Résumé : les benzodiazépines (BZD) et les antidépresseurs sont efficaces pour réduire l’anxiété, mais devant les effets indésirables que les BZD induisent et face au délai d’action des antidépresseurs, le développement de nouvelles stratégies constitue un besoin primordial. Récemment, il a été montré que l’activation du récepteur 5-HT4 (5-HT4R) pouvait représenter une cible d’action prometteuse. Bien qu’un certain nombre d’études ait évalué l’activité anxiolytique des agonistes du 5-HT4R, après une administration chronique, aucune étude n’a examiné leurs effets après une administration unique, ni même le circuit cérébral à la base de cette réponse comportementale. Nous avons donc cherché à savoir si l’activation aiguë du 5-HT4R via le recrutement des terminaisons neuronales glutamatergiques du cortex préfrontal médian (CPFm) se projetant sur le noyau du raphé dorsal (NRD), un circuit impliqué dans les processus émotionnels, induisait des effets anxiolytiques rapides, grâce à des outils pharmacologiques, électrophysiologiques et optogénétiques. L’administration unique par voie systémique ou intra-CPFm d’un agoniste du 5-HT4R a produit des effets anxiolytiques rapides chez la souris, associés à une augmentation de l’activité des neurones sérotoninergiques du NRD. L’activation des projections glutamatergiques du CPFm vers le NRD a permis de réduire l’anxiété des souris, alors que l’inhibition de ces projections a bloqué les effets anxiolytiques induits par l’injection unique intra-CPFm d’une BZD (diazépam) ou d’un agoniste du 5-HT4R (RS 67333). Toutefois, ces effets ne sont que partiellement bloqués après l’administration par voie systémique de ces composés, suggérant que le circuit cortex-raphé est un carrefour nécessaire mais non suffisant à l’activité anxiolytique du diazépam et du RS 67333. Enfin, l’administration prophylactique d’un agoniste du 5-HT4R avant l’induction d’un stress a prévenu le développement d’un phénotype anxio-dépressif chez la souris, laissant penser que cette molécule pourrait renforcer la résilience au stress des populations à risque. / Benzodiazepines (BZD) and antidepressants are effective in reducing anxiety, but adverse effects of BZD and the delayed onset of action of antidepressants emphasize the need to develop fast-acting new drugs. Recent studies indicated that activation of 5-HT4 receptor (5-HT4R) could be a promising target. Although a number of studies have assessed 5-HT4R agonist anxiolytic activity after chronic treatment, few of them have neither evaluated their anxiolytic profile acutely, neither the brain circuits involved in this behavioral activity. Here, we evaluated whether acute 5-HT4R activation in glutamatergic axon terminals arising from the medial prefrontal cortex (mPFC) to the dorsal raphe nucleus (DRN), a circuit involved in emotional processes, induced fast anxiolytic effects, using pharmacologic, electrophysiologic and optogenetic tools. Acute systemic administration and intra-mPFC infusion of 5-HT4R produced fast anxiolytic effects in mice and increased DRN serotonin cell firing. Optogenetically activating mPFC terminals targeting the DRN reduced anxiety in mice whereas silencing this circuit blocked BZD (diazepam) and 5-HT4R agonist (RS 67333) mPFC infusion -induced anxiolytic effects. However, anxiolytic effects induced by an acute systemic administration of both molecules were partially blocked after optogenetically inhibiting cortical glutamatergic terminals in the DRN, suggesting that cortex-brainstem neural circuit is necessary but not sufficient for a rapid activity of diazepam and RS 67333. Finally, the prophylactic administration of a 5-HT4R agonist before stress prevented the development of an anxio-depressive phenotype in mice, suggesting that this molecule could reinforce the resilience of population at risk.

Background: The 5-hydroxytrptamine receptor 4 (5-HT4 receptor) is heavily expressed on colonic epithelial cells and has been targeted as a therapeutic for functional bowel symptoms and pain; however, adverse cardiac events related to 5-HT4 agonist treatment limited their therapeutic use. Previous studies in the Mawe laboratory have demonstrated that intraluminal application of a 5-HT4 agonist exerts protective epithelial actions in animal models of colitis, and accelerates recovery from colitis. The aim of this study was to test the effects of a luminally restricted 5-HT4 agonist in a mouse model of experimental colitis. Methods: The luminally restricted 5-HT4 agonist (Takeda Pharmaceuticals; 10 mg/kg) was administered to mice during active dextran sodium sulfate (DSS) induced colitis. Colitis activity was evaluated using disease activity index, a fecal lipocalin-2 assay, and histological damage scoring. Epithelial proliferation and colonic motility were also measured as readouts of the potential protective actions and colonic function, respectively. Results: Oral gavage and intracolonic delivery of this luminally restricted 5-HT4 agonist had no detectable effect on recovery from colitis or colonic motility as compared to vehicle. Additionally, in positive control experiments, we failed to see an effect of the 5-HT4 agonist, tegaserod, on colitis severity or colonic motility in any of the measures tested. Conclusions: In conclusion, it is unclear if the luminally restricted 5-HT4 agonist has any effect on recovery from DSS colitis. Given inconsistencies with the model and lack of an effect of tegaserod, additional studies will be required, possibly involving different doses and time points, to fully assess the actions of this luminally restricted compound in colitis recovery.

Environs 70 millions de personnes seront atteintes par la maladie d’Alzheimer (MA) en 2030 et les coûts engendrés par la prise en charge des patients affectés par cette pathologie excédera quatre fois les coûts des maladies cancéreuses. Dans le but lutter contre cette pathologie multifactorielle, des stratégies thérapeutiques combinatoires ainsi que le développement de MTDL « Multi Target Directed Ligands » suscitent un grand intérêt. Dans ce contexte, l’association d’inhibiteurs de l’acétylcholinestérase (AChE) avec les agonistes des récepteurs sérotoninergiques de type 4 (5-HT4) a montré des effets bénéfiques sur la mémoire et la protection du cerveau chez les rongeurs. Après avoir démontré l’avantage de l’association de la galantamine, un inhibiteur de l’AChE avec le RS 67333, un agoniste des récepteurs 5-HT4 dans un modèle de déficit mnésique induit par la scopolamine sur les performances de mémoires de travail et de référence, nous avons étudié le donecopride, un MTDL récemment développé, à la fois inhibiteur de l’AChE et agoniste partiel des récepteurs 5-HT4. Chez les souris sauvages, une administration unique de donecopride augmente la sécrétion du neuropeptide protecteur sAPPα et a démontré des effets anti-amnésiants et pro-cognitifs. Dans un modèle amyloïdogénique de la MA (5xFAD), six mois de traitement chronique par le donecopride ont amélioré les performances de mémoire de travail à l’âge de 9 mois, sans modifier la densité des plaques amyloïdes au niveau cérébral. Par ailleurs, nous avons également étudié les effets d’un autre composé MTDL « 7m » qui est à la fois agoniste des récepteurs 5-HT4 et antagoniste des récepteurs 5-HT6, qui a montré des effets anti-amnésiants chez les souris sauvages lorsque le déficit mnésique est induit par administration de scopolamine. Ainsi, la modulation chronique et simultanée de différentes cibles centrales d’intérêt représente un potentiel thérapeutique important dans le cadre du traitement de la MA. / In 2030, the number of people affected by Alzheimer’s disease (AD) is expected to reach almost 70 million, and the cost of the disease would be over four folds cost of cancer diseases care. To face the multifactorial disease combining drugs arouse a big interest and the concept of MTDL “Multi Target Directed Ligands” has emerged. Thus, combining acetylcholinesterase (AChE) inhibitors with serotonergic receptor type 4 (5-HT4) showed beneficial effects on memory and brain protection in rodents. First, we showed beneficial effects of galatamine, an AChE inhibitor while combined to RS 67333, a 5-HT4 receptors partial agonist, on working and reference memory performances in a pharmacological model with scopolamine-induced amnesia. Then, we assessed effects of donecopride, the AChE inhibitor and partial agonist of 5-HT4 receptors. Donecopride, which increases sAPPα release in cell culture and C57BL/6 mice, showed anti-amnesiant and pro-cognitive effects in NMRI mice. In 5xFAD mice, an amyloidogenic mice model of AD, six months of chronic treatment of donecopride improves working memory performances in 9 months old 5xFAD mice, but does not affect spatial learning performances neither flexibility. Moreover, donecopride inhibits AChE and does not affect 5-HT4 receptor expression level neither amyloid plaque density in the brain. In the other hand, we also showed that the MTDL, which modulate 5-HT4 and 5-HT6 receptors, recovers working memory performances in NMRI mice where scopolamine induced memory deficit. Thus, hitting multiple targets, particularly while administered early and chronically, accounts for a hopeful strategy to better face AD

La Maladie d’Alzheimer (MA) est la première cause de démence au monde. Un fort coût de prise en charge, associé une faible efficacité des traitements actuels font de la découverte d’une thérapie efficace une priorité. Dans ce contexte les récepteurs sérotoninergiques de type 4 (5-HT4R) représentent une cible prometteuse. En effet, l’utilisation d’agonistes des 5-HT4R chez l’animal entraîne à la fois des effets pro-mnésiants et anti-amnésiants et une action sur la physiopathologie de cette maladie. Par ailleurs, l’aspect multifactoriel de la MA a conduit à faire émerger ces derniers années un consensus quant à la nécessité du développement de stratégie thérapeutique multi-cibles. Dans un premier temps, nous avons démontré l’intérêt de l’association d’un inhibiteur de l’acétylcholinestérase (IAChE) - l’un des rares médicaments disponibles, à un agoniste des 5-HT4R (RS67333) sur les performances de mémoire de travail et de référence chez la souris. Par la suite et afin de mieux comprendre les mécanismes mises en jeu dans les effets anti-amnésiant du RS67333, nous avons étudié les effets de la stimulation des 5-HT4R sur la plasticité synaptique mesurée au moyen d’une approche ex vivo au niveau de la région CA1 de l’hippocampe chez la souris saine NMRI. En effet, la plasticité synaptique, est un élément essentiel des processus d’apprentissage et de mémoire. Une première étude chez la souris saine a montré que la stimulation des 5-HT4R inhibait la potentialisation à long terme (LTP) induite par stimulation thêta-burst (TBS). Nos résultats suggèrent que l’inhibition de la LTP par l’agoniste est médiée par une modification de la neurotransmission GABAergique. La dernière partie de mes travaux a porté sur un modèle transgénique murins mimant certains des aspects de la MA (souris 5xFAD). Ainsi, si la stimulation des 5-HT4R conduisait à des résultats similaires en terme de transmission synaptique de base ou de plasticité à long-terme, elle modifie de façon importante la plasticité à court terme. L’ensemble de ces résultats obtenus ex vivo nécessiteraient d’être associé à des mesures in vivo, pour faire le lien entre les effets sur la plasticité synaptique et les performances de mémoire. Nos travaux montrent l’existence d’une association entre les 5-HT4R et la transmission GABAergique dans la modulation de la plasticité synaptique hippocampique de la région CA1. Plus généralement, ils renforcent l’intérêt de stratégies multi-cibles contenant notamment un agoniste des 5-HT4R. / Alzheimer’s disease (AD) is the first cause of dementia in the world. Due to its high cost of care combined with the lack of efficient treatment, the discovery of an effective therapy is a priority. In that regard, 5-HT4R are a promising target. Indeed, preclinical studies showed promnesic and anti-amnesic effect of 5-HT4R agonist as well as a disease-modifying effect on amyloid processing. Furthermore, given the multifactorial aspect of AD pathophysiology, there is a consensus concerning the necessity for multi-target therapy to treat effectively this disease. First, we confirmed the beneficial effect of a combined treatment with galantamine, an IAChE, and RS67333, a 5-HT4R agonist, on working and reference memory performances in a pharmacological model of scopolamine-induced amnesia. Then, for a better understanding of the mechanisms involved in 5-HT4R stimulation-induced increase in memory performances, we investigated the effects of such stimulation on CA1 area synaptic plasticity. Indeed, synaptic plasticity is a key component of learning and memory processes. Through ex-vivo electrophysiological recordings, we demonstrated that 5-HT4R activation impairs TBS-induced LTP in wild-type healthy mice. Further experiments suggested that such impairment involves a modulation of GABAergic neurotransmission. In addition, a third study on a transgenic model of AD (5xFAD mice) showed similar results. These results, obtained exclusively ex vivo, need to be associated with in vivo experiments to close the gap with behavioral experiments and allow an interpretation of memory performances through synaptic plasticity modifications. Our work shows the existence of an interplay between 5-HT4R and GABAergic transmission in the regulation of synaptic plasticity in hippocampal CA1 area. Furthermore, we strengthen the interest toward multi-target treatment involving 5-HT4R agonists in the field of AD.

Les actions thérapeutiques des antidépresseurs, disponibles actuellement, requièrent plusieurs semaines de traitement. Ce délai est dû aux adaptations des sites pré et post-synaptiques qui, respectivement, augmentent la disponibilité synaptique des monoamines sérotonine et noradrénaline (5-HT et NA), et entraînent les changements neuroplastiques modifiant la fonction neuronales dans les régions limbiques. Il a été récemment observé, chez un modèle animal de dépression, que l’agoniste RS67333 des récepteurs sérotoninergiques de type 5-HT4 produisait des changements comportementaux, électrophysiologiques, cellulaires et biochimiques, tel qu’observé chez les antidépresseurs. Ces changements apparaissent seulement après 3 jours de traitement tandis que les antidépresseurs nécessitent souvent plusieurs semaines. De plus, l’activation des récepteurs 5-HT4 ne générait pas de tolérance, et cela pendant 21 jours de traitement. Seulement, les propriétés de signalisation et de régulation de ces récepteurs sont très loin d’êtres établies. Nous avons alors voulu mieux caractériser ces deux aspects de leur fonction, en se concentrant d’avantage sur les isoformes a et b, fortement exprimés dans le système limbique. Pour cela, nous avons voulu évaluer d’abord leur capacité de production d’AMPc dans un système hétérologue. Les essais d’accumulation d’AMPc démontrent que les deux isoformes sont capables de moduler positivement et négativement des niveaux d’AMPc en présence de 5-HT. Par contre, la stimulation au RS67333 induit seulement une augmentation du niveau d’AMPc dans les deux cas. Ensemble, ces observations indiquent que les deux isoformes sont capables de coupler à l’adénylate cyclase à travers les protéines Gαs et Gαi. La quantification des récepteurs internalisés a montré que l’isoforme b internalisait plus efficacement que l’isoforme a suite à l’incubation à la 5-HT (61 ± 3 % pour le b vs 40 ± 2 % pour le a). Les protéines kinases PKA et PKC n’étaient pas impliquées dans cette différence, toutefois, la PKC a été trouvée essentielle à l’internalisation des deux isoformes. L’internalisation de l’isoforme b par 5-HT n’a pas été affecté par la surexpression de forme inactive de GRK2 (GRK2- K220R) et a été partiellement inhibé par un mutant négative de la β-arrestine (βarr(319-418)), tandis que l’internalisation de l’isoforme a a été bloquée par les deux. Ces observations indiquent que les mécanismes d’internalisation des deux isoformes du récepteur 5-HT4 les plus abondants dans le système nerveux central sont distincts. Des comportements spécifiques à chaque isoforme ont aussi été constatés au niveau de la régulation fonctionnelle suite à l’exposition au RS67333, qui désensibilise seulement l’isoforme b. D’après nos observations, nous avons conclu que les isoformes a et b diffèrent dans leur propriétés de signalisation et de régulation. L’incapacité du RS67333 à désensibiliser l’isoforme a fournit un substrat moléculaire pour les effets antidépressifs prolongés de cet agoniste dans les études pré-cliniques. / The therapeutic actions of antidepressants, currently available, require several weeks of treatment. This delay is due to pre-and post-synaptic sites adjustments, which, respectively, increase the availability of synaptic monoamines 5-HT and NA, and induce neuroplastic changes amending neuronal function in the limbic regions. We have recently observed in animal model of depression that serotonergic 4 receptor agonist RS67333 produces behavioural, electrophysiological, cellular and biochemical changes, as seen in antidepressants. More importantly, these changes appear only after 3 days of treatment while antidepressants often require several weeks. Moreover, activation of 5-HT4 receptors does not generate tolerance and that for 21 days of treatment. However, the signalling and regulation properties of these receptors haven’t been established yet. Here, we wanted to better characterize these two aspects of their function, and in particular for isoforms a and b, strongly expressed in the limbic system. First, we assessed their ability to produce cAMP in a heterologous system. Functional assays revealed that both isoforms were capable of positive and negative modulation of cAMP levels by 5-HT. Stimulation by RS67333 induced cAMP stimulation. Together, these observations indicate that that both isoforms are able to couple adenylate cyclase through Gαs and Gαi proteins. Moreover, quantification of receptors sequestration showed that isoform b internalised more efficiently than the isoform a, following incubation with 5-HT (61 ± 3 % for b, 40 ± 2 % for a). PKA and PKC proteins, two seconds messenger kinases activated by these receptors, are not involved in producing this difference. However, PKC is essential to the internalization of both isoforms. Isoform b internalization was not affected by an inactive GRK2 mutant (GRK2-K220R) and was partially inhibited by dominant negative β-arrestin (βarr(319-418), while isoform a internalization was dependant on both. These observations indicate that internalization mechanisms of the two isoforms, most abundantly expressed in the central nervous system, are different. Functional desensitization studies showned that RS67333 selectively desensitizes the isoform b, but not isoforme a. Based on these observations, we conclude that isoform a and b differ in their signalling and regulatory properties. Isoform a incapacity to desensitization by RS67333 provides a molecular substrate for prolonged antidepressant affects of this agonist in pre-clinical studies.

Les antidépresseurs actuels sont très similaires au niveau de leur mécanisme d’action et sont plus ou moins efficaces. Un des problèmes majeurs est leur long temps de latence à fournir une action thérapeutique dû aux adaptations des sites pré et post synaptiques. Dans un modèle animal, nous avons récemment découvert que l’agoniste RS67333 des récepteurs 5-HT4 était en mesure de produire en trois jours les mêmes effets antidépresseurs qui normalement prennent de deux à trois semaines à apparaître avec les antidépresseurs actuellement disponibles. De plus, nous avons constaté que les effets antidépresseurs de cet agoniste possédaient une résistance à la tolérance. Il y a d’autres agonistes du même récepteur, tel que le prucalopride qui ne produit pas d’effets antidépresseurs comme RS67333. Étant donné que l’efficacité du Prucalopride à stimuler les 5-HT4Rs est similaire sinon plus grande que celle de RS67333, nous avons énoncé l’hypothèse que le récepteur 5-HT4 pourrait adopter différentes conformations actives suite à son activation par différents agonistes. Nous avons ainsi décidé d’explorer les principales réponses fonctionnelles des récepteurs 5-HT4B en observant leurs propriétés de régulation et de signalisation. Nous avons montré que l’isoforme B du récepteur 5-HT4, étant hautement exprimé dans le système limbique, détient une signalisation et une régulation différentes dépendant du ligand activateur. Nos résultats indiquent que chacun des agonistes testés (5-HT, RS67333, ML10302, Zacopride, Prucalopride) modulent distinctivement la production d’AMPc et l’internalisation du récepteur. Les résultats nous ont clairement permis de déterminer que les agonistes possèdent une efficacité et ou puissance différentes les uns par rapport aux autres. De plus, l’ordre d’efficacité des agonistes à moduler la voie de l’AMPc était (Prucalopride > Zacopride = ML10302 = 5-HT > RS67333) et est différente de leur ordre d’efficacité à induire la régulation du récepteur par internalisation (5-HT > Zacopride > Prucalopride > ML10302 = RS67333). Ainsi, nous avons montré que les 5-HT4Rs adoptent des conformations qui sont ligand-spécifiques. Cela implique que la sélectivité fonctionnelle serait un facteur important à considérer dans les mécanismes d’action antidépresseur des agonistes de ce récepteur. / Antidepressants currently available are very similar toward their mechanism of action and are more or less effective. One major problem is their long latency to provide a therapeutic effect due to adaptations of pre and post synaptic locations. In an animal model, we recently discovered that the agonist RS67333 of the 5-HT4 receptors was able to produce in three days the same antidepressant effects that normally take two to three weeks to appear with the currently available antidepressants. In addition, we found that the antidepressant effects of this agonist had a resistance to tolerance. There are others agonists of the same receptor such as prucalopride, which does not produce antidepressant effects as RS67333. Since the effectiveness of prucalopride to stimulate 5-HT4Rs is similar if not greater than RS67333, we stated the hypothesis that the 5-HT4 receptor could adopt different active conformations following its activation by various agonists. We decided to explore the major functional responses of 5-HT4B by observing their regulatory and signaling properties. We showed that the B isoform of the 5-HT4, being highly expressed in the limbic system, has a different signaling and regulation depending on the ligand. Our results indicate that each of the agonists tested (5-HT, RS67333, ML10302, Zacopride, Prucalopride) distinctively modulate cAMP production and receptor internalization. The results have clearly identified that agonists differed in potency and efficacy. Moreover, the order of effectiveness of agonists to modulate the cAMP pathway was (prucalopride> zacopride = 5-HT = ML10302> RS67333) different from their order of effectiveness in inducing receptor regulation by internalization (5-HT> Zacopride> Prucalopride> RS67333 = ML10302). Thus, we have shown that 5-HT4Rs adopt conformations that are ligand-specific. This implies that functional selectivity is an important factor in the mechanisms of antidepressant action of this receptor agonists.

Les antidépresseurs actuels sont très similaires au niveau de leur mécanisme d’action et sont plus ou moins efficaces. Un des problèmes majeurs est leur long temps de latence à fournir une action thérapeutique dû aux adaptations des sites pré et post synaptiques. Dans un modèle animal, nous avons récemment découvert que l’agoniste RS67333 des récepteurs 5-HT4 était en mesure de produire en trois jours les mêmes effets antidépresseurs qui normalement prennent de deux à trois semaines à apparaître avec les antidépresseurs actuellement disponibles. De plus, nous avons constaté que les effets antidépresseurs de cet agoniste possédaient une résistance à la tolérance. Il y a d’autres agonistes du même récepteur, tel que le prucalopride qui ne produit pas d’effets antidépresseurs comme RS67333. Étant donné que l’efficacité du Prucalopride à stimuler les 5-HT4Rs est similaire sinon plus grande que celle de RS67333, nous avons énoncé l’hypothèse que le récepteur 5-HT4 pourrait adopter différentes conformations actives suite à son activation par différents agonistes. Nous avons ainsi décidé d’explorer les principales réponses fonctionnelles des récepteurs 5-HT4B en observant leurs propriétés de régulation et de signalisation. Nous avons montré que l’isoforme B du récepteur 5-HT4, étant hautement exprimé dans le système limbique, détient une signalisation et une régulation différentes dépendant du ligand activateur. Nos résultats indiquent que chacun des agonistes testés (5-HT, RS67333, ML10302, Zacopride, Prucalopride) modulent distinctivement la production d’AMPc et l’internalisation du récepteur. Les résultats nous ont clairement permis de déterminer que les agonistes possèdent une efficacité et ou puissance différentes les uns par rapport aux autres. De plus, l’ordre d’efficacité des agonistes à moduler la voie de l’AMPc était (Prucalopride > Zacopride = ML10302 = 5-HT > RS67333) et est différente de leur ordre d’efficacité à induire la régulation du récepteur par internalisation (5-HT > Zacopride > Prucalopride > ML10302 = RS67333). Ainsi, nous avons montré que les 5-HT4Rs adoptent des conformations qui sont ligand-spécifiques. Cela implique que la sélectivité fonctionnelle serait un facteur important à considérer dans les mécanismes d’action antidépresseur des agonistes de ce récepteur. / Antidepressants currently available are very similar toward their mechanism of action and are more or less effective. One major problem is their long latency to provide a therapeutic effect due to adaptations of pre and post synaptic locations. In an animal model, we recently discovered that the agonist RS67333 of the 5-HT4 receptors was able to produce in three days the same antidepressant effects that normally take two to three weeks to appear with the currently available antidepressants. In addition, we found that the antidepressant effects of this agonist had a resistance to tolerance. There are others agonists of the same receptor such as prucalopride, which does not produce antidepressant effects as RS67333. Since the effectiveness of prucalopride to stimulate 5-HT4Rs is similar if not greater than RS67333, we stated the hypothesis that the 5-HT4 receptor could adopt different active conformations following its activation by various agonists. We decided to explore the major functional responses of 5-HT4B by observing their regulatory and signaling properties. We showed that the B isoform of the 5-HT4, being highly expressed in the limbic system, has a different signaling and regulation depending on the ligand. Our results indicate that each of the agonists tested (5-HT, RS67333, ML10302, Zacopride, Prucalopride) distinctively modulate cAMP production and receptor internalization. The results have clearly identified that agonists differed in potency and efficacy. Moreover, the order of effectiveness of agonists to modulate the cAMP pathway was (prucalopride> zacopride = 5-HT = ML10302> RS67333) different from their order of effectiveness in inducing receptor regulation by internalization (5-HT> Zacopride> Prucalopride> RS67333 = ML10302). Thus, we have shown that 5-HT4Rs adopt conformations that are ligand-specific. This implies that functional selectivity is an important factor in the mechanisms of antidepressant action of this receptor agonists.

Les actions thérapeutiques des antidépresseurs, disponibles actuellement, requièrent plusieurs semaines de traitement. Ce délai est dû aux adaptations des sites pré et post-synaptiques qui, respectivement, augmentent la disponibilité synaptique des monoamines sérotonine et noradrénaline (5-HT et NA), et entraînent les changements neuroplastiques modifiant la fonction neuronales dans les régions limbiques. Il a été récemment observé, chez un modèle animal de dépression, que l’agoniste RS67333 des récepteurs sérotoninergiques de type 5-HT4 produisait des changements comportementaux, électrophysiologiques, cellulaires et biochimiques, tel qu’observé chez les antidépresseurs. Ces changements apparaissent seulement après 3 jours de traitement tandis que les antidépresseurs nécessitent souvent plusieurs semaines. De plus, l’activation des récepteurs 5-HT4 ne générait pas de tolérance, et cela pendant 21 jours de traitement. Seulement, les propriétés de signalisation et de régulation de ces récepteurs sont très loin d’êtres établies. Nous avons alors voulu mieux caractériser ces deux aspects de leur fonction, en se concentrant d’avantage sur les isoformes a et b, fortement exprimés dans le système limbique. Pour cela, nous avons voulu évaluer d’abord leur capacité de production d’AMPc dans un système hétérologue. Les essais d’accumulation d’AMPc démontrent que les deux isoformes sont capables de moduler positivement et négativement des niveaux d’AMPc en présence de 5-HT. Par contre, la stimulation au RS67333 induit seulement une augmentation du niveau d’AMPc dans les deux cas. Ensemble, ces observations indiquent que les deux isoformes sont capables de coupler à l’adénylate cyclase à travers les protéines Gαs et Gαi. La quantification des récepteurs internalisés a montré que l’isoforme b internalisait plus efficacement que l’isoforme a suite à l’incubation à la 5-HT (61 ± 3 % pour le b vs 40 ± 2 % pour le a). Les protéines kinases PKA et PKC n’étaient pas impliquées dans cette différence, toutefois, la PKC a été trouvée essentielle à l’internalisation des deux isoformes. L’internalisation de l’isoforme b par 5-HT n’a pas été affecté par la surexpression de forme inactive de GRK2 (GRK2- K220R) et a été partiellement inhibé par un mutant négative de la β-arrestine (βarr(319-418)), tandis que l’internalisation de l’isoforme a a été bloquée par les deux. Ces observations indiquent que les mécanismes d’internalisation des deux isoformes du récepteur 5-HT4 les plus abondants dans le système nerveux central sont distincts. Des comportements spécifiques à chaque isoforme ont aussi été constatés au niveau de la régulation fonctionnelle suite à l’exposition au RS67333, qui désensibilise seulement l’isoforme b. D’après nos observations, nous avons conclu que les isoformes a et b diffèrent dans leur propriétés de signalisation et de régulation. L’incapacité du RS67333 à désensibiliser l’isoforme a fournit un substrat moléculaire pour les effets antidépressifs prolongés de cet agoniste dans les études pré-cliniques. / The therapeutic actions of antidepressants, currently available, require several weeks of treatment. This delay is due to pre-and post-synaptic sites adjustments, which, respectively, increase the availability of synaptic monoamines 5-HT and NA, and induce neuroplastic changes amending neuronal function in the limbic regions. We have recently observed in animal model of depression that serotonergic 4 receptor agonist RS67333 produces behavioural, electrophysiological, cellular and biochemical changes, as seen in antidepressants. More importantly, these changes appear only after 3 days of treatment while antidepressants often require several weeks. Moreover, activation of 5-HT4 receptors does not generate tolerance and that for 21 days of treatment. However, the signalling and regulation properties of these receptors haven’t been established yet. Here, we wanted to better characterize these two aspects of their function, and in particular for isoforms a and b, strongly expressed in the limbic system. First, we assessed their ability to produce cAMP in a heterologous system. Functional assays revealed that both isoforms were capable of positive and negative modulation of cAMP levels by 5-HT. Stimulation by RS67333 induced cAMP stimulation. Together, these observations indicate that that both isoforms are able to couple adenylate cyclase through Gαs and Gαi proteins. Moreover, quantification of receptors sequestration showed that isoform b internalised more efficiently than the isoform a, following incubation with 5-HT (61 ± 3 % for b, 40 ± 2 % for a). PKA and PKC proteins, two seconds messenger kinases activated by these receptors, are not involved in producing this difference. However, PKC is essential to the internalization of both isoforms. Isoform b internalization was not affected by an inactive GRK2 mutant (GRK2-K220R) and was partially inhibited by dominant negative β-arrestin (βarr(319-418), while isoform a internalization was dependant on both. These observations indicate that internalization mechanisms of the two isoforms, most abundantly expressed in the central nervous system, are different. Functional desensitization studies showned that RS67333 selectively desensitizes the isoform b, but not isoforme a. Based on these observations, we conclude that isoform a and b differ in their signalling and regulatory properties. Isoform a incapacity to desensitization by RS67333 provides a molecular substrate for prolonged antidepressant affects of this agonist in pre-clinical studies.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) peuvent activer des voies de signalisation indépendantes des protéines G. Cependant, la régulation de ces voies, et en particulier leur désensibilisation, est peu connue. Le récepteur de la sérotonine de type 4 (R-5-HT4) est un RCPG exprimé dans le cerveau et les organes périphériques. Il est impliqué dans des fonctions physiologiques importantes comme la mémoire, l'apprentissage, la prise de nourriture, le contrôle respiratoire et la mobilité gastro-intestinale. Le R-5-HT4 est couplé à la protéine Gs. De plus, il active la voie Src/ERK1/2, indépendamment des protéines G et des β-arrestines.Nous avons montré que GRK5, physiquement associé à la région C-terminale (C-ter) du R-5-HT4 inhibait la voie Src/ERK1/2 couplée au récepteur, mais pas la voie Gs. Ce résultat a été observé dans la lignée de cellules HEK-293 mais aussi dans des neurones de collicules en culture. Cette inhibition nécessite deux séquences d'évènements : l'association de la β-arrestine1 à une région riche en sérines et thréonines, localisée dans le domaine C-ter du récepteur et la phosphorylation par GRK5, de la β-arrestine1 (en sérine 412) liée au récepteur. La β-arrestine1 phosphorylée empêche l'activation de Src, constitutivement liée au récepteur, nécessaire à l'activation d'ERK1/2. Ceci constitue la première démonstration que la phosphorylation d'une β-arrestine par une GRK régule la signalisation indépendante des protéines G. En plus de ces résultats, nous avons démontré que l'activation d'ERK1/2 par le R-5-HT4, indépendante des β-arrestines, implique la libération d'un ligand induite par une métalloprotéase, conduisant à la transactivation d'un autre récepteur. Par une approche protéomique, nous avons également identifiés plusieurs partenaires potentiels du R-5-HT4. L'étude de ces partenaires pourrait apporter un éclairage supplémentaire sur les voies de signalisation du récepteur et leur régulation. / G protein-coupled receptors (GPCRs) have been found to trigger G protein-independent signalling. However, the regulation of G protein-independent pathways, especially their desensitization, is poorly characterized.The 5-Hydroxytryptamine 4 receptor (5-HT4R) is a GPCR widely expressed in the brain and at the periphery. It is implicated in important physiological functions such as memory, cognition, feeding, respiratory control and gastrointestinal motility. 5-HT4R couples to the Gs/cAMP/PKA pathway. Moreover, this receptor can activate a Src/ERK pathway independently of both G proteins and β-arrestins.Here, we show that the G protein-independent 5-HT4R-operated Src/ERK pathway, but not the Gs pathway, is inhibited by GPCR kinase 5 (GRK5), physically associated with the proximal region of receptor C-terminus, in both HEK-293 cells and colliculi neurons. This inhibition requires two sequences of events: the association of β-arrestin1 to a phosphorylated serine/threonine cluster located within the receptor C-terminal domain and the phosphorylation by GRK5 of β-arrestin1 (at Ser 412) bound to the receptor. Phosphorylated β-arrestin1 prevents in turn activation of Src constitutively bound to 5-HT4R, a necessary step in receptor-stimulated ERK signalling. This is the first demonstration that β-arrestin phosphorylation by a GRK regulates G protein-independent signalling.In addition to these results, we also demonstrated that the β-arrestin-independent activation of ERK1/2 by the 5-HT4R involves a metalloprotease-dependant ectodomain shedding and transactivation of another receptor. By a proteomic approach, we also identified several potential partners of the 5-HT4R. Study of these proteins may provide a better understanding of 5-HT4R signalling and his regulation.

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