its buoyant density, D. discoideum RNase P exhibits one of the most proteinaceous idiosyncrasies, among the characterized holoenzymes of eukaryotic origin [Stathopoulos et al. 1995]. Although it has been established that this enzyme contains both RNA and protein components, very little is known on the exact composition of the ribonucleoprotein complex. A recent report identified a putative RNA subunit of D. discoideum RNase P of length of 369 nucleotides through phylogenetic comparative analysis [Marquez et al. 2005]. Genomic analysis of the available data from D. discoideum sequencing projects, revealed among others the existence of two open reading frames (drpp20 and drpp40) encoding two proteins (DRpp20 and DRpp40) that show significant similarity to previously characterized proteins subunits Rpp20 and Rpp40 from human RNase P. The encoded protein DRpp20 has a predicted molecular mass of 26,4 KD, pI 5,6 and exhibits significant similarity to characterized human RNase P protein subunit, Rpp20 (34% identity, 56% similarity at a length of 140 amino acids). Likewise, the protein DRpp40 of a predicted mass of 48,2 KD and pI 5,5, displays significant similarity to its human counterpart, Rpp40 (26% identity, 45% similarity at a length of 302 amino acids). DRpp20 harbors a region of low complexity (rich in threonine residues) which confers to higher MW in comparison with the human homologue. Such regions have not been encountered so far in proteins of this kind in other organisms. Tandem repeats at the genomic and the protein level, are abundant in D. discoideum [Eichinger et al. 2005] and it remains to be proven if these features contribute to the structure and function of DRpp proteins. To the best of our knowledge no homologues of DRpp20 and DRpp40 have been identified in yeast and archaeal RNase P enzymes. Additionally, pattern search of the D. discoideum protein sequences using MetaServer and Pfam prediction tools identified a DRpp20 region (amino acids 56 to 126) that bears similarity to the Alba domain. PSORT analysis of DRpp20 and DRpp40 predicts that these proteins are likely to localise into the nucleus. In this study the putative ORFs were subcloned into pET-29 expression vector and the recombinant vectors were used for the transformation of BL21(DE3)pLysS. The recombinant polypeptides were purified from the cell extract using Ni2+-nitriloacetic acid agarose column. The purified proteins are isolated in their native form as supported by circular dichroism analysis of the preparations. These preparations were used for the production of polyclonal antibodies as well as functional studies as described below. DRpp20 and DRpp40 are functionally associated with the RNase P ribonucleoprotein catalytic complex. Using anti-DRpp20 and anti-DRpp40 polyclonal antibodies we ascertained the concurrence of DRpp20 and DRpp40 with purified RNase P activity after standard purification schemes. Moreover, the nature of this association permits the precipitation of RNase P activity through antigen-antibody interaction using the same antibodies. RNA-proteins interactions between the protein subunits, the RNA moiety and/or the RNA substrate are expected in the holoenzyme complex, and therefore the ability of DRpp40 and DRpp20 to bind to RNA molecules was investigated. In a series of experiments using a variety of binding partners (plasmids, tRNAs and total RNA), we did not detect any DNA or RNA binding properties for DRpp20 and DRpp40, although other proteins that contain the Alba core interact with DNA or double stranded RNA regions. Although neither DRpp20 nor DRpp40 harbours an ATPase domain, we tested DRpp40 and DRpp20 for ATPase activity mostly due to the latter homology with human Rpp20, which was shown to have ATPase activity. We could not detect any ATPase activity associated with aforementioned proteins or holoenzyme. Our future prospects are the determination of minimal catalytic core and the complete mapping of all protein-protein and RNA-protein interactions within RNase P holoenzyme. The completion of this project will contribute in a decisive manner to the understanding of both the catalytic mechanism and the evolution of RNase P from a primordial ribozyme to a highly organized ribonucleoprotein complex.

Με την αλληλούχιση του ανθρώπινου γονιδιώματος αλλά και άλλων οργανισμών, μια νέα εποχή άρχισε για την επιστήμη της βιολογίας, γνωστή ως "μεταγονιδιωματική εποχή". Ο όρος σε καμιά περίπτωση δεν σηματοδοτεί το τέλος της αλληλούχισης ή της ανάλυσης των ήδη αλληλουχημένων γονιδιωμάτων, απλά δηλώνει πως οι τεχνικοί περιορισμοί για την ανίχνευση γονιδιωματικής πληροφορίας έχουν σε μεγάλο βαθμό αντιμετωπισθεί . Η επόμενη μεγάλη πρόκληση είναι η κατανόηση του πρωτεόματος, δηλαδή του συνόλου των πρωτεϊνών που εκφράζονται σε ένα κύτταρο. Εξαιρετικά σημαντικό βήμα προς την κατεύθυνση αυτή αποτελεί η μελέτη του δικτύου των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων. Οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις αποτελούν ένα ιδιαίτερα σημαντικό πεδίο έρευνας καθώς ρυθμίζουν ένα τεράστιο αριθμό διεργασιών οι οποίες είναι βασικές για τη δομή και τη λειτουργία του. Εκτιμάται πως το δίκτυο των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων στον άνθρωπο αφορά περίπου 130,000 ζεύγη αλληλεπιδράσεων, ενώ ο αριθμός των αλληλεπιδράσεων που έχουν ταυτοποιηθεί αλλά παραμένει ως ζητούμενο η επιβεβαίωση των αντίστοιχων πειραματικών αποτελεσμάτων, αποτελεί μόνο το 8%, περίπου, του πραγματικού δικτύου. Ο κύριος όγκος πληροφορίας στο πεδίο αυτό δίνεται μέσα από βάσεις δεδομένων και έρχεται από μεγάλης κλίμακας πειράματα υψηλής απόδοσης τα οποία όμως, έχει βρεθεί πως δίνουν σε μεγάλο ποσοστό ανακριβή αποτελέσματα εξ αιτίας μιας σειράς εγγενών προβλημάτων των μεθόδων και της φύσεως των πρωτεϊνών. Η εκτίμηση του πραγματικού μεγέθους του δικτύου των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων υποδεικνύει και τον όγκο των δεδομένων που θα παραχθεί στο εγγύς μέλλον αλλά και την ανάγκη για βελτίωση της αξιοπιστίας της πληροφορίας που διατίθεται στις σχετικές βάσεις δεδομένων. Σκοπός αυτής της εργασίας είναι η ανάπτυξη μιας αναλυτικής βάσης δεδομένων γνώσης για την ταυτοποίηση δικτύων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων αντλώντας πληροφορία από επιλεγμένες μετά από αξιολόγηση, δημόσιες βάσεις πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων. Η συλλογή αυτή της πληροφορίας θα οδηγήσει μεσοπρόθεσμα στη δημιουργία μιας βάσης δεδομένων για τη διαχείριση της συλλογής, της οργάνωσης και της ανάκτησης δεδομένων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων όπου κατάλληλα υπολογιστικά εργαλεία θα αναπτυχθούν ώστε να αξιολογηθεί ο βαθμός αξιοπιστίας της καταχωρημένης σχετικής πληροφορίας σε μια μεγάλη ομάδα δημόσιων γονιδιωματικών βάσεων δεδομένων. Επίσης θα υπάρξει η δυνατότητα χρήσης εργαλείων για την ανάλυση των αξιολογημένων δεδομένων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, την μελέτη πρωτεϊνών με άγνωστη λειτουργία αλλά και τον προσδιορισμό μη καταγεγραμμένων έως τώρα πρωτεϊνικών συμπλεγμάτων. / The elucidation of protein-protein interaction (PPI) networks (protein interactomes) is a major objective of systems biology. This task is crucial for furthering our understanding of the cellular machinery dynamics, in light of the fundamental role of proteins in cellular function. The development of high-throughput methods for PPI identification, including the widely used yeast two hybrid and the mass spectrometry of co-immunoprecipitated complexes, drastically increased the PPI data in model organisms and the human. However, these methods suffer from intrinsic detection biases and >70% of false positives. Moreover, independent public databases (dbs) of experimentally derived PPIs exhibit a remarkably limited overlap, mainly due to uncoordinated data validation and curation criteria. These limitations scale up in highly complex systems like the human for which only 8-10% of the estimated PPIs have been determined. Furthermore, new PPI prediction is affected by the current data quality and quantity along with predictive algorithm limitations to incorporate the available protein information. Thus, there is initially a need for a systematic curation of multiple datasets into one common db. We have integrated high- and low- throughput experimental data, ortholog protein interactions, protein domain interactions, and protein structure/function and expression data from twelve highly informative and updated dbs into one local db using the Microsoft_SQL_Server. The db selection was based on their unique gene content, PPIs recorded, annotation depth, curation methodology and relational scheme. This data will be enriched with PPI information mined from the literature. The final dataset will be appropriately scored to rank and validate the PPIs with increased confidence, forming the basis for a human interactome knowledge base.

Η ανάπτυξη του ανοσοποιητικού συστήματος ξεκινά από πολυδύναμα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα, τα οποία διαδοχικά δίνουν γένεση σε ενδιάμεσους πληθυσμούς προγονικών κυττάρων οι οποίοι σταδιακά χάνουν την ικανότητά τους για αυτοανανέωση και τελικά δίνουν γένεση στα πλήρως διαφοροποιημένα κύτταρα της μυελικής και λεμφικής σειράς. Η συγκεκριμένη διαδικασία στηρίζεται στο λεπτό συντονισμό της αυτοανανέωσης, αλλά και της διαφοροποίησης, απαιτεί δε την έκφραση διαφορετικών γονιδίων που σχετίζονται με τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, τη μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων, αλλά και συμπλόκων αναδιοργάνωσης της δομής της χρωματίνης που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση. Η geminin έχει προταθεί ότι ρυθμίζει την απόφαση ενός κυττάρου για πολλαπλασιασμό ή διαφοροποίηση. Αλληλεπιδρά με μεταγραφικούς παράγοντες, με σύμπλοκα αναδιάταξης της δομής της χρωματίνης, ρυθμίζοντας την έκφραση γονιδίων που ελέγχουν τη νευρωνική διαφοροποίηση. Παράλληλα, δρα σαν αναστολέας του κυτταρικού κύκλου, προσδενόμενη στο παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA, CDT1. Στόχος μας ήταν να διερευνήσουμε τον in vivo ρόλο της Geminin στη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό, στο ανοσοποιητικό σύστημα. Στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής, βασιζόμενοι στο σύστημα Cre-loxP, δημιουργήσαμε μύες που επιτρέπουν την υπό συνθήκη εξάλειψη (knockout) του γονιδίου της geminin, πλαισιώνοντας τα εξώνια 3 και 4 του γονιδίου της με θέσεις loxP. Η στόχευση του γονιδίου και η παρεμβολή των 3 loxP θέσεων πραγματοποιήθηκε σε pc3 εμβρυικά πολυδύναμα κύτταρα μυός, χρησιμοποιώντας κατάλληλο πλασμιδιακό knockout φορέα, που έφερε τη κασέτα επιλογής TKneo. Μετά από ένεση των ορθά ανασυνδυασμένων pc3 κλώνων σε βλαστοκύστεις, τη δημιουργία χιμαιρικών μυών που εκφράζουν την Cre ρεκομπινάση στη γαμετική σειρά, και την επακόλουθη διασταύρωσή τους με μύες αγρίου τύπου, δημιουργήθηκαν ετερόζυγοι μύες για το πλαισιωμένο με loxP θέσεις αλληλόμορφο της Geminin, που παράλληλα έφερε και τη κασέτα επιλογής TKneo («floxed-ΤΚneo»), το πλαισιωμένο με loxP θέσεις αλληλόμορφο της Geminin, που στερούνταν της κασέτας επιλογής TKneo (floxed), καθώς επίσης και το αλληλόμορφο που στερούνταν των εξωνίων 3 και 4 και είναι το πλήρες knockout (ΔGEM ΚΟ -null) αλληλόμορφο). Από διασταυρώσεις ετερόζυγων για το ΔGEM ΚΟ αλληλόμορφο της geminin, δεν προέκυψαν ομόζυγοι μύες για το ΔGEM ΚO αλληλόμορφο (-/-), τόσο μεταγεννητικά όσο και in utero. Η μειωμένη αντιπροσώπευση των ΔGEM+/- μυών σε συνδυασμό με την αύξηση των Thy1-/B220- κυττάρων σε σπλήνα και λεμφαδένες ενήλικων μυών, η σημαντική αύξηση των Thy1+ και ειδικότερα των CD8+ Τ κυττάρων, καθώς επίσης και η αισθητή μείωση των CD4+ Τ κυττάρων του σπλήνα σε ζώα ηλικίας 5 μηνών, προτείνει ένα είδος απλοανεπάρκειας των ετερόζυγων για Geminin μυών. Σε παραπλήσια αποτελέσματα οδηγηθήκαμε και μετά από την ανάλυση των GT KO για το γονίδιο της Geminin (GT) μυών με τη μεθοδολογία της παγίδευσης γονιδίων. Τα ετερόζυγα GT ζώα διασταυρώθηκαν με ετερόζυγα ζώα για το πλήρες ΚΟ του BRG1 (BRG) και με ετερόζυγα ζώα που υπερεκφράζουν μια επικρατούσα κατασταλτική μορφή του BAF57 (BAFΔΝ, BAF), προκειμένου να διαπιστωθεί εάν υπάρχει γενετική αλληλεπίδραση μεταξύ της Geminin και των μελών του συμπλέγματος αναδιοργάνωσης της δομής της χρωματίνης SWI/SNF, BRG1 και BAF57 που έχει δειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο κατά την ανάπτυξη και διαφοροποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος. Ιστοειδικά, χρησιμοποιώντας την floxedΤΚneo σειρά μυών σε συνδυασμό με την CD2-Cre, που επιτρέπει την εξάλειψη του γονιδίου από το στάδιο των DN κυττάρων του θύμου και μετά, είδαμε ότι η ανάπτυξη του θύμου δεν φαίνεται να επηρεάζεται κατά την απουσία της Geminin, ενώ αντίθετα ο ολικός αριθμός των σπληνοκυττάρων μειώνεται στα FlTKneo/KO;CD2 σε σχέση με τα WT. Μιτωγονική διέγερση με ConA εναιωρήματος σπληνοκυττάρων από FlTKneo/KO;CD2 και WT ζώα, έδειξε ότι τα FlTKneo/KO;CD2 Τ λεμφοκύτταρα αδυνατούν να διαιρεθούν. Τέλος, έγινε προσπάθεια για ιστοειδική υπερέκφραση στο ανοσοποιητικό σύστημα της ανθρώπινης Geminin συντηγμένης με τη πράσινη φθορίζουσα χρωστική (GFP). Το συγκεκριμένο σύστημα επιτρέπει την υψηλή έκφραση του διαγονιδίου κυρίως στα Τ κύτταρα. Ενώ προέκυψαν ιδρυτές για όλες τις πιο πάνω σειρές τόσο με χαμηλή όσο και με υψηλή ενσωμάτωση του διαγονιδίου, η έκφραση της GFP δεν κατέστη δυνατόν να ανιχνευθεί με FACS. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι η Geminin είναι ιδιαίτερα σημαντική κατά τα αρχικά στάδια ανάπτυξης του εμβρύου μυός, ενώ ιστοειδικά στο ανοσοποιητικό σύστημα η πλήρης εξάλειψή της δεν έχει καμία επίπτωση στην ανάπτυξη του θύμου αδένα, ενώ αντίθετα στη σπλήνα εμφανίζονται μειωμένοι οι πληθυσμοί των ώριμων CD4 και CD8 Τ λεμφοκυττάρων. Τέλος, φαίνεται να συνεργάζεται με το σύμπλεγμα αναδιοργάνωσης της δομής της χρωματίνης SWI/SNF στη ρύθμιση των CD4 κυττάρων του θύμου αδένα και των CD8 του σπλήνα. / Immune system development initiates from a multipotent hematopoietic stem cell that consecutively generates intermediate progenitors that concomitantly lose their self-renewal ability and finally generate the fully differentiated cells of the myeloid and lymphoid lineage. The whole procedure is based on the fine tuning of the processes of both self-renewal and differentiation, and requires the expression of diverse genes that are implicated in the processes of cell cycle regulation, transcriptional regulation, and are constituents of chromatin remodeling complexes that operate during differentiation. Geminin has been proposed to control a cell’s decision to proliferate or differentiate. It interacts with transcription factors, with chromatin remodeling complexes, regulating neurospecific gene transcription. At the same time, Geminin acts as a cell cycle inhibitor through direct binding to the DNA licensing factor CDT1. Our goal was to investigate Geminin’s in vivo role in differentiation and cell cycle regulation in the immune system. In this thesis, using Cre-loxP system, we generated conditional knockout mice for Geminin’s gene, flanking exons 3 and 4 with loxP sites. Gene targeting and the insertion of the three loxP sites was performed in pc3 mouse embryonic stem cells, using a suitable knockout plasmid vector, which bared the TKneo cassette selection marker. Upon injection of the homologously recombined pc3 clones into blastocysts, the generation of chimeric mice that expressed Cre recombinase in their germ line, and their subsequent cross to wild type mice, we were able to generate heterozygote mice for the flanked by loxP sites allele of Geminin that also bared TKneo selection marker (“floxed-TKneo” allele), the flanked by loxP sites allele of Geminin that was deprived of the TKneo selection marker (the floxed allele) and the complete knockout allele of Geminin (ΔGEM KO (null) allele) that was deprived of exons 3 and 4. From ΔGEM+/- intercrosses we didn’t recover any homozygote knockout mice, both postnatally and in utero. The reduced number of the ΔGEM+/- obtained, in combination with the dramatic increase of Thy1-B220- cells from spleen and lymph nodes from ΔGEM+/- adult mice, the significant increase in Thy1+ and CD8+ from lymph nodes and the discernible decrease of spleenic CD4 T cells in ΔGEM+/- aged 5 months suggest that ΔGEM+/- mice are haploinsufficient. Similar results were obtained from the analysis of the GT knockout that we generated, using a gene trap mutagenesis approach. GT heterozygote mice were crossed with heterozygote mice for BRG1 Knockout (BRG mice) and with heterozygote mice that overexpressed a dominant negative form of BAF57 (BAFΔN, BAF mice), so as to investigate whether there is a genetic interaction between Geminin and the two members of the SWI/SNF chromatin remodeling complex that have significant roles during development and differentiation of the immune system. Upon conditional inactivation of Geminin’s gene in the immune system, using floxedTKneo and CD2-Cre mouse lines, that allowed the deletion of the gene from the DN stage and on, we were surprised to see that in the Geminin conditional knockout mice, thymic development was largely unaffected. On the contrary, spleenic cellularity from Geminin conditional knockout mice was fairly reduced, when compared to WT control littermates. Mitogenic stimulation with ConA of spleenic whole cell extract from Geminin conditional KO (FlTKneo/KO;CD2) and WT mice demonstrated that the mutant T cells were unable to divide. Finally, we tried to overexpress human Geminin tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) specifically in the immune system. This particular system would ensure high expression of the transgene mainly in T cells. We obtained founders for all of the cloned constructs, both with low and high copy transgene integration, but we were unable to detect GFP expression by FACS analysis. Our results show that Geminin has a pivotal role during early mouse embryonic development, whereas tissue specific inactivation in the immune system leaves thymic development largely unaffected, whereas mature CD4 and CD8 T cells in the spleen are drastically reduced. Finally, Geminin seems to operate with SWI.SNF complex for the regulation of thymic CD4 and spleenic CD8.

Βασικός στόχος της παρούσας διατριβής είναι η αποσαφήνιση του τρόπου της διεπιφανειακής εναπόθεσης του νικελίου στην επιφάνεια της τιτάνιας, η οποία λαμβάνει χώρα στη διεπιφάνεια “τιτάνιας / ηλεκτρολυτικού διαλύματος”. Ο στόχος αυτός επιτεύχθηκε μέσω μιας κατάλληλης θεωρητικής και υπολογιστικής επεξεργασίας δεδομένων, που προέρχονται από την εφαρμογή ηλεκτροχημικών και φασματοσκοπικών τεχνικών, την εκτέλεση πειραμάτων προσρόφησης, καθώς επίσης και σε ab – initio υπολογισμούς για την εξακρίβωση της δομής των συμπλόκων εσωτερικής σφαίρας τα οποία σχηματίζονται και των συγκεντρώσεών τους στη διεπιφάνεια. Δείγματα βιομηχανικής τιτάνιας (Degussa, P 25) πλούσιας σε ανατάση χρησιμοποιήθηκαν για το σκοπό αυτό. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε για μια ευρεία περιοχή παραμέτρων εμποτισμού και πιο συγκεκριμένα τιμές pH, ιονικής ισχύος και συγκέντρωσης του υδατικού συμπλόκου [Ni(H2O)6]2+ στο διάλυμα. Μεταβάλλοντας τις παραμέτρους αυτές ρυθμίστηκε η επιφανειακή συγκέντρωση των ιόντων Ni(II). Χρησιμοποιήθηκε μια πληθώρα μεθοδολογιών στηριγμένες σε δεδομένα εναπόθεσης, μετρήσεις τιμών pH, ποτενσιομετρικές τιτλοδοτήσεις μάζας και πειράματα μικροηλεκτροφόρησης σε συνδυασμό με φασματοσκοπία διάχυτης ανάκλασης (DRS). Ο συνδυασμός όλων των παραπάνω φαίνεται πως υποδεικνύει το σχηματισμό μονοπυρηνικών / ολιγοπυρηνικών συμπλόκων εσωτερικής σφαίρας κατά την εναπόθεση των ιόντων [Ni(H2O)6]2+ στη διεπιφάνεια “τιτάνιας / ηλεκτρολυτικού διαλύματος”. Η μοντελοποίηση της διαδικασίας εναπόθεσης η οποία βασίστηκε στα προαναφερθέντα πειραματικά αποτελέσματα, αποκάλυψε την ακριβή δομή αυτών των επιφανειακών συμπλόκων και κατέστησε δυνατό τον προσδιορισμό της κατανομής των εναποτιθέμενων ειδών και ειδικότερα των σχετικών τους συγκεντρώσεων για διάφορες τιμές της επιφανειακής συγκέντρωσης Ni(II). Στο συμπαγές τμήμα της διεπιφάνειας “τιτάνιας / ηλεκτρολυτικού διαλύματος” σχηματίζονται τρία μονοπυρηνικά σύμπλοκα εσωτερικής σφαίρας: ένα μονο - υποκατεστημένο, δι - υδρολυμένο σύμπλοκο πάνω από τις ακραίες οξο - ομάδες ανταλλάσοντας ένα υδατικό υποκαταστάτη με ένα επιφανειακό άτομο οξυγόνου (διαμόρφωση TiO), ένα δι - υποκατεστημένο, δι - υδρολυμένο σύμπλοκο πάνω από δύο ακραίες γειτονικές οξο - ομάδες ανταλλάσοντας δύο υδατικούς υποκαταστάτες με δύο επιφανειακά άτομα οξυγόνου (διαμόρφωση TiO - TiO) και ένα δι - υποκατεστημένο μη υδρολυμένο σύμπλοκο πάνω από μία ακραία και μία γεφυρωμένη οξο - ομάδα (διαμόρφωση Ti2O - TiO). Επιπρόσθετα, σχηματίζονται ένα διπυρηνικό και ένα τριπυρηνικό σύμπλοκο εσωτερικής σφαίρας κατά την εναπόθεση των ιόντων [Ni(H2O)6]2+ στο συμπαγές τμήμα της διεπιφάνειας “τιτάνιας / ηλεκτρολυτικού διαλύματος”. Στην πρώτη περίπτωση η θέση υποδοχής συμπεριλαμβάνει μία γεφυρωμένη και δύο ακραίες οξο - ομάδες (διαμόρφωση Ti2O-TiO—TiO), ενώ στη δεύτερη περίπτωση δύο γεφυρωμένες και τρεις ακραίες οξο - ομάδες (διαμόρφωση Ti2O-TiO—TiO—TiO-Ti2O). Η διαμόρφωση TiO κυριαρχεί σε όλο το εύρος της περιοχής επιφανειακών συγκεντρώσεων το οποίο μελετήθηκε. Η συνεισφορά των διαμορφώσεων TiO - TiO και Ti2O - TiO είναι επίσης σημαντική σε πολύ χαμηλές τιμές επιφανειακής συγκέντρωσης Ni(II), μειώνεται όμως σε μεγάλο βαθμό καθώς αυτή αυξάνεται. Οι σχετικές επιφανειακές συγκεντρώσεις των διαμορφώσεων Ti2O-TiO--TiO και Ti2O-TiO—TiO--TiO-Ti2O αρχικά αυξάνουν με την επιφανειακή συγκέντρωση Ni(II) και μετά μένουν πρακτικά σταθερές. Η προαναφερθείσα κατανομή των εναποτιθέμενων ειδών στη διεπιφάνεια εξηγήθηκε με τη χρήση στερεοχημικών όρων. Επιπρόσθετα, η δομή των επιφανειακών συμπλόκων εσωτερικής σφαίρας και η κατανομή αυτή είναι σε γενική συμφωνία με εκείνες οι οποίες προβλέφθηκαν με την εκτέλεση ημιεμπειρικών κβαντομηχανικών υπολογισμών για την εναπόθεση του Ni στο TiO2. Το μοντέλο εναπόθεσης το οποίο αναπτύχθηκε περιέγραψε πολύ καλά τις adsorption edges, τις τιτλοδοτήσεις “πρωτονίου - ιόντος” και τις ισόθερμες εναπόθεσης, ενισχύοντας επιπλέον την αξιοπιστία και ορθότητά του. / The main goal of this work is the elucidation of the mode of interfacial deposition of nickel on the surface of titania, which takes place in the “titania / electrolytic solution” interface. This goal was achieved through the use of several methodologies combined with spectroscopic techniques, as well as ab – initio calculations in order to determine the structure of the inner sphere complexes formed as well as their relative interfacial concentrations. Samples of titania (Degussa, P 25) rich in anatase were used for this purpose. The study was performed over a quite wide range of impregnation parameters namely pH, ionic strength and concentration of the [Ni(H2O)6]2+ aqua complex in the solution. By changing these parameters, the Ni(II) surface concentration was regulated. Several methodologies based on deposition data, pH measurements, potentiometric mass titrations and microelectrophoresis have been used in conjunction with diffuse reflectance spectroscopy. These suggested the formation of mono - nuclear / oligo - nuclear inner sphere complexes upon deposition of the [Ni(H2O)6]+2 ions at the “titania / electrolytic solution” interface. The modelling of the deposition process based on the aforementioned experimental results revealed the exact structure of these surface complexes and allowed the determination of their relative concentrations at various values of Ni(II) surface concentration (interfacial speciation). Three mono-nuclear inner sphere complexes are formed at the compact layer of the “titania / electolytic solution” interface; one mono - substituted, di - hydrolyzed complex above the terminal oxo - groups by exchanging one water ligand with a surface oxygen atom (TiO configuration), a di - substituted, di - hydrolyzed complex above two terminal adjacent oxo - groups by exchanging two water ligands with the two surface oxygen atoms (TiO-TiO configuration) and one di - substituted, non - hydrolyzed complex above one terminal and one bridging adjacent oxo - groups ( Ti2O-TiO configuration). One binuclear and one three - nuclear complex are formed, in addition, at the compact layer. In the first case the receptor site involves one bridging and two terminal oxo- groups (Ti2O-TiO--TiO configuration) whereas in the second case the receptor site involves two bridging and three terminal oxo - groups (Ti2O-TiO--TiO--TiO-Ti2O configuration). The TiO configuration predominates in the whole range of the surface concentration studied. The contribution of the TiO-TiO and Ti2O-TiO configurations is also important at very low Ni(II) surface concentration, but this contribution is rapidly decreased as the Ni(II) surface concentration increases. The relative surface concentrations of the Ti2O-TiO--TiO and Ti2O-TiO--TiO--TiO-Ti2O configurations initially increase with the Ni(II) surface concentration and then remain practically constant. The aforementioned interfacial speciation was explained in stereochemical terms. Moreover, the structure of the inner sphere surface complexes and the interfacial speciation are in general agreement with those predicted by performing semi-empirical quantum chemical calculations of the deposition process. The deposition model developed has described the ‘adsorption edges’, the ‘proton–ion titration curves’ and the deposition isotherms well, further corroborating its validity.