Galectina-3, uma proteína que se liga a -galactosídeos, é expressa por neutrófilos e inúmeras evidências indicam que esta molécula atua como uma possível reguladora da resposta imune. Sabe-se que galectina-3 ao ligar com LPS pode levar a formação de oligômeros, que podem alterar o limiar de ativação de células da resposta imune inata. Apesar de existirem diversos estudos que mostram a influência de galectina-3 na resposta de neutrófilos frente a componentes bacterianos, os resultados são em sua maioria contraditórios e inconclusivos. Para elucidar a influência da galectina-3 na reposta imune inata a patógenos periodontais, o presente trabalho avaliou a atividade antimicrobiana in vitro de neutrófilos, isolados de camundongos selvagens (WT) ou geneticamente deficientes de galectina-3 (Gal-3KO), previamente estimulados com LPS de Aa e Pg. Os resultados não evidenciaram diferenças significativas no número de unidades formadoras de colônia (UFC) recuperadas das culturas de neutrófilos provenientes de animais deficientes de galectina-3 e do grupo controle (WT). Contudo, a estimulação de neutrófilos com LPS por 18 horas levou a redução no número de UFC recuperadas das culturas, quando comparado com as culturas estimuladas com LPS por apenas 3 horas. / Galectin-3, a protein that binds -galactosides, is expressed by neutrophils and numerous evidences indicate that this molecule acts as a possible regulator of the immune response. It is known that galectin-3 binding to LPS can lead to the formation of oligomers and thus changing the activation threshold of cells of the innate immune response. Although there are several studies that show the influence of galectin-3 in neutrophil response against bacterial components, the results are conflicting and inconclusive in their majority. To elucidate the influence of galectin-3 in the innate immune response to periodontal pathogens, the present study evaluated the in vitro antimicrobial activity of neutrophils, isolated from wild-type or galectin-3 deficient mice, previously stimulated with LPS of Aa and Pg. The results showed no significant differences in the number of colony forming units (CFU) recovered from cultured galectin-3 deficient neutrophils or control group. However, in a 18 hours time course of LPS stimulation, we observed reduction in the number of CFU, when compared to 3 hours of LPS stimulation.

Orientador: Maria Isabel Felisberti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-15T06:00:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Taba_EduardodosSantos_D.pdf: 4256071 bytes, checksum: ec0a3acba638d80495c8dfba90548e34 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Blendas do polímero biodegradável poli(hidroxibutirato) foram preparadas com os seguintes copolímeros aleatórios: poli(estireno-co-acrilonitrila)-SAN; poli(estireno-co-metacrilato de 2-hidróxietila)-S-Hema; poli(metacrilato de metila-co-vinil fenol-P(MMA-co-VPh). Os copolímeros SAN foram sintetizados via copolimerização em massa, enquanto os copolímeros S-Hema foram sintetizados pela copolimerização em solução utilizando DMF como solvente. Os copolímeros foram caracterizados por ressonância magnética nuclear (RMN) de H e C, cromatografia de permeação em gel (GPC), calorimetria exploratória diferencial (DSC) e análise dinâmico-mecânica (DMA). As blendas foram preparadas dissolvendo-se os polímeros em um bom solvente e adicionando-se à solução resultante um mau solvente para a coagulação dessas blendas. As análises das blendas por DSC, DMA e microscopia eletrônica de varredura (SEM) mostraram que todas elas são imiscíveis. A cinética de cristalização do PHB em blendas P(MMA-co-VPh)/PHB e SAN/PHB foi estudada por DSC. Esses estudos mostraram que a presença do copolímero P(MMA-co-VPh) causa a diminuição da taxa de cristalização do PHB e aumenta a energia de ativação do processo de cristalização do PHB. Para as blendas PHB/SAN, o efeito do copolímero em diminuir a taxa de cristalização do PHB é menor que nas blendas PHB/P(MMAco- VPh). Além disso, o teor de acrilonitrila no copolímero pouco afeta a taxa de cristalização do PHB. Os expoentes de Avrami ¿n¿ determinados para a cristalização do PHB nas blendas P(MMA-co-VPh)/PHB e SAN/PHB são aproximadamente iguais ao expoente ¿n¿ para o PHB puro indicando que o mecanismo de cristalização do PHB não se altera nas blendas. Sendo assim, este trabalho possibilitou o entendimento de aspectos importantes referentes ao comportamento de fases e à cinética de cristalização de blendas contendo PHB associado a copolímeros aleatórios.Os estudos cinéticos podem colaborar para a compreensão do comportamento de cristalização de copolímeros/PHB em equipamentos de processamento. Além disso, esse estudo pode ajudar na escolha do copolímero e de sua composição para um melhor controle da cristalização do PHB nessas blendas / Abstract: Blends of biodegradable poly(hydroxybutyrate) were prepared with the following random copolymers: poly(styrene-co-acrylonitrile)-SAN; poly(styrene-co-2-hydroxyethylmethacrilate)-S-Hema; poly(methylmethacrylateco- vinylphenol)-P(MMA-co-VPh).SAN copolymers were synthesized by bulk copolymerization; while S-Hema copolymers were synthesized by solution copolymerization using DMF as solvent. The resulting copolymers were characterized by nuclear magnetic resonance (RMN) of H and C, gel permeation chromatography (GPC), differential scanning calorimetry (DSC) and dynamic-mechanical analysis (DMA). Blends were prepared using coprecipitation method where a binary homogeneous soilution was added to a large volume of non solvent. DSC, DMA and scanning electron microscopy (SEM) analysis revealed that all the blends are immiscible in the entire composition range. Despite the immiscible blends, DSC analysis show that the copolymers interferes in the PHB crystallization, being capable of suppress this process in some blends. Crystallization kinetics of the PHB in PHB/P(MMA-co-VPh) and PHB/SAN blends was studied by DSC and the results revealed that the presence of P(MMA-co-VPh) copolymer decreases the PHB crystallization rate and increases the activation energy for the overall crystallization process. In respect to PHB/SAN blends, the influence of the copolymer in decrease the PHB crystallization rate is lower than the observed in PHB/P(MMA-co-VPh) blends. Moreover, the acrylonitrile concentration in the copolymer causes little effect in the PHB crystallization rate. The Avrami exponent ¿n¿ determined for the crystallization process in PHB/P(MMA-co-VPh) and SAN/PHB blends are approximately equal to the ¿n¿ exponent for pure PHB indicating that the crystallization mechanisms for pure PHB do not change in the blends. This work made possible the understanding of important aspects of the phase behavior and crystallization kinetics of random copolymers/PHB blends. The crystallization kinetics studies can collaborate for the understanding of the behavior of crystallization of these blends in processing equipments. Moreover, this study can help in the choice of the copolymer and its composition for better control of the crystallization of PHB in these blends / Doutorado / Físico-Química / Doutor em Ciências

Orientador: Paulo Pinto Joazeiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T06:40:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nascimento_MariaAmaliaCavinato_M.pdf: 2973013 bytes, checksum: eef160eabbd2d1426a9f2e0795702488 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: É reconhecido que a sínfise púbica de algumas espécies de mamíferos, incluindo camundongos, passa por transformações estruturais durante a prenhez e no período pós-parto. Estas transformações incluem o surgimento de um ligamento interpúbico e o amolecimento deste tecido nos dois últimos dias antes do parto. Este ligamento permite a separação dos ossos púbicos, garantindo a passagem segura do feto pelo canal de parto. Após o parto ocorre a involução deste ligamento. Ambos os períodos de remodelação tecidual envolvem grandes modificações da matriz extracelular e de seus componentes, bem como um balanço entre proliferação e morte celular programada. A galectina-3, uma lectina animal com especificidade de ligação por ß-galactosídeos, é uma proteína amplamente distribuída entre diferentes tipos de células e tecidos, podendo ser encontrada dentro das células tanto no núcleo quanto no citoplasma, ou ainda na superfície celular ou no espaço extracelular. Através de interações específicas com diversos ligantes intra e extracelulares, a galectina-3 participa de numerosos processos fisiológicos e patológicos, como por exemplo, desenvolvimento, reações imunes, controle do ciclo celular, apoptose e metástase. Este estudo teve como objetivo localizar a expressão de galectina-3 nas populações celulares que compõem esta articulação durante o período de prenhez, a fim de investigar seu possível envolvimento nos processos de remodelação da sínfise. Foi observado que a galectina-3 está presente em todas as populações celulares que compõem a sínfise púbica e o ligamento interpúbico de todos os grupos estudados. Além disso, a galectina-3 é co-localizada com a a-actina de músculo liso em alguns tipos celulares. A quantificação da detecção de galectina-3 nos permitiu observar que ela é expressa em diferentes concentrações durante o período estudado. Esses resultados nos permitiram concluir que a galectina-3 parece estar envolvida na remodelação da sínfise púbica, através de sua participação na ativação de células semelhantes a fibroblastos, no ciclo celular, na diferenciação e nos processos de morte celular programada. / Abstract: It is recognized that the pubic symphysis of some mammal species, including mice, undergoes structural transformations during pregnancy and post-partum. These transformations include the emerging of an interpubic ligament and softening of this tissue in the two last days of pregnancy. This ligament allows the pelvic bones separation, warranting fetus self passage through the birth channel. After delivery this ligament involutes. Both periods of tissue remodeling involve changes in extracellular matrix and its components, as so a balance between cell proliferation and death. Galectin-3, an animal lectin with specificity for ß-galactosídes, is widely spread among different types of cells and tissues, thus being found inside the cells in the cytoplasm and in the nucleus, on cell surface or in the extracellular space. Through specific interactions with a variety of intra and extracellular ligands galectin-3 participates of numerous physiological and pathological processes, like for example, development, immune reactions, cell cycle control, apoptosis and metastasis. This research had the objective to localize galectin-3's expression in mouse pubic symphysis cells during pregnancy, and to investigate its involvement in the pubic remodeling process. It was observed that galectin-3 is present in all pubic cells populations of all of the studied groups. Besides that, galectin-3 is colocalized with a-smooth muscle actin in some cell types. Quantifying of galectin-3 detection revealed that this protein is expressed in different concentrations during the studied period. These results allowed us to conclude that galectin-3 seems to be involved in mouse pubic symphysis remodeling, probably working in the activation of fibroblast like cells, on cell cycle, on differentiation and in the processes of programmed cell death. / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Neste trabalho, foi desenvolvido um sistema laser utilizando como meio ativo um cristal de YLF cortado em ângulo de Brewster e dopado com 15mol% de érbio substituindo o ítrio, emitindo na região dos 3 m e bombeado por diodo laser com pico de emissão em 975 nm. Com este sistema foi obtido 1,80(18) W operando em regime quasecontínuo. O oscilador foi otimizado para aplicações médicas operando com potência máxima em 250 s de tempo de pulso. O peculiar comportamento temporal do laser foi estudado neste trabalho pela primeira vez, assim como a otimização da potência máxima em função da duração do pulso. Há diferenças nos mecanismos intrínsicos do laser quando este é operado em regime contínuo ou pulsado, especialmente no efeito da transferência de energia por conversão ascendente W22, cujo valor ainda é muito divergente na literatura. O valor estimado neste trabalho para este parâmetro de transferência de energia é 2,0x10-16 cm3/s. / In this work we present the development of a laser system based on an Er:YLF Brewster cut crystal with 15mol% erbium at the yttrium site, emitting at 3 m and pumped by a laser diode emitting at 975 nm. Using this system we obtained 1,80(18) W peak power when operating in the quasi-continuous regime. The cavity is optimized for medical applications and to operate at maximum power when pumped with 250 s pulse duration. The unique temporal behavior of this laser was subject of this study for the first time, as the optimization of the maximum output power as a function of the pulse duration. There are differences in the intrinsic mechanism of the laser when it is operated in pulsed or cw condition, especially with respect to the effect of the W22 energy transfer upconverssion parameter which value in the literature is very divergent. The estimated value of this process was also obtained in this work and is 2,0x10-16 cm3/s.

A angiogênese é um processo fundamental e fisiológico de organismos vertebrados, sendo responsável pela formação de novos vasos sanguíneos a partir dos já existentes. Entretanto, a angiogênese pode ocorrer também em condições patológicas, como causa ou consequência de doenças. Um exemplo disso está nos tumores, que para crescer além de alguns milímetros cúbicos, necessitam de um suprimento adequado de oxigênio e nutrientes, e, portanto, dependem da angiogênese. Por isso, compostos que inibem a angiogênese já estão em uso na clínica, não só para o tratamento de tumores, mas também de outras doenças dependentes da angiogênese, as retinopatias. Neste projeto, daremos continuidade à linha de pesquisa do nosso grupo, que procura identificar e validar peptídeos com potencial translacional (pré-fármacos), por apresentarem atividade anti-angiogênica. Utilizando a metodologia do Phage Display, nosso grupo identificou e caracterizou um hexapeptídeo, que foi selecionado por interagir com os receptores do principal fator iniciador da angiogênese, o VEGF (fator de crescimento endotelial vascular). Os receptores de VEGF (ou VEGFR) são proteínas do tipo receptor tirosina quinase, expressos em células endoteliais e essenciais para a iniciação e progressão da neovascularização. O hexapeptídeo identificado em nosso laboratório liga-se ao VEGFRs e inibe a formação de vasos sanguíneos in vivo em modelos animais de angiogênese. Neste trabalho, procuramos estender os estudos com este hexapeptídeo para identificar o sítio de ligação do mesmo no VEGFR e avançar em modelos que permitam a determinação dos requisitos estruturais de interação peptídeoreceptor. Com estes conhecimentos, poderemos num futuro próximo, caminhar para o desenvolvimento racional de moléculas peptideomiméticas com propriedades anti-angiogênicas. / Angiogenesis is a fundamental and physiological process for vertebrate organisms, being responsible for the formation of new blood vessels, sprouting from the existent ones. However, angiogenesis may occur in pathological conditions, being cause or consequence of diseases. One example is tumor development. To grow beyond a few cubic millimeters, tumors need a suitable supply of oxygen and nutrients, and, therefore, they are dependent of angiogenesis. In fact, anti-angiogenic compounds are already in therapeutic use, targeting not only tumors but other angiogenesis dependent diseases, like retinopathies. In this project, we expand research from our own group to identify and develop anti-angiogenic peptides with translational potential (pre-drugs). Using Phage Display methodology, our group identified and characterized a hexapeptide, that was selected based on its capacity to interact with the receptors for the main initiator factor of angiogenesis, the VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). VEGF receptors (VEGFR) are tyrosine kinase proteins, expressed by endothelial cells and essential for neovascularization initiation and progress. The hexapeptide identified in our lab binds to VEGFRs and inhibit blood vessel formation in vivo when tested in an angiogenesis animal model. In this study, we seek to further understand the interaction of this hexapeptide with its receptor by identifying its binding domain on VEGFR and develop models that will allow the determination of the structural requirements for interaction of this receptor ligand pair. With this knowledge, we can in a near future progress to a rational development of novel peptidemimetic molecules with angiogenic properties similar to this hexapeptide.

O mecanismo pelo qual a sinalização da leptina no hipotálamo permite o início da puberdade ainda não foi esclarecido. Um possível mecanismo para a ação molecular da leptina no eixo reprodutivo é constituído por uma alteração na sinalização do NPY. Objetivou-se neste estudo foi verificar se novilhas precoces Bos taurus indicus possuem a expressão modificada de genes hipotalâmicos relacionadas à sinalização da leptina. Dentre uma população de 500 novilhas entre 20 e 25 meses de idade, 100 novilhas foram selecionadas com base nas características da raça (Nelore), mês de nascimento e peso corpóreo (290 kg). Estas 100 novilhas foram classificadas de acordo com a presença ou não de um corpo lúteo (CL) notável. Dez novilhas sem um CL e dez novilhas com CL notável receberam uma injeção de prostaglandina, e de acordo com a observação visual de cio e palpação retal, 6 novilhas precoces e 6 novilhas não precoces foram selecionadas para o experimento. Estas 12 novilhas foram abatidas e amostras de tecido do hipotálamo foram coletadas e congeladas em nitrogênio liquido. A expressão de SOCS-3, NPY, NPY-Y1 e NPY-Y4 no hipotálamo foi quantificada por PCR em tempo real usando uma proteína ribossomal RP-L19 como um gene de referência. A expressão hipotalâmica de SOCS-3 ou NPY não foi diferente entre os grupos de novilhas (P > 0,50). Acreditava-se que as novilhas ciclando poderiam ser resistentes à leptina devido a um aumento na expressão do SOCS-3 no hipotálamo. Houve uma tendência (P = 0,10) de redução na expressão dos receptores do NPY, NPY-Y1 e NPY-Y4 em novilhas que atingiram a puberdade precocemente. A expressão do NPY-Y1 foi 8.3 vezes menor e a expressão do NPY-Y4 foi 14.3 vezes menor em novilhas precoces. Quando analisados em conjunto, houve uma redução de 11 vezes na expressão dos receptores de NPY em novilhas precoces, e este efeito foi estatisticamente significante (P = 0,03). Estes resultados sugerem que, a menor expressão dos receptores de NPY pelo hipotálamo de novilhas precoces pode torná-lo menos sensível à inibição do NPY, e permitir a obtenção da puberdade com maior peso vivo e níveis menores de leptina circulante. Em conclusão, não houve uma correlação entre a expressão do gene NPY e SOCS-3 e a precocidade sexual das novilhas Nelore, porém houve uma tendência significativa de redução da expressão dos receptores de NPY-Y1 e NPY-Y4 no hipotálamo das novilhas precoces. / The molecular mechanism by which leptin signaling in the hypothalamus might permit the initiation of puberty has not been elucidated. One possible mechanism for leptin molecular action on the reproductive axis is affecting NPY signaling. It was our objective to test whether early-maturing Bos indicus heifers have altered expression of hypothalamic genes related to leptin signaling. Among a population of 500 heifers between 20 and 25 months of age, 100 heifers were selected base on breed attributes (Nelore), month of birth, and body weight (290 kg). These 100 heifers were scored as prepubertal or pubertal according to the presence or not of a noticeable corpus luteum (CL). Ten heifers without a CL and ten heifers with noticeable CL received a prostaglandin injection, and according to visual observation of heat and rectal palpation, 6 prepubertal and 6 pubertal heifers were selected for the experiment. These 12 heifers were slaughtered and samples of hypothalamus were collected and frozen in liquid nitrogen. Expression of SOCS-3, NPY, NPY-Y1 and NPY-Y4 at the hypothalamus was quantified by real-time PCR using the ribosomal protein RP-L19 as a reference gene. Hypothalamic expression of SOCS-3 or NPY was not different between groups of heifers (P > 0, 50). It was thought that late-maturing heifers could be resistant to leptin due to an increased expression of SOCS-3 at the hypothalamus. However, there was a tendency for NPY-Y1 and NPY-Y4 expression to be reduced in heifers that reached puberty earlier (P = 0,10). Expression of NPY-Y1 was 8.3-folds lower and NPY-Y4 expression was 14.3-folds lower in early-maturing heifers. When analyzed together, there was an 11-fold reduction in NPY receptors expression in early-maturing heifers, and this effect was statistically significant (P = 0,03). These results suggest that, because of the lower expression of NPY receptors, the hypothalamus of early-maturing heifers could be less sensitive to NPY inhibition, and therefore reach puberty with lower levels of circulating leptin. In conclusion, there was no effect between the expression of NPY and SOCS-3 and sexual precocity of Nelore heifers, but there was a significant tendency of reduction in NPY-Y1 e NPY-Y4 receptors expression in the hypothalamus of sexually precocious heifers.

Tumores são definidos como microambientes compostos não só pelas células malignas, mas também por células endoteliais, fibroblastos e leucócitos, que promovem o crescimento tumoral e a angiogênese. Galectina-3, uma proteína que se liga a b- galactosídeos, é abundantemente expressa por monócitos/macrófagos, dentre outros leucócitos. Inúmeras evidências sugerem que galectina-3 atua como uma molécula reguladora da resposta inflamatória. Tendo em vista que o infiltrado inflamatório pode promover a progressão de tumores, o objetivo do presente trabalho foi avaliar se galectina-3, expressa tanto pela célula tumoral como pelas células estromais, modula o crescimento de melanoma. Para tal, células de melanoma murino Tm1 foram transfectadas com o gene de galectina-3. Ambos clones celulares (galectina-3 positivos e negativos) foram injetados na intrafáscia ou no subcutâneo de camundongos (fêmeas) C57BL/6 selvagens e/ou nocautes para o gene de galectina-3 para análise da implantabilidade e crescimento tumoral. Com relação à implantabilidade, não foi observado diferenças no estabelecimento de uma massa tumoral proliferativa em animais selvagens inoculados com células Tm1 transfectadas ou não com o gene de galectina-3 em animais selvagens. Em relação a taxa de crescimento dos tumores, nenhum animal nocaute inoculado com células Tm1 galectina-3 positivas apresentou tumores de dimensões mensuráveis até o 11º dia pós-inóculo. Independente do nível de expressão de galectina- 3 pela célula tumoral, os tumores originados nos animais nocautes apresentavam menor massa em gramas comparados ao grupo selvagem, sugerindo que galectina-3 expressa pelas células estromais promove o crescimento tumoral. Ainda, os tumores originados nos animais nocautes e no grupo selvagem inoculado com células Tm1 galectina-3 positivas apresentavam menor extensão de área necrótica do que os animais selvagens inoculados com células Tm1 galectina-3 negativas. Interessantemente, os animais selvagens e nocautes inoculados com células Tm1 galectina-3 positivas apresentaram tumores com menor área vascular e menor número de estruturas vasculares funcionais quando comparados aos animais selvagens inoculados com células Tm1 galectina-3 negativas. A análise de expressão gênica nos tumores mostrou que os níveis relativos de RNAm de VEFG (fator de crescimento de endotélio vascular) foram menores nos animais inoculados com células Tm1 galectina-3 positivas em relação aos inoculados com células Tm1 galectina-3 negativas, indicando que galectina-3 expressa pelas células tumorais atua como uma molécula anti-angiogênica. Finalizando, o presente trabalho sugere que galectina-3 pode atuar como uma molécula pró- ou anti-tumoral, dependendo do tipo celular que a expressa no microambiente tumoral. / Tumors have been described as microenvironments composed not only by malignant cells, but also by endothelial cells, fibroblasts and leukocytes, which can promote tumor growth and angiogenesis. Galectin-3, a b-galactoside binding protein, is expressed by monocytes/macrophages and others leukocytes. In fact, several lines of evidence suggest that galectin-3 act as master regulators of the inflammatory response. Based on the fact that the inflammatory infiltrate can promote tumor progression, the proposal of this study was to evaluate if galectin-3, either from tumor or stromal cells could modulate melanoma growth. Tm1 murine melanoma cell line was transfected with the galectin-3 gene. Both clones (galectin-3 negative and positive) were injected in the foot pad or subcutaneous in female C57BL/6 wild-type (WT) and galectin-3 knock-out (KO) mice to tumor engraftment and growth analysis. There was no difference in the tumor engraftment between animas injected with Tm1 galectin-3 positive or negative cells. In addition, any knock-out mice injected with galectin-3 positive cells had measurable tumors up to day 11 post inoculation. Regardless the galectin-3 expression level in the melanoma cell, tumors from galectin-3 KO mice were smaller than those from WT animals, suggesting that galectin-3 expressed by stromal cells promotes tumor growth. Moreover, tumor necrotic area was smaller in KO mice and in wild-type animals injected with Tm1 galectin-3 positive cells compared to wild type animals injected with Tm1 galectin-3 negative cells. Interestingly, both vascular area and the number of functional vessels in animals injected with galectin-3 positive Tm1 cells were smaller in WT as well as in KO mice compared to the same animals injected with galectin-3 negative Tm1 cells. Gene expression analysis showed that VEGF (vascular endothelial growth factor) mRNA levels were smaller in wild type animals injected with Tm1 galectin-3 positive cells compared to those injected with Tm1 galectin-3 negative cells, indicating that galectin-3 expressed by tumor cells can act as an anti-angiogenic molecule. The present study suggests that galectin-3 can act either as a pro or antitumoral molecule, depending on which type of cell (tumoral or stromal) this lectin is expressed within tumor microenvironment.

Les mégacaryocytes sont des cellules de la moelle osseuse qui par un processus complexe et encore mal caractérisé, mégacaryopoïèse/thrombopoïèse, donnent naissance, in fine, aux plaquettes sanguines. La différenciation mégacaryocytaire nécessite un intense remodelage nucléaire et cytoplasmique, guidé à la fois par des facteurs intrinsèques mais aussi par des facteurs extrinsèques tel que le microenvironnement médullaire. Les plaquettes sanguines sont des acteurs essentiels du maintien de l'intégrité vasculaire. Elles sont les premiers éléments cellulaires à intervenir dans l'arrêt du saignement lors d'une blessure vasculaire par la formation d'un thrombus via des mécanismes d'adhésion, de sécrétion et d'agrégation, trois étapes majeures de l'hémostase physiologique. Dans un premier temps, mes travaux de thèse visent à déterminer le rôle inconnu de l'isoforme alpha des PI3Ks de classe II (PI3KC2a), de la PI3K de classe III (Vps34) et de leur produit, le phosphatidylinositol 3 monophosphate (PI3P), dans la production et les fonctions plaquettaires. Grâce à un modèle murin présentant une inactivation partielle de la PI3KC2a, j'ai mis en évidence son rôle clé dans la génération d'un pool basal de PI3P dans les plaquettes. L'inactivation de la PI3KC2a affecte la composition du cortex sous-membranaire plaquettaire induisant une morphologie plaquettaire anormale, une accumulation de plaquettes à deux corps appelées " barbell-shaped proplatelets ", un défaut de formation du thrombus ex vivo et un retard d'occlusion de la carotide après lésion in vivo. Ainsi, la PI3KC2a joue un rôle majeur dans le maintien de l'intégrité du squelette membranaire contrôlant la structure et la dynamique membranaire, processus critique à la production de plaquettes fonctionnelles. D'autre part, la délétion de Vps34 spécifiquement dans la lignée mégacaryocyte/plaquette se traduit par une microthrombopénie modérée associée à une migration anormale des mégacaryocytes liées à un défaut de trafic vésiculaire et une diminution du taux de PI3P. De façon intéressante, Vps34 joue aussi un rôle dans l'activation plaquettaire en régulant la production de PI3P sous stimulation, la croissance du thrombus ex vivo et les capacités thrombotiques in vivo. Le rôle de Vps34 dans la plaquette indépendamment de son rôle dans le mégacaryocyte a été confirmé via l'utilisation de nouveaux inhibiteurs spécifiques de Vps34, SAR405 et INH1, ex vivo. Vps34 est donc critique dans la régulation de la production plaquettaire par les mégacaryocytes ainsi que dans l'activation plaquettaire. Dans un deuxième temps, je me suis intéressé à l'impact du microenvironnement médullaire sur la mégacaryopoïèse, et plus spécifiquement sur la communication entre adipocytes médullaires et progéniteurs hématopoïétiques lors de leur différenciation en mégacaryocytes. Grace à un système de coculture in vitro, j'ai montré que les adipocytes améliorent la différenciation mégacaryocytaire via un transfert direct de lipides, dans un but non-énergétique. Dans un contexte d'obésité, nous observons, in vivo, associée à une adiposité médullaire augmentée une maturation mégacaryocytaire exacerbée, une production et une demi-vie plaquettaire défectueuses ayant pour conséquence une macrothrombopénie. Ainsi, le microenvironnement médullaire et plus particulièrement l'adipocyte impacte directement sur la mégacaryopoïèse et la production plaquettaire. En conclusion, ces travaux de thèse contribuent à caractériser les mécanismes de production et de fonction plaquettaire régulés par des facteurs intrinsèques tels que le PI3KC2a et Vps34, ainsi que par des facteurs extrinsèques tels que l'adipocyte médullaire. / Megakaryopoiesis is a highly specialised and complex process occurring in the bone marrow, by which megakaryocytes give rise to de novo circulating blood platelets. Megakaryocyte differentiation implies cytoplasmic and nuclear rearrangements regulated by intrinsic as well as extrinsic factors such as bone marrow microenvironment. Platelets play a critical role in preventing blood loss after vascular injury by orchestrating clot formation through mechanisms of adhesion, secretion and aggregation. These mechanisms are the three major steps of physiological haemostasis leading to the maintenance of vascular integrity. Firstly, my thesis work focused on characterizing the role of class II PI3K alpha isoform (PI3KC2a), class III PI3K (Vps34) and their common product the phosphatidylinositol 3 monophosphate (PI3P) in platelet production and function. Using a unique mouse model partially inactivated for PI3KC2a, I highlighted its key role in the production of a basal PI3P housekeeping pool in platelets. PI3KC2a partial inactivation affects platelet membrane skeleton composition leading to an abnormal platelet morphology, an enrichment of platelet with two cell bodies recently called "barbell-shaped proplatelets", an ex vivo defective thrombus formation and an in vivo delayed carotid occlusion following injury. Thus, PI3KC2a plays a major role in membrane structure and dynamics by maintaining membrane skeleton integrity, which is crucial for functional platelet production. On the other hand, Vps34 specific deletion in megakaryocyte/platelet lineage induced mild microthombopenia correlated to an abnormal megakaryocyte migration linked to an affected PI3P production as well as vesicular trafficking in megakaryocytes. In platelets, Vps34 plays a role in their activation by regulating PI3P production under stimulation, ex vivo thrombus growth and in vivo thrombotic capacity. Vps34 role in platelet independently from its role in megakaryocyte was confirmed using two recently developed inhibitors, SAR405 and INH1, which reproduced ex vivo thrombus growth defects. Therefore, Vps34 is critical for platelet production by megakaryocyte as well as platelet activation. Secondly, I studied the impact of bone marrow microenvironment on megakaryopoiesis and more specifically the crosstalk between medullar adipocytes and hematopoietic progenitors differentiating towards the megakaryocyte lineage. Using an in vitro coculture assay, I demonstrated that adipocytes enhanced megakaryocyte differentiation through a direct lipid transfer, in a non-energetic aim. In the context of obesity, increased marrow adipocity is associated to enhanced megakaryocyte differentiation and defective platelet production and lifespan leading to macrothrombopenia. Thus, bone marrow microenvironment through adipocytes impact directly on megakaryopoiesis and platelet production. Altogether my thesis work contributes to better understand platelet production and function, mechanisms regulated by intrinsic factors such as PI3KC2a and Vps34 as well as extrinsic factors like medullar adipocytes.

v angličtině Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology and Toxicology Candidate: Lucie Pohanová Supervisor: Assoc. Prof.. Přemysl Mladěnka, Pharm.D., Ph.D. Title of Thesis: Chelation of ferrous ions by xanthen-3-one derivatives Iron is an essential element important for proper function of cells. Imbalance of iron levels can lead to serious diseases. Since there is no excretory mechanism, the homeostasis is regulated at the level of absorption in the intestine. The iron overload, which leads to tissue damage due to catalysis of the formation of free radicals, occur because of genetic disorders such as hemochromatosis or owing to frequent administration of transfusions. Rational therapy for iron overload is the administration of the chelators. The aim of this study was to evaluate the ability of derivatives of 2,6,7- trihydroxyxanthen-3-one (synthesized at the University of Sarajevo - Dr. Durić) to chelate iron in 4 (patho) physiologically relevant pH conditions. The ferrozine spectrophotometric method was used to determine the degree of chelation. Measurements showed dependency of the chelating effect on pH: lowering pH resulted in the decrease of the effect. At pH 7.5, most of the substances showed 100% ferrous ion chelation in the stoichiometric ratio of 1...

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Fyzikální chemie Mgr. Lenka Řežábková Studium úlohy proteinů 14-3-3 v regulaci G-proteinové signalizace Role of the 14-3-3 proteins in the regulation of G-protein signaling Disertační práce Školitel: doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D. Konzultanti: doc. RNDr. Petr Heřman, CSc. doc. RNDr. Jaroslav Večeř, CSc. Praha, 2012 Abstract The 14-3-3 family of phosphoserine/phosphothreonine-binding proteins dynamically regulates the activity of their binding partners in various signaling pathways that control diverse physiological and pathological processes such as signal transduction, metabolic pathways, cell cycle and apoptosis. More than 300 different cellular proteins from diverse eukaryotic organisms have been described as binding partners for the 14-3-3 proteins. During my Ph.D., I was particularly interested in the role of 14-3-3 proteins in the regulation of G protein signaling pathway. The 14-3-3 proteins affect the G protein signaling via the interaction with negative regulators of G protein cascade - the RGS proteins and phosducin. I employed both biochemical and biophysical approaches to understand how the activity and function of RGS3/14-3-3 and phosducin/14-3-3 complexes are regulated. I solved the low-resolution solution structure of...