Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-03-26Bitstream added on 2014-06-13T19:15:56Z : No. of bitstreams: 1 frasnelli_sct_me_arafo.pdf: 758242 bytes, checksum: fc10d5e79dcb4b386aacc5d2776f572c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Diabetes mellitus se caracteriza pelo acúmulo de produtos finais da glicação avançada (AGEs) que ativam seu receptor RAGE. Entre as complicações associadas ao diabetes está a modulação da resposta imune, evidenciada pela maior susceptibilidade à infecção em diabéticos. O sistema imune percebe e reaje aos microrganismos por meio de receptores de padrões moleculares (receptores semelhantes à Toll, TLRs). Lipopolissacarídeo da parede celular (LPS) é um dos principais fatores de virulência de microrganismos Gramnegativos e é reconhecido principalmente por TLR4. A hipótese deste trabalho é que a ativação de RAGE e TLR4 por seus ligantes pode resultar em efeito sinérgico na modulação da proliferação, morte celular e expressão de citocinas inflamatórias por células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Foram selecionados 7 indivíduos não diabéticos e 6 indivíduos portadores de diabetes tipo 2 para coleta de PBMCs. Estas células foram estimuladas com LPS bacteriano e BSA glicado, isoladamente e combinados, na presença e na ausência de inibidores dos receptores RAGE e TLR4. Proliferação e morte celular foram avaliadas por contagem direta em hemocitômetro e citometria de fluxo, respectivamente. A expressão de citocinas e quimiocinas inflamatórias foi avaliada por RT-qPCR, enquanto a modulação do padrão de resposta imune adaptativa foi estudada por meio de citometria de fluxo. Os resultados mostram 18 18 que PBMCs de pacientes portadores de diabetes tendem a ser mais resistentes à indução de morte celular. De um modo geral, a inibição dos receptores RAGE e TLR4 não interfere na atividade metabólica e viabilidade celular em diabéticos e não diabéticos. A expressão gênica de CCL3 e CCR5 não foi regulada pelos receptores RAGE e TLR, sendo discretamente mais elevada em pacientes não diabéticos. A expressão de TNF-α e IL-10 foi regulada... / Diabetes mellitus is characterized by the progressive accumulation of advanced glycation end-products (AGEs), which bind and activate their membrane-bound receptor (RAGE) on a variety of target cells. Modulation of the immune response is one of the diabetes-associated complications and is reflected on the increased susceptibility of diabetes patients to infections and sepsis. The immune system senses and reacts to microorganisms by pattern-recognition receptors, such as Toll-like receptors (TLRs). Bacterial lipopolysaccharide (LPS) is a major virulence factor of Gram-negative microorganisms, which is recognized mainly by TLR4. The hypothesis of this study is that of a synergism between activated TLR4 and RAGE that modulates the response of cells of innate and adaptive immunity in the circulation (peripheral blood monocytic cells, PBMCs). PBMCs were collected from 13 volunteers (7 with type 2 diabetes and 6 systemically-healthy controls). The cells were stimulated with bacterial LPS and glycated bovine serum albumin (AGE-BSA), both independently and in association. To study the role of TLR4 and RAGE signaling, these stimulations were performed in the presence and absence of specific inhibitors of RAGE and TLR4. We used direct counting in a hemocytometer and flow cytometry, respectively, to assess cell proliferation and 20 20 death. The expression of selected cytokines and receptors was studied by RTqPCR, whereas the effect of these stimuli on the modulation of T helper-type response was determined by flow cytometry. We observed increased cell survival in PBMCs from diabetic patients. Inhibition of RAGE and TLR4 had no marked effect on cell proliferation, metabolic activity and survival. Gene expression of CCL3 (MIP-1alpha) and CCR5 was discretely higher in PBMCs from non-diabetic patients and was not affected by RAGE or TLR4 signaling... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Carlos Rossa Junior / Coorientador: Silvana Regina Perez Orrico / Banca: José Eduardo Cezar Sampaio / Banca: Sandra Helena Penha de Oliveira / Resumo: Diabetes mellitus se caracteriza pelo acúmulo de produtos finais da glicação avançada (AGEs) que ativam seu receptor RAGE. Entre as complicações associadas ao diabetes está a modulação da resposta imune, evidenciada pela maior susceptibilidade à infecção em diabéticos. O sistema imune percebe e reaje aos microrganismos por meio de receptores de padrões moleculares (receptores semelhantes à Toll, TLRs). Lipopolissacarídeo da parede celular (LPS) é um dos principais fatores de virulência de microrganismos Gramnegativos e é reconhecido principalmente por TLR4. A hipótese deste trabalho é que a ativação de RAGE e TLR4 por seus ligantes pode resultar em efeito sinérgico na modulação da proliferação, morte celular e expressão de citocinas inflamatórias por células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Foram selecionados 7 indivíduos não diabéticos e 6 indivíduos portadores de diabetes tipo 2 para coleta de PBMCs. Estas células foram estimuladas com LPS bacteriano e BSA glicado, isoladamente e combinados, na presença e na ausência de inibidores dos receptores RAGE e TLR4. Proliferação e morte celular foram avaliadas por contagem direta em hemocitômetro e citometria de fluxo, respectivamente. A expressão de citocinas e quimiocinas inflamatórias foi avaliada por RT-qPCR, enquanto a modulação do padrão de resposta imune adaptativa foi estudada por meio de citometria de fluxo. Os resultados mostram 18 18 que PBMCs de pacientes portadores de diabetes tendem a ser mais resistentes à indução de morte celular. De um modo geral, a inibição dos receptores RAGE e TLR4 não interfere na atividade metabólica e viabilidade celular em diabéticos e não diabéticos. A expressão gênica de CCL3 e CCR5 não foi regulada pelos receptores RAGE e TLR, sendo discretamente mais elevada em pacientes não diabéticos. A expressão de TNF-α e IL-10 foi regulada... (Resumo completo, clicar acesso eletr^ônico abaixo) / Abstract: Diabetes mellitus is characterized by the progressive accumulation of advanced glycation end-products (AGEs), which bind and activate their membrane-bound receptor (RAGE) on a variety of target cells. Modulation of the immune response is one of the diabetes-associated complications and is reflected on the increased susceptibility of diabetes patients to infections and sepsis. The immune system senses and reacts to microorganisms by pattern-recognition receptors, such as Toll-like receptors (TLRs). Bacterial lipopolysaccharide (LPS) is a major virulence factor of Gram-negative microorganisms, which is recognized mainly by TLR4. The hypothesis of this study is that of a synergism between activated TLR4 and RAGE that modulates the response of cells of innate and adaptive immunity in the circulation (peripheral blood monocytic cells, PBMCs). PBMCs were collected from 13 volunteers (7 with type 2 diabetes and 6 systemically-healthy controls). The cells were stimulated with bacterial LPS and glycated bovine serum albumin (AGE-BSA), both independently and in association. To study the role of TLR4 and RAGE signaling, these stimulations were performed in the presence and absence of specific inhibitors of RAGE and TLR4. We used direct counting in a hemocytometer and flow cytometry, respectively, to assess cell proliferation and 20 20 death. The expression of selected cytokines and receptors was studied by RTqPCR, whereas the effect of these stimuli on the modulation of T helper-type response was determined by flow cytometry. We observed increased cell survival in PBMCs from diabetic patients. Inhibition of RAGE and TLR4 had no marked effect on cell proliferation, metabolic activity and survival. Gene expression of CCL3 (MIP-1alpha) and CCR5 was discretely higher in PBMCs from non-diabetic patients and was not affected by RAGE or TLR4 signaling... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo não disponível

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-04T18:15:33Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2010-Dissertação-MarceloCordeiro.pdf: 2495604 bytes, checksum: 2d51566d7f95818c5bd7b1860032afdc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T18:15:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2010-Dissertação-MarceloCordeiro.pdf: 2495604 bytes, checksum: 2d51566d7f95818c5bd7b1860032afdc (MD5) Previous issue date: 2010-09-27 / Os papilomavírus são um grupo de pequenos vírus DNA dupla fita caracterizado por induzir a formação de lesões que, normalmente, são benignas e podem regredir naturalmente, mas também apresentam opotencial para se tornarem tumores malignos. O papilomavírus humano (HPV) está fortemente relacionado às doenças sexualmente transmissíveis (DST) e é uma das principais causas de câncer cervical. O papilomavírus bovino (BPV), por sua vez, representa um grave problema econômico em termos de pecuária. Em bovinos, são mais comuns as papilomatosescutânease mucosas nas regiões genital e orofaríngea. Existem bem caracterizados seis tipos diferentes de BPV (BPV 1 ao 6) e, recentemente, quatro novos tipos (BPVs 7 ao 10) foram seqüenciados. No Nordeste, especialmente no estado de Pernambuco (Zona da Mata), a incidência da papilomatose bovina é muito alta, causando grandes perdas econômicas para os criadores. Não há tratamento com eficácia comprovada. Proteção contra a infecção é conferida por anticorpos neutralizantes dirigidos contra osepítopos conformacionais de proteínas estruturais L1. Esses anticorpos podem ser eficientemente induzidos pela imunização com virus-like particles(VLP) que se formam espontaneamente, após a expressão de L1 em sistemas heterólogos. Nos últimos anos, a levedura metilotrófica Pichia pastoris emergiu como um sistema eficaz e barato para produzir altos níveis deproteínarecombinante. O foco deste trabalho foi construir e avaliar dois plasmídeos (pPICZAαL1B2 e pPICZAL1B2), como vetores para expressão do geneL1BPV-2 em células de P. pastoris. Um deles (pPICZAαL1B2) insere na proteína recombinante um sinal de secreção (α-mating). Assim, esperou-se comparar a eficiência da expressão heteróloga através das viasintra e extracelulares. O gene L1 foi amplificado por PCR do genoma completo BPV-2, foi clonado em vetor pGEM-T(Promega ®) e, posteriormente, foi subclonado nos vetores de expressão pPICZA e pPICZAα (Invitrogen ®). PCR e análise de restrição indicarama inserção correta do gene L1 em ambos os vetores, bem como o seqüenciamento. Por eletroporação, P. pastoris (cepa de levedura X-33) foi transformada com a construção pPICZAL1B2 ou pPICZAαL1B2, cuja integração no genoma de levedura pode ser identificada por PCR da colônia. As leveduras transformadas foram selecionadas para experimentos de cultura com indução com metanol. A expressão de L1 foi indicada por RT-PCR e análise de proteínas. A proteína recombinante L1foi detectada em células de levedura, que sofreram tratamento com solução de lise (via intracelular) e em meio de cultura submetido a precipitação com acetona (via extracelular). Este estudo fornece um caminho para uma estratégia de vacina com VLP contra papilomaviroses bovina e apresenta um modelo experimental para estudos de papilomatosessimilares, além de mostrar um modelo experimental interessante para futuras aplicações em seres humanos. / Papillomaviruses are a group ofsmall double-stranded DNA viruses characterized by inducingthe formation of lesions that are usually benign and may regress naturally, but also havethe potential to become malignant tumors. The human papillomavirus (HPV) is strongly related to sexually transmitted diseases (STDs) and is a major cause of cervical cancer. The bovine papillomavirus (BPV), in turn, represents a serious economic problem in terms of livestock. In cattle,cutaneous and mucosal papillomatosis at genital and oropharyngeal regionsare the most common. There are six different types of BPV (BPV 1-6) well characterized and, recently, four new types (BPVs 7-10) havebeen sequenced.In theNortheast, especially inthe state of Pernambuco (Zona da Mata), the incidence of bovine papillomatosis isveryhigh,causing great economic losses for breeders. There isno treatment with proven efficacy. Protection against infection is conferred by neutralizing antibodies directed against structural L1proteinconformational epitopes. These antibodies can be efficiently induced by immunization with virus-like particles (VLP) that are formed spontaneously after L1 expression in heterologous systems. In recent years, the methylotrophic yeast Pichia pastorishas emerged as an efficient and inexpensive heterologous system to produce high protein levels. The focus of this paper is to construct andevaluate two plasmids (pPICZAαL1B2 and pPICZAL1B2), as vectors to gene expression of L1BPV-2 in cells of P. pastoris. One of them (pPICZAαL1B2) inserts a secretion signal (α-matting)on recombinant protein. Thus, it had been expected to compare the heterologous expression via intracellular and extracellular pathway efficiency. L1 gene has been amplified by PCR from the complete BPV-2 genome, has been cloned into pGEM-T vector (Promega®) and, subsequently, has been sub cloned into pPICZA and pPICZAαexpression vectors (Invitrogen®). PCR and restriction analysis haveindicated the correct insertion of the L1 gene in both vectors, as well as sequencing. By electroporation, P. pastoris(strain X-33 yeast) has been transformed with pPICZAL1B2 orpPICZAαL1B2 constructions, whose integration into yeast genome could be identified by colony PCR. Transformed yeast has been selected to culture experiments withmethanol induction. L1 expression has been indicated by RT-PCR and protein analysis. L1 recombinant protein has been detected in yeast cells that has undergonelysis solution treatment (intracellular pathway) and from the culture medium acetone precipitation submitted (extracellularpathway). This study provides a way for a VLP-vaccine strategyagainst bovine papillomaviroses and exhibits an experimental model for similar papillomatosis studies, whileshowingan interesting experimental model for future applications in humans.

Orientador: Lício Augusto Velloso / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T06:28:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_AndressaCoopedos_D.pdf: 9572929 bytes, checksum: ce4c4fb2095c6ffe99868ec77f19d5b3 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A ativação da sinalização através do toll-like receptor-4 (TLR4) e a indução de estresse de retículo endoplasmático (ERE) são importantes mediadores da resistência à insulina na obesidade e em outras situações nas quais há um excesso de ácidos graxos saturados. Em um estudo recente, demonstrou-se que sinalização através de TLR4 pode, per se, induzir a ativação de ERE, sugerindo que a ativação do TLR4 é o evento inicial para a indução do estresse celular que contribui para o aumento da expressão de genes de resposta inflamatória. No entanto, os mecanismos que conectam essas duas vias distintas são desconhecidos. As chaperonas GRP78 e GRP94 exercem uma função importante no processamento das moléculas recém-traduzidas do TLR4. Além disso, a chaperona GRP94 é responsável por sua translocação e conteúdo na superfície celular. Durante uma ativação prolongada da via de sinalização do TLR4, a demanda por novas moléculas sintetizadas aumenta, e consequentemente, a demanda por novas chaperonas. Por esta razão, nós aventamos a hipótese de que sob uma ativação extrema da via do TLR4, a síntese de proteínas sobrepujaria a expressão de chaperonas, dessa forma induzindo ERE. Para testar essa hipótese, monócitos da linhagem THP-1 foram incubados com LPS e foi avaliada a expressão e ativação de proteínas responsivas ao ERE por real-time PCR, citometria de fluxo, imunoprecipitado e western blot. Em alguns experimentos, as células foram privadas de glicose ou tratadas com siRNA para aumentar ou diminuir, respectivamente, a expressão das chaperonas. Experimentos de time-course revelaram que o LPS induz um aumento de 2,5 vezes na expressão do TLR4, iniciando após 8 h, com um pico após as 24 h e permanecendo significantemente aumentado após 48 h. A expressão de GRP78 foi aumentada em três vezes com um aumento acentuado após 24 h sem aumento às 8 h, enquanto o GRP94 aumenta apenas 1,5 vezes com um pico após 2 h que retorna aos valores basais após 8 h do estímulo. Não houve aumento da expressão protéica das chaperonas após 48 h. A indução de ERE por LPS foi detectada antes de 4 h do estímulo observado pela avaliação da via da PERK/eIF2a, IRE1 e ATF6 e se mantém ativado após 48 h. Adicionalmente, a privação de glicose em células THP-1 aumenta a expressão de GRP94 e GRP78 em 2,5 e 11 vezes, respectivamente. Na ausência de glicose, o tratamento com LPS não induz ERE. A inibição da expressão das chaperonas por siRNA anula o efeito da privação de glicose em proteger as células do desenvolvimento de ERE induzido por LPS. Portanto, a hiperexpressão das chaperonas GRP78 e GRP94 protegem as células do ERE induzido por LPS. Assim, defeito na expressão das chaperonas induzido por TLR4 é um mecanismo envolvido na integração da sinalização do TLR4 e ERE / Abstract: TLR4 activation and the induction of endoplasmic reticulum stress (ERS) are two of the most important mechanisms connecting excessive fat with insulin resistance. Recently, it was shown that activation of TLR4 can, per se, induce ERS, suggesting that TLR4 is a primary event in the induction of the cellular stress that contributes to increased inflammatory gene expression. However, the mechanisms linking these molecular events are unknown. The chaperones GRP78 and GRP94 play an important role during the assembly of newly translated TLR4 molecules. In addition, the chaperone GRP94 escorts the protein to the cell membrane. Under prolonged activation, the demand for newly synthesized TLR4 molecules increases, and thus, the demand for new chaperones. Therefore, we hypothesized that under increased activation of TLR4, the synthesis of the protein would not be matched by the expression of chaperones, thus, triggering ERS. To test this hypothesis, the monocyte cell line THP-1 was incubated with LPS and the expression/activation of proteins involved in ERS was determined by real-time PCR, flow-cytometry, immunoprecipitation and immunoblot. In some experiments, cells were deprived of glucose or treated with siRNA to increase or decrease, respectively, the expression of the chaperones. Time-course experiments revealed that LPS led to a 2.5-fold increase of TLR4 expression starting as early as 8h, peaking after 24h and remaining significantly increased after 48h. The expression of GRP78 underwent a 3-fold increase with a sharp rise at 24h (no increase at 8h), while GRP94 increased by only 1.5-fold with a peak at 2h and an early return to base-line levels. None of the chaperones were increased after 48h. LPS-induced ERS was detected as early as 4h after stimulus as detected by the evaluation of PERK/eIF2?, IRE1 and ATF6 pathways. Strong signals of ERS were still present after 48h. The pre-incubation of THP-1 in glucose-deprived medium produced 2.5 and 11-fold increases of GRP94 and GRP78, respectively. Upon glucosedeprivation, LPS could no longer induce ERS. Inhibition of chaperone expression by siRNA completely abrogated the effect of glucose deprivation to protect cells from LPS-induced ERS. Thus, the hyperexpression of GRP78 and GRP94 protect cells from LPS-induced ERS. Defective TLR4-induced chaperone expression is a mechanism involved in the integration of TLR4 signaling and ERS / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Suicide is a serious public health problem around the world. Each year, approximately 800.000 people complete suicide and it is estimated that for each suicide committed, there must be another 20 attempts. Differences have been reported between individuals who attempted suicide and those who committed suicide. These tend to be male, older, less impulsive, using more lethal methods, leave suicidal note and are more depressed. The attempters tend to be female and use a non-violent method, such as poisoning. Despite these differences, a seasonal pattern has been described with peak in the spring / summer, but there are divergences in suicide attempts. This lack of consensus allowed us to evaluate through a systematic review if these attempts occur more frequently in the spring / summer as already described for cases of suicide. A seasonal profile similar to the occurrences of suicide was also found for suicide attempts. This seasonal behavior suggests the influence of an environmental modulator, and since light is the main synchronizing agent of the endogenous rhythm with the environment through the light-dark cycle, it is also likely to be an important agent of the circannual / seasonal rhythms. As Brazil is a country with great territorial extension, crossing the Equator line (latitude 0º) and the Tropic of Capricorn (latitude S24°14’), we investigated the influence of latitude and photoperiod in the seasonality of suicides in all Brazilian cities in the period from 2010 to 2015. A seasonal variation of suicides were find with peak in late spring / early summer and nadir in winter. This seasonal profile is better observed as latitude decreases. The further away from latitude 0 °, the higher the suicide rate and amplitude (Peak / Trough ratio), and the in-phase correlation between the seasonality of suicide occurrences and the photoperiod. As several diseases have been associated with disturbances in circadian rhythm, this environmental modulation of the circadian rhythm may play a relevant role in the formation of seasonal suicidal behavior in individuals with vulnerability. In animals, the manipulation of the photoperiod, simulating seasons, results in changes in the gene expression and behavioral profile. We studied, in C57BL / 6J mice, the effect of the photoperiod gradual variation, a simulation from winter to summer, to observe the molecular effect in brain structures related to human suicide and behavioral changes. A significant decrease in circadian gene expression and loss of rhythmicity were found, in addition to an antidepressant-like behavior in the forced swimming test. The photoperiodic influence observed in animal models associated with seasonal suicide reports only in countries distant from 0º latitude, where there are significant alterations in the photoperiod, reinforce the participation of light as an important modulator of the seasonality of suicidal behavior. / O suicídio é um grave problema de saúde pública em todo o mundo. A cada ano, aproximadamente 800.000 pessoas cometem suicídio e estima-se que para cada suicídio cometido, deve haver outras 20 tentativas. Foram relatadas diferenças entre indivíduos que tentaram suicídio e aqueles que consumaram o suicídio. Estes que consumaram tendem a ser do sexo masculino, mais velhos, menos impulsivos, usando métodos mais letais, deixam nota de suicídio e são mais deprimidos. Aqueles que tentam e não efetivam o suicídio, tendem a ser do sexo feminino e utilizam método não-violento, como o envenenamento. Apesar dessas diferenças, um padrão sazonal tem sido descrito com pico na primavera/verão, mas há divergências nas tentativas de suicídio. Esta ausência de consenso nos permitiu avaliar através de uma revisão sistemática, se essas tentativas ocorrem com maior frequência na primavera/verão assim como já descrito para os casos de suicídio. Um perfil sazonal semelhante às ocorrências de suicídio foi encontrado também para tentativas de suicídio. Este comportamento sazonal sugere a influência de um modulador ambiental, e como a luz é o principal agente sincronizador do ritmo endógeno com o ambiente através do ciclo claro-escuro, é provável que também seja um importante agente dos ritmos circanuais/sazonais. Como o Brasil é um país com grande extensão territorial, atravessando a linha do Equador (latitude 0º) e o Trópico de Capricórnio (latitude S24°14’), investigamos a influência da latitude e fotoperíodo na sazonalidade dos suicídios em todas as cidades brasileiras no período de 2010 a 2015. A variação sazonal dos suicídios teve pico no final da primavera/início do verão e nadir no inverno. Este perfil sazonal é melhor observado à medida que decresce a latitude. Quanto mais distante da latitude 0º, maiores as taxas de suicídio e amplitude (razão pico/vale), além de correlação em fase entre a sazonalidade das ocorrências de suicídio e o fotoperíodo. Assim como várias doenças têm sido associadas a perturbações no ritmo circadiano, esta modulação ambiental do ritmo circadiano pode ter papel relevante na formação do comportamento suicida sazonal em indivíduos com vulnerabilidade. Em animais, a manipulação do fotoperíodo, simulando estações do ano, resulta em alterações no perfil de expressão gênica e comportamental. Estudamos em camundongos C57BL/6J, o efeito da variação gradual do fotoperíodo, simulando do inverno ao verão em curto tempo, para observar o efeito molecular em estruturas cerebrais relacionadas ao suicídio em humanos e alterações comportamentais. Uma redução importante e perda de ritmicidade em genes circadianos foi encontrada, além de um efeito tipo antidepressivo no teste do nado forçado. A influência fotoperiódica observada em modelos animais associada a relatos de sazonalidade do suicídio apenas em países distantes da latitude 0º, onde há alterações significativas no fotoperíodo, reforçam a participação da luz como um importante modulador da sazonalidade do comportamento suicida.

Orientador: Mario Jose Abdalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T16:18:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aquino_NiltonSergiode_M.pdf: 666411 bytes, checksum: 2c02dd4742835246669966068bdac040 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Diversos estudos epidemiológicos realizados indicam a ligação, tanto da obesidade quanto do DM tipo 2, a um estado de inflamação sub-clínico, onde encontramos elevação do nível sérico de diversas citocinas pró-inflamatórias. TLR4 é uma subclasse dos TLR's e estão localizados em vários tecidos e células do organismo dos mamíferos, incluindo aqueles insulino sensíveis. A sua ativação pela exposição a ácidos graxos livres (AG) e lipopolissacarídeos (LPS), derivado da membrana externa das bactérias Gramnegativas, causa um aumento do nível sérico de diversas citocinas pró-inflamatória e resistência à insulina. Assim esses receptores emergem como candidatos a intermediar o processo inflamatório sub-clínico e a resistência à insulina. Recentes estudos demonstraram que um grupo de derivados da ciclohexanona inibe, de forma específica, o TLR4. Dentre os derivados com atividade inibidora de citocinas destaca-se o (6R)-6-[N-(2-cloro-4-fluorfenil)sulfamoil]-ciclohex-1-ene-1-carboxilato de etila, designado pelo FDA para estudos clínicos como TAK-242 e que apresenta uma potente capacidade supressora na produção de NO, IL-6 e TNF-a. No presente estudo, sintetizamos e investigamos o efeito do tratamento crônico com TAK-242 por via oral na transdução do sinal da insulina, estado de inflamação subclínico e na sensibilidade à insulina em camundongos tratados com dieta hiperlipídica. Tais animais, após quatorze dias de tratamento, demonstraram significante melhora na sensibilidade à insulina, na tolerância à glicose e aumento na capacidade de sinalização da insulina no tecido adiposo, fígado e músculo através da via da Akt. A administração de TAK-242 também diminuiu a resistência à insulina em nosso modelo de choque séptico induzido por LPS de bactérias Gram-negativas com uma alta taxa de sobrevida dos animais. Assim, novos derivados da ciclohexanona, como o TAK-242, podem oferecer uma nova abordagem terapêutica para as doenças cuja patogenicidade envolve o TLR4, como o processo inflamatório sub-clínico e a resistência à insulina. / Abstract: Insulin resistance and type 2 diabetes are associated with obesity and a state of abnormal inflammatory response. TLR4 detects Gram-negative bacteria through recognition of the lipid A moiety of lipopolysaccharide (LPS) and has an important role in inflammation and immunity. Since it is activated by LPS and saturated fatty acids, which are inducers of insulin resistance, TLR4 appears as a candidate for participation in the cross-talk between inflammatory and metabolic signals. We investigated, herein, in vivo efficacy and associated molecular mechanisms by TAK 242, a small-molecule selective TLR4 inhibitor, improved diabetes control and insulin action. The effect of TAK 242 was investigated on insulin sensitivity, insulin signaling and activity in tissues of high-fat dietfed mice. Moreover, these mice showed significantly improved insulin sensitivity, improved glucose tolerance and enhanced insulin signaling capacity in adipose tissue, muscle and liver as compared to control mice during high fat feeding. TAK 242, in our endotoxin shock model, by oral administration, also demonstrated efficacy against the LPSinduced cytokines with a high survival rate and improved insulin sensibility in mice. In conclusion, we demonstrated that TAK-242, a small-molecule selectively suppresses TLR4-signaling, improves glucose tolerance and insulin action in high-fat dietfed mice. Manipulation of TLR4 pathways is considered to have great therapeutic potential. Cyclohexene derivatives, like TAK-242, represent a novel therapeutic approach to the treatment of human obesity, insulin resistance and type 2 diabetes. / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Wilson Nadruz Júnior / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T23:44:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sales_MariaLilian_D.pdf: 3937457 bytes, checksum: 1aca22e05bdd5e09c3f3e53c2841451e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Estudos experimentais revelaram que a inibição de componentes da via de sinalização celular regulada pelos Toll-Like Receptors (TLRs) pode atenuar a hipertrofia cardíaca em animais submetidos à sobrecarga pressora. O objetivo deste estudo foi investigar a influência dos polimorfismos Asp299Gly do TLR4 e Pro249Ser do TLR6 sobre a estrutura do ventrículo esquerdo (VE) em indivíduos hipertensos. Foram estudados 443 pacientes por meio de avaliação clínica, laboratorial e ecocardiográfica, enquanto que os polimorfismos foram detectados por reação de polimerase em cadeia/enzima de restrição. Ademais, monócitos obtidos de sangue periférico de pacientes hipertensos foram estimulados in vitro com LPS (agonista de TLR4) e zimosan (agonista de TLR6) e a produção de interleucina-6 e fator de necrose tumoral-alfa (TNF-alfa) foi avaliada de acordo com a presença da variante Asp299Gly do TLR4 e Pro249Ser do TLR6. Mulheres que carregavam o alelo TLR4 299Gly apresentaram menor espessura de parede posterior do VE, menor espessura de septo, menor índice de massa do VE e reduzida prevalência de hipertrofia cardíaca. Mulheres homozigotas para TLR6 249Ser apresentaram menor espessura da parede do VE e menor espessura relativa da parede do VE em relação às mulheres com os genótipos Pro/Ser e Pro/Pro. Estes achados foram confirmados por análise de regressão linear múltipla, que incluiu idade, pressão arterial sistólica e diastólica, índice de massa corpórea, menopausa, diabetes mellitus e uso de antihipertensivos como fatores confundidores. Por fim, estudos funcionais in vitro revelaram que monócitos de homens e mulheres que apresentaram o alelo TLR4 299Gly tiveram menor produção de interleucina-6 após estímulo com LPS e a presença do alelo TLR6 249Ser em homozigose esteve associada a uma menor produção de interleucina-6 e TNF-alfa após estímulo com zimosan apenas nos monócitos extraídos de mulheres hipertensas. De maneira geral, esses dados sugerem que pode haver uma interação entre gêneros, polimorfismos dos receptores Toll-like e fenótipo do VE em indivíduos hipertensos. Sob esta perspectiva, estudos longitudinais são necessários para avaliar o impacto destes polimorfismos sobre o risco cardiovascular em mulheres hipertensas / Abstract: Experimental studies have shown that inhibition of components of cell signaling pathway regulated by Toll-Like Receptors (TLRs) can reduce cardiac hypertrophy in animals subjected to pressure overload. The aim of this study was to investigate the influence of the polymorphisms TLR4 Asp299Gly and TLR6 Pro249Ser on the structure of the left ventricle in hypertensive subjects. We studied 443 patients by clinical, laboratory and echocardiographic, while polymorphisms were detected by the polymerase chain / restriction enzyme. Moreover, monocytes obtained from peripheral blood of hypertensive patients were stimulated in vitro with LPS (TLR4 agonist) and zymosan (TLR6 agonist) and the production of interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) was assessed according to the presence of the Asp299Gly variant of TLR4 and Pro249Ser of TLR6. Women who carried the TLR4 299Gly allele had lower posterior wall thickness, thinner septum, a lower rate of left ventricular mass and reduced prevalence of cardiac hypertrophy. Women homozygous for TLR6 249Ser had lower posterior wall thickness and relative wall thickness, compared to women with the genotype Pro/Ser and Pro/Pro. These findings were confirmed by analysis of multiple linear regression that included age, systolic and diastolic blood pressure, body mass index, menopause, diabetes mellitus and use of antihypertensive drugs as confounding factors. Finally, in vitro functional studies revealed that monocytes from men and women who harbored the TLR4 299Gly allele had lower production of interleukin-6 after stimulation with LPS and the presence of homozygous 249Ser allele was associated with a lower production of Interleukin-6 and TNF-alpha after stimulation with zymosan only in monocytes hypertensive women. These data suggest that there may be an interaction between gender, polymorphisms of Toll-like receptors and ventricular phenotype in hypertensive subjects. In this regard, longitudinal studies are needed to assess the impact of these polymorphisms on the cardiovascular risk of hypertensive women / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Dentre os diversos fatores que provocam diminuição no desempenho reprodutivo, a degeneração testicular térmica é o motivo mais freqüente de baixa fertilidade em Bos taurus no Brasil. Baseados nos efeitos sobre a secreção de hormônios hipofisários e gonadais, o GH vem sendo estudado para o tratamento da infertilidade masculina. Um delineamento experimental tipo blocos ao acaso utilizou dezesseis touros adultos submetidos a 4 tratamentos em esquema fatorial 2x2 (0 e 96 horas de insulação testicular, 0 e 1,2 mg bST/kg PV), com o objetivo de testar os efeitos da bST no tratamento de touros submetidos a insulação testicular. Motilidade, alterações de acrossoma, defeitos de cauda e cabeça, gota protoplasmática proximal e defeitos espermáticos totais aumentaram em conseqüência da insulação testicular. As concentrações seminais de Testosterona foram temporariamente diminuídas em resposta a insulação testicular. A ocorrência de gota protoplasmática distal, anomalias de peça intermediária e concentrações seminais de IGF1 não foram afetadas pela insulação testicular. A somatotropina recombinante bovina não afetou as características espermáticas ou concentrações seminais de Testosterona e IGF1. / Testicular heat degeneration is the most common cause of poor fertility of Bos taurus bulls in the tropics. The Growth Hormone has been studied in man infertility treatment with some progress. A randomly blocks experimental design used 16 mature bulls allotted in 4 treatments in a 2x2 factorial arrangement (0 e 96 hours of scrotal insulation, 0 e 1,2 mg bST/kg BW) was performed to asses the effects ob bulls submitted to scrotal insulation. Motility, abnormal acrosome, tail and head defects, proximal droplet, and abnormal sperm increased, and seminal plasma Testosterone was temporally increased in response to scrotal insulation. Distal droplet, midpiece and seminal plasma IGF1 were not affected by bST. The bST did not affect sperm characteristics or seminal Testosterone and IGF1.

This work is dedicated to the study of the structure of attractors of dynamical systems with the objective of estimating their fractal dimension. First we study the case of exponential global attractors of some generalized gradient-like semigroups in a general Banach space, and estimate their fractal dimension in terms of themaximumof the dimension of the local unstablemanifolds of the isolated invariant sets, Lipschitz properties of the semigroup and rate of exponential attraction. We also generalize this result for some special evolution processes, introducing a concept of Morse decomposition with pullback attractivity. Under suitable assumptions, if (A, \'A POT. \') is an attractor-repeller pair for the attractor A of a semigroup {T (t ) : t 0}, then the fractal dimension of A can be estimated in terms of the fractal dimension of the local unstable manifold of \'A POT. \', the fractal dimension of A, the Lipschitz properties of the semigroup and the rate of the exponential attraction. The ingredients of the proof are the notion of generalized gradient-like semigroups and their regular attractors, Morse decomposition and a fine analysis of the structure of the attractors. Also, making use of the skew product semiflow and its Morse decomposition, we give some estimates of the fractal dimension of the pullback attractors of non-autonomous dynamical systems / Este trabalho é dedicado ao estudo da estrutura dos atratores de sistemas dinâmicos com o objetivo de obter estimativas de suas dimensões fractais. Primeiramente estudamos o caso de atratores globais exponenciais de alguns semigrupos gradient-like generalizados em um espaço de Banach geral, e estimamos suas dimensões fractais em termos da máxima dimensão das variedades instáveis locais dos conjuntos invariantes isolados, a propriedades de Lipschitz do semigrupo e da taxa de atração exponencial. Também generalizamos este resultado para alguns processos de evoluções especiais, introduzindo um conceito de decomposição de Morse com atração pullback. Sob hipóteses apropriadas, se (A, \'A POT. \') é um par atrator-repulsor para o atratorA de um semigrupo {T (t ) : t 0}, então a dimensão fractal de A pode ser estimada em termos da dimensão fractal da variedade instável de \'A POT. \', a dimensão fractal de A, as propriedades de Lipschitz do semigrupo e a taxa de atração exponencial. Os ingredientes da demonstração são a noção de semigrupos gradient-like e seus atratores regulares, decomposição de Morse e uma análise fina da estrutura dos atratores. Além disto, fazendo uso do skew product semiflow e sua decomposição de Morse, damos estimativas da dimensão fractal dos atratores pullback de sistêmas dinâmicos não-autônomos