La zone marginale de la rate apparaît comme un lieu stratégique de détection des antigènes et agents pathogènes véhiculés par le sang. Ces propriétés sont principalement liées à la présence de cellules appartenant au système immunitaire inné parmi lesquelles se trouvent des nombreuses cellules présentatrices d'antigènes (APC), comme les macrophages, les lymphocytes B de la zone marginale (MZB) ou encore les cellules dendritiques (DC). Ces cellules représentent une première ligne de défense contre les pathogènes véhiculés par le sang et sont importantes pour l'initiation des réponses immunes. Il a fortement était suggéré la localisation dans la zone marginale d'une autre population appartenant au système immunitaire inné : les lymphocytes T Natural Killer invariants ou iNKT. Ces lymphocytes T non conventionnels sont caractérisés par l'expression de marqueurs de cellules NK et de lymphocytes T conventionnels notamment le TCR. Contrairement aux lymphocytes T conventionnels, les iNKT reconnaissent des antigènes (Ag) lipidiques (d'origine exogène ou endogène) présentés par l'intermédiaire de la molécule CD1d exprimée à la surface des APC, notamment les DC. En réponse à ces lipides, et notamment l'α-galactosylceramide (α-GalCer), les cellules iNKT ont la capacité unique de sécréter rapidement de grandes quantités de cytokines immunomodulatrices comme l'IFN-γ et/ou l'IL-4 qui, en retour, permettent l'activation d'autres populations immunes telles que les DC, les cellules NK, les lymphocytes B et lymphocytes T conventionnels. Les DC, en tant qu'APC professionnelles, sont de puissantes cellules activatrices des lymphocytes T conventionnels mais également des iNKT. Cependant, bien que souvent souligné dans la littérature, le rôle des autres APC dans l'activation des lymphocytes T conventionnels mais surtout des iNKT restait relativement obscur lorsque ce travail de thèse a débuté. Parmi les APC, les MZB représentaient des cibles idéales puisqu'elles ont la particularité d'exprimer fortement les molécules de présentation telle que les molécules du CMH de classe II, la molécule CD1d mais aussi les molécules de co-stimulation. Nous avons donc débuté notre travail par l'étude du rôle des MZB dans l'activation des lymphocytes conventionnels et des iNKT. Nous montrons que les MZB sensibilisés avec un peptide de l'ovalbumine sont capables d'activer les lymphocytes T CD4+, dont la réponse est orientée vers un profil Th1 après l'activation des MZB par le CpG-ODN (agoniste du TLR-9). Ainsi, les MZB se comportent comme de véritables APC. Nous avons ensuite étudié l'activation des iNKT en réponse à lα'-GalCer. De façon surprenante, bien que les MZB expriment fortement la molécule CD1d, elles sont incapables d'activer in vitro les iNKT primaires en réponse l'α-GalCer libre. Elles sont cependant capables de présenter l'α-GalCer aux iNKT suggérant qu'il manque aux MZB des facteurs (solubles ou non) pour induire l'activation des iNKT. De façon intéressante, l'ajout de DC non sensibilisées restaure la production d'IFN-γ et d'IL-4 par les iNKT co-cultivés en présence de MZB sensibilisés avec l'α-GalCer. Nous montrons que les DC participent à cette activation via un mécanisme de présentation croisée mais également via l'apport de facteurs nécessaires aux MZB pour induire l'activation des iNKT. Il existe une réelle coopération entre ces deux types d'APC pour une activation optimale des iNKT. Finalement, nous montrons que les MZB sensibilisés avec l'α-GalCer induisent l'activation des lymphocytes iNKT et NK in vivo. Nous nous sommes ensuite concentrés sur les DC qui comme indiqué ci-dessus, sont des APC professionnelles. Cependant, dans la rate, les DC représentent une population très hétérogène dont le rôle de chaque sous-population notamment dans l'activation des iNKT était également très peu connu lorsque ce travail a débuté.

Pour optimiser les stratégies vaccinales anti-tumorales, l’activation des cellules du système immunitaire inné est cruciale pour générer l’expansion des lymphocytes T spécifiques des antigènes tumoraux. Les lymphocytes T Natural Killer invariant (iNKT) représentent une famille unique de lymphocytes T innés ayant des propriétés immunomodulatrices puissantes. Ces cellules reconnaissent via leur récepteur T des antigènes glycolipidiques présentés par la molécule CD1d exprimée par les cellules présentatrices d’antigènes. L'alpha-galactosylcéramide (α-GalCer), un puissant activateur des cellules iNKT, est en développement clinique dans le cancer. Les cellules dendritiques (DCs) sont équipées pour activer les cellules iNKT and promouvoir de puissantes réponses immunitaires adaptatives. Considérant la capacité unique des DC CD8α+ à présenter de façon croisée les antigènes aux lymphocytes T CD8+, notre objectif a visé à délivrer l’α-GalCer (considéré ici comme un adjuvant) et des antigènes tumoraux aux DC CD8α+ dans le but de générer de puissantes réponses T cytotoxiques anti-tumorales. Pour cela, les antigènes ont été incorporés dans des nanoparticules de PLGA décorées à leur surface avec des anticorps anti-Clec9a, un marquer exprimé spécifiquement par les DC CD8α+. Nos résultats montrent chez la souris que la co-délivrance simultanée de l’α-GalCer et d’auto-antigènes tumoraux (Trp2 et gp100) aux DC CD8α+ promeut une forte réponse anti-tumorale dans un contexte prophylactique et thérapeutique. Nous démontrons que cet effet vaccinal est dû aux cellules iNKT (mais pas aux lymphocytes T auxiliaires) et aux lymphocytes T CD8+. L’efficacité vaccinale est corrélée à un rapport supérieur entre les lymphocytes T CD8+ spécifiques des antigènes tumoraux et les lymphocytes T CD4+ régulateurs au sein des tumeurs. Chez l’homme, la co-administration de l’α-GalCer et de l’antigène tumoral (Mélan A) aux DC BDCA3+ (les équivalents humains des DC CD8α+) induit une forte expansion des lymphocytes T CD8+ spécifiques du Mélan-A in vitro. Nos résultats montrent pour la première fois que la tolérance aux auto-antigènes tumoraux peut être levée en exploitant la fonction «helper» des cellules iNKT et mettent en évidence de nouvelles approches thérapeutiques contre le développement tumoral. / To optimize anti-tumor vaccine strategies, exploitation of cells of the innate immune system to assist the expansion of tumor antigen-specific T cells is of interest. Invariant Natural Killer T lymphocytes (iNKT) are a unique population of “innate-like” T cells endowed with potent immunomodulatory properties. These cells recognize through their T cell receptor glycolipids presented by the CD1d molecule expressed by antigen presenting cells. Alpha-galactosylceramide (α-GalCer), a potent iNKT cell activator, is in clinical development in cancer. Dendritic cells (DC) are well equipped to trigger iNKT cells activation and to promote adaptive immune responses. Regarding the unique ability of CD8α+ DCs to cross-present antigens to CD8+ T cell response, we intended to deliver α-GalCer (viewed here as an adjuvant) and tumor antigens to CD8α+ DCs with the aim to generate efficient antitumor cytotoxic T cells. To this end, antigens were incorporated in PLGA-based nanoparticles decorated with anti-Clec9a antibodies, a marker specifically expressed by CD8α+ DCs. Our results show (mouse system) that simultaneous co-delivery of α-GalCer and tumor selfantigens (Trp2 and gp100) to CD8α+ DCs promotes strong anti-tumor responses in prophylactic and therapeutic settings. We attributed the therapeutic effects of the vaccine to iNKT cells (but not to T-helper lymphocytes) and to CD8+ T lymphocytes. The efficacy was correlated with a high ratio of tumor antigen specific CD8+ T cells to CD4+ regulatory T lymphocytes infiltrating the tumor. In human, co-administration of α-GalCer and a tumor antigen (Melan A) to DC BDCA3+ (the human equivalent of CD8α+ DCs) strongly induces the expansion of Melan-A specific CD8+ T lymphocytes in vitro. Our results demonstrate that tolerance to self-antigens can be abrogated by manipulating the NKT cells’ helper functions and shed light on novel therapeutic approaches for controlling tumor development.

La zone marginale de la rate apparaît comme un lieu stratégique de détection des antigènes et agents pathogènes véhiculés par le sang. Ces propriétés sont principalement liées à la présence de cellules appartenant au système immunitaire inné parmi lesquelles se trouvent des nombreuses cellules présentatrices d’antigènes (APC), comme les macrophages, les lymphocytes B de la zone marginale (MZB) ou encore les cellules dendritiques (DC). Ces cellules représentent une première ligne de défense contre les pathogènes véhiculés par le sang et sont importantes pour l’initiation des réponses immunes. Il a fortement était suggéré la localisation dans la zone marginale d’une autre population appartenant au système immunitaire inné : les lymphocytes T Natural Killer invariants ou iNKT. Ces lymphocytes T non conventionnels sont caractérisés par l’expression de marqueurs de cellules NK et de lymphocytes T conventionnels notamment le TCR. Contrairement aux lymphocytes T conventionnels, les iNKT reconnaissent des antigènes (Ag) lipidiques (d’origine exogène ou endogène) présentés par l’intermédiaire de la molécule CD1d exprimée à la surface des APC, notamment les DC. En réponse à ces lipides, et notamment l’α-galactosylceramide (α-GalCer), les cellules iNKT ont la capacité unique de sécréter rapidement de grandes quantités de cytokines immunomodulatrices comme l’IFN-γ et/ou l’IL-4 qui, en retour, permettent l’activation d’autres populations immunes telles que les DC, les cellules NK, les lymphocytes B et lymphocytes T conventionnels. Les DC, en tant qu’APC professionnelles, sont de puissantes cellules activatrices des lymphocytes T conventionnels mais également des iNKT. Cependant, bien que souvent souligné dans la littérature, le rôle des autres APC dans l’activation des lymphocytes T conventionnels mais surtout des iNKT restait relativement obscur lorsque ce travail de thèse a débuté. Parmi les APC, les MZB représentaient des cibles idéales puisqu’elles ont la particularité d’exprimer fortement les molécules de présentation telle que les molécules du CMH de classe II, la molécule CD1d mais aussi les molécules de co-stimulation. Nous avons donc débuté notre travail par l’étude du rôle des MZB dans l’activation des lymphocytes conventionnels et des iNKT. Nous montrons que les MZB sensibilisés avec un peptide de l’ovalbumine sont capables d’activer les lymphocytes T CD4+, dont la réponse est orientée vers un profil Th1 après l’activation des MZB par le CpG-ODN (agoniste du TLR-9). Ainsi, les MZB se comportent comme de véritables APC. Nous avons ensuite étudié l’activation des iNKT en réponse à lα’-GalCer. De façon surprenante, bien que les MZB expriment fortement la molécule CD1d, elles sont incapables d’activer in vitro les iNKT primaires en réponse l’α-GalCer libre. Elles sont cependant capables de présenter l’α-GalCer aux iNKT suggérant qu’il manque aux MZB des facteurs (solubles ou non) pour induire l’activation des iNKT. De façon intéressante, l’ajout de DC non sensibilisées restaure la production d’IFN-γ et d’IL-4 par les iNKT co-cultivés en présence de MZB sensibilisés avec l’α-GalCer. Nous montrons que les DC participent à cette activation via un mécanisme de présentation croisée mais également via l’apport de facteurs nécessaires aux MZB pour induire l’activation des iNKT. Il existe une réelle coopération entre ces deux types d’APC pour une activation optimale des iNKT. Finalement, nous montrons que les MZB sensibilisés avec l’α-GalCer induisent l’activation des lymphocytes iNKT et NK in vivo. Nous nous sommes ensuite concentrés sur les DC qui comme indiqué ci-dessus, sont des APC professionnelles. Cependant, dans la rate, les DC représentent une population très hétérogène dont le rôle de chaque sous-population notamment dans l’activation des iNKT était également très peu connu lorsque ce travail a débuté. / The spleen, with its highly specialized lymphoid compartments, plays a central role in clearing blood-borne pathogens. Innate immune cells, that are mainly present in the marginal zone of the spleen, are strategically located to respond to blood-borne microorganisms and viruses. Among innate cells, macrophages and marginal zone B (MZB) cells represent the first line of defense against blood-borne pathogens and with dendritic cells (DC) are important for initiation of the immune response. Along with these populations of antigen-presenting cells (APC), it was also suggested that invariant Natural Killer T (iNKT), a population of innate-like T lymphocytes, were also located in the marginal zone of the spleen. Unlike conventional T lymphocytes, iNKT cells recognize exogenous and self (glyco)lipid antigens (Ag) presented by the non-classical class I Ag presenting molecule CD1d expressed on APC, in particular DC. Upon lipid recognition, in particular in response to the non-mammalian glycolipid, α-galactosylceramide (α-GalCer), iNKT cells have the unique capacity to rapidly produce large amounts of immunoregulatory cytokines, including IFN-γ and IL-4, which lead to downstream activation of other immune populations (DC, NK cells, B cells and conventional T cells). Through this property, iNKT cells influence the strength and quality of the ensuing immune response. Dendritic cells, as professional APC, are potent activators of conventional T lymphocytes and iNKT cells. When we started our PhD, the role of APC other than DC in the priming of T lymphocytes including iNKT cells remained unclear. Among them, MZB cells represented good candidates since they express high levels of MHC class II and CD1d molecules and their ability to activate and orientate conventional and innate-like T lymphocytes, such as iNKT cells, were elusive. We show that MZB cells, when loaded OVA peptide promote the release of IFN-γ and IL-4 by antigen specific CD4+ T lymphocytes and their stimulation with CpG-ODN biases them toward more Th1 inducers. Surprisingly, although able to activate iNKT hybridomas, MZB cells sensitized with free α-GalCer do not directly activate ex vivo sorted iNKT cells unless DC are added to the culture system. Dendritic cells help MZB cells to promote iNKT cell activation in part through α-GalCer cross-presentation and also through DC-expressed co-factors. Interestingly, MZB cells amplify the DC-mediated activation of iNKT cells and depletion of MZB cells from total splenocytes strongly reduces iNKT cell activation in response to α-GalCer. Thus, DC and MZB cells provide help to each other to optimize iNKT cell stimulation. Finally, in vivo transfer of α-GalCer-loaded MZB cells potently activates iNKT and NK cells. Thus, we show for the first time a role of MZB cell in iNKT cell activation in response to free α-GalCer, an important finding to better understand the modalities of iNKT cell activation. As mentioned above, DC are professional APC and thus are strong activators of conventional and unconventional T lymphocytes. However, DC in the spleen represent an heterogeneous cell population and when we started our study, the role of DC subsets in T lymphocyte priming was still unclear. Among DC subsets, we concentrated on the major splenic DC subset located in the marginal zone, the CD8α- DC. This DC subset was further subdivided in CD4+ and CD4- subtypes. We provide evidences that CD4+ and CD4- DC are equally efficient at priming CD4+ T lymphocytes when loaded with OVA peptide and whole OVA, leading to a mixed Th1/Th2 response, and also CD8+ T lymphocytes when pulsed with OVA peptide (but not whole OVA).

Le KRN 7000 a une action antitumorale due à la stimulation du système immunitaire. Il agit sur les maladies auto-immunes, les infections bactériennes et parasitaires. Il est donc capital d’avoir des analogues plus sélectifs. Le but de cette thèse est de former des analogues originaux contraints de céramides précurseurs de dérivés du KRN 7000, en bloquant la conformation entre les chaînes grasses pour moduler la réponse immunitaire Th1 ou Th2. La stratégie de synthèse utilise une réaction d’hétérocycloaddition [4+2] entre une Nvinyl-1,3-oxazolidin-2-one chirale et un hétérodiène munis tous deux d’une chaîne grasse. Dans tous les cas, avec l’Eu(fod)3 le cycloadduit formé majoritairement est l’endo alpha alors qu’avec SnCl4, c’est l’endo Bêta. Divers analogues de céramides ont été préparés via un enchaînement de réactions : hydroboration/oxydation, élimination de la copule chirale, obtention de la lactone puis du lactame. Une glycosylation finale permettra d’accéder aux analogues galactosylés. / KRN7000 anti-tumor activity is due to immune system stimulation. It acts on autoimmunes diseases, bacterial and parasitic infections. Hence is needed the development of more selective analogues. The aim of this thesis is to form original constrained analogues of ceramides, KRN7000 derivatives precursors in restraining the conformation between the fatty chains to modulate the immune response Th1 or Th2. The synthetic approach is based on a heterocycloaddition [4+2] reaction between a chiral N-vinyl-1,3-oxazolidin-2-one and a heterodiene, both bearing one fatty chain. In all cases, the major formed cycloadduct is endo with Eu(fod)3 whereas with SnCl4, it is endo . Various analogues of ceramides have been prepared via a reactions cascade: hydroboration/oxidation, chiral auxillary removal, formation of the desired lactone then lactame. A final glycosylation will allow having access to galactosyl analogues.

L'asthme est une maladie inflammatoire chronique des voies aériennes dont l'incidence a augmenté dramatiquement au cours de ces deux dernières décennies. Chez les individus sensibles, cette inflammation induit des épisodes de sifflements récurrents, une oppression thoracique, une sécrétion de mucus ainsi qu'une obstruction des voies respiratoires, un recrutement éosinophilique et une hyperréactivité broncho-pulmonaire (HRB). Les avancées dans la compréhension de la physiopathologie de l'asthme ont été réalisées grâce aux modèles expérimentaux murins. Ces travaux ont mis en évidence le rôle de différentes cellules dans l'immunorégulation de l'inflammation bronchique, notamment les lymphocytes T de type Th2. Toutefois, les mécanismes immunologiques impliqués dans la protection ou l'exacerbation de la maladie sont encore peu connus. Au cours de notre étude, nous avons mis en évidence l'influence de cellules Natural Killer T invariantes (iNKT) dans le développement de l'asthme allergique expérimental. Les cellules iNKT représentent une population immunorégulatrice de lymphocytes T, caractérisée par l'expression d'une chaîne alpha invariante du TCR (Va14Ja18 et Va24Ja18, respectivement chez la souris et chez l'homme) qui est positivement sélectionnée par la molécule CD1d. Ces cellules synthétisent rapidement et massivement de nombreuses cytokines, comme l'IL-4 et l'IFN-g, lorsqu'elles sont simulées par l'a-galactosylcéramide (a-GalCer), glycolipide reconnu spécifiquement par les lymphocytes iNKT. Le spectre d'action attribué aux cellules iNKT est particulièrement large. Elles sont impliquées dans le contrôle des réponses immunes contre des infections, des maladies autoimmunes, des modèles de contact de sensibilité et des tumeurs.<br /><br />En utilisant un modèle où les souris sont immunisées de façon systémique par l'ovalbumine (OVA) et ensuite stimulées au niveau des voies aériennes par ce même antigène (étape désignée comme « challenge »), nous avons démontré que les cellules iNKT sont impliquées dans la sévérité de l'asthme allergique expérimental. En effet, divers symptômes de l'asthme sont diminués chez les souris déficientes en cellules iNKT (Ja18-/-), notamment, l'inflammation éosinophilique, la production de cytokines de type Th2, comme l'IL-4 et l'IL-5, la sécrétion d'IgE et l'HRB. L'implication des cellules iNKT dans la sévérité de l'asthme a été confirmée puisque le transfert adoptif des cellules iNKT à des souris Ja18-/- rétablit les symptômes décrits ci-dessus. <br /><br />En nous basant sur ces résultats, nous nous sommes demandés si nous pourrions modifier la sévérité de l'asthme allergique en agissant sur les lymphocytes iNKT. Pour cela, nous avons traité des souris par l'a-GalCer. Nous avons ainsi démontré qu'une seule injection d'a-GalCer 1 h avant le premier challenge intranasal à des souris précédemment immunisées inhibait la totalité des symptômes de l'asthme. L'administration intranasal de l'a-GalCer inhibe les symptômes de l'asthme chez les souris immunisées et provoquées par l'OVA. Cette protection peut être transférée chez des souris immunisées grâce à des cellules en provenance de souris traitées par l'a-GalCer. L'implication de l'IFN-g dans cette protection a été mise en évidence par des anticorps neutralisants, ainsi que par le transfert de cellules iNKT en provenance de souris IFN-g-/-. <br /><br />En conclusion, nos résultats démontrent que les cellules iNKT sont impliquées dans la sévérité de l'asthme allergique expérimental en activant la sécrétion de cytokines de type Th2 et que le traitement par l'a-GalCer, qui agit spécifiquement sur les lymphocytes iNKT, inhibe le développement de la maladie en induisant la sécrétion d'IFN-g. Ainsi, nos résultats suggèrent que l'a-GalCer pourrait constituer un nouvel outil thérapeutique dans le traitement de l'asthme allergique.

Le KRN 7000 a une action antitumorale due à la stimulation du système immunitaire. Il agit sur les maladies auto-immunes, les infections bactériennes et parasitaires. Il est donc capital d'avoir des analogues plus sélectifs. Le but de cette thèse est de former des analogues originaux contraints de céramides précurseurs de dérivés du KRN 7000, en bloquant la conformation entre les chaînes grasses pour moduler la réponse immunitaire Th1 ou Th2. La stratégie de synthèse utilise une réaction d'hétérocycloaddition [4+2] entre une Nvinyl-1,3-oxazolidin-2-one chirale et un hétérodiène munis tous deux d'une chaîne grasse. Dans tous les cas, avec l'Eu(fod)3 le cycloadduit formé majoritairement est l'endo alpha alors qu'avec SnCl4, c'est l'endo Bêta. Divers analogues de céramides ont été préparés via un enchaînement de réactions : hydroboration/oxydation, élimination de la copule chirale, obtention de la lactone puis du lactame. Une glycosylation finale permettra d'accéder aux analogues galactosylés.

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Pas de résumé / Recently targeted therapies appeared as attractive alternatives to classical antitumoral treatments. The approach, developed on the concept of targeting drug to cancer cells, aims to spear normal tissues and decrease the side effects. This doctoral dissertation focuses on developing new anticancer targeted treatments in the field of chemotherapy and cancer immunotherapy by exploiting an original targeting moiety, the B subunit of Shiga toxin (STxB). Its specific properties, such as, recognition with its receptor Gb3 overexpressed in cancer cells or in antigen-presenting cells, its unconventional intracellular trafficking, guided the choice of this protein as targeting carrier. This project is based in the use of copper-free Huisgen [3+2] cycloaddition as a coupling method, which led to successful preparation of various conjugates for their respective applications. The concept was first validated by STxB-biotin conjugate. The high yield of the reaction and the compatibility between the targeting carrier and the chemical ligation promoted the design of conjugates for chemotherapy and immunotherapy. Two therapeutical optimizations of previously developed strategy in STxB drug targeting delivery were investigated: synthesis of multivalent drug-conjugates and synthesis of conjugates containing a highly potent anticancer agent. Both approaches exploited three anticancer agents: SN38, Doxorubicin and Monomethyl auristatin F. The disulfide spacer, combined with various self-immolative systems, insured drug release. Two cytotoxic conjugates STxB–doxorubicin (STxB-Doxo) and STxB-monomethyl auristatin F (STxB-MMAF) were obtained in very high yield and demonstrated strong tumor inhibition activity in the nanomolar range on Gb3-positive cells. Based on the results the STxB-MMAF conjugate was investigated on a mouse model. The project aimed also to develop STxB bioconjugates for vaccine applications. Previous studies used B subunit as a targeting carrier coupled to an antigenic protein in order to induce a more potent immune response against cancer. The conjugates were prepared using a commercial linker, requiring modifying the antigen at first place, or by oxime ligation, where slightly acidic conditions promoted the coupling. Thus, the work presented herein proposed an alternative ligation via copper-free click chemistry especially for more sensitive antigenic proteins. Various types of conjugates were synthesised and investigated for their immune stimulation properties. The STxB targeting strategy was also applied to the development of a new vaccine based on coupling the targeting carrier to alpha-GalCer, one of the most potent immune stimulating agents known. The work focused on the synthesis of functionalised alpha-Galcer with an azide handle.